Фармакологическое обоснование применения диоксинора орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят
На правах рукописи
БОРИСЕНКО СТАНИСЛАВ ВИТАЛЬЕВИЧ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
ДИОКСИНОРА ОРАЛЬНОГО ПРИ КОЛИБАКТЕРИОЗЕ
И САЛЬМОНЕЛЛЕЗЕ ПОРОСЯТ
06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией
06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Воронеж - 2013
Работа выполнена в отделе фармакологии и лаборатории диагностического мониторинга ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии.
| Научные руководители: | доктор биологических наук Востроилова Галина Анатольевна доктор ветеринарных наук Бригадиров Юрий Николаевич |
| Официальные оппоненты: | Паршин Павел Андреевич доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Воронежский аграрный университет им. императора Петра I», заведующий кафедрой ветеринарно-санитарной экспертизы |
| Сашнина Лариса Юрьевна кандидат ветеринарных наук, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии, ведущий научный сотрудник отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии | |
| Ведущая организация: | ФГОУ «Курская государственная сельскохозяйственная академия им. профессора И.И. Иванова» |
Защита состоится «20»декабря 2013 г. в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИВИПФиТ РАСХН) по адресу: 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии
Автореферат размещен на официальном сайте ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии - http://www.nivipat.ru и официальном сайте ВАК РФ – http://vak2.ed.gov.ru
Автореферат разослан «19» ноября 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук, доцент Т.И. Ермакова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Желудочно-кишечные болезни свиней являются одной из сложных проблем, стоящих перед ветеринарной наукой и практикой. Они носят массовый характер и сопровождаются высокой летальностью животных. В большинстве случаев желудочно-кишечные заболевания имеют сложную этиологическую структуру, проявляются в форме тяжелых патологических процессов (Э.П. Карева, А.Г. Ирский, Н.А. Солдатенко и др., 2003; Х.З. Гаффаров, А.В. Иванов, Е.А. Непоклонов и др., 2005).Они широко распространены во всех странах мира с развитым свиноводством, занимают ведущее место в патологии свиней и наносят огромный экономический ущерб (А.Г. Шахов 2003; З. Пейсак 2008). Данная патология занимает большой удельный вес среди заболеваний свиней и достигает 30-36% в некоторых европейских странах и до 48% в РФ (А.П. Еремин, С.П. Еремин, 2006; А.Г. Шахов, Л.Ю. Сашнина, Д.В. Федосов и др., 2010;).
Значительную часть среди желудочно-кишечных болезней свиней инфекционной природы занимают колибактериоз и сальмонеллез (Э.-Г. Гельвиг, 2003; А.Г. Шахов, Ю.Н. Бригадиров, Л.Ю. Сашнина и др., 2008).
Меры борьбы с колибактериозом и сальмонеллезом поросят должны быть комплексные и включать проведение всех технологических и ветеринарно-санитарных мероприятий, применение средств специфической профилактики с использованием эффективных отечественных и зарубежных вакцин, а также современных химиопрепаратов, обладающих широким спектром антимикробного действия в отношении энтеробактерий. На ветеринарном рынке предлагается и широко используется в производстве огромное количество различных антибактериальных препаратов. Однако, в связи с массовым бесконтрольным, не всегда обоснованным применением различных антибиотиков формируется множественная лекарственная устойчивость у патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, циркулирующих среди свинопоголовья (Л.И. Ефанова, В.В Давыдова, О.А. Манжурина и др., 2010). Поэтому при применении антибиотиков необходимо учитывать их чувствительность к выделенным патогенам, а также использовать антибактериальные препараты с различным механизмом действия на микробную клетку с учетом их фармакологической совместимости (Э.П. Карева, А.Г. Ирский, Н.А. Солдатенко и др., 2003). Таким комплексным препаратом является диоксинор оральный, содержащий в своем составе норфлоксацин и диоксидин.
Поэтому актуальность проведения научно-исследовательских работ, связанных с изучением вопросов эпизоотологии и поиском новых антимикробных препаратов при колибактериозе и сальмонеллезе поросят с целью повышения эффективности ветеринарных мероприятий, несомненна.
Цель и задачи исследований. Основной целью данной работы является изучение этиологии желудочно-кишечных болезней свиней в крупных свиноводческих хозяйствах и разработка комплексного антимикробного препарата диоксинора орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Изучить эпизоотическую ситуацию и этиологическую структуру желудочно-кишечных болезней поросят в ряде специализированных свиноводческих хозяйств Воронежской, Липецкой, Ростовской и Курской областей.
2. Изучить влияние диоксинора орального на течение эшерихиозной и сальмонеллезной инфекции белых мышей.
3. Изучить субхроническую токсичность диоксинора орального на клинически здоровых поросятах.
4. Отработать оптимальную дозу препарата при лечении поросят, больных колибактериозом и сальмонеллезом.
5. Определить фармакокинетические параметры диоксинора орального.
6. Установить сроки выведения остаточных количеств диоксинора орального из организма поросят.
7. Изучить лечебную эффективность диоксинора орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят и определить экономическую эффективность его применения.
Научная новизна. Впервые изучена эпизоотическая ситуация и этиологическая структура желудочно-кишечных болезней поросят в специализированных свиноводческих хозяйствах Воронежской, Липецкой, Ростовской и Курской областей, укомплектованных животными со статусом свободных от возбудителей инфекционных болезней (СВИБ) и хозяйствах, занимающихся разведением конвенциональных свиней. В опытах in vivo установлено влияние диоксинора орального на течение эшерихиозной и сальмонеллезной инфекций белых мышей. Изучена субхроническая токсичность препарата на клинически здоровых поросятах и его фармакокинетические параметры. Определены сроки выведения диоксинора орального из организма поросят. В производственных опытах выявлена высокая терапевтическая и экономическая эффективность диоксинора орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят.
