Фитофторозные корневые гнили малины и земляники, методы их диагностики
На правах рукописи
КОПИНА МАРИЯ БОРИСОВНА
ФИТОФТОРОЗНЫЕ КОРНЕВЫЕ ГНИЛИ МАЛИНЫ И ЗЕМЛЯНИКИ, МЕТОДЫ ИХ ДИАГНОСТИКИ
Специальность: 06.01.07 – защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата сельскохозяйственных наук
МОСКВА – 2013
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии)
| Научный руководитель: | доктор сельскохозяйственных наук Головин Сергей Евгеньевич |
| Официальные оппоненты | доктор сельскохозяйственных наук, профессор Белошапкина Ольга Олеговна ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева |
| доктор биологических наук Шилов Илья Александрович ГНУ ВНИИСХБ Россельхозакадемии | |
| Ведущая организация | Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт садоводства им. И. В. Мичурина Россельхозакадемии |
Защита состоится « » 2013 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.035.01 в Государственном научном учреждении Всероссийском селекционно-технологическом институте садоводства и питомниководства Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии) по адресу: 115598, Москва, Бирюлёво-Загорье, ул. Загорьевская 4, конференц-зал, факс 8(495) 329-3- 66.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, с авторефератом – на официальном сайте ВАК РФ – http//vak.ed.gov.ru и на официальном сайте ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии – http//vstisp.org.
Автореферат размещён на сайте ВАК РФ (http//vak.ed.gov.ru) «__»___ 2013 г.
Автореферат разослан «___»_______ 2013 г.
Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные и скреплённые гербовой печатью, просим направлять учёному секретарю диссертационного совета.
Учёный секретарь диссертационного совета,
кандидат сельскохозяйственных наук Л.А. Марченко
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Корневые гнили относятся к числу весьма вредоносных болезней ягодных культур. Среди патогенов, поражающих корневую систему, известны возбудители ризоктониозной гнили Rhizoctonia spp., питиозной гнили Pythium spp., виды из родов Verticillium и Fusarium. В последнее время особое внимание уделяется гнилям корней малины и земляники, вызываемым оомицетами рода Phytophthora. Это, в первую очередь, связано с высокой вредоносностью данных возбудителей, которые способны вызывать гибель от 40% до 78% растений за вегетационный период (Abad et al., 2008; Kroon, 2010). Также фитофторозы влияют на производство здорового посадочного материала, ухудшая его фитосанитарное качество. Около 13 видов Phytophthora описаны как возбудители корневых гнилей ягодных культур (Cooke et al., 2000). Среди них серьезную угрозу представляет карантинный объект - биотип Ph. fragariae Hickman, вызывающий гниль корней малины и земляники.
Основной источник распространения фитофторозов - зараженный посадочный материал, где возбудитель может сохраняться долгое время в покоящихся стадиях. Поэтому фитосанитарный контроль продукции растениеводства, особенно импортируемого посадочного материала, играет важную роль (Александров, 2004).
Для предотвращения проникновения возбудителей фитофторозов из других стран и их распространения на территории России требуется применять достоверные и чувствительные методы диагностики. Традиционные методы для выявления оомицетов рода Phytophthora не являются достаточно надежными. При выделении в культуру фитофторозы быстро подавляются сопутствующими микромицетами, а также имеют схожую симптоматику проявления болезни с другими возбудителями корневых гнилей (Новотельнова, 1974). Идентификация Phytophthora spp. по форме спорангиев представляется сложной, поскольку многие виды, в том числе и карантинные, имеют практически сходное строение. Кроме того, классические методы, применяемые для рутинной диагностики растительных образцов, весьма длительны и трудоемки.
В последние десятилетия во многих странах получил распространение метод выявления фитопатогенов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР отличается высокой точностью и специфичностью и позволяет выявлять возбудителей Phytophthora spp. в растительных и почвенных образцах (Bonants et al., 1997; Cooke et al., 2000). Разработка новых высокочувствительных и специфичных методов для идентификации оомицетов Phytophthora spp. на малине и землянике является приоритетной задачей, т.к. между странами происходит широкий обмен посадочным материалом. Поскольку в России фитофторозные корневые гнили двух широко распространенных ягодных культур - малины и земляники остаются слабо исследованными, а молекулярно-генетические методы их диагностики не разработаны, то настоящее исследование представляется актуальным.
Цель и задачи исследований. Целью проводимых исследований являлось усовершенствование методов диагностики возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
Для достижения этой цели предстояло решить следующие задачи:
- Уточнить видовой состав и распространенность оомицетов рода Phytophthora-возбудителей гнилей корней земляники и малины.
- Оптимизировать методы пробоподготовки при молекулярно-генетической идентификации возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
- Разработать и оптимизировать мультиплексную ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации основных возбудителей фитофторозов.
- Разработать метод диагностики фитофторозов в почве комбинацией метода биоприманок и ПЦР.
Научная новизна. Впервые в России проведено изучение видового разнообразия фитофторозных корневых гнилей малины и земляники с применением молекулярных методов диагностики. Оптимизированы методы пробоподготовки исследуемого материала при идентификации оомицетов Phytophthora spp. методом классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени». Впервые в посадочном материале малины идентифицирован вид Phytophthora tentaculata Krber & Marwitz, ранее не выявляемый в РФ. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика возбудителей фитофторозов малины и земляники методом мультиплексной ПЦР «в реальном времени», которая позволяет идентифицировать в одной пробирке Ph. cactorum, Ph. nicotianae, Ph. citricola и карантнинный вид Ph. fragariae. Разработана диагностика почвы на присутствие видов Phytophthora сочетанием метода биоприманок и ПЦР.
Практическая значимость и реализация результатов исследований. Проведенные исследования позволили разработать систему внутреннего положительного контроля (ВПК), которую возможно применять не только для молекулярной диагностики фитофторозов, но и других фитопатогенов.
