Евна фармако- токсикологическая оценка препарата гепавитол
На правах рукописи
СТАРИКОВА ЕЛЕНА АЛЕКСЕЕВНА
фармако-токсикологическая оценка
препарата ГЕПАВИТОЛ
06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Краснодар – 2013
Работа выполнена в лаборатории фармакологии Государственного научного учреждения Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный
институт Россельхозакадемии
| Научный руководитель: | доктор ветеринарных наук Кузьминова Елена Васильевна |
| Официальные оппоненты: | доктор ветеринарных наук, главный ветеринарный врач ППЗ «Братковский бройлер» Богосьян Адам Аведисович |
| кандидат ветеринарных наук, консультант отдела оперативного реагирования при возникновении заразных и иных болезней животных Государственного управления ветеринарии Краснодарского края Соловьев Валерий Сергеевич | |
| Ведущая организация: | ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет» |
Защита состоится «20» декабря 2013 г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.07 при ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет» по адресу: 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.
Автореферат размещен на официальном сайте ФГБОУ ВПО «Кубанский ГАУ» http://www.kubsau.ru «18» ноября 2013 г. и официальном сайте ВАК РФ – http://vak.ed.gov.ru.
Автореферат разослан «18» ноября 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор ветеринарных наук И.А. Родин
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Заболевания печени у мелких домашних животных являются одними из наиболее распространенных патологий (Уша Б.В., 1979; Кузнецов Н.И., Кудинова Н.А., 2007; Карпенко Л.Ю., 1998).
Печень – полифункциональный орган, играющий основную роль в метаболизме, секреции, детоксикации и экскреции различных веществ. Поражение ее ткани ведет к снижению барьерной функции, нарушению в белковом, углеводном, жировом, пигментном, гормональном и витаминном обменах.
Ассортимент лекарств, применяемых в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной системы, достаточно обширен. При этом выделяют сравнительно небольшую группу препаратов - гепатопротекторов, которые оказывают избирательное действие на печень. Их влияние направлено на повышение устойчивости органа к действию патогенных факторов, нормализацию функциональной активности и стимуляцию репаративно-регенерационных процессов в печени (Никитин И.Г., 2007; Оковитый С.В., 2006; Антипов В.А., Трошин А.Н., 2010).
Помня о том, что при всех заболеваниях печени повреждаются мембранные структуры обоснованным является применение веществ, оказывающих восстанавливающее действие на клеточные мембраны гепатоцитов и тормозящих деструкцию клеток. Такой направленностью действия обладают фосфолипидные препараты (Сергеева С.А., 2001; Малявина В.В., 2007; Кунц Э., 1994; Ипатова О.М., 2005).
Защитное действие многих гепатопротекторов основывается на ингибировании процессов перекисного окисления липидов, которые рассматриваются как один из ведущих патогенетических механизмов развития поражений печени. Поэтому, использование антиоксидантов, таких как бета-каротин и селен является целесообразным (Кузьминова Е.В., Семененко М.П., 2007; Родионова Т.Н., 2010; Кудинова С.П., Казарян Р.В., 1988; Беляев В.А., 2010; Дорожкин В.И., 2001; Кощаев А.Г., 2008).
Исходя из этого, был разработан новый гепатопротектрный препарат, в состав которого вошли каротин, селен и фосфолипиды, получивший название гепавитол.
Цель и задачи исследований. Основная цель настоящей работы состояла в разработке нового препарата гепавитол, изучении его фармако-токсикологических свойств и лечебной эффективности при заболеваниях печени у собак.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- научно обосновать рецептуру гепавитола и изучить его физико-химические свойства, определить показатели качества препарата и методы их контроля;
- изучить токсикологические свойства гепавитола (острая, хроническая токсичность, влияние на функциональное состояние желудочно-кишечного тракта и почек, раздражающее свойства препарата при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки);
- изучить фармакологические свойства (фармакодинамика) препарата;
- определить терапевтическую эффективность гепавитола при заболеваниях печени у собак.
Научная новизна. Разработан новый препарат – гепавитол, представляющий собой оригинальную композицию, состоящую из бета-каротина, органической формы селена и фосфолипидов. Впервые проведено изучение комплекса токсикологических показателей гепавитола, позволившее выявить степень безопасности его применения. Определено, что препарат относится к группе малотоксичных соединений, полученные экспериментальные данные свидетельствует о безопасности его применения в широком диапазоне доз и длительности назначения. Установлены фармакодинамические свойства препарата, а также впервые доказана возможность использования гепавитола в качестве лечебного средства при заболеваниях печени у собак.
Теоретическая и практическая значимость работы. Для ветеринарной медицинской практики предложен новый препарат гепавитол, обладающий гепатопротекторными свойствами. Результаты изучения эффективности применения лекарственного средства могут быть использованы в практике ветеринарии при фармакотерапии гепатопатий.
Данные проведенных исследований учтены при разработке НТД (временная инструкция по применению препарата гепавитол в ветеринарии).
Изложенные в диссертационной работе материалы могут быть использованы при составлении научно-информационной литературы, в учебном процессе сельскохозяйственных ВУЗов, а также в ветеринарной практике.
Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований, являющихся основой диссертации, доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Краснодарского НИВИ (2010 - 2013 гг.); на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); на Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии» (Екатеринбург, 2011); на Международной научно-практической конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы» (п. Персиановский, 2013).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 научных статьях, 2 из которых в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- состав и физико-химические свойства гепавитола;
- токсикологическая оценка препарата;
- фармакологические свойства (фармакодинамика) гепавитола;
- терапевтическая эффективность препарата при заболеваниях печени у собак.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из разделов: введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список использованной литературы включает 256 источников, в том числе иностранных 128. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 4 фотографиями и 5 рисунками.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена в период с 2010 по 2013 годы в лаборатории фармакологии Государственного научного учреждения Краснодарский научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук, в соответствии с Государственными планами научных исследований и является частью задания с № госрегистрации 150070.2308023075.11.5.002/001. Часть исследований проведена на базе ветеринарной клиники ГБУ РО Шахтинской горСББЖ.