Практическая значимость. Результаты проведенных исследований расширяют и углубляют научное представление об эпизоотологии и этиологии желудочно-кишечных болезней свиней в условиях современного ведения производства. Для терапии поросят, больных сальмонеллезом и колибактериозом, разработан новый комплексный препарат диоксинор оральный, обладающий выраженным антимикробным действием в отношении их возбудителей.
Результаты исследований вошли в нормативную документацию на препарат диоксинор оральный, зарегистрированный в Российской Федерации Россельхознадзором (ПВР-2-3.0/02563), и утвержденную инструкцию по его применению.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследования представлены, доложены и одобрены на: годовых отчетах по НИР Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии (Воронеж, 2011-2013); 3-ем съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации» (Санкт-Петребург, 2011), IV-ой Международной научно-практической конференции, преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов «Инновационные процессы в АПК» (Москва, РУДН, 2012), научной и учебно-методической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов факультета ветеринарной медицины и технологии животноводства «Актуальные вопросы ветеринарной медицины и технологии животноводства», посвященной 100-летию Воронежского ГАУ им. императора Петра I (Воронеж, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Эпизоотическая ситуация и этиологическая структура желудочно-кишечных болезней поросят в современных свиноводческих хозяйствах.
2. Фармако-токсикологические свойства диоксинора орального.
3. Фармакокинетические параметры и сроки выведения остаточных количеств диоксинора орального из организма поросят.
4. Лечебная эффективность комплексного препарата диоксинор оральный при колибактериозе и сальмонеллезе поросят.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 185 источников, из них 62 зарубежных автора, приложений. Работа содержит 15 таблиц и 5 рисунков.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена в отделе фармакологии и лаборатории диагностического мониторинга ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии в период с 2010-2013 гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданию 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. рег. 15070.3666026906.06.8.001.2), программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации Россельхозакадемии на 2008-2013 гг.
Для оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах использовали данные отчетов ветеринарных служб и результаты собственных исследований, которые были проведены в шести крупных специализированных свиноводческих хозяйствах Воронежской (ООО «Инвестагропромкомплекс» спецхоз «Октябрь»), Липецкой (ООО «Племенное»), Ростовской (ООО «Русская свинина, Миллерово»), Тамбовской (ООО «Сатинское») и Курской (ООО «Бекон», ОАО «Агорфирма Любимовская») областей, стационарно неблагополучных по желудочно-кишечным болезням поросят.
При проведении клинического обследования животных учитывали их внешний вид, состояние кожных покровов, подвижность, потребление корма, акты дефекации, консистенцию и цвет фекалий в соответствии с принятыми в клинической диагностике методами.
Этиологическую структуру желудочно-кишечных болезней поросят изучали на основании эпизоотологического обследования хозяйств, результатов бактериологических и молекулярно-генетических исследований патологического материала (кровь из сердца, печень с желчным пузырем, почки, селезенка, трубчатая кость, тонкий отдел кишечника с содержимым) от павших и убитых с диагностической целью больных животных.
Микробиологические исследования патологического материала и фекалий изучали общепринятым в бактериологии методом. Посевы патологического материала проводили на мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среду Эндо, которые инкубировали при температуре 370С в течение 24 часов, после чего учитывали характер роста микроорганизмов. У выделенных чистых культур изучали тинкториальные, морфологические и культурально-биохимические свойства. Чувствительность выделенных культур к антибиотикам определяли методом индикаторных бумажных дисков. Оценку результатов проводили путем измерения величины зоны задержки роста культур. Патогенность выделенных микроорганизмов определяли с помощью постановки биопробы на белых мышах. Видовую принадлежность бактерий устанавливали с помощью определителей Bergey’s (1997) и М.А. Сидорова с соавт.(1995).
Серологическую типизацию эшерихий и сальмонелл проводили в реакции агглютинации с О- и Н- агглютинирующими сальмонеллезными сыворотками и О- коли сыворотками согласно «наставлению по применению сывороток сальмонеллезных О- комплексных и О- и Н- агглютинирующих для идентификации сальмонелл в реакции агглютинации» (1990) и «наставлению по применению сывороток агглютинирующих эшерихиозных к адгезивным антигенам К88, К99, 987Р, F41 и А20 (1997).
Молекулярно-генетические исследования проводили методом ПЦР с применением соответствующих утвержденных тест-систем, амплификацию ДНК в программируемом термостате. Для регистрации продуктов ПЦР использовали метод электрофоретического разделения продуктов амплификации в агарозном геле.
В опытах in vivo испытаны 3 композиции препарата. Определение их эффективности проводили в модельных опытах при экспериментальном заражении белых мышей суточными культурами Salmonella cholerae suis, E. coli.
Эксперименты проведены на половозрелых конвенциональных нелинейных разнополых белых мышах с массой тела 20-22 г, разводимых в виварии Всероссийского НИВИ патологии, фармакологии и терапии. Животные содержались при 20-22 0С и влажности 40-60%. Содержание, кормление и манипуляции над ними проводили в соответствии с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в эксперименте (Страсбург, 1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ №267 от 2003 года).
Группы формировали по принципу аналогов по 15 животных с учетом массы тела, развития и клинического состояния. Животные контрольных групп лечению не подвергались. За подопытными животными вели клиническое наблюдение в течение 10 дней, учитывали заболеваемость, гибель, сроки выздоровления. Специфичность гибели определяли бактериологическим методом путем выделения исходных культур микроорганизмов.
Заражение животных проводили внутрибрюшинно смывом суточных агаровых культур эшерихий и сальмонелл. Разведения культур делали на стерильном физиологическом растворе. Концентрацию микробных клеток определяли по стандарту мутности. В предварительных опытах была определена DLM микроорганизмов, которая составила для Salmonella cholerae suis - 2 млн.м.к., Escherichia coli – 4,0 млн. м.к.