Предложены оптимальные методы выделения ДНК из чистых культур оомицетов рода Phytophthora и пораженной растительной ткани биоприманок при молекулярно-генетической диагностике этих фитопатогенов.
Впервые в России разработан метод мультиплексной ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации основных фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
Определена возможность изучения видового разнообразия фитофторозов в растительных и почвенных образцах сочетанием метода биоприманок с классической ПЦР, ПЦР «в реальном времени», а также секвенированием гена Ypt1 возбудителей рода Phytophthora.
Разработанные методы диагностики успешно применяются при проведении фитосанитарной экспертизы в ФГБУ «ВНИИКР».
Основные положения, выносимые на защиту:
- Видовой состав и распространенность возбудителей фитофторозных корневых гнилей в насаждениях и посадочном материале малины и земляники;
- Оптимизация молекулярно-генетических методов идентификации фитофторозов (методы экстракции ДНК; разработка внутреннего положительного контроля (ВПК)
- Мультиплексная ПЦР «в реальном времени» для диагностики основных видов возбудителей фитофторозов малины и земляники.
- Диагностика почвы на присутствие видов Phytophthora, комбинацией метода биоприманок и ПЦР.
Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на Междисциплинарном микологическом форуме (г. Москва, 14-15 апреля 2010 г.), международной научно-практической конференции «Инновационные направления и проблемы в защите садовых культур от вредных организмов на современном этапе» (г. Москва, ВСТИСП, 12-14 июля 2010 г.), всероссийском научно-практическом семинаре «Современные методы защиты плодовых и ягодных насаждений от болезней и вредителей» (г. Москва, ВСТИСП, 20 апреля 2011 г.), 3 съезде микологов России (г. Москва, 10-12 октября 2012г.), научно-практической конференции ЕОКЗР и Проекта QBOL «ДНК баркодирование и методы диагностики» (г. Гарлем, Нидерланды, 21-25 мая 2012 г), 6 международной конференции IUFRO «Фитофторозы в лесах и природных экосистемах» (г. Кордоба, Королевство Испания, 9-15 сентября 2012 года), международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы защиты садовых культур от вредных организмов» (г. Москва, ВСТИСП 19 марта 2013 г.), заседаниях Ученого совета и секции ягодных культур ГНУ ВСТИСП, заседаниях Ученого совета ФГБУ «ВНИИКР».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано девять печатных работ, в том числе 5 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК.
Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах и состоит из введения, 7 глав, общих выводов, рекомендаций по практическому применению, списка использованной литературы из 124 источников (из них 91- зарубежных авторов). В диссертации содержится 13 рисунков, 26 таблиц и 8 приложений.
Автор выражает благодарность заместителю директора ФГБУ «ВНИИКР», к.б.н. Мазурину Е.С. за полезные советы на протяжении всех этапов исследований и постоянное внимание к работе. Признателен сотрудникам лаборатории микологии ФГБУ «ВНИИКР»: зав. лабораторией, к.б.н. Скрипка О.В., ст. научн. сотруднику Дудченко И.П. за помощь на начальных этапах исследований. А также зав. лабораторией, к.б.н. Камаеву И.О. за помощь в статистической обработке данных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обоснована актуальность и практическая значимость темы исследований, сформулирована основная цель и задачи исследования.
Глава I. Обзор литературы. В этой главе приведены сведения о видовом составе, распространенности и вредоносности возбудителей рода Phytophthora в насаждениях малины и земляники. Рассмотрены систематическое положение, биологические особенности и симптоматика основных возбудителей фитофторозных корневых гнилей. Приведено описание основных методов диагностики возбудителей.
Глава II. Материалы и методы. Работа была выполнена в 2010-2013 гг. в центре защиты растений и биотехнологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, а также на базе ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»).
Растительный материал отбирали при фитосанитарных обследованиях посадок земляники и малины в г. Москва, в Пушкинском, Ленинском, Егорьевском и Коломенском районах Московской области, а также коллекционных посадок ГНУ ВСТИСП и с карантинно-вегетационного участка ФГБУ «ВНИИКР». Также в исследованиях был использован посадочный материал (с открытой и закрытой корневой системой) малины и земляники отечественного и импортного происхождения, поступивший в ФГБУ «ВНИИКР» для установления фитосанитарного состояния. Всего было проанализировано 553 растительных образца (381 образец - земляники и 172- малины). Выделение возбудителей фитофторозных корневых гнилей из пораженных растений и почвенных образцов проводили с использованием метода биоприманок (Головин, 2001).
В работе использовали 13 штаммов Phytophthora sрp., 8 из которых возбудители фитофторозных корневых гнилей малины и земляники. Поддержание и изучение чистых культур проводили на 1,5% питательных средах: овсяной агар (ОА), картофельно-глюкозный агар (КГА), фасолевый агар (ФА).
Выделение ДНК из растительного материала и чистых культур проводили следующими методами: с использованием готовых наборов «ДНК-Экстран», «Сорб-ГМО-А», «Сорб-С» (ЗАО «Синтол», Москва), «Проба ГС» (ООО «Агродиагностика», Москва); согласно методике описанной J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990) для выделения ДНК из растений; согласно протоколу по выделению ДНК из растительных тканей (www.protocol-online.org). Концентрацию и чистоту выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 при длине волны 260 нм.
С выделенными образцами ДНК проводили классическую ПЦР. Смесь реактивов для постановки одной реакции объемом 25 мкл содержала 75 мкМ Трис-НCl (рН 8,8); 20 мкМ (NH4)2SO4; 0,01% Твин 20; 200 мкМ каждого dNTP; 20 пМ каждого праймера; 2,5 мкM MgCl2; 1 Ед Smar Taq-ДНК-полимеразы (ООО «Диалат Лтд», Москва) и 2 нг целевой ДНК. Температурно-временные параметры изменяли в зависимости от применяемой пары праймеров. Результаты амплификации регистрировали после проведения электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Quantum-ST-4-1500 (Япония).
