Повышение эффективности изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей
На правах рукописи
СЛИЗОВСКАЯ НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА
ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
СЫВОРОТОК-РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ГРУПП КРОВИ
ЛОШАДЕЙ
06.02.01 – разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата сельскохозяйственных наук
Дивово, Рязанской области – 2009
Работа выполнена в Государственном научном учреждении
Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства
Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук,
доцент
Храброва Людмила Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Коровушкин Алексей Александрович
кандидат сельскохозяйственных наук,
Купцова Надежда Александровна
Ведущая организация: Московская академия ветеринарной медицины
и биотехнологии им. К.И.Скрябина
Защита состоится 17 ноября 2009 г. в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 006.018.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте коневодства (391105, РФ, Рязанская обл., Рыбновский район, п. Дивово, п/о Институт Коневодства)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института коневодства
Автореферат разослан «___»____________________2009 года
Ученый секретарь
диссертационного совета Готлиб М.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В настоящее время иммуногенетические методы находят широкое применение при идентификации и контроле происхождения животных, изучении генетической структуры популяций, при разработке методов и приемов генетического мониторинга, а также при изучении связи с продуктивностью, воспроизводительной способностью и устойчивостью животных к различным заболеваниям. В коневодстве типирование лошадей по эритроцитарным антигенам особенно актуально, так как позволяет наряду с генетической сертификацией проводить эффективную профилактику гемолитической болезни новорожденных жеребят.
В связи с этим важным направлением научных исследований является совершенствование методов получения моноспецифических сывороток–реагентов для типирования эритроцитарных антигенов лошадей, а также их использования для решения задач практической селекции.
В настоящее время производство моноспецифических сывороток-реагентов все еще остается трудоемким и не всегда эффективным процессом, так как иммунный ответ дают только 20-25% иммунизированных лошадей, а результативность иммунизаций зависит от большого ряда факторов (Дубровская Р.М., 1987; Шемарыкин Е.И., 1981; Потапова Д.В., 1989; Мемедейкин В.В., 1997).
Основными проблемами при проведении иммунизаций лошадей являются: рациональный подбор лошадей–доноров и реципиентов, прогнозирование иммунореактивности доноров, а также определение спектра антигенов полученной «сырой» сыворотки. Не менее важной производственной задачей, определяющей эффективность получения моноспецифических сывороток–реагентов, является разработка стратегического плана адсорбции полученных сывороток.
Недостаточная изученность этих вопросов свидетельствует о необходимости разработки эффективной методологии иммунизации лошадей и совершенствования методов использования моноспецифических сывороток-реагентов. Решение этих вопросов должно основываться на системном подходе и учитывать генетические особенности групп крови лошадей
Цель и задачи исследований. Целью проводимых исследований явилась разработка способов повышения эффективности изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей. В связи с этим было необходимо решить следующие задачи:
- Оптимизировать составление плана иммунизации донорам и реципиентов на основе генетического анализа групп сцепления эритроцитарных антигенов.
- Изучить влияние иммунизаций на содержание общего количества белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей - доноров.
- Проанализировать связь D-системы групп крови с заболеваемостью жеребят неонатальным изоэритролизисом.
- Отработать технологию использования планшетного микрометода при определении групп крови лошадей.
- Определить экономическую эффективность использования предлагаемых разработок при получении и использовании сывороток – реагентов.
Научная новизна. Впервые на основании системного подхода разработана аналитическая схема подборов доноров к реципиентам, позволяющая оптимизировать процесс планирования и полностью исключить неперспективные варианты иммунизации лошадей.
Установлена возможность прогнозирования иммунореактивности доноров при иммунизациях по содержанию общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей.
Разработаны оптимальные параметры планшетного микрометода для типирования эритроцитарных антигенов лошадей, а также определена экономическая эффективность внедрения данного метода.
Практическая значимость результатов исследований. Разработана и апробирована аналитическая модель подборов доноров к реципиентам, позволяющая существенно повысить эффективность иммунизации и оптимизировать состав донорского поголовья с учетом генотипических особенностей лошадей.