Основной объект исследований – препарат гепавитол, опытные образцы наработаны в лаборатории фармакологии Краснодарского НИВИ.
Экспериментальные и научно-производственные опыты проведены в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных в период проведения работы и учета результатов. При постановке опытов были использованы физиологические, клинические, токсикологические, морфологические, биохимические и другие методы исследований.
Общетоксические свойства гепавитола были изучены и определены в соответствии с «Методическими рекомендациями по токсико-экологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии», одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).
Токсикологическую оценку препарата проводили в остром опыте на белых крысах и собаках по методике Deishmann & Le Blanc (Саноцкий И. В., 1970). Гепавитол опытным крысам вводился внутрижелудочно с помощью полиэтиленового зонда и шприца в дозах от 0,42 г/кг до 7,1 г/кг массы тела, в контрольной группе животных в тех же объемах вводили растительное масло.
Вторую серию экспериментов по определению острой токсичности гепавитола проводили на собаках. Для этого по принципу парных аналогов было подобрано 10 особей, из которых сформировали две группы. В опытной группе вводили препарат внутрижелудочно после 12-ти часовой голодной диеты, однократно, в дозе 7,1 г или 6,5 мл на килограмм массы тела (расчет производился индивидуально по весу собаки). Выбор дозы был обусловлен стандартом классификации по степени воздействия веществ на организм животных при проведении токсикологических исследований (свыше 5000 г/кг массы тела – 4 класс опасности малоопасные вещества) и результатами исследований препарата на лабораторных крысах. Контрольная группа получала аналогичный объем растительного масла.
Параметры хронической токсичности изучали по общепринятым методикам на белых крысах и собаках. Образец гепавитола задавали индивидуально, перорально, ежедневно, натощак в течение 60 дней по непрерывной схеме в дозах, руководствуясь результатами, полученными при исследовании острой токсичности.
В первой серии опыты проводили на белых крысах, из которых сформировали 3 группы аналогов, по 10 голов в группе. Поскольку в остром опыте среднесмертельная доза (LD50) установлена не была, первая группа крыс получала исследуемый образец препарата гепавитол в дозе 1/10 от максимально введенной (7,1 г/кг – 6,5 мл/кг), вторая группа получала препарат в дозе 1/20 от максимально введенной, третья группа служила контролем и получала растительное масло в объеме 0,11 мл на животное. Вещества задавали ежедневно индивидуально в виде желточно-маслянных шариков, в течение 2-х месяцев.
По окончании хронического эксперимента изучалось воздействие гепавитола на макро- и микроструктуру внутренних органов крыс. Патологоанатомический анализ органов и тканей проводился согласно «Курса патогистологической техники» (Меркулов Г. А., 1969). В работе использовался анатомический и гистологический комплекс методов исследования. Анатомический метод был использован для изучения формы, размеров и топографии органов. Органы и ткани подвергали препарированию и описывали. Гистологический метод использовали для изучения микроструктуры органов и тканей, при котором срезы окрашивали гематоксилином Бемера и водным 0,1%-ным раствором эозина и эозином по Романовскому-Гимзе.
Для гистологического исследования фрагменты органов (желудок, двенадцатиперсная кишка, кусочки печени, почек, селезенки, сердца, лимфоузлы) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивали рутинными красителями (гематоксином и эозином) и просматривали с помощью светового микроскопа.
Во второй серии опытов по оценке хронической токсичности гепавитола для опытов было сформировано 3 группы беспородных собак - аналогов (самцы с первоначальной массой тела 10,9-12,3 кг) по 5-ть особей в группе. Дозы препарата в опытных группах составили 15 мл (1-я опытная) и 25 мл (2-я опытная) на животное, что превышало условно-терапевтическую дозу в 3 и 5 раз. Контрольная группа получала подсолнечное масло в объеме наибольшей дозировки. Режим введения: ежедневно, индивидуально, в течение 60 дней.
В течение эксперимента ежедневно, проводилось наблюдение за общим состоянием животных, их выживаемостью. Взвешивание осуществлялось в начале и в конце опыта. Были проведены лабораторные исследования крови фоновые и в конце опыта.
Для выявления возможного повреждающего действия гепавитола на функцию пищеварительного тракта и почек у собак каждые 10 дней собирали мочу и фекалии, в которых исследовали физико-химические показатели. В фекалиях определяли цвет, запах и консистенцию (органолептически), наличие кровяных пигментов (бензидиновой пробой), желчных пигментов, жира (окраской суданом-3), крахмала (обработка раствором Люголя), рН – лакмусовой бумагой. В моче определяли цвет, консистенцию, запах, концентрацию водородных ионов, удельный вес, содержание белка, углеводов, гемоглобина, желчных пигментов.
Оценку местно-раздражающего действия препарата гепавитол проводили методом накожных аппликаций и конъюнктивальной пробой на кроликах и морских свинках.
У морских свинок предварительно выстригали волосы на участке спины размером 2-3 см, в направлении от задней трети спины к голове. Препарат наносили 5 дней подряд, кроликам с внутренней стороны уха, свинкам на выстриженные участки путем втирания, после чего в течение 24-х часов учитывали состояние кожного покрова (окраску, местную температуру, припухлость, зуд).
Для конъюнктивальной пробы препарат вводили под нижнее веко в количестве 3-х капель, в подогретом до 37° С виде. Одновременно для контроля в другой глаз закапывали такое же количество растительного масла.
После введения препарата учитывается клиническое состояние животных (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений), в том числе изменение кровенаполнения конъюнктивы, состояние век и роговицы, наличие выделений.