С лечебной целью животным опытных групп через 6 часов после заражения вводили диоксинор оральный в дозе 0,075 мл/кг один раз в сутки в течение 5 дней. С профилактической целью препарат вводили однократно одновременно с заражением в дозе 0,075 мл/кг.
О терапевтической и профилактической эффективности препарата судили по количеству выживших мышей после окончания лечения и суммарной продолжительности жизни животных в каждой группе через 10 дней после инфицирования.
Изучение антимикробной активности препарата диоксинор оральный проводили методом серийных разведений (Б.И. Антонов с соавт., 1986, М.А. Сидоров с соавт., 1995). Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) изучаемых препаратов определяли методом серийных разведений в мясо-пептонном бульоне (МПБ); минимальную бактерицидную концентрацию (МБцК) – путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды (МПА) не содержащие препарат.
Изучение безвредности (переносимости) препарата диоксинор оральный проведено на 16 клинически здоровых поросятах, 10-дневного возраста. Животные были разделены на 4 группы (n=4). Поросятам первой группы препарат не вводили (контроль), второй – применяли диоксинор оральный в дозе 0,05 мл/кг, третьей – 0,25 мл/кг (пятикратная терапевтическая доза), четвертой – 0,5 мл/кг (десятикратная терапевтическая доза) однократно. Токсическое действие препарата при его пероральном введении оценивали по клиническому состоянию животных, морфологическим и биохимическим показателям крови. Кровь для исследования брали у поросят из ушной вены утром до кормления через 7 суток после однократного введения диоксинора орального.
Изучение субхронической токсичности препарата диоксинора орального проведено на 18 поросятах месячного возраста массой тела 12-15 кг, которые были разделены на 3 группы. Токсическое действие препарата при его пероральном применении оценивали по клиническому состоянию, морфологическим и биохимическим показателям крови. Кровь для исследования брали у поросят из хвостовой вены в утреннее время до кормления.
Диоксинор оральный применяли поросятам в дозах 0,5 (терапевтическая доза) и 2,5 мл/10 кг массы тела (5-ти кратная терапевтическая доза) в течение 14 дней с интервалом между введениями 24 часа. Животным контрольной группы препарат не применяли.
Отработка оптимальной дозы препарата при колибактериозе и сальмонеллезе поросят проведена в условиях ОАО «Сатинское» Сампурского района Тамбовской области на 80 поросятах 1-1,5 месячного возраста. Животные по принципу аналогов были разделены на четыре группы (n=20).
Диоксинор оральный раствор применяли ежедневно с интервалом 24 часа в течение 3-5 дней в дозах: 1-я опытная группа - 0,25 мл/10 кг массы тела, 2-я - 0,5 мл/10 кг и 3-я - 0,75 мл/10 кг массы тела. Поросятам четвертой группы применяли Энрофлон 10% согласно наставлению по его применению (базовый вариант).
За подопытными животными в течение 10 дней ежедневно вели клиническое наблюдение, учитывали количество выздоровевших животных, падеж, общее состояние.
При изучении фармакокинетики диоксинора орального в опыт было подобрано 10 поросят массой тела 9-10 кг. Животным опытной группы (n=9) вводили диоксинор оральный однократно в дозе 0,5 мл/10 кг. Контрольному поросенку препарат не применяли. Через 1, 3, 6, 9, 12, 24 часа после введения препарата кровь для исследования брали у поросят из сосудов хвоста и определяли содержание норфлоксацина и диоксидина.
В опыт по изучению сроков выведения остаточных количеств препарата из организма животных было подобрано 14 клинически здоровых поросят месячного возраста, из которых два были контрольными, им препарат не применяли. Поросятам опытной группы в течение 5-ти дней один раз в сутки вводили диоксинор оральный в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела.
Для проведения исследований через 1, 3, 5 и 7 суток после последнего введения препарата убивали по 3 опытных животных и на 3 и 7 сутки по одному контрольному поросенку. Остаточные количества диоксинора орального определяли по уровню диоксидина и норфлоксацина в органах, тканях и биологических жидкостях поросят.
Определение норфлоксацина и диоксидина проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Предел количественного определения норфлоксацина составлял в экстрактах крови, моче 0,025 мкг/мл, в тканях – 0,035мкг/г; диоксидина - 0,1 мкг/мл и 0,3 мкг/г соответственно.
С целью характеристики общего состояния животных при проведении модельных и клинических исследований в крови определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, лейкоформулу – общепринятыми методами. Фракции белка - электрофорезом в агарозном геле, концентрацию общего белка, липидов и билирубина наборами фирмы «Витал» (Санкт-Петербург), концентрацию мочевины, фосфора, холестерина, глюкозы, креатинина, кальция, активность аспартат– и аланинаминотрасфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы и -глутамилтрансферазы – на биохимическом анализаторе «Hitachi-902».
Клинические испытания диоксинора-орального при колибактериозе и сальмонеллезе проведены в ООО «Племенное» Воловского района Липецкой области и ООО «Русская свинина Миллерово» Миллеровского района Ростовской области на поросятах 5-7 и 25-30-дневного возраста.
Расчет экономической эффективности применения диоксинора орального при желудочно-кишечных болезнях поросят проводили по методике Ю.Е. Шатохина с соавт. (1997).
Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью компьютера с процессором Intel Core 2 Quad, пакета программного обеспечения Microsoft Office 2007 и Statistica 7.0.