Выявлено, что показатель общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови продуцентов позволяет прогнозировать иммунореактивность лошадей–доноров в процессе иммунизации. Установлено отсутствие несовместимости родительских пар по эритроцитарному антигену Dc.
Определены оптимальные технологические параметры планшетного микрометода, используемого при типировании эритроцитарных антигенов лошадей, показана высокая экономическая эффективность его использования.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 2-ой научно-практической конференции по болезням лошадей (Москва, 2001), на координационных совещаниях по коневодству (ВНИИ коневодства, 2001, 2007), конференции молодых ученых РСХА (2001), а также на семинаре «Современные достижения в изучении генетики лошади» (ВНИИК, 2007). Результаты проделанной работы вошли в «Методические рекомендации по производству и использованию сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей» (ВНИИ коневодства, 2005).
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 123 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, методики, 5 разделов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и предложений производству. Включает 16 таблиц и 6 рисунков. Список использованной литературы содержит 125 источников, в том числе 67 на иностранных языках. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе методические рекомендации и 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.
Материалы и методика исследований. Материалом для исследований служили результаты типирования групп крови 2476 голов лошадей заводских и местных пород, в том числе чистокровной верховой, арабской чистокровной, орловской и русской рысистых, тракененской, советской тяжеловозной, башкирской и их помесей.
При проведении 15 серийных иммунизаций было использовано конское поголовье экспериментальной конюшни ВНИИ коневодства и других хозяйств в количестве 29 голов разных пород, в возрасте 2 лет и старше. Все лошади находились в условиях конюшенно-пастбищного содержания и в дополнение к стандартному рациону получали комплексную витаминно-минерально-аминокислотную подкормку.
Исследования проводили по схеме, приведенной в рисунке 1.
Иммунизацию лошадей-реципиентов производили согласно рекомендациям (Р.М. Дубровская, 1983) и собственным методическим разработкам. На основании модельного анализа групп сцепления эритроцитарных антигенов была разработана и апробирована аналитическая модель подборов доноров к реципиентам.
До начала и во время иммунизаций проводили определение содержания общего белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови, а после каждой иммунизации определяли титр сыворотки, полученной от лошадей-продуцентов.
 |
Рис. 1. – Общая схема исследований
Влияние эритроцитарного антигена Dc на проявление гемолитической болезни новорожденных жеребят оценивали по результатам заводской деятельности маток арабской (n=801) и чистокровной верховой (n=459) пород, продуцировавших в конных заводах «Восход», «Лабинский», «Терский» и «Хреновской» в период 1977-1998 гг. Типирование лошадей по группам крови проводили в лаборатории иммуногенетики ВНИИ коневодства при помощи моноспецифических сывороток-реагентов для эритроцитарных систем крови A, D и K. Учитывались только те жеребости, в которых жеребята унаследовали отцовский антиген Dc, чтобы каждая жеребость могла служить проверкой наличия несовместимости родительских пар.
Результаты плодовой деятельности таких кобыл оценивали по следующим показателям воспроизводства: проценту зажеребляемости; слабо- и мертворожденных жеребят; благополучной выжеребке и делового выхода жеребят.
При разработке параметров микрометода определения групп крови были оптимизированы такие основные технологические характеристики, как время экспозиции (в диапазоне 30 мин – 3 часа), объем и соотношение сыворотки и взвеси эритроцитов, концентрация взвеси эритроцитов (в диапазоне 0,5 – 2,5%). Предварительно была разработана оценочная шкала качественных характеристик реакции агглютинации в микропланшете: конфигурация и площадь агглютината, яркость его окраски и форма ободка.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработка аналитической модели подборов доноров к реципиентам при иммунизации лошадей
Изготовление иммуносерологических реактивов для определения групп крови лошадей сопряжено с низкой эффективностью проводимых мероприятий по ряду разнообразных причин: ограниченности поголовья донорского стада, слабой иммунореактивности продуцентов, неполного набора сывороток-реагентов, получения сложных «сырых» сывороток и др. Одной из весомых причин невысокой результативности производства реагентов у лошадей является наличие открытых систем групп крови с еще не до конца определенным набором антигенных факторов. Помимо этого в большинстве систем групп крови есть аллели с группами сцепленных эритроцитарных антигенов, которые затрудняют процесс абсорбции получаемых сывороток.