При гематологических исследованиях определяли количество эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева, выводили лейкоформулу по В.Г. Мухину, содержание гемоглобина (гемоглобинцианидным методом), высчитывали цветовой показатель, СОЭ в аппарате Панченкова. Биохимические исследования проводились на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor Junior с помощью наборов фирмы «ELITech Clinical Systems». Определяли уровень белковых фракций (нефелометрически), витамина А (по Бессею, в модификации Анисовой), витамина Е (по цветной реакции с хлорным железом и -дипиридилом).
Исследование показателей системы ПОЛ-АОЗ проводили в соответствии с методическими рекомендациями ВНИВИПФиТ (1997) по изучению процессов перекисного окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у животных.
Оценку фармакологических свойств (фармакодинамика) гепавитола проводили на собаках. Предварительно для формирования групп проводили полный клинический осмотр животных, а также оценивали ряд морфо-биохимических параметров крови и показателей антиоксидантной защиты организма. Препарат гепавитол давали за 30 минут до кормления индивидуально, перорально с небольшим количеством корма или принудительно с помощью шприца из расчета на 0,5 мл на 1 кг массы тела в течение 2-х недель.
Изучение фармакологического действия гепавитола проводили на экспериментальной модели острого гепатита у крыс, вызванного ССL4, в соответствии с Методическими указаниями по изучению гепатозащитной активности фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, под общей редакцией Р.У. Хабриева, 2005).
О фармакодинамике препарата судили по клиническим показателям, изменениям в морфологическом составе крови, белковом, липидном, углеводном, минеральном, витаминном обменах, в состоянии перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты организма, а также по ряду биохимических показателей, характеризующих функциональное состояние печени.
При разработке показаний к применению эффективность препарата гепавитол изучали при остром гепатите у собак. Для экспериментов были отобраны 14 собак в возрасте 2-6 лет с основным диагнозом пироплазмоз (с преобладанием гепатопривного синдрома), которых разделили на две группы по методу парных аналогов. В комплекс лечебных мероприятий животным первой (опытной) группы в схему лечения включали гепавитол, собакам второй (контрольной) группы применяли эссенциале.
В следующей серии экспериментов разрабатывались показания к применению гепавитола при гепатозе. Для этого было отобрано 14 собак в возрасте от 2 до 5 лет имевших симптоматические проявления хронической патологии печени (по типу жировой гепатоз). Терапию проводили комплексно: у животных с признаками дегидратации (перемежающееся рвота и понос) для борьбы с обезвоживанием организма внутривенно вводили раствор Рингера; всем собакам применяли витамины группы В, животным с холестазом в качестве желчегонного средства – аллохол (согласно инструкции по применению). Животным первой группе применяли гепавитол, в контроле в качестве препарата сравнения использовали эссенциале.
Эффективность лечения животных опытной группы оценивалась в динамике по сравнению с контрольной группой. Заключение о положительном действии препарата делали на основании результатов комплексных клинических, биохимических, гематологических исследований и по УЗИ гепатобилиарной системы.
Полученные в опытах данные подвергнуты биометрической обработке с помощью программного обеспечения фирмы Microsoft ®, фирмы Carl Zeiss ®. Критерий достоверности определяли по таблице Стъюдента.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Токсикологические свойства гепавитола
Гепавитол представляет собой масляный раствор: бета-каротина (выпускаемый по ФС 42-3867), селена (в форме селеноорганического препарата ДАФС-25) и фосфолипидов (соевого лецитина).
При определении параметров острой токсичности исследуемый образец препарата опытным крысам вводился внутрижелудочно с помощью полиэтиленового зонда и шприца в дозах от 0,42 г/кг до 7,1 г/кг массы тела. Пересчет введенной дозы препарата и растительного масла в граммы проводили исходя из их плотности 0,921 г/мл. Результаты опытов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Определение острой токсичности препарата гепавитол для белых крыс
| № | Масса тела, г | Доза, г/кг массы тела | Доза на животное, г | Доза на животное, мл | Эффект |
| 1 | 205 | 0,42 | 0,090 | 0,08 | Гибели не зарегистрировано |
| 2 | 197 | 0,62 | 0,122 | 0,11 | |
| 3 | 208 | 0,94 | 0,195 | 0,18 | |
| 4 | 200 | 1,4 | 0,28 | 0,25 | |
| 5 | 195 | 2,1 | 0,41 | 0,37 | |
| 6 | 211 | 3,2 | 0,67 | 0,60 | |
| 7 | 207 | 4,7 | 0,97 | 0,87 | |
| 8 | 197 | 7,1 | 1,39 | 1,25 |
В результате проведенных исследований установлено, что однократное введение гепавитола в дозах от 420 до 7100 мг/кг массы тела не вызывало клинической картины токсикоза у белых крыс, гибели животных не отмечалось.
Во второй серии экспериментов по определению острой токсичности гепавитола на собаках его введение в дозе 7,1 г или 6,5 мл на килограмм массы тела не вызывало гибели и острой интоксикации животных, не влияло отрицательно на их общее состояние и поведение. Последующее наблюдение за собаками показало, что по показателям внешнего вида, шерстного покрова, видимых слизистых оболочек, отношению к воде и пище, подвижности, ритму и частоте дыхания подопытные животные не имели отличий от контрольных за весь период наблюдений. Однако, у всех собак зарегистрировано некоторое увеличение количества актов дефекации, в первые сутки после введения, как образца препарата, так и растительного масла. Это можно рассматривать как ответную реакцию организма большие объемы масла, который в этих дозах оказывал некоторый слабительный эффект.
Таким образом, однократное введение исследуемого образца препарата гепавитол в дозах до 7100 мг/кг переносится животными без видимых последствий, он классифицируется как препарат малотоксичный и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).