При постановке классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени» в качестве внутреннего положительного контроля выделения нуклеиновых кислот и прохождения полимеразной цепной реакции использовали фрагмент гена мыши 1700042G15 (www.ncbi.nlm.nih.gov) некодирующей РНК (Мазурин, Копина, Шероколава, 2012).
Амлификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ5 (Bio-Rad, США), в присутствии интеркалирующего красителя Eva Green (ЗАО «Синтол», Москва) с праймерами YPh1F/YPh2R, (Schena et al., 2008) или с внесением в реакционную смесь флуоресцентно меченых проб. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 2,5 мкл 10Х ПЦР буфера MagMix (ООО «Диалат Лтд», Москва), 10 пМ каждого из праймеров, 5 пМ зонда, 5 нг целевой ДНК и стерильную воду. Для разработки мультиплексной ПЦР «в реальном времени» подбирали олигонуклеотиды на основе гена ras-related protein Ypt1.
При постанове ПЦР «в реальном времени» проводили количественное определение целевой ДНК в образце. Метод основан на построении стандартной кривой, которая отражает линейную зависимость между значением порогового цикла (Сt) и исходным количеством ДНК.
Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).
Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением программ Statistica 5.5 и PAST.
Глава III. Изучение видового разнообразия возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники.
3.1 Видовой состав возбудителей рода Phytophthora в насаждениях малины, земляники и посадочном материале отечественного происхождения.
В 2010-2012 годах были проведены обследования посадок земляники и малины в г. Москва, районах Московской области (Пушкинском, Ленинском, Егорьевском и Коломенском), а также в ряде ЛПХ Архангельской и Рязанской областей.
За период проведения исследований в насаждениях малины и земляники было выявлено 3 наиболее распространенных возбудителя фитофторозных корневых гнилей, среди них: Ph. cactorum, Ph. nicotianae и Ph. citricola (табл.1). Наиболее часто на посадках земляники выявляли вид Ph. cactorum, в среднем 37,6% пораженных растений. Этот оомицет был обнаружен во всех исследуемых образцах земляники, отобранных в Московской, Архангельской и Рязанской областях.
В посадках малины чаще других выявляли оомицет Ph. nicotianae, (в среднем 17,7% зараженных образцов), несколько реже встречался вид Ph. cactorum, он был выявлен в 6,2% исследуемых растений. Стоит отметить, что вид Ph. nicotianae наиболее часто выделяли из прикорневой почвы исследуемых растений малины, из корней этот оомицет был выделен в единичных случаях.
При проведении обследований насаждений малины в Ленинском районе Московской области был обнаружен карантинный объект: возбудитель фитофторозной корневой гнили Ph. fragariae var. rubi, наличие которого было подтверждено ПЦР «в реальном времени», классической ПЦР и секвенированием фрагмента гена Ypt1. Полученная нами нуклеотидная последовательность участка гена Ypt1 карантинного возбудителя была депонирована в базу GenBank (JQ 622803.1).
Наименее встречаемым видом в насаждениях был возбудитель Ph. citricola, его удалось обнаружить в 7,3% и 2,2% образцах малины и земляники соответственно.
Таблица 1 – Распространенность фитофторозов в насаждениях земляники и малины
| Место отбора образцов | Количество проанализир.образцов | Частота встречаемости, % | ||||||||||
| Phytophthora spp. | Ph. nicotianae | Ph. citricola | Ph. cactorum | Ph. fragariae var. rubi | ||||||||
| М* | З** | М | З | М | З | М | З | М | З | М | З | |
| г. Москва | 11 | 13 | 45,5 | 30,8 | 27,3 | 15,4 | 18,2 | 7,7 | 9,1 | 38,4 | 0 | 0 |
| Ленинский район | 12 | 11 | 33,3 | 27,3 | 33,3 | 18,2 | 16,6 | 0 | 16,6 | 36,4 | 8,3 | 0 |
| Егорьевский район | 11 | 14 | 27,3 | 28,6 | 27,2 | 7,1 | 0 | 0 | 9,1 | 35,7 | 0 | 0 |
| Пушкинский район | 9 | 9 | 22,1 | 22,1 | 11,1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 22,1 | 0 | 0 |
| Коломенский район | 12 | 13 | 25,0 | 23,1 | 25,0 | 15,3 | 16,6 | 7,7 | 8,3 | 30,8 | 0 | 0 |
| Рязанская область | 7 | 6 | 14,3 | 16,7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 33,3 | 0 | 0 |
| Архангельская область | 8 | 6 | 12,5 | 33,3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 66,7 | 0 | 0 |
| В среднем: | 25,7 | 26,0 | 17,7 | 8,0 | 7,3 | 2,2 | 6,2 | 37,6 | 1,2 | 0,0 | ||
| Всего образцов: | 70 | 72 | ||||||||||
Примечание: *М-малина, **З- земляника
Помимо обследования насаждений ягодных культур, изучение видового разнообразия оомицетов рода Phytophthora проводили на посадочном материале малины и земляники отечественного происхождения (табл.2).
Таблица 2 – Виды оомицетов Phytophthora sрp., выявленные в отечественном посадочном материале земляники и малины
| Вид или род возбудителя | Частота встречаемости, % | |
| Земляника | Малина | |
| Ph. cactorum (Lebert et Cohn) Schroet. | 10,8 | 3,2 |
| Ph. citricola Sawada | 2,2 | 1,6 |
| Ph. nicotianaе Breda de Haan | 2,2 | 9,6 |
| Ph. syringae (Kleb.) Klebahn | 0.5 | - |
| Phytophthora sрp. de Bary | 2,7 | 11,2 |
В протестированных нами 185 образцах земляники наиболее часто встречался возбудитель Ph. cactorum (10,8% пораженных растений), в образцах малины (62 образца) этот патоген встречался значительно реже- 3,2%. Вид Ph. nicotianaе выявили у 9,6% растений малины, земляника поражалась этим оомицетом в меньшей степени-2,2%. В 1,6% образцов малины и 2,2% образцов земляники был идентифицирован возбудитель фитофторозной гнили Ph. citricola.