Таблица 1
Частота встречаемости групп сцепления антигенов в
аллелях групп крови лошадей (в %)
| Частота встречаемости | Группа сцепления |
| 1-49 | Ac (bc, ce); Dd (dkl, del), De (cegmq), Dg (dhgm), Dl (adl, dkl, delq) |
| 50-75 | Aa (ad, ag), Ab (bc), Ad (dg, ad), Ae (ce); Dd (dl), De (delq), Df (cfm), Dk (dkl), Dm (cm, cgm, mq, Dn (dln), Dq (mq), Dr (lr, qr);Pa (ac,ad), Pd (ad) |
| 76-100 | Af (adf), Ag (adg); Da(adl), Db (bcmq), Dc (cgm, cm), Dg (gm, cgm), Dh (dghm), Di (cegimnq), Dl (dl), Dm (gm), Do (deloq), Dp (gmp); Qa (ac), Qc (ac), Pc (ac) |
При анализе генетических групп сцепления антигенов в системах A, P, D и Q-групп крови были выявлены разные частоты их встречаемости (таблица 1)
Низкая частота встречаемости групп сцепления характерна только для антигенов Ab, Ac, Pa, Pd, De. Все прочие эритроцитарные антигены генетически детерминированы аллелями со сравнительно высокой (50-100%) частотой встречаемости сцепленных факторов и имеют вариации в зависимости от антигенного состава группы. Очень высокая степень встречаемости сцепленных факторов была выявлена у следующих групп антигенов: в системе A - adf и adg; в системе Q – ac; в системе P – ac; в системе D - adl, bcmq, cm, gm, dghm, cegimnq, dl, deloq, gmp.
Чтобы разрешить проблему получения сложных сывороток со стойкими группами сцепления, на основании модельного анализа была составлена оптимальная схема подборов доноров к реципиентам с учетом эффективности последующей адсорбции на примере D-системы групп крови (таблица 2). В результате использования разработанной оптимальной схемы подборов можно получить моноспецифическую сыворотку или же сыворотку, требующую минимума адсорбций.
В связи с наличием неразделимых групп сцепления эритроцитарных антигенов возможен ряд подборов пар доноров, неперспективных в плане получения моноспецифических сывороток. Получаемые в результате таких подборов «сырые» сыворотки содержат антитела, соответствующие прочным аллельным группам сцепления, и на их основе невозможно получение «чистой» сыворотки (таблица 3).
Таблица 2
Оптимальные варианты подбора доноров и реципиентов
по антигенам D-системы крови
| Антиген | Генотип донора | Генотип реципиента |
| Da | adl | dek, de, dfk, dkl, d |
| adlr | dek, dfk, dlnqr | |
| adlnr | dlnqr | |
| Db | bcm | cefgm, cegm, cgmq, cgmqr |
| Dc | cgm | dghm |
| cgmp | dghmp | |
| cgmq | dghmq, dghmqr | |
| cgmqr | dghmqr | |
| cgmr | dghmqr | |
| Dd | deln | cefgmq, cegimnq |
| De | deln | dfklr, dghm |
| Df | cefgm | cegimn |
| cfmqr | cgmqr | |
| dfklr | dek | |
| Dg | cgm | bcm, cfmqr |
| cgmq | bcm, cfmqr | |
| cgmr | cfmqr | |
| cgmqr | cfmqr | |
| cgmp | bcm, cfmqr | |
| dghm | bcm, cfmqr | |
| Dh | dghm | cgm/deln |
| Dk | cfgkm | cefgm |
| dkl | adl, de | |
| Dl | dklqr | dghmqr |
| deklqr | cefgmq, cegimnq | |
| Dn | adlnr | adlr |
| dlnq | dek, delq, dlqr | |
| dlnqr | dek, dlqr | |
| Do | deloq | delq, dek |
| Dp | cgmp | cefgmq, cegminq, cfgkm, cfmqr, cgm, cgmq, cgmqr, cgmr |
| dghmp | dghmq | |
| dghmqr |
Таблица 3
Варианты неперспективных подборов пар донор - реципиент для получения моноспецифических сывороток-реагентов для D - системы групп крови
| Получаемая сыворотка | Генотип донора | Генотип реципиента | Проблемная группа сцепления |
| Анти-Dc | bcmq | любой из возможных | bc |
| сegimnq | --- // --- | сi | |
| Анти-Dd | adl(nr), del(korq) | --- // --- | dh, dl |
| Анти-De | cegimn | --- // --- | ei |