За помощь при проведении исследований выражаем искреннюю признательность сотрудникам отдела фармакологии и испытательного центра ГНУ ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Эпизоотическая ситуация и этиологическая структура желудочно-кишечных болезней поросят в специализированных свиноводческих
хозяйствах
В крупных специализированных свиноводческих хозяйствах, занимающихся выращиванием обычных (конвенциональных свиней) - ООО «Инвестагропромкомплекс» спецхоз «Октябрь» Бутурлиновского р-на Воронежской области и ООО «Племенное» Воловского р-на Липецкой области и хозяйств, укомплектованных животными со статусом свободных от возбудителей инфекционных болезней (СВИБ) - ЗАО «А/ф Любимовская» Кореневского р-на, ООО «Бекон» Мантуровского р-на Курской обдасти и ООО «Русская свинина Миллерово» Миллеровского р-на Ростовской области была изучена степень распространения и этиологическая структура желудочно-кишечных заболеваний свиней.
При анализе эпизоотической ситуации за 2010-2011гг. установлено, что в общей заболеваемости животных желудочно-кишечная патология составила:
- в ООО «Инвестагропромкомплекс» и ООО «Племенное» (конвенциональные свиньи) у поросят-сосунов 90-96% и 85-90%, а в хозяйствах, укомплектованных животными со статусом СВИБ: ЗАО «А/ф Любимовская» - 20-25%, ООО «Бекон» - 40-50%, ООО «Русская свинина Миллерово» - 40-45%;
- у поросят на доращивании - 45-50% и 40-45%; 25-30%, 35-37% и 30-35%;
- у свиней группы откорма - 40-45% и 70-75%; 10-12%, 35-40% и 30-35% соответственно.
Падеж поросят-сосунов от желудочно-кишечных болезней из общего числа павших животных в указанные годы составил:
- у поросят-сосунов в ООО «Инвестагропромкомплекс» 75-80% и в ООО «Племенное» 80-85% (конвенциональные свиньи), в ЗАО «А/ф Любимовская» 15-20%, в ООО «Бекон» 40-45%,, в ООО «Русская свинина Миллерово» 33-35% (со статусом СВИБ);
- у поросят на доращивании - 35-40% и 40-45%; 30-33%, 25-30% и 30-35%;
- у свиней группы откорма - 45-55% и 80-90%; 5-15%, 35-40% и 30-32%.
Из представленных данных видно, что желудочно-кишечная патология имеет широкое распространение в структуре заболеваемости и падежа поросят во всех хозяйствах. В хозяйствах, укомплектованных животными со статусом СВИБ, заболеваемость у поросят-сосунов составила – 33,3-40,0%, у поросят на доращивании – 30-34%, у животных на откорме – 25-29%; а в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней – 87,5-93,0%; 42,5-47,5% и 55-60%. Падеж соответственно - у поросят-сосунов – 29,3-33,3%, поросят на доращивании – 28,3-32,7% и откорме – 23,3-29% и 77,5-82,5%; 37,5-42,5% и 62,5-72,5%.
Бактериологическими и молекулярно-генетическими исследованиями у больных и павших животных в указанные годы установлен следующий спектр возбудителей.
В хозяйствах укомплектованных животными со статусом СВИБ:
В ЗАО «Агрофирма Любимовская» у поросят-сосунов (n=30) – в 26,7% случаев выделены E.coli серологических вариантов О147, О142, О101, в 3,5% - ротавирус; у поросят группы доращивания (n=22) – в 40% случаев E.coli серологических вариантов О139,О26, в 10% - Cl. perfringens тип А.
В ООО «Бекон» у поросят-сосунов (n=20) – в 40% случаев выделены E.coli серологических вариантов О101, О149, О26, в 4,5% - ротавирус; у поросят группы доращивания (n=16) – в 55,6% E. coli с адгезивными антигенами - К88 и К99, в 10% - Cl. perfringens тип А; у свиней группы откорма (n=9) – в 5% - B. hyodуsenteriae.
В ООО «Русская свинина, Миллерово» у поросят-сосунов (n=38) – в 71,4% случаев выделены E.coli серологических вариантов О101, О149, в 33,3% - Cl. рerfringens тип А; в 9,5% - P. vulgaris; в 3,1% - ротавирус. У поросят группы доращивания (n=27) – в 73,3% случаев E.coli серологических вариантов О139 (К88), О33, О138, в 20% - P. vulgaris и у свиней группы откорма (n=15) – в 6,7% - S. choleraе suis; в 33,3% - Y. enterocolytica.
В хозяйствах, занимающихся выращиванием обычных (конвенциональных свиней):
В ООО «Племенное» - у поросят-сосунов (n=19) - в 60% случаев выделены E. coli серологических вариантов О26, О101, О139, О141, в 20% - P. vulgaris и у 60% - ротавирус, у животных на доращивании (n=12) - в 13,3% - S. typhimurium, в 20% случаев ротавирус.
В ООО «Инвестагропромкомплекс» у поросят-сосунов (n=33) – в 77,8% случаев E. coli серологических вариантов О9, О137, О18, О115, О101, в 4,8% - S. choleraе suis; в 9,5% - S. typhimurium и в 65,8% случаев ротавирус. У поросят группы доращивания (n=25) – в 100% случаев E.coli (серологических вариантов О139 (К88) и у свиней группы откорма (n=18) – в 33,3% - S. typhimurium, в 33,3% - S. choleraе suis.
Из бактериальных патогенов наиболее часто выделяли возбудители колибактериоза и сальмонеллеза (рис. 1).