3.2 Видовой состав возбудителей рода Phytophthora в посадочном материале импортного происхождения.
При изучении видового состава оомицетов Phytophthora spp. на посадочном материале малины и земляники импортного происхождения было проанализировано 38 и 126 образцов растений соответственно (табл.3). Установлено, что наиболее часто по сравнению с другими видами рода Phytophthora, в зарубежных образцах малины выявлялся возбудитель гнили корней - Ph. citricola в 10,5 % растений. Частота выделения этого патогена из образцов земляники (производство Сербия) составляла 1,6%, аналогичное количество выделений на этой культуре было характерно для вида Ph. cactorum. В импортных образцах малины этот возбудитель выявлен у 2,6% исследуемых растений.
Таблица 3 – Виды оомицетов Phytophthora sрp., выявленные в импортном посадочном материале земляники и малины
| Вид или род возбудителя | Частота встречаемости, % | |||
| Земляника | Происхождение | Малина | Происхождение | |
| Ph. cactorum (Lebert & Cohn) Schrt. | 1,6 | Нидерланды | 2,6 | Бельгия |
| Ph. citricola Sawada | 1,6 | Сербия | 10,5 | Польша, Нидерланды |
| Ph. nicotianaе Breda de Haan | 0,8 | Чехия | 7,9 | Нидерланды, Сербия |
| Ph. syringae (Kleb.) Klebahn | - | - | 5,2 | Нидерланды, Бельгия |
| Ph. cryptogea Pethybr. & Laff. | - | - | 2,6 | Нидерланды |
| Ph. tentaculata Krber & Marwitz | - | - | 2,6 | Нидерланды |
| Phytophthora sрp. de Bary | 2,3 | Венгрия, Белоруссия | 13,1 | Сербия, Нидерланды, Польша, Бельгия |
В 7,9% образцов посадочного материала малины (происхождение Сербия и Нидерланды) был выявлен возбудитель Ph. nicotianaе. В единичных растительных образцах малины с закрытой корневой системой, (происхождение Нидерланды) был идентифицирован вид Ph. cryptogea и вид Ph. tentaculata, который ранее в нашей стране не выявлялся. Расшифровка нуклеотидной последовательности участка гена Ypt1 данного возбудителя и сравнение с базой GenBank позволили определить его видовую принадлежность. Применение метода плавающих биоприманок и секвенирования позволило в 5,2% исследуемых образцов посадочного материала малины идентифицировать Ph. syringae.
В исследуемом импортном посадочном материале малины и земляники отмечена низкая зараженность возбудителями фитофторозов по сравнению с отечественным материалом. Вероятно, это связано с применением в европейских странах в насаждениях ягодных культур фунгицидов, фумигации почвы, позволяющих получать посадочный материал с низкой степенью заражения фитофторозами. На территории России использование таких пестицидов запрещено.
Глава IV. Применение метода ПЦР для изучения возбудителей фитофторозов.
4.1. Оптимизация методов выделения ДНК из чистых культур возбудителей фитофторозов.
Определение способа экстракции ДНК из чистых культур Phytophthora spp. проводили с использованием серии 10-кратных разведений суспензии зооспор Ph. сactorum. Из каждого разведения проводили выделение ДНК различными методами (табл.4).
Таблица 4 – Сравнение чувствительности методов выделения ДНК из суспензии зооспор Ph. сactorum
| Концентрация зооспор шт/мл | Метод выделения ДНК | |||||
| Без выделения | Нагрев98С 20 мин | «Проба ГС» | «Loewe» | Патент № 2177035 | «ДНК-Экстран» | |
| 2,5х106 | + | + | + | + | -+ | + |
| 2,5х105 | +- | + | + | +- | -+ | + |
| 2,5х104 | + | +- | + | +- | -+ | + |
| 2,5х103 | + | + | + | -+ | -+ | + |
| 2,5х102 | - | - | - | - | - | +- |
| 2,5х101 | - | - | - | - | - | +- |
| 2,5х100 | - | - | - | - | - | - |
Примечание: повторность опыта 3 кратная; «+» положительный результат в повторности; «-» отрицательный результат в повторности; «+-» 2 положительных значения в повторности; «-+» 2 отрицательных значения в повторности.
Применение разных способов выделения ДНК из суспензии зооспор Ph. сactorum позволило выбрать наиболее чувствительный метод - с использованием набора «ДНК-Экстран», который позволял выделить ДНК из образца в концентрации не менее 25 зооспор в мл. В тоже время внесение суспензии зооспор непосредственно в пробирку с ПЦР смесью, нагрев суспензии при 98С в течение 20 мин, выделение с использованием набора «Проба ГС» - позволили выделить ДНК при большей концентрации зооспор, которая составляла 2,5х103 шт/мл. Выделение ДНК из суспензии по патентному изобретению № 2177035 оказалось не пригодным для поставленной задачи.
Основываясь на эксперименте, описанном выше, проводили определение эффективности применения набора для выделения ДНК «ДНК-Экстран» в комплексе с иммуноспецифической ПЦР.
Дополнительное выделение ДНК с использованием набора «ДНК-Экстран» из пробирок, где проводился иммунозахват, не привело к образованию продуктов амплификации с праймерами Yph1F/Yph2R специфичных для Phytophthora sрp. При постановке ПЦР непосредственно в пробирках, где проводился иммунозахват, были амплифицированы продукты размером 470 пар оснований (п.о.), что указывает на возможность применения данного метода как самостоятельный этап выделения ДНК из чистых культур.
4.2. Идентификация возбудителей фитофторозов методом классической ПЦР.