| deloq | --- // --- | eo | |
| Анти-Dg | cegimn | --- // --- | gi |
| cgmp, dghm | --- // --- | gp, gh | |
| Анти-Dl | adl | --- // --- | al |
| delo | --- // --- | lo | |
| dek | сefgmq, cegimnq | dl | |
| delq | cefgm, cegimn | ||
| dfk | cefgm, cfgkm, cfm | ||
| dkl | cfgkm | ||
| dl | d | ||
| Анти-Dm | cegm(finq), cgm(fqrkp), dghm(pqr) | любой из возможных | im, cm, gm hm |
| Анти-Dn | cegimn | --- // --- | in |
Проведенный анализ показал, что, даже при соблюдении требования минимальных различий между донором и реципиентом по антигенам групп крови при составлении подбора, можно получить сложную поливалентную сыворотку, включающую антитела на нужный антиген, но в дальнейшем «очистить» ее до моноспецифического состояния практически невозможно. Приведенные в таблице 3 варианты нерациональных подборов демонстрируют генотипические характеристики лошадей-доноров, которых нецелесообразно использовать для получения сывороток-реагентов в связи имеющимися группами сцепления и необходимостью многоэтапной адсорбции. Важно отметить, что моноспецифическую сыворотку анти-Dm получить очень сложно, даже используя дальнейшую адсорбцию.
Учитывая, что каждый этап адсорбции снижает титр получаемой сыворотки, при составлении плана иммунизации продуцентов необходимо не только подбирать пары с минимальными различиями в наличии эритроцитарных антигенов, но и учитывать возможность последующей адсорбции лишних антител.
Апробация разработанной аналитической модели подборов доноров к реципиентам была проведена на 15 серийных иммунизациях лошадей, что позволило получить 11 сывороток и в целом повысить эффективность иммунизаций до 73%.
Влияние иммунизаций на содержание общего белка и иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей
Практическая работа по получению сывороток-реагентов значительно усложняется потому, что 75-80% иммунизированных лошадей остается ареактивными. Известно, что иммунореактивность лошадей – продуцентов зависит от большого ряда факторов: возраста, физиологического состояния, типа нервной системы, времени года и т.д. (Дубровская Р.М., 1987; Потапова Д.В. 1989; Мемедейкин В.В., 1997). Поэтому при производстве сывороток-реагентов важно заранее прогнозировать иммунореактивность лошадей-продуцентов и оценивать результативность проводимой иммунизации.
При мониторинге содержания общего белка в сыворотке крови лошадей до начала и в процессе иммунизации не было установлено существенных изменений этого показателя в зависимости иммунореактивности продуцентов (Рис. 2). В то же время отмечена тенденция увеличения содержания общего белка в крови лошадей-продуцентов, давших сыворотку с высоким титром антител (1:16-1:32) уже после первого внутримышечного введения крови доноров реципиентам, т.е. на начальном этапе проведения иммунизации. Несколько иная динамика колебаний общего количества белка наблюдалась у лошадей-реципиентов, давших сыворотку с невысоким титром антител (1:8), что может быть связано со спецификой антигенной активности эритроцитарных факторов. После 4-й серийной иммунизации, к моменту взятия крови у лошадей-продуцентов в большом объеме, самое высокое содержание общего белка было отмечено у лошадей, давших сыворотку с высоким титром антител к эритроцитарным антигенам, тогда как у ареактивных доноров его уровень был даже ниже начального.
Рис. 2. Динамика содержания общего белка в сыворотке крови лошадей-продуцентов в процессе иммунизации.