На рисунке 1 видно, что эшерихии выделены от животных хозяйств обоих типов, однако в спецхозах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней, они обнаружены у поросят-сосунов на 22,9% чаще, чем от свиней в хозяйствах, укомплектованных животными со статусом СВИБ (68,9% и 46,03% соответственно), от поросят на доращивании - на 23,7% (80% и 56,3%). Сальмонеллы выделены от животных разных технологических групп в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней (у поросят-сосунов - 4,8%, на доращивании - 4,4% и откорме - 22,2%), а в хозяйствах со статусом СВИБ они изолированы только от животных группы откорма - в 3,35% случаев.
| Хозяйства, укомплектованные животными со статусом СВИБ | Хозяйства, занимающиеся разведением обычных (конвенциональных) свиней |
 |  |
Рис. 1 Частота выделения эшерихий и сальмонелл от свиней
Кроме того в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней, чаще диагностировали смешанные инфекции, вызываемые несколькими бактериальными патогенами или бактериями и вирусами. Смешанные бактериальные инфекции у поросят-сосунов регистрировали чаще на 10,5%, на доращивании – на 22,6% и откорме - на 49,9%. Наиболее часто они были представлены следующими микроорганизмами: E. coli+E. faecalis, E. coli+E. faecium, E.coli+Cl. perfringens тип А, E. coli+ S. typhimurium + S. choleraе suis + ротавирус.
Таким образом, желудочно-кишечная патология занимает большой удельный вес в структуре заболеваемости и падежа свиней. Однако в хозяйствах, укомплектованных животными со статусом СВИБ, заболеваемость поросят-сосунов была меньше – на 53-54,2%, на доращивании – на 12,5-13,5% и откорме – на 30-31%. Падеж поросят-сосунов был также меньше – на 48,2-49,2%, на доращивании – на 9,2-9,8% и откорме – на 39,2-43,5%. В хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней, эшерихии у поросят-сосунов выделяются – на 22,9%, у животных на доращивании – на 23,7% чаще, чем в хозяйствах со статусом СВИБ. Сальмонеллы выделены от животных всех технологических групп в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней, а в хозяйствах со статусом СВИБ только у поросят группы откорма, при этом частота их обнаружения была на 18,5% меньше. Смешанные бактериальные инфекции у поросят-сосунов в хозяйствах, занимающихся разведением конвенциональных свиней на 10,5%, на доращивании - на 22,6% и откорме - на 49,9% встречаются также чаще.
3.2. Влияние диоксинора орального на течение эшерихиозной и
сальмонеллезной инфекции белых мышей
В опытах in vivo были испытаны 3 композиции препарата. При экспериментальном заражении мышей культурой Salmonella cholerae suis лечение композицией 1 в дозе 0,075 мл/кг обеспечило сохранность 80,0% животных при 100,0% гибели в контроле. Эффективность композиций 2 и 3 была ниже на 6,7 и 20,0% соответственно.
При экспериментальном заражении мышей культурой E. coli эффективность лечения животных композициями 1, 2 и 3 в дозе 0,075 мл/кг была выше соответственно на 6,7, 13,4 и 20,0% по сравнению с таковой при сальмонеллезной инфекции.
Отмечено увеличение суммарной продолжительности жизни белых мышей в зависимости от микроорганизма-возбудителя и применяемой композиции. Наиболее высокой суммарная продолжительность их жизни при обеих инфекциях была при применении композиции 1 (132-139 дней), а при назначении композиции 3 этот показатель в среднем на 14,5 дня был ниже.
О профилактической эффективности препарата судили по количеству выживших мышей после окончания опыта и суммарной продолжительности жизни животных в каждой группе через 10 дней после инфицирования.
При экспериментальном заражении мышей культурами Salmonella cholerae suis и E. coli однократная инъекция композиций 1 и 2 в дозе 0,075 мл/кг обеспечила сохранность 60,0-66,7% животных при 100,0% гибели в контрольной группе.
Наименее выраженным профилактическим эффектом (43,3%) при обеих инфекциях обладала композиция 3. При инфекции, вызванной Salmonella cholerae suis, суммарная продолжительность жизни белых мышей составила 117-116 дней при применении композиций 1 и 2, при эшерихиозной инфекции соответственно 124 дня (композицияя 1) и 123 дня (композиция 2). Суммарная продолжительность жизни мышей при применении композиции 3 была ниже и составила в среднем 101 день. Таким образом, и по данному показателю наиболее высокие результаты отмечены у композиции 1.
3.3. Антимикробная активность диоксинора орального
При изучении антимикробной активности диоксинора орального было установлено, что препарат обладает широким спектром антимикробного действия в отношении всех испытанных культур микроорганизмов.
Минимальная бактериостатическая концентрация препарата в отношении как музейных, так и полевых штаммов эшерихий составила – 0,19-0,78 мкг/мл. Минимальная бактериостатическая концентрация диоксинора орального в отношении музейных штаммов сальмонелл - 0,39 мкг/мл, полевых – 0,39-0,78 мкг/мл. Бактерицидная концентрация препарата превышала бактериостатическую в отношении изученных культур в 2 раза.
3.4. Изучении безвредности (переносимости) диоксинора орального
При изучении безвредности (переносимости) диоксинора орального на поросятах, было установлено, что препарат в терапевтической дозе (0,05 мл/кг массы тела), 5-ти (0,25 мл/кг) и 10-ти кратно (0,5 мл/кг) ее превышающих, не влияет отрицательно на клинический статус, биохимические и морфологические показатели крови поросят. Таким образом, препарат хорошо переносится животными как в терапевтической дозе, так в 5 и 10 раз превышающих ее.
3.5. Изучение субхронической токсичности диоксинора орального на клинически здоровых поросятах
Диоксинор оральный применяли поросятам в дозах 0,5 (терапевтическая доза) и 2,5 мл/10 кг массы тела (5-ти кратная терапевтическая доза) в течение 14 дней с интервалом между введениями 24 часа. Животным контрольной группы препарат не применяли.
Диоксинор оральный в изученных дозах не оказывал существенного влияния на клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит поросят. показатели клинического состояния поросят всех групп в течение опыта находились в пределах нормы. При многократном применении диоксинора орального в дозах 0,5 и 2,5 мл/10 кг морфологические, биохимические и иммунологические показатели крови также существенно не отличались от таковых у поросят контрольной группы (табл. 1 и 2).