При определении параметров хронической токсичности гепавитола на крысах испытывали дозы 1/10 и 1/20 от максимально введенной (7,1 г/кг массы тела). В результате проведенных опытов было установлено, что гепавитол в испытанных дозах не оказывал токсического действия на организм животных. На всем протяжении эксперимента существенных отклонений от нормы в поведении, общем состоянии и аппетите крыс не регистрировали. Животные были подвижны, реакции и рефлексы сохранены. Тактильная и болевая чувствительность не нарушались. Изменений функций пищеварения и мочеотделения отмечено не было. Имевшие место колебания клинических показателей были незначительными и не выходили из границ физиологических пределов.
Гравиметрическими исследованиями выявлено увеличение массы у крыс, которое составило в первой опытной группе – 17,4%, во второй – 16,1%, в контроле этот показатель равнялся 12,2%.
Биохимическими исследованиями крови установлено, что среднее значение показателей у крыс опытных групп не выходило за верхние границы нормы для данного вида животных и статистически не отличалось от их уровня в контроле. Выявлено увеличение на уровне тенденции концентрации общего белка на 13,5% и 15%, в сравнении с контрольными животными.
При патоморфологических и гистологических исследованиях у животных как в опытных, так и в контрольной группах не было выявлено отклонений от нормы в макро- и микроструктуре внутренних органов крыс.
Определение хронической токсичности на собаках показало, что применение гепавитола в дозах превышающих условно-терапевтическую в 3 и 5 раз не привело к развитию токсикоза и не позволило установить его вредного влияния на организм животных.
Оценка местно-раздражающего действия гепавитола методом накожных аппликаций и конъюнктивальной пробой на кроликах и морских свинках показала, что препарат характеризуется как не проявляющий раздражающего действия при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки.
Таким образом, обобщая результаты опытов по изучению токсических свойств препарата гепавитол установлено, что он относится к классу малотоксичных веществ.
3.2 Фармакодинамика гепавитола
Оценку фармакологических свойств (фармакодинамика) гепавитола проводили на собаках. После применения гепавитола в течение 2-х недель проводили оценку его влияния на уровень обменных процессов организма собак, в результате установлено, что у животных достоверно возрос уровень общего белка (на 16,5%), уровень альбуминов увеличился на 10,5%. Также у животных к концу экспериментального периода достоверно увеличилась концентрация фосфолипидов на 44,1%. Анализируя данные по витаминному составу крови, установили: увеличение концентрации витамина А в 1,4 раза у собак, получавших гепавитол (со степенью достоверности Р0,05). В содержании витамина Е выявили наличие тенденции к увеличению этого показателя на 18,3% по отношению к фоновым данным.
Позитивное влияние гепавитола на показатели характеризующие интенсивность ПОЛ-АОЗ у собак проявилось в снижении концентрации продуктов липопероксидации. Так, по окончании эксперимента регистрировались ниже уровни диеновых конъюгатов – на 14,3% и малонового диальдегида – на 25,3%, а активность глутатионпероксидазы была выше аналогичного показателя при фоновых исследованиях на 10,7%.
Улучшение обменных процессов в организме собак под влиянием препарата оказало влияние на клинический статус животных: собаки стали более подвижные, отмечено улучшение состояния кожи и шерстного покрова.
Гепавитол проявляет гепатозащитное действие при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом у лабораторных крыс, снижая уровень гепатоиндикаторных ферментов в крови опытных животных (АсАт и АлАт в среднем в 1,7 раза, ЩФ – на 50,4%), а также препятствуя развитию гипербилирубинемии и гиперпротеинемии, что свидетельствует о целесообразности его применения в качестве гепатопротектора.
3.3 Разработка показаний к применению препарата гепавитол
3.3.1 Эффективность гепавитола при гепатите у собак
При разработке показаний к применению препарата гепавитол были отобраны 14 собак с основным диагнозом пироплазмоз (с преобладанием гепатопривного синдрома). При первичном клиническом обследовании собак общее состояние оценивали как удовлетворительное. Собаки с терминальной формой заболевания в эксперименте не участвовали.
Клинически начало заболевания у собак характеризовалось, отсутствием аппетита, повышением температуры тела (у 10-ти животных), тахикардией, одышкой. У 6-ти собак (по три в группе) на 3-4 сутки суток появлялось иктеричное окрашивание слизистых оболочек ротовой полости, конъюнктивы. Снижение детоксикационной функции печени приводило к нарастанию интоксикации, дегидратации, что клинически проявлялось саливацией, рвотой, реже диареей. По результатам УЗИ в печени наблюдались диффузные изменения паренхимы по типу острого гепатита.
Клинический анализ крови показал снижение содержания эритроцитов до 3,9±0,22*1012/л и гемоглобина до 82,5±1,8 г/л. Отмечалось уменьшение сегментоядерных клеток, а также лимфо- и моноцитоз.
При оценке биохимического статуса больных собак установлено:
гиперпротеинемия (содержание общего белка до 75,4±1,6 г/л); в уровне мочевины, креатинина и хлоридов значимых изменений не выявлено (следовательно, сильного поражения почек у отобранных в опыт животных не развивалось); гипогликемия, обусловленная отказом животных от пищи и поражением паренхимы печени; повышенный уровень АлАТ до 98,4±2,1 ЕД/л и АсАТ до 76,3±2,5 ЕД/л; у шести животных (по три в группе) установлены холестатические отклонения, что проявилось увеличением уровня холестерина и щелочной фосфатазы, при этом статистическая обработка, в целом по группе, хотя и установила повышение этих показателей, но без ярко выраженной манифестации; концентрация общего билирубина в сыворотке крови была значительно выше нормы до 18,1±1,7 мкМ/л, что связано с массовым распадом эритроцитов и высвобождением гемоглобина, распадающегося в печени до билирубина. Значительно возрастало количество прямого билирубина до 7,1±0,6 мкМ/л. При анализе протеинограммы установлено выраженное снижение содержания альбуминов, при повышении концентрации - и -глобулинов, что указывает на интенсификацию иммунобиологической реактивности организма (в острой фазе воспалительного процесса).