Более информативные результаты были получены при изучении динамики общего содержания иммуноглобулинов у лошадей-продуцентов (таблица 4).
Таблица 4
Динамика содержания иммуноглобулинов
в сыворотке крови реактивных и ареактивных
лошадей-доноров при иммунизации
| Этапы иммунизации | Содержание иммуноглобулинов, мг/мл | ||
| реактивные доноры | ареактивные доноры | ||
| Титр 1:16 – 1:32 | Титр 1:8 | Титр отсутствует | |
| до иммунизации | 11,22±0,51** | 10,46±0,80 | 9,33±0,44 |
| I | 13,17±0,35*** | 12,26±0,79*** | 9,72±0,30 |
| II | 13,70±0,45*** | 12,60±0,93** | 9,72±0,48 |
| III | 13,17±0,18* | 13,45±0,71* | 10,79±1,05 |
| IV | 13,52±0,28*** | 13,88±0,62*** | 9,84±0,56 |
Примечание. Достоверность различий: *Р >0,95;**Р >0,99;***Р >0,999.
У лошадей-доноров, не выработавших эритроцитарных антител, общее содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови до иммунизации и во время нее было достоверно ниже и не подвергалось значительным колебаниями. Напротив, у двух групп реактивных доноров, общее содержание иммунных белков было достоверно выше еще до начала иммунизации и постепенно возрастало в процессе иммунизации.
Рис. 3. Динамика содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови
продуцентов при иммунизациях лошадей
Полученные данные свидетельствуют, что показатель содержания общего количества иммуноглобулинов в сыворотке крови может служить в качестве критерия иммунореактивности лошадей-продуцентов и эффективности проводимой иммунизации.
Анализ связи эритроцитарного антигена Dc с заболеваемостью жеребят неонатальным изоэритролизисом
У 1-2% жеребят разных пород встречается заболевание неонатальным изоэритролизом, которое может быть обусловлено несовместимостью родительских пар по эритроцитарным антигенам Qa, а также, возможно, Aа, Ca, Dc и Pa. Для проверки гипотезы о связи широко распространенного антигена Dc с гемолитической болезнью новорожденных жеребят была проанализирована заводская карьера кобыл чистокровной верховой и арабской пород, имевших пять и более «несовместимых» жеребостей по этому антигену.
Показатели зажеребляемости, благополучной выжеребки и делового выхода жеребят у кобыл арабской чистокровной породы с «проблемными» подборами менялись волнообразно, достигая максимальных значений при 11 и 12 «несовместимых» жеребостях. Доля слабо- и мертворожденных жеребят колебалась в интервале от 10 до 36%, с максимальными значениями на пятую и восьмую жеребости (рис. 4). При этом многие кобылы выкармливали здоровых жеребят, унаследовавших отцовский антиген Dc, и после девяти «несовместимых» жеребостей.
Рис. 4. Динамика показателей воспроизводства кобыл арабской породы при несовместимости родительских пар по антигену Dc.
У маток чистокровной верховой породы, давших «несовместимых» жеребят по антигену Dc, была отмечена сходная динамика репродуктивных показателей. Более того, максимальные уровни зажеребляемости, благополучной выжеребки и делового выхода жеребят наблюдались после 9-11 «проблемных» жеребостей, при этом число слабо- и мертворожденных жеребят явно имело тенденцию к снижению.
Проведенный анализ основных показателей воспроизводства кобыл чистокровной верховой и арабской пород. имевших многочисленные «несовместимые» жеребости по эритроцитарному антигену Dc, не подтверждает его связи с возникновением иммуногенетической несовместимости у новорожденных жеребят.
Оптимизация параметров планшетного микрометода
при типировании групп крови
С целью апробации планшетного микрометода при типировании групп крови лошадей была разработана оценочная бальная шкала проявления агглютинации в лунках планшета с учетом таких факторов, как дисперсность агглютината, его конфигурация, яркость окраски и форма ободка. Для определения оптимальных параметров реакции агглютинации в планшете при определении групп крови лошадей проведен ряд серийных опытов.