Таблица 1
Гематологические показатели крови клинически здоровых поросят
при применении диоксинора орального
| Показатели | Контроль | Дозы диоксинора орального, мл/10 кг | |
| 0,5 | 2,5 | ||
| Эритроциты, 1012/л | 5,67±0,24 | 5,98±0,11 | 5,74±0,14 |
| Лейкоциты, 109/л | 12,7±0,42 | 12,2±0,33 | 12,9±0,40 |
| Гемоглобин, г/л | 101,6±4,21 | 108,1±3,56 | 106,0±6,08 |
| СОЭ, мм/час | 3,5±0,12 | 3,5±0,17 | 3,3±0,10 |
| Нейтрофилы, % Палочкоядерные | 4,0±0,27 | 3,7±0,10 | 3,6±0,42 |
| Сегментоядерные | 31,4±2,15 | 33,0±2,66 | 30,3±3,11 |
| Эозинофилы, % | 3,56±0,29 | 3,71±0,21 | 3,60±0,35 |
| Базофилы, % | - | - | - |
| Моноциты, % | 5,40±0,41 | 5,30±0,56 | 5,45±0,40 |
| Лимфоциты, % | 55,6±3,50 | 54,3±6,78 | 57,1±5,32 |
Таблица 2
Биохимические и иммунологические показатели крови клинически здоровых поросят при применении диоксинора орального
| Показатели | Контроль | Дозы диоксинора орального, мл/10 кг | ||
| 0,5 | 2,5 | |||
| Общий белок, г/л | 68,5±0,78 | 70,5±2,13 | 67,7±1,56 | |
| Альбумины, г/л | 27,9±1,15 | 28,7±2,07 | 27,4±3,02 | |
| Глобулины, г/л | - | 13,2±1,18 | 13,6±2,56 | 13,2±1,11 |
| - | 11,9±0,40 | 12,2±1,28 | 12,0±0,98 | |
| - | 15,5±0,73 | 15,9±1,67 | 15,1±1,56 | |
| Мочевина, мМ/л | 4,50±0,35 | 4,40±0,56 | 4,51±0,40 | |
| Глюкоза, мМ/л | 6,81±0,48 | 6,78±0,50 | 6,59±0,20 | |
| Общие липиды, г/л | 2,55±0,06 | 2,60±0,10 | 2,57±0,11 | |
| Холестерин, мМ/л | 2,43±0,12 | 2,38±0,11 | 2,40±0,16 | |
| АсАТ, Ед/л | 23,8±0,60 | 22,6±2,17 | 20,8±2,00 | |
| АлАТ, Ед /л | 27,9±1,15 | 29,3±2,06 | 26,5±2,10 | |
| Кальций, мМ/л | 3,19±0,03 | 3,15±0,21 | 3,20±0,15 | |
| Фосфор, мМ/л | 3,98±0,15 | 3,88±0,30 | 3,92±0,14 | |
| БАСК, % | 98,4±0,84 | 98,3±0,79 | 97,9±1,54 | |
| КАСК, % гемолиза | 13,2±1,32 | 12,9±2,11 | 13,0±1,10 | |
3.6. Отработка оптимальной дозы препарата при лечении поросят,
больных колибактериозом и сальмонеллезом
Проведенными исследованиями установлено, что терапевтический эффект после применения диоксинора орального при желудочно-кишечной патологии животных в дозах 0,5 мл/10 кг и 0,75 мл/10 кг массы тела составил - 95%. При назначении препарата в дозе 0,25 мл/10кг терапевтический эффект составил - 90%, в базовом варианте - 85%, при этом пало 2 поросенка.
При применении диоксинора орального в дозах 0,25, 0,5 и 0,75 мл/10 кг массы тела сроки выздоровления поросят составили 4±0,5, 3±0,4 и 3±0,5 дня соответственно, в базовом варианте - на 1-2 дня больше. Среднесуточный прирост массы тела поросят опытных групп превосходил базовый вариант соответственно на 4,2, 15,3 и 16,9%.
Таким образом, применение поросятам диоксинора орального при желудочно-кишечной патологии бактериальной этиологии в дозах 0,5 и 0,75 мл/10 кг массы тела обеспечивает высокую терапевтическую эффективность (95%). Однако лечение животных препаратом в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела по сравнению с дозой 0,75 мл/10 кг является более экономичной при достижении одинакового терапевтического эффекта.
3.7. Фармакокинетические параметры диоксинора орального
Фармакокинетические исследования показали, что максимальное содержание диоксидина в крови наблюдается через 1 час, а норфлоксацина - через 3 часа (рис. 2 и 3).
Рис. 2. Содержание норфлоксацина в крови поросят
Как видно на рисунке 2 концентрация норфлоксацина, входящего в состав диоксинора орального, при однократном введении сохраняется в крови на протяжении 24 часов, на уровне, превышающем минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) для эшерихий в 3,5 раза, а сальмонелл – в 1,7 раза.
Второй антимикробный компонент препарата - диоксидин (рис. 3) также имеет высокую терапевтическую концентрацию в крови, сохраняющуюся на протяжении 24 часов на уровне, превышающем минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) для эшерихий в 4,2 раза, а сальмонелл – в 2,1 раза.
Рис. 3. Содержание диоксидина в крови поросят
Таким образом, учитывая синергизм двух компонентов диоксинора орального можно сказать, что терапевтическая эффективность препарата даже при однократном введении в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела превышает минимальную бактериостатическую концентрацию в течение суток как для эшерихий, так и сальмонелл.