Схема лечения для всех больных собак включала в себя: из этиотропных средств протозойный препарат неозидин; из симптоматических средств: раствор Рингера, фурасемид, цианкобаламин, у собак с проявлением холестаза в качестве желчегонного средства – аллохол. При повышении температуры тела давали анальгин. В комплекс лечебных мероприятий животным первой (опытной) группы в схему лечения включали гепавитол, который применяли индивидуально, 2-3 раза в день (с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела), в течение 30 дней. Собакам второй (контрольной) группы применяли эссенциале по 1 капсуле 3 раза в сутки. Во всех группах собак, больных гепатитом, назначалась строгая диета, с увеличением числа приема пищи.
Лечение собак с использованием гепавитола обеспечивала более выраженный терапевтический эффект, что подтверждалось позитивным сдвигом в лабораторных показателях.
Из данных, представленных в таблице 2, установлено, что к 10-м суткам терапии в обеих группах наблюдалась нормализация ряда исходных показателей. Однако, наиболее интенсивно этот процесс проходил у опытных животных. Так, содержание общего белка во всех группах уже к 10-му дню лечения вошло в параметры нормы, в этот же период оптимизировался уровень глюкозы и холестерина. Повышенный уровень ферментов АсАТ, АлАТ и ЩФ в контрольной группе на 10-й день лечения свидетельствует о незавершенности детоксикационных и репаративных процессов у больных животных. У собак опытной группы вышеназванные показатели были близки к референтным, что подтверждает эффективное восстановление функции печени при использовании гепавитола. Так, разница с контролем составила по АлАТ - 27,3%, по АсАТ – 19,4%, по ЩФ – 30,2%. Аналогичная ситуация прослеживалась и в содержании билирубина - на 10-й день опыта концентрация прямого билирубина снизилась до уровня нормы в обеих группах, а оптимизация содержания общего билирубина зарегистрирована только у собак первой группы (разница составила 44,2% и она была достоверной).
Таблица 2
Биохимические показатели крови собак, больных гепатитом, при
применении гепавитола (М±m; n=7)
| Показатели | Опыт | Контроль | |||
| 10-й день | 30-й день | 10-й день | 30-й день | ||
| Белок общий, г/л | 67,5±2,3 | 61,4±1,8 | 69,8±2,7 | 62,9±3,1 | |
| Мочевина, мМ/л | 4,8±0,5 | 5,1±0,9 | 6,3±1,1 | 5,9±0,7 | |
| Глюкоза, мМ/л | 3,8±0,3 | 4,7±0,8 | 3,3±0,6 | 3,9±0,4 | |
| Холестерин, мМ/л | 5,8±1,2 | 5,4±0,9 | 6,3±0,7 | 5,9±0,5 | |
| АлАТ, Ед/л | 60,1±1,2* | 51,8±2,5 | 76,5±1,8 | 59,3±1,5 | |
| АсАТ, Ед/л | 45,9±1,4* | 27,4±2,1 | 54,8±2,8 | 42,7±1,9 | |
| ЩФ, Ед/л | 95,3±2,3* | 81,7±1,6* | 124,1±2,2 | 98,9±1,7 | |
| Амилаза, Ед/л | 674,5±6,9 | 598,9±7,2 | 821,7±8,1 | 756,3±5,4 | |
| Об. Билир., мкМ/л | 9,5±1,2* | 5,4±0,7 | 13,7±0,8 | 7,9±1,1 | |
| Пр. билир, мкМ/л | 2,4±0,2 | 1,8±0,3 | 2,6±0,5 | 2,3±0,2 | |
| Креатинин, мМ/л | 74,9±3,1 | 68,1±2,6 | 85,3±3,7 | 80,4±3,5 | |
| Хлориды, мМ/л | 110,1±2,8 | 109,8±1,9 | 115,6±3,1 | 111,2±2,6 | |
* - различия достоверны (Р<0,05) по сравнению с контрольными животными
К концу экспериментального периода в первой группе показатели клинического и биохимического анализа крови соответствовали норме. Во второй группе у двух животных из 7-ми уровень АсАТ и ЩФ незначительно превышал норму, что свидетельствует о неполном восстановлении функции печени и требует продолжения курса терапевтических мероприятий.
В процессе применения гепатопротекторов изменения клинических показателей в сторону улучшения были зарегистрированы у животных обеих групп, но при применении гепавитола лечебный эффект проявлялся раньше. Так, у животных опытной группы улучшение клинического состояния наступало на 4-й день терапии, в контрольной группе этот процесс проявлялся на 6-й день. Летальный исход в обеих группах отсутствовал, продолжительность температурной реакции в опытной группе составила 2-3 дня, в контроле 3-4.
К 10-м суткам терапии у всех животных нормализовался аппетит, рвота и диарея отсутствовали, они стали активны, слизистые оболочки у животных первой группы стали бледно-розового цвета, а у контрольных желтый оттенок присутствовал у двух собак, что свидетельствует о сохраняющемся холестазе печени, который отмечался и на 30-е сутки эксперимента.
При ультразвуковом исследовании печени и желчевыделительной системы в конце эксперимента установлено, что у всех животных первой опытной группы и у 5-ти контрольных собак ультразвуковая картина печени соответствует практически здоровым животным. У двух контрольных животных наблюдалось снижение эхогенности паренхимы с ее неоднородной структурой и незначительно выраженной отечностью, нарушение контуров печени, также установлено расширение внутрипеченочных протоков. Что свидетельствует о неполном восстановлении тканей печени после лечения.
Таким образом, к при 30-ти дневном курсе терапии гепавитолом у 100% животных нормализовались клинические показатели и морфо-биохимический статус крови, в группе сравнения этот эффект был зарегистрирован у 5-ти собак (71,4%).