В отличие от постановки реакций в серологических пробирках, наиболее четко выраженная крупнозернистая агглютинация эритроцитов в лунках планшета была отмечена при концентрации суспензии 1,5% и времени инкубации 1 час. Суспензия с 0,5% концентрацией имела очень бледную окраску, что затрудняло чтение результатов реакции, также как и 2,5% взвесь с излишне интенсивной окраской. Инкубация в термостате в течение 30 и 40 минут было явно недостаточной для полного проявления агглютинации эритроцитов с антителами сыворотки, а прочтение результатов через 1,5 и 3 часа несколько затрудняло дифференциацию бахромчатости краев по причине высыхания взвеси в лунках планшета.
Оптимальная концентрация суспензии эритроцитов для микрометода на планшете составляет 1,5%, время инкубации 1 час.
Экономическая эффективность результатов исследований
Изготовление сывороток-реагентов – это длительный произ-водственный процесс, связанный с содержанием большой группы лошадей – продуцентов. Основной статьей расхода при получении реагентов являются затраты на донорское поголовье, в том числе на приобретение и содержание животных. Поэтому очень важно иметь такое поголовье продуцентов, которое отвечает потребностям лаборатория по генотипам и иммунореактивности.
Расчет экономической эффективности использования аналитической схемы подборов пар доноров к реципиентам при составлении плана иммунизаций показал, что при этом методе один рубль затрат на производство сывороток позволяет получить 85 коп. прибыли, что является хорошим показателем эффективности.
Результаты внедрения микрометода наглядно представлены в таблице 5. Благодаря внедрению микрометода расход дефицитных сывороток-реагентов сократился в 3 раза, существенно снизились затраты рабочего времени и прочие расходы. При этом значительно повысилась чувствительность метода, а срок хранения проб крови увеличился в 1,5 раза.
В настоящее время лаборатория полностью перешла на планшетный микрометод, что позволило существенно сэкономить имеющиеся запасы сывороток-реагентов.
Таблица 5.
Сравнительная оценка эффективности методов определения групп крови лошадей
| № | Показатели (в расчете на одну голову) | Пробирочный метод | Планшетный микрометод | Экономия при использовании микрометода |
| 1 | Расход сывороток-реагентов, µл | 75 | 25 | 50 |
| 2 | Расход рабочего времени на операции | 30 мин | 10 мин | 20 мин |
| 3 | Дополнительные расходы, включая хим.реактивы и эл. энергию на 1 пробу, руб. | 37 | 9 | 28 |
Производственная проверка показала высокую эффективность системного подхода при использовании аналитической модели. Для 15 апробированных подборов результативность составила 73%, т е было получено 11 сывороток из 15 возможных.
ВЫВОДЫ
1. Результативность получения сывороток-реагентов для определения групп крови лошадей в значительной степени определяется планом иммунизации, который должен составляться с учетом генотипических различий доноров и реципиентов, а также возможности последующей адсорбции полученной сыворотки.
2. Большинство аллелей групп крови лошадей включают группы сцепленных антигенов, что необходимо учитывать как при подборах донорских пар, так и при адсорбции «сырых» сывороток.
3. При контроле содержания общего белка в сыворотке крови лошадей в процессе иммунизации не было выявлено четко выраженной зависимости иммунореактивности продуцентов от этого показателя.
4. Установлена достоверная связь между содержанием иммуноглобулинов в сыворотке крови лошадей и их иммунореактивностью. Реактивные лошади-продуценты с высоким титром антител имели достоверно более высокий уровень общего количества иммуноглобулинов еще до иммунизации, который постепенно увеличивался после каждой инъекции крови донора.
5. Анализ показателей воспроизводства кобыл арабской и чистокровной верховых пород, имевших несовместимые жеребости по антигену Dc, не подтвердил связи гемолитической болезни жеребят с этим фактором.
6. В результате проведенных исследований отработаны оптимальные параметры проведения планшетного микрометода: концентрация взвеси эритроцитов должна составлять 1,5%, количество взвеси эритроцитов и сыворотки-реагента 0,25-0,30µл, время инкубации 1 час.