3.8. Изучение сроков выведения остаточных количеств диоксинора орального из организма поросят
При изучении остаточных количеств диоксинора орального было установлено, что через сутки после последнего введения препарата остаточные количества диоксидина определяются во всех исследуемых органах и биологических жидкостях. На 3 сутки диоксидин выявляется в следовых количествах (ниже предела детектирования) в экстрактах крови, мочи, органов и тканей.
На 5 сутки после последнего введения препарата диоксидин отсутствует во всех органах, тканях и жидкостях организма поросят.
Исследования содержания норфлоксацина в крови, органах и тканях на 1, 3, 5 и 7 сутки после окончания применения диоксинора орального показали, что препарат интенсивно выводится из организма поросят в первые трое суток.
Через 7 суток норфлоксацин также не детектируется в исследуемых биологических жидкостях, органах и тканях.
В связи с тем, что не было возможности определить метаболиты норфлоксацина, с учетом литературных данных и результатов собственных исследований, убой животных на мясо можно проводить не ранее чем через 14 суток после последнего введения лекарственного средства.
3.9. Лечебная и экономическая эффективность диоксинора
орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят
Изучение терапевтической эффективности диоксинора орального при колибактериозе проведены в ООО «Племенное» на поросятах 5-7-дневного возраста с признаками диареи, угнетения, снижения аппетита.
Поросятам опытной группы (n=116) применяли ежедневно один раз в сутки индивидуально препарат диоксинор оральный в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела в течение 5 дней. Животных контрольной группы (n=109) лечили препаратом Спектам-паста (CEVA Sante Animal) согласно наставлению по применению. За подопытными животными в течение семи дней вели ежедневное клиническое наблюдение, учитывали общее состояние, падеж, сроки выздоровления. Результаты испытаний приведены в таблице 3.
Таблица 3
Сравнительная терапевтическая эффективность диоксинора орального при колибатериозе поросят
| Показатели | Группы животных | |
| Спектам – паста (базовый вариант) | Диоксинор оральный | |
| Количество поросят | 109 | 116 |
| Выздоровело, голов / % | 98 / 89,8 | 108 / 93,1 |
| Сроки выздоровления, дней | 6,6±0,4 | 3,7±0,5 |
| Пало, голов / % | 4 / 3,7 | 3 / 2,6 |
| Осталось больных, голов / % | 7 / 6,4 | 5 / 4,3 |
Проведенные испытания (табл. 3) показали, что диоксинор оральный обладает высокой терапевтической эффективностью (93,1%) при колибактериозе поросят-сосунов, превышая таковую в базовом варианте (89,8%) на 3,3%. При применении диоксинора орального срок выздоровления поросят был на 2,9 дня меньше, чем в группе сравнения.
Во втором опыте изучение лечебной эффективности диоксинора орального при колибактериозе и сальмонеллезе поросят проведено в ООО «Русская свинина, Миллерово» Ростовской области. Бактериологическими исследованиями патологического материала от вынужденно убитых с диагностической целью поросят (n=3) выделены: -гемолитические культуры Еscherichia соli серологических вариантов О138, О139 (К88), вызывающие отечную болезнь у поросят, и Salmonella cholerae suis.
Опыт проведен на поросятах 25-30 дневного возраста, разделенных на две группы с учетом общего состояния и тяжести заболевания и находящихся в одинаковых условиях кормления и содержания.
Животные первой группы (n= 1326) служили базовым вариантом, для их лечения применяли энрофлон 10% раствор для орального введения, производства ИП «ВИК- здоровье животных» по схеме 0,5 мл/10 кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней.
Поросятам опытной группы (n= 1117) применяли один раз в день диоксинор оральный в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела в течение 5 дней.
За подопытными животными в течение семи дней вели ежедневное клиническое наблюдение, учитывали общее состояние, падеж, сроки выздоровления. Результаты испытаний представлены в таблице 4.
Таблица 4
Сравнительная терапевтическая эффективность диоксинора орального при сальмонеллезе и колибатериозе поросят
| Показатели | Группы животных | |
| Базовый вариант (энрофлон 10%) | Диоксинор оральный | |
| Количество поросят | 1326 | 1117 |
| Выздоровело, голов / % | 1270 / 95,8 | 1086 / 97,2 |
| Пало, голов / % | 35 / 2,6 | 12 / 1,1 |
| Осталось больных, голов / % | 21 / 1,5 | 19 / 1,7 |
| Сроки выздоровления, дней | 6±0,5 | 5±0,5 |
Проведенные испытания (табл. 4) показали, что диоксинор оральный обладает высокой (97,2%) терапевтической эффективностью при колибактериозе (отечной болезни) и сальмонеллезе поросят. В базовом варианте лечебный эффект был несколько ниже и составил 95,8%. При лечении поросят диоксинором оральным пало 12 (1,1%) животных, а при назначении энрофлона 10% - 35 (2,6%) поросят. Выздоровление животных после применения диоксинора орального наступало на один день раньше.
Экономическую эффективность применения комплексного антибактериального препарата диоксинор оральный изучали в ООО «Племенное» Воловского района Липецкой области на 116 больных колибактериозом поросятах 5-7 дневного возраста. Препарат назначали в дозе 0,5 мл на 10 кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней.
Экономический эффект, полученный в результате лечебных мероприятий с применением диоксинора орального, составил 4 рубля на рубль затрат.
4. ВЫВОДЫ
1. В крупных специализированных свиноводческих хозяйствах, укомплектованных животными со статусом свободных от возбудителей инфекционных болезней (СВИБ), желудочно-кишечная патология поросят в период подсоса, на доращивании и откорме регистрируется клинически реже на 53-54,2%, 12,5-13,5%, 30-31% и морфологически на 48,2-49,2%, 9,2-9,8% и на 39,2-43,5% соответственно в сравнении с аналогичными показателями в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней.