С образцами ДНК, выделенной из коллекционных культур, проводили постановку классической ПЦР. Всего было проанализировано 9 пар праймеров, из которых 1 пара олигонуклеотидов была универсальна для всех грибов, 2 пары - универсальны для рода Phytophthora, остальные праймеры были специфичны для отдельных видов (табл. 5). Для каждой пары праймеров была проведена оптимизация состава реакционной смеси.
Таблица 5 – Специфичность праймеров при диагностике Phytophthora sрp.
| Культура | Исследуемые праймеры | ||||||||
| Phytophthora spр. | Ph. cactorum | Ph. megasperma | Ph. nicotianae | Ph. fragariae | |||||
| YPh1F YPh2R | Phy1s Phy2а | ITS1 ITS4 | YcacR YcacF | YmegF YmegR | РНF РHR | TRP1F TRP2R | DC6/ITS4 DC1/DC5 | набор «Loewe» | |
| Ph. cactorum | + | - | + | + | - | - | - | - | - |
| Ph. cinamoni | + | - | + | - | - | - | - | - | - |
| Ph. cryptogea | + | - | + | - | - | - | - | - | - |
| Ph. megasperma | + | - | + | - | + | - | - | - | - |
| Ph. nicotianae | + | - | + | - | - | + | - | - | - |
| Ph. fragariae var. rubi | + | - | + | - | - | - | + | + | + |
| Ph.fragariae var. fragariae | + | - | + | - | - | - | + | + | + |
| Ph. capsici | + | - | + | - | - | - | - | - | - |
| Ph. infestans | + | - | + | - | - | - | - | - | - |
| Ph. citricola | + | - | + | - | - | - | - | - | - |
Примечание: «+» положительный результат ПЦР, «-» отрицательный результат ПЦР
При внесении ДНК каждого вида в реакционную смесь ПЦР с универсальными праймерами для грибов-ITS1/ITS4 и для рода Phytophthora - Yph1F/Yph2R, были получены амликоны соответствующего размера. Применение праймеров Phy1s/Phy2а не привело к образованию специфичных фрагментов участка гена ITS-28S rDNA. Это позволило выбрать маркеры Yph1F/Yph2R и ITS1/ITS4, которые использовали для дальнейших исследований.
При постановке ПЦР со специфичными праймерами было установлено, что пары олигонуклеотидов реагировали с видом, для которого они были синтезированы и не реагировали с другими оомицетами Phytophthora sрp. Данные таблицы 5 показывают, что неспецифичных продуктов при постановке ПЦР с праймерами, подобранными для конкретного возбудителя фитофтороза, не выявлено. Это свидетельствует о возможности применения данных маркеров для видовой идентификации возбудителей рода Phytophthora.
4.3. Разработка внутреннего положительного контроля классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени».
Для разработки внутреннего положительного контроля в работе использовали плазмидную ДНК, содержащую клонированные фрагменты гена 1700042G15 мыши. На начальном этапе разработки внутреннего контроля были подобраны 4 пары праймеров, амплифицирующие участок гена 1700042G15, из которых пара Mus714F/Mus714R была признана наиболее подходящей.
На следующем этапе ампликон размером 714 п.о., полученный с праймерами Mus714F/Mus714R, был клонирован в вектор pTZ57R/T (Fermentas, США), который трансформировали в клетки E. coli. Из бактериальных колоний была выделена плазмидная ДНК.
При определении наиболее оптимальной концентрации ВПК было показано, что плазмиды в количестве 0,1 нг на реакцию достаточно для амплификации ВПК и не влияет на амплификацию фрагмента Ypt1 гена возбудителей фитофторозов размером 470 п.о. Наличие полосы размером 714 п.о. свидетельствовало о прохождении амплификации и отсутствии ингибирования в ходе ПЦР (рис.1).
Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов амплификации Ypt1 гена фитофторозов (470 п.о.) и гена 1700042G15Rik мыши (714 п.о.) при различной концентрации плазмиды:№1 – 100нг; №2 – 50нг; №3 – 20нг; №4 – 10нг; №5 – 5нг;
№6 – 1,0 нг; №7 – 0,5 нг; №8-0,1 нг; №9 – 0 нг.
При разработке ВПК для постановки ПЦР «в реальном времени» к клонированному фрагменту гена 1700042G15 было подобрана пара праймеров и зонд меченый флуоресцентным красителем НЕХ.
Определение оптимальной концентрации плазмиды проводили при постановке ПЦР «в реальном времени» с образцами ДНК, выделенных из биоприманок, зараженных Ph. citricola. В состав реакционной смеси входили праймеры PHF/PHR, подобранный к ним зонд Ph.cit, с флуоресцентным красителем ROX, и праймеры Mus139F/Mus139R, с зондом Mus 139P, меченым красителем НЕХ (табл.6).
Внесение ВПК в реакционную смесь не влияло на специфичность зонда Ph.cit., подобранного для идентификации Ph. citricola. Во всех образцах регистрировалась флуоресценция по красителю ROX, значение порогового цикла варьировало в пределах 25,8-26,7. Для дальнейших исследований наиболее оптимальной концентрацией было внесение плазмиды в количестве 0,0005нг на реакцию.
Таблица 6 – Оптимизация концентрации плазмиды для разработки ВПК при постановке ПЦР «в реальном времени»
| Концентрация плазмиды, нг/мкл | Ct* ROX-специфичный Ph.citricola | Ct НЕХ-ВПК |
| 0,05 | 26,7 | 20,6 |
| 0,01 | 26,4 | 22,5 |
| 0,005 | 25,9 | 24,7 |
| 0,001 | 26,2 | 26,4 |
| 0,0005 | 25,8 | 28,1 |
| 0,0001 | 26,0 | 31,2 |
Примечание: *Ct ROX и Ct НЕХ- значение порогового цикла по красителю ROX и НЕХ соответственно
Полученные плазмиды были использованы для создания стоковых 10-ти кратных растворов внутреннего положительного контроля, которые в дальнейшем добавляли в реакционные смеси в соответствующих концентрациях.