7. Использование микрометода позволяет снизить расход сывороток-реагентов и затраты рабочего времени в 3 раза, а также продолжительность анализа с четырех до одного часа. Планшетный микрометод типирования групп крови можно использовать как в лабораторных, так и в полевых условиях.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. При получении сывороток - реагентов для типирования групп крови лошадей подбор пар «донор-реципиент» следует проводить с учетом групп сцепления и в соответствии с рекомендованной схемой, что позволит избежать получения проблемных сывороток.
2. Для успешной работы необходимо комплектовать донорский табун лошадьми со следующими генотипами Аa, Аadf, Аbc, Аce, Аbce; Dadlnr, Dadlr, Ddlnqr, Dbcm, Ddghm, Dcgm, Ddeloq, Ddek, Ddkl, Dcegimn, Cа, Kа, Uа, Pa, Pb, Qac, Qc, Qabc, Qb.
3. Отбор лошадей-продуцентов проводить с учетом высокого содержания иммуноглобулинов на уровне 11 мг/мл и выше.
4. Иммуногенетическим лабораториям целесообразно полностью перейти на типирование групп крови лошадей планшетным микрометодом, который позволяет существенно экономить сыворотки-реагенты и затраты рабочего времени персонала, а также может быть использован как в лабораторных, так и в полевых условиях.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Зайцев А.М., Мелентьева Н.М. Характеристика генетической структуры кузнецкой породы лошадей по эритроцитарным антигенам и полиморфным системам белков и ферментов крови// Материалы науч. сессии РСХА «Стратегия развития животноводства –21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. – Дивово, 2001.-С.70-72.
2. Мелентьева Н.М. Повышение эффективности изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// Сб.науч.тр. –Дивово, 2007. –С.107-111.
3. Мелентьева Н.М. Связь систем групп крови с заболеваемостью жеребят неонатальным изоэритролизисом// Журнал «Коневодство и конный спорт», 2007.- № 4. –С. 21-22.
4. Методические рекомендации по производству и использованию сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// ВНИИК – 2005/ Храброва Л.А., Дубровская Р.М., Потапова Д.В, Мелентьева Н.М, Орехова Т.М.
5. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Генетическая детерминация гемолитической болезни жеребят// Науч. основы сохранения и совершенствования пород лошадей. - Дивово, 2003. –С. 74-80.
6. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Технологические аспекты микрометода определения групп крови лошадей// Итоги исследований по коневодству в первом году 21 века. – Дивово, 2002. – С.38-40
7. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А. Усовершенствование методики получения сывороток-реагентов для открытых систем групп крови у лошадей// Проблемы сохранения генофонда, повышения племенных и продуктивных качеств заводских и местных пород лошадей: Тезисы. – Дивово, 2003. –С.41-44.
8. Мелентьева Н.М., Храброва Л.А., Матвиенко А.П. Оценка экономической эффективности применяемых методов изготовления и использования сывороток-реагентов для типирования групп крови лошадей// Сб.науч.тр. –Дивово, 2007. –С.103-106.
9. Угадчиков С.Т., Мелентьева Н.М., Цуцков В.В. Влияние минерально–витаминно–аминокислотного премикса на иммунореак-тивность лошадей-доноров//Материалы науч. сессии РСХА «Стратегия развития животноводства – 21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. – Дивово, 2001. С.93-94.
10. Храброва Л.А., Мелентьева Н.М. Гемолитическая болезнь новорожденных жеребят: диагностика и профилактика// Материалы 2-ой научно-практической конференции по болезням лошадей. – М., 2001. – С. 98-99.
11. Храброва Л.А., Мелентьева Н.М. Гемолитическая болезнь новорожденных жеребят: диагностика, профилактика// Материалы научной сессии РСХА «Стратегия развития животноводства – 21 век» и координационного совещания по научно-исследовательской работе в коневодстве. – Дивово, 2001. – С.68-70
Издательская лицензия ИД №05806 от 10.09.2001г.
Подписано в печать 28.09.09. Формат 60х84 1/16
Печатных листов 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №28
Участок печати ГНУ ВНИИ коневодства
Рыбновский район, Рязанская область
Тел./факс 8(4912)24-02-65, 24-05-39
E-mail: [email protected]