2. Ведущими возбудителями желудочно-кишечных болезней свиней на комплексах обоих типов являются энтеропатогенные эшерихии и сальмонеллы, которые от животных из хозяйств, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) животных, выделяются чаще, в том числе эшерихии на 22,9%(поросята-сосуны) и 23,7% (животные на доращивании), сальмонеллы на 18,5% (животные на откорме). Последние в указанных хозяйствах выделяются и от поросят других технологических групп.
3. Смешанные инфекции, вызванные энтеропатогенными эшерихиями и сальмонеллами, диагностируются также чаще в хозяйствах, занимающихся разведением обычных (конвенциональных) свиней: у поросят-сосунов на 10,5%, животных на доращивании - на 22,6 и откорме - на 49,9%.
4. Композиция норфлоксацина с диоксидином в опытах in vivo обладает синергидным действием в отношении эшерихий и сальмонелл. Применение трех сочетаний норфлоксацина и диоксидина (9:1; 9,5:0,5 и 8,5:1,5) на белых мышах, экспериментально зараженных культурами Salmonella cholerae suis, обеспечивает терапевтическую эффективность 80%, 73,3% и 60%, а при инфицировании E. coli - 86,7%, 86,7% и 80% соответственно. Профилактическая эффективность при заражении белых мышей культурами Salmonella cholerae suis составила от 46,7 до 60%, а E.coli от 40 до 66,7% соответственно.
5. Минимальная бактериостатическая концентрация диоксинора орального в отношении как музейных, так и полевых штаммов эшерихий составляет – 0,19-0,78 мкг/мл. В отношении музейных штаммов сальмонелл - 0,39 мкг/мл, полевых – 0,39-0,78 мкг/мл. Бактерицидная концентрация препарата превышала бактериостатическую в 2 раза.
6. Диоксинор оральный как при однократном, так и при многократном применении в дозах 0,05 и 0,25 мл/кг не оказывает существенное влияние на клинический статус, скорость роста, поведение и аппетит поросят, морфологические, биохимические и иммунологические показатели крови.
7. Оптимальной терапевтической дозой диоксинора орального при желудочно-кишечной патологии, вызванной E.coli и Salmonella cholerae suis, является 0,5 мл/10 кг массы тела.
8. После однократного введения диоксинора орального поросятам в терапевтической дозе, норфлоксацин и диоксидин в максимальных концентрациях 4,28±0,20 и 0,96±0,05 обнаруживаются в крови через 3 и 1 часа. После курсового применения диоксидин и норфлоксацин в исследованных органах и тканях через 5 и 7 суток не обнаруживаются.
9. Диоксинор - оральный обладает высокой терапевтической эффективностью при колибактериозе поросят-сосунов (91,0-94,0%) и при смешанном течении колибактериоза и сальмонеллеза у животных на доращивании (94,0-98,0%).
10. Экономическая эффективность от применения диоксинора орального поросятам при колибактериозе составляет 4 рубля на один затраченный рубль.
5. Практические предложения
1. Для лечения поросят при колибактериозе и сальмонеллезе диоксинор оральный рекомендуется применять индивидуально или групповым методом в дозе 0,5 мл/10 кг массы тела в течение 5 дней.
2. Основные научные положения работы и ее практические результаты рекомендуется использовать в производственных условиях ветеринарными специалистами, а также в учебном процессе студентами, аспирантами и научными работниками ветеринарного профиля.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи, включенные в перечень научных изданий ВАК для опубликования
результатов исследований
1. Бригадиров, Ю.Н. Комплексная система мероприятий по профилактике и борьбе с респираторными и желудочно-кишечными болезнями свиней в современных условиях производства // Ю.Н. Бригадиров, О.В. Казимиров, С.В. Борисенко, М.Л. Бердников, Е.В. Михайлов, А.Н. Модин, Н.А. Борисенко, О.А. Манжурина, В.В. Давыдова // Ветеринарная патология. – 2011. - №4. – С. 40-45.
2. Казимиров, О.В. Лечебная эффективность новых комплексных антимикробных препаратов при желудочно-кишечных заболеваниях поросят бактериальной этиологии / О.В. Казимиров, Ю.Н. Бригадиров, М.Л. Бердников, С.В. Борисенко, Е.В. Михайлов, А.Н. Модин // Достижения науки и техники АПК. – 2012. - №1. – С. 33-34.
3. Борисенко, С.В. Изучение влияния диоксинора орального на качественный и количественный состав микрофлоры фекалий больных диареями поросят / С.В. Борисенко // Ветеринарный врач. – 2012. - №3. - С.12 -15.
Статьи, опубликованные в журналах, материалах и сборниках конференций
4. Бригадиров, Ю.Н. Диоксинор – оральный» новый комплексный препарат при желудочно-кишечной и респираторной патологии свиней / // Ю.Н. Бригадиров, Е.В. Михайлов, С.В. Борисенко, А.Н. Модин, О.В. Казимиров, Н.А. Борисенко // Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: Матер. 3-го съезда фармакологов и токсикологов России. - Санкт – Петербург, 2011. - С 77-79.
5. Борисенко, С.В. Экономическая эффективность применения Диоксинора орального при желудочно-кишечных заболеваниях поросят / С.В. Борисенко // Инновационные процессы в АПК: Сборник статей 4 международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов. – Москва, 2012. – С. 109 – 111.
6. Борисенко, С.В. Применение антимикробного препарата диоксинор оральный при сальмонеллезе и колибактериозе поросят / С.В. Борисенко, Н.А. Борисенко, Д.А. Саврасов //Актуальные вопросы ветеринарной медицины и технологии животноводства: Матер. научной и учебно-методической конференции профессорского-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов факультета ветеринарной медицины и технологии животноводства – Воронеж: ФГБОУ ВПО Воронежский ГАУ, 2012. – С. 40-43.