3.3.2 Эффективность гепавитола при гепатозе у собак
В эксперименте участвовали 14 собак имевших симптоматические проявления хронической патологии печени (по типу жировой гепатоз). При первоначальном клиническом осмотре животных установлено:
- показатели температуры, пульса и дыхания регистрировались в пределах нормы;
- общее состояние угнетенное, со сниженной динамической активностью, слабостью конечностей и шаткой походкой, быстрой утомляемостью животных, кахексичный вид, а также отсутствие аппетита со слов владельцев. В 57% случаях были отмечены: диарея, периодическая рвота и метеоризм кишечника;
- при оценке состояния видимых слизистых оболочек отмечалась их сухость, в 4-х случаях анемичность, а 6-ти незначительную иктеричность слизистых оболочек ротовой полости и склер глаз;
- кожный покров у всех больных животных был сухой, шерстный покров – тусклый, взъерошенный, регистрировались алопеции в области бедер, поясницы и основания хвоста. У большинства собак регистрировался зуд, что приводило к расчесыванию и нарушению целостности кожи этих участков;
- лимфатические узлы не увеличены, бобовидной формы, тестоватой консистенции, безболезненные и подвижные при пальпации;
- оценка границ печени выявила умеренную гепатомегалию, без резкой боли, у 8-ми собак.
По результатам клинического анализа крови собак при фоновых исследованиях зарегистрирована эритропения (снижение содержания эритроцитов до 4,25±0,26*1012/л) и низкий уровень гемоглобина 95,3 г/л. Содержание лейкоцитов у собак до начала эксперимента регистрировалось уровне 13,1±0,34*109/л.
При изучении биохимических показателей крови было установлено, что в крови, больных гепатозом собак, концентрация общего белка составила 53,9±2,4 г/л. Уровень мочевины регистрировался на нижней границе нормы и составил 3,5±0,8 мМ/л. В результате оценки содержания в крови собак индикаторных энзимов (АсАТ, АлАТ и ЩФ) получены данные, свидетельствующие об изменении концентраций этих показателей в сторону увеличения от физиологической нормы. Повреждение структурных компонентов печени и напряженность обменных процессов усугубляется повышением проницаемости плазматических мембран гепатоцитов, что и объясняет повышение активности сывороточных трансаминаз. Количественное содержание АлАТ в крови больных собак составило 72,8±2,9 Ед/л, а АсАТ 47,9±3,4 Ед/л. Зарегистрированная гиперфосфатаземия свидетельствует об умеренном холестазе у ряда животных (ее содержание выявлялось на уровне 108,1±5,1 Ед/л, что незначительно превышает норму). Результаты пигментного обмена показали отклонения от нормы в сторону увеличения содержания общего билирубина у больных гепатозом собак до 12,1±1,6 мкМ/л. У отобранных в опыт животных, уровень витамина А был ниже, чем у здоровых собак и составлял 78,6±3,9мкг%.
Таким образом, фоновое исследование собак показало, что нарушение функционального состояния печени при гепатозе сопровождается широким спектром морфо-биохимических отклонений в системе крови.
Для исследования гепатопротекторных свойств препарата гепавитол 14 собак с диагнозом гепатоз по принципу парных аналогов разделили на две группы (опытную и контрольную) по 7-мь особей в каждой.
Терапию при гепатозе проводили комплексно: у животных с признаками дегидратации (перемежающееся рвота и понос) для борьбы с обезвоживанием организма внутривенно вводили раствор Рингера; всем собакам применяли витамины группы В, животным с холестазом в качестве желчегонного средства – аллохол.
Животным первой группе применяли гепавитол, который задавали индивидуально 2-3 раза в день (с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела) в течение 30 дней. Собакам второй (контрольной) группы в качестве препарата сравнения применяли эссенциале по 1 капсуле 3 раза в сутки.
Использование гепавитола при лечении гепатоза у собак обеспечивало хороший терапевтический эффект, что подтверждалось улучшением клинического статуса животных и положительной динамикой лабораторных показателей.
При оценке клинического состояния собак установлено, что в процессе лечения положительные изменения были зарегистрированы у животных в обеих группах. Но в контрольной группе стабилизация клинического статуса произошла к концу эксперимента только у 4-х собак (57 %), а еще трем животным применение лечебных препаратов продолжили. В группе с использованием гепавитола у 5-ти животных уже через две недели восстановился аппетита, прекратилась рвота и диарея, снизилась интенсивность зуда до полного прекращения. На пораженных участках кожа подсыхала и покрывалась корочкой, с последующим очищением. Непигментированные видимые участки кожи и слизистых оболочек были бледно-розового цвета. К 30-му дню терапии у всех животных нормализовались клинические показатели. Прием воды и пищи у собак происходил с нормальной частотой, акт мочеиспускания и дефекации осуществлялся без отклонений от нормы. В местах алопеций наблюдали активный рост волос, у собак опытной группы шерсть отросла практически полностью, а у собак контрольной группы - частично. При пальпации болезненность в области печени и увеличение ее размеров отсутствовали.
В опытной группе при ультразвуковом исследовании печени в конце эксперимента эхограмма практически соответствовала здоровым животным. У 3-х контрольных животных еще обнаруживались в паренхиме участки печени повышенной эхогенности, при некотором расширении сосудов.
В результате лабораторных исследований крови установлено, что к концу эксперимента у всех собак наблюдалась нормализация факторов периферической крови. Уровень лейкоцитов в обеих группах находился в пределах нормы (10,3±0,86 и 11,5±0,73*109/л) без значимой разницы между группами. Лейкоцитарная формула как опытной группе животных, так и у контрольных собак не имела отклонений от нормы. Концентрация эритроцитов и гемоглобина в группе собак с применением гепавитола увеличилось на 46,5% и 31,8% относительно фоновых показателей. Достоверная разница между группами по данным показателям составили 17,3% и 11,7%.
При изучении биохимических компонентов крови (таблица 3) установлено, что содержание общего белка в крови собак в обеих группах после лечения повысилось и регистрировалось на уровне (68,3±1,5 и 56,1±1,7г/л). При использовании гепавитола его концентрация с достоверной разницей превосходила показатели контроля на 21,8%.