Глава V. Разработка методов выявления и идентификации основных возбудителей фитофторозов малины и земляники методом мультиплексной ПЦР «в реальном времени».
5.1. Подбор праймеров и зондов, определение их специфичности. Для разработки мультиплексной ПЦР «в реальном времени» с целью одновременного выявления и дифференциации основных возбудителей фитофторозов малины и земляники был выбран наиболее вариабельный участок генома оомицетов ген Ypt1. Из базы данных GenВank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были отобраны нуклеотидные последовательности гена Ypt1 возбудителей фитофторозов малины и земляники. Также при анализе использовали данные секвенирования чистых культур Phytophthora sрp. из коллекции ФГБУ «ВНИИКР».
Подбор универсальных праймеров для возбудителей рода Phytophthora был основан на принципе комплементарности участков гена Ypt1 разных видов фитофторозов (рис. 2). В анализируемых последовательностях были определены консервативные участки (для подбора прямого и обратного праймеров) с наибольшей гомологией нуклеотидов между видами.
Рисунок 2 – Подбор прямого универсального праймера для мультиплексной диагностики Phytophthora spp. в режиме реального времени (точками обозначена идентичность нуклеотидов в последовательностях)
Подбор зондов специфичных для Ph. cactorum, Ph. fragariae, Ph. nicotianae и Ph. citricola основывался на принципе наименьшей комплементарности определенного участка гена Ypt1 аналогичным участкам других видов (рис. 3). В анализируемых последовательностях выбирали участки с наибольшим количеством несовпадений по нуклеотидам между видами.
Рисунок 3 – Подбор специфичного зонда для диагностики Ph. cactorum в режиме
реального времени
При определении специфичности зондов установлено, что флуоресценция по 4 красителям FAM - Ph. fragariae, НЕX - Ph. cactorum, ROX - Ph. nicotianae и Cy5 - Ph. citricola регистрировалась только при исследовании ДНК чистых культур этих возбудителей. При тестировании других видов фитофтор зафиксирован отрицательный результат, что свидетельствует об отсутствии перекрестных реакций.
Эксперименты показали, что 4 видоспецифичных зонда в одной пробирке способны выявлять искомый вид возбудителя фитофтороза, даже если он находился в смеси с другими видами рода Phytophthora (табл.7).
Таблица 7 – Мультиплексная ПЦР «в реальном времени» с различными видами возбудителей фитофторозов в одной пробирке
| ДНК, выделенная из различных возбудителей фитофторозов | Значение Ct* с подобранными зондами | |||
| Ph.FR-FAM | Ph.cac-HEX | Ph.cit-ROX | Ph.nic- CY5 | |
| Ph.fragariae | Ph.cactorum | Ph.citricola | Ph.nicotianaе | |
| Ph. fragariae | 24,7 | N/A** | N/A | N/A |
| Ph.cactorum | N/A | 24,6 | N/A | N/A |
| Ph. citricola | N/A | N/A | 27,7 | N/A |
| Ph. nicotianae | N/A | N/A | N/A | 29,0 |
| Ph. fragariae+Ph. nicotianae | 26,3 | N/A | N/A | 30,0 |
| Ph. fragariae+Ph. cactorum | 25,9 | 25,7 | N/A | N/A |
| Ph. fragariae+Ph. citricola | 29,7 | N/A | 30,5 | N/A |
| Ph. cactorum+Ph. nicotianae | N/A | 26,2 | N/A | 29,8 |
| Ph. cactorum+Ph. citricola | N/A | 28,0 | 31,0 | N/A |
| Ph.citricola+Ph. nicotianae | N/A | N/A | 28,9 | 28,9 |
| Ph. fragariae+Ph. cactorum +Ph. nicotianae | 26,7 | 26,7 | N/A | 30,4 |
| Ph. fragariae +Ph. cactorum +Ph. citricola | 29,1 | 28,4 | 29,4 | N/A |
| Ph. cactorum + Ph. nicotianae +Ph. citricola | N/A | 28,5 | 29,2 | 30,0 |
| Ph. fragariae +Ph. cactorum +Ph. nicotianae +Ph. citricola | 28,7 | 28,8 | 28,9 | 28,2 |
Примечание: *Ct-значение порогового цикла, **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции
5.2. Оптимизация мультиплексной ПЦР «в реальном времени»
Определение оптимальных условий мультиплексной ПЦР «в реальном времени» проводили на амплификаторе i-Cycler iQ5, Bio Rad, изменяя следующие параметры: температуру отжига пробы (от 500С до 660С) и концентрацию пробы (от 2,5пМ до 10пМ на реакцию). В результате проведенных исследований была определена оптимальная температура отжига подобранных зондов, она составила 53,2°С. При внесении каждого из четырех зондов в концентрации 5 пМ на реакцию были получены наилучшие результаты.
5.3 Определение чувствительности подобранных зондов при постановке ПЦР «в реальном времени»
Чувствительность разработанных проб определяли постановкой ПЦР «в реальном времени» с образцами серии разведений суспензии, содержащей известное количество мицелия возбудителя фитофтороза.
Применение последовательных разведений культур Ph. citricola, Ph. cactorum, Ph. nicotianae показало, что разное исходное количество мицелия незначительно повлияло на пределы обнаружения каждой из подобранных проб. Применение зонда, разработанного для идентификации Ph. citricola, позволяло выявить данного возбудителя в концентрации не менее 3,3х10-7 мг/мл. В то время как в другие зонды при таком количестве мицелия не были способны выявлять искомый вид фитофтороза. Зонды, специфичные для Ph. nicotianae и Ph. cactorum, характеризовала более низкая чувствительность, она составляла 2,0х10-5 мг/мл и 2,7х10-6 мг/мл соответственно.