В опытной группе содержание мочевины в крови собак на 30-е сутки эксперимента повысилось с 3,3±0,5 мМ/л (фоновый показатель) до 4,5±0,3 мМ/л. У контрольных животных этот показатель изменялся в узких границах, если до начала эксперимента ее содержание составляло 3,5±0,8 мМ/л, то на 30-е сутки оно достигло уровня 3,7±0,2 мМ/л. У собак обеих групп содержание холестерина в крови находилось в пределах 3,6±0,7 и 3,9±0,6 мМ/л, что соответствовало физиологической норме.
Таблица 3
Биохимические показатели крови собак после лечения гепатоза (М±m; n=7)
| Показатели | Опыт | Контроль | Норма |
| Белок общий, г/л | 68,3±1,5* | 56,1±1,7 | 55-71 |
| Мочевина, мМ/л | 4,5±0,3 | 3,7±0,2 | 3,5-9,2 |
| Глюкоза, мМ/л | 4,7±0,5 | 4,3±0,8 | 3,3-5,6 |
| Холестерин, мМ/л | 3,6±0,7 | 3,9±0,6 | 2,8-6,9 |
| АлАТ, Ед/л | 37,3±1,2* | 45,1±1,4 | 15-58 |
| АсАТ, Ед/л | 35,4±1,6* | 44,7±1,9 | 16-43 |
| ЩФ, Ед/л | 58,9±3,7 | 65,4±2,8 | 10-100,7 |
| Амилаза, Ед/л | 776,9±5,4 | 811,9±6,7 | 510-1864 |
| Об. билирубин, мкМ/л | 5,4±0,2 | 6,1±0,5 | 1,7-10,6 |
| Пр. билирубин, мкМ/л | 1,1±0,09 | 1,5±0,18 | 0-2,5 |
| Креатинин, мМ/л | 88,1±3,4 | 92,3±2,8 | 55-114 |
| Хлориды, мМ/л | 112,8±4,2 | 115,6±3,7 | 107-126 |
| Витамин А, мкг% | 110,8±2,6* | 82,1±2,9 | - |
* - различия достоверны (Р<0,05) по сравнению с контрольными животными
Определение ферментативной активности АсАТ и АлАТ показало, что у всех собак за период эксперимента произошло достоверное снижение этих показателей. На 30-е сутки эксперимента их уровень составил по АлАТ 37,3±1,2 и 45,1±1,4 Ед/л, а по АсАт 35,4±1,6 и 44,7±1,9 Ед/л. Таким образом, у животных контрольной группы ферментативная активность аминотрансфераз находилась на более высоком уровне, чем у собак опытной группы, достоверная разница составила 20,9% (АлАТ) и 26,2% (АсАТ). Средний показатель щелочной фосфатазы до начала эксперимента в обеих группах регистрировался на верхней границе нормы. В заключительный период эксперимента уровень этого фермента в крови собак всех групп снижался и достиг пределов 58,9±3,7 и 65,4±2,8 Ед/л, что соответствует физиологической норме.
Следовательно, наиболее эффективное нормализирующее влияние на активность АлАТ, АсАТ и ЩФ, оказало использование схемы лечения с гепавитолом, что указывает на более эффективное восстановление мембранных структур клеток печени и свидетельствует о снижении цитолитического синдрома.
Терапия гепавитолом способствовала уменьшению проявления холестатического синдрома, что проявлялось уменьшением как активности щелочной фосфатазы так и уровня билирубина. Показатель билирубина в крови собак до начала эксперимента был повышен. После введения препаратов содержание этого метаболита в крови снизилось до 5,4±0,2 мкМ/л в опытной группе и до 6,1±0,5 мкМ/л в контроле.
Содержание витамина А в крови собак в начале эксперимента находилось на низком уровне (78,6±3,9 и 85,3±4,1 мкг% против 115,6±4,3 мкг% у здоровых животных). На 30-е сутки эксперимента содержание ретинола у животных опытной группы было наиболее выраженным и достигало 110,8±2,6 мкг%. У собак контрольной группы содержание витамина А в течение эксперимента имело тенденцию к уменьшению, его уровень в крови составил 82,1±2,9 мкг%, со статистически достоверной разницей с животными, получавшими гепавитол 34,9%.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют, что препарат гепавитол обладает выраженным гепатопротекторным действием при гепатозе собак, что проявляется улучшением клинического статуса, оптимизацией гематологических и биохимических показателей крови, при улучшении протеинсинтетической, пигментообразовательной и детоксикацоинной функций печени, а также снижении цитолитического синдрома.
4. ВЫВОДЫ
1. Разработан новый препарат гепавитол, который представляет собой масляный раствор бета-каротина, селена и фосфолипидов. Это прозрачная, без осадка маслянистую жидкость, коричневого цвета, без запаха, со вкусом обезличенного масла.
2. Гепавитол не токсичен для животных как в острых, так и в хронических экспериментах. Введение исследуемого образца препарата при определении параметров острой токсичности в дозах в дозах от 0,42 г/кг до 7100 мг/кг не вызывает гибели и выраженного токсикоза у животных, что классифицирует его как малотоксичный препарат и по ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества» он относится к 4-му классу опасности (малоопасные вещества).
3. Применение гепавитола в течении двух месяцев в токсичных дозах не вызывает гибели лабораторных крыс и собак, не проявляет негативного воздействия на общее состояние животных и показатели их клинического статуса, на функциональную активность печени, процессы пищеварения и мочеотделения, а также морфо-биохимические показатели крови (выявленное повышение уровня общего белка и лейкоцитов свидетельствует о защитной реакции организма на исследуемый препарат, при этом их содержание не выходило за верхнюю границу нормы).
Патоморфологическое и гистологическое исследование внутренних органов и тканей животных свидетельствует об отсутствии дополнительной нагрузки на органы, при длительном применении препарата.
4. Гепавитол при нанесении на кожу и слизистые оболочки не проявляет местного раздражающего действия. В экспериментах по изучению влияния препарата на качество мясопродуктов установлено, что длительное его применение не оказывает отрицательного влияния на физико-химические и вкусовые качества мяса.
5. Фармакодинамика гепавитола характеризуется увеличением уровня общего белка на 16,5%, стабилизацией его фракционного состава, увеличением концентрации фосфолипидов на 44%, витамина А в 1,4 раза, витамина Е на 18,3%, оптимизацией уровня гепатоиндикаторных ферментов. Применение гепавитола повышает антиоксидантные защитные силы организма (активность глутатионпероксидазы возросла на 10,7%), а также снижает уровень токсичных продуктов липопероксидации (зарегистрировано снижение концентрации диеновых конъюгатов на 14,3% и малонового диальдегида на 25,3%). Оптимизация обменных процессов в организме собак под влиянием препарата оказывает позитивное влияние на клинический статус животных (увеличение массы тела, улучшение состояния кожи и шерстного покрова).
Гепавитол проявляет гепатозащитное действие при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом, снижая уровень ферментов в крови опытных крыс (АсАт и АлАт в среднем в 1,7 раза, ЩФ – на 50,4%), а также препятствуя развитию гипербилирубинемии, что свидетельствует о целесообразности его применения в качестве гепатопротектора.
6. Применение гепавитола в комплексной терапии гепатита у собак обуславливало более выраженный гепатопротекторный эффект в сравнении с традиционной схемой лечения. Его использование вело к увеличению содержания в крови эритроцитов и гемоглобина (разница с контролем составила 17,3% и 12,9%). Эффективное восстановление функции печени подтверждалось снижением активности ферментов до значений нормы (относительно контрольной группы были ниже уровни АлАТ на 27,3%, АсАТ на 19,4%, по ЩФ на 30,2%). Оптимизация содержания общего билирубина зарегистрирована только у собак опытной группы (разница составила 44,2% и она была достоверной). К концу эксперимента ультразвуковая картина печени опытных собак соответствовала практически здоровым животным. Месячный курс терапии с гепавитолом при гепатите у собак ведет к нормализации клинических показателей и морфо-биохимических факторов крови у 100% животных, в группе сравнения этот эффект был зарегистрирован у 5-ти собак (71,4%).
7. Гепавитол обладает гепатопротекторными свойствами и является эффективным терапевтическим средством при хронической патологии печени у собак (гепатоз), что проявляется улучшением клинического статуса, оптимизацией гематологических и биохимических показателей крови, при улучшении протеинсинтетической, пигментообразовательной и детоксикацоинной функций печени, а также снижении цитолитического синдрома. Репаративный эффект препарата проявляется повышением уровня общего белка на 21,8%, стабилизацией его фракционного состава, повышением содержания мочевины до 4,5±0,3 мМ/л, снижением уровня билирубина и ферментов печени (у животных контрольной группы активность аминотрансфераз находилась на более высоком уровне, чем у собак опытной группы, достоверная разница составила 20,9% (АлАТ) и 26,2% (АсАТ). Применение гепавитола обеспечивало более высокую терапевтическую эффективность, что подтверждалось улучшением клинического статуса собак, а также положительной динамикой лабораторных показателей, что вело к снижению продолжительности болезни в 1,5-1,7 раза.
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Для практического животноводства и ветеринарии предлагается новый препарат гепавитол, обладающий гепатопротекторным действием. Входящий в его состав комплекс биологически активных веществ улучшает функциональное состояние печени и её детоксикационную функцию, способствует сохранению и восстановлению структуры гепатоцитов.
Гепавитол рекомендуется использовать как самостоятельно, так и в комплексе терапевтических мероприятий при заболеваниях печени животных 2 раза в день в течение 3 – 5 недель с общей суточной дозой 0,5 мл на кг массы тела. Использование препарата регламентируется временной инструкцией по применению.
Результаты исследований могут быть использованы при составлении научной и информационной литературы, в учебном процессе профильных учебных заведений.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Кузьминова, Е.В. Опыт применения каротиноидных препаратов при токсическом поражении печени /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова //Материалы второй межд. научн.-практ. конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии».- Екатеринбург, 2011. – С. 159-160.
- Кузьминова, Е.В. Практические аспекты применения антиоксидантов при токсическом поражении печени /Е.В. Кузьминова, Т.А. Шах-Меликьян, Е.А. Старикова //Материалы межд. научн.-практ. конференции, посв. 65-летию Краснодарского НИВИ «Актуальные проблемы современной ветеринарии».- Краснодар, 2011 – Ч.I. – С. 182-184.
- Кузьминова, Е.В. Влияние препарата бета-каротина на регенеративные процессы при заживлении ран. /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова //Материалы межд. научн.-практ. конференции, посв. 65-летию Краснодарского НИВИ «Актуальные проблемы современной ветеринарии».- Краснодар, 2011 – Ч.I. – С. 180-182.
- Старикова, Е.А. Оценка острой токсичности препарата гепавитол /Е.А. Старикова, Е.В.Кузьминова //Материалы межд. научн.-практ. конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы».- п. Персиановский, 2013 – Том 3 – С. 234-236.
- Старикова, Е.А. Фармакологические свойства препарата гепавитол /Е.А. Старикова, Е.В. Кузьминова //Материалы межд. научн.-практ. конференции «Инновационные пути развития АПК: проблемы и перспективы».- п. Персиановский, 2013 – Том 3 – С. 236-248.
- Кузьминова, Е.В. Диагностическое значение биохимических показателей при гепатопатологиях /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова, Т.В. Михалева //Ветеринария Кубани. - 2013. - №5 - С. 11-13.
- Кузьминова, Е.В. Применение биологически активных веществ для нормализации обменных процессов у животных /Е.В.Кузьминова, М.П. Семененко, Е.А. Старикова, Е.В. Тяпкина //Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2013. - № 11 – С. 98-103.