Глава VI. Оптимизация методов выделения ДНК из биоприманок при диагностике фитофторозных корневых гнилей
Для определения оптимального метода выделения ДНК возбудителей фитофторозов проводили экстракцию ДНК разными методами из зараженных биоприманок. При этом учитывали количество и качество полученных образцов ДНК (табл.8).
Таблица 8 – Эффективность выделения ДНК из биоприманок различными методами
| № п/п | Метод выделения ДНК | Концентрация ДНК нг/мкл | Чистота ДНК | Значение Сt-Ph.cact | Значение Сt-ВПК | |
| 260/280 | 260/230 | |||||
| 1 | ChL+СТАВ | 428,0 | 1,44 | 0,88 | N/A* | N/A |
| 2 | LiCl 8М+ СТАВ | 358,1 | 1,40 | 0,83 | N/A | N/A |
| 3 | ChL+СТАВ (оптимизированный) | 190,4 | 1,51 | 0,97 | N/A | N/A |
| 4 | «ДНК-Экстран» | 593,1 | 1,13 | 0,77 | N/A | N/A |
| 5 | «Проба ГС» | 175,2 | 1,19 | 0,67 | N/A | N/A |
| 6 | «Сорб-ГМО-А» | 33,3 | 1,78 | 1,86 | 33,0 | 29,4 |
| 7 | «Сорб-С» | 155,9 | 1,11 | 0,28 | N/A | N/A |
| 8 | J. J. Doyle, J. L. Doyle | 104,4 | 2,0 | 1,84 | 26,0 | 25,8 |
| 9 | «Loewe» Phytoplasma | 104,9 | 1,76 | 1,21 | 31,5 | 28,6 |
Примечание: *Ct-значение порогового цикла, **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции
Было установлено, что все способы выделения позволяют получить образцы с высокой концентрацией ДНК, за исключением применения набора «Сорб-ГМО-А». При постановке ПЦР «в реальном времени» с образцами ДНК, выделенных методами №1-3, с использованием наборов «ДНК-Экстран», «Сорб-С», «Проба ГС» концентрация была наибольшей среди всех методов и составляла 175,2-428,0 нг/мкл. Однако, флуоресценция по красителям специфичного зонда и внутреннего положительного контроля не регистрировалась, что говорит об ингибировании ПЦР. Степень чистоты образцов ДНК, выделенных этими методами, была низкая.
Использование набора «Сорб-ГМО-А», выделение ДНК по методике, описанной J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990), согласно набору «Loewe» для диагностики Phytoplasma, позволяет получать ДНК возбудителя приемлемой чистоты. Несмотря на то, что концентрация выделенной ДНК значительно меньше по сравнению с ранее описанными методами (от 33,3 до 104,9 нг/мкл), при постановке ПЦР «в реальном времени» были получены положительные результаты. Положительное значение ВПК указывает на отсутствие ингибиторов реакции. При внесении в реакционную смесь ДНК Phytophthora sрp., выделенную в соответствии с методикой J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990) значение порогового цикла составляло 26,0. Такое значение было наименьшим по сравнению с другими методами выделения ДНК, что указывает на большее количество целевой ДНК, выделенной из образца при применении этого метода.
При постановке классической ПЦР с применением внутреннего положительного контроля были подтверждены результаты описанные выше. На рисунке 4 представлены амплифицированные фрагменты гена Ypt1 с молекулярной массой 470 п.о. и фрагменты гена мыши 1700042G15-внутреннего контроля – размером 714 п.о.
Рисунок 4 – Электрофореграмма продуктов амплификации с праймерами Yph1F/Yph2R. Методы выделения ДНК: 1,2- ChL+СТАВ; 3,4- LiCl 8М+СТАВ; 5,6-ChL+СТАВ (оптимизированный); 7,8-«ДНК-Экстран»; 9,10-«Проба ГС»; 11,12-«Сорб-ГМО-А»; 13,14-«Сорб-С»; 15,16- J. J. Doyle & J. L. Doyle; 17,18-«Loewe» Phytoplasma; 19-вода; 20- положительный контроль
Использование метода количественного анализа возбудителя при постановке ПЦР «в реальном времени», позволило определить наибольшую концентрацию патогена в исследуемом материале (табл.9).
Таблица 9 – Зависимость количества возбудителя фитофтороза от места отбора пораженной ткани в биоприманке
| №п/п | Часть биоприманки | Количество пропагул, шт | Среднее значение* | ||||
| 1 | Некротизированная ткань | 2253,1 | 549,2 | 7522,1 | 3609,8 | 724,1 | 2931,6a |
| 2 | Здоровая ткань | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0,0 | 0b |
| 3 | Граница некротизированной и здоровой ткани | 6613,7 | 2112,4 | 6708,1 | 2478,5 | 1902,9 | 3963,1a |
| 4 | Некротиз. тк. рядом со здоровой тканью | 1861,0 | 3019,9 | 1844,7 | 7884,3 | 4037,1 | 3729,4а |
| 5 | Здоровая ткань вблизи некротизированной | 68,6 | 14,8 | 0,0 | 64,3 | 0,0 | 29,5b |
Примечание: *Разные буквы обозначают статистически значимые различия значений, определенные критерием Дункана (при р<0,05)
При сравнении разных мест отбора ткани из биоприманки для выделения ДНК возбудителей Phytophthora spр. было установлено, что между вариантами некроз, некроз и здоровая ткань, некроз до здоровой ткани нет статистически достоверных различий. Можно рекомендовать одно из указанных мест в биоприманке для выделения ДНК в соответствии с методикой J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990).
Для определения оптимальной навески зараженной биоприманки, необходимой для выявления возбудителя фитофтороза при постановке ПЦР « в реальном времени», были использованы образцы последовательных разведений Ph. citricola, содержащие известную массу мицелия возбудителя (мкг). Программное обеспечение Bio Rad IQ5 строило стандартную кривую зависимости порогового цикла (Ct) от количества мицелия, что позволяло определить количество мицелия фитофтороза в разных навесках биоприманки на основе значений их Ct (табл.10).
Таблица 10 – Влияние массы биоприманки на значение Сt при диагностике
Ph. citricola ПЦР «в реальном времени»
| № п/п | Масса биоприманки, мг | Среднее Ct ВПК | Среднее Ct-Ph.cit от положительных значений* | Масса мицелия, мкг** | % положит. значений Ct- Ph.cit |
| 1 | 1 | 25,9 | 34,1 a | 0,7 | 60,0 |
| 2 | 5 | 25,8 | 29,9 b | 57,4 | 100,0 |
| 3 | 10 | 26,1 | 29,9 b | 42,3 | 80,0 |
| 4 | 15 | 26,0 | 30,1 b | 94,5 | 80,0 |
| 5 | 20 | 25,9 | 29,5 bс | 154,9 | 60,0 |
| 6 | 25 | 26,2 | 27,8 bс | 207,2 | 60,0 |
| 7 | 30 | 25,9 | 26,6 bc | 289,3 | 60,0 |
| 8 | 40 | 26,0 | 26,7 bc | 341,7 | 60,0 |
| 9 | 50 | 26,0 | 27,7 bc | 391,5 | 40,0 |
| 10 | 60 | 26,2 | 26,3 c | 567,6 | 20,0 |
Примечание: *Разные буквы обозначают статистически значимые различия значений, определенные критерием Дункана (при р<0,05), **Масса мицелия возбудителя фитофтороза в пораженной биоприманке
Было установлено, что с увеличением массы растительной ткани, отбираемой для исследования, возрастала масса мицелия возбудителя. Максимальное количество мицелия 567,6 мкг выявлено в навесках массой 60 мг, что можно было предположить. Однако, доля положительных значений порогового цикла по зонду Ph.cit при такой навеске биоприманки составила всего 20%. Следовательно, при больших количествах отбираемого материала, возможность идентифицировать возбудителя сокращается. Вероятнее всего, это связано с увеличением в образце растительной ДНК, что приводит к ингибированию ПЦР.
Статистический анализ различий значений порогового цикла (Ct) в зависимости от массы биоприманки показал, что значимо не различаются навески биоприманки от 5 мг до 50 мг. Однако, только при массе отбираемой ткани, равной 5 мг, положительные значения порогового цикла были отмечены во всех случаях. При массе 10-15 мг положительные значения Ct были получены в 80% случаев. По нашему мнению, такие навески образца для выявления фитофтороза малины и земляники являются наиболее оптимальными по сочетанию в себе количества возбудителя и растительной ткани.
Заключительным показателем оптимизации выделения ДНК из биоприманок было определение времени отбора образцов для молекулярно-генетических исследований. Для этого отбирали биоприманки с разной степенью поражения фитофторозами поверхности листовой пластинки: до 10% поверхности, от 11% до 25%, от 26% до 50%, свыше 50% поверхности (табл.11). С образцами выделенной ДНК проводили постановку ПЦР «в реальном времени».
Таблица 11 – Влияние степени поражения биоприманки на значение Сt при диагностике Ph.citricola методом ПЦР «в реальном времени»
| № п/п | Фото | Некротизация приманки, % | Среднее Ct ВПК | Среднее Ct-Ph.cit от положительных значений* | % положит. значений Ct- Ph.cit |
| 1 |   | до 10 | 28,3 | 26,7 a | 71,4 |
| 2 |   | 11-25 | 29,4 | 29,7 b | 71,4 |
| 3 |   | 26-50 | 29,5 | 30,5 b | 57,1 |
| 4 |   | свыше 50 | 30,7 | 29,9 b | 42,9 |
Примечание: *Разные буквы обозначают статистически значимые различия значений, определенные критерием Дункана (при р<0,05).
Было установлено, что наибольшее число положительных значений порогового цикла свойственно для биоприманок, степень поражения которых не превышает 25%. Наибольшее количество отрицательных результатов было получено при отборе ткани биоприманки, степень некротизации которой была выше 50%, доля положительных результатов при этом составила 42,9 %.
Минимальные значения Ct и наименьшее ингибирование ПЦР отмечено при использовании образцов ДНК, полученных из биоприманок с пораженностью менее 10%. Из приведенных данных в таблице 11 видно, что применение таких образцов для дальнейших исследований позволяло получить значение порогового цикла в среднем 26,7. Для остальных образцов ДНК, выделенных из биоприманок некротизированных более 10%, этот показатель статистически значимо выше. Таким образом, наиболее эффективно выделение ДНК возбудителей фитофторозов земляники и малины (при наименьших значениях Ct и высокой доле положительных значений) происходит из приманок с поражением, не превышающим 10%. В практических целях диагностики возможно применение биоприманок с некротизацией тканей до 25%.
Глава VII. Экономическая эффективность методов диагностики возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники
7.1. Экономическая эффективность пробоподготовки образцов для молекулярной диагностики фитофторозов малины и земляники
Для расчета экономической эффективности сравнивали оптимизированный метод выделения ДНК из биоприманок и экстракцию ДНК из зараженных корней, метод, который в настоящее время используют в зарубежных исследованиях (табл.12).
Таблица 12 – Материальные затраты на выделение ДНК одного образца при диагностике основных возбудителей фитофторозных корневых гнилей малины и земляники, руб.
| Статья расхода | Выделение ДНК из биоприманок | Выделение ДНК из корней |
| Коммунальные услуги, связанные с выделением ДНК | 3,7 | 4,4 |
| Амортизация оборудования | 1,8 | 1,7 |
| Амортизация помещения | 1,9 | 2,7 |
| Затраты на оплату труда специалиста | 212,6 | 250,1 |
| Расходные материалы | 156,5 | 167,9 |
| Сумма прямых затрат | 376,5 | 426,7 |
| Общепроизводственные затраты | 257,2 | 298,7 |
| Себестоимость теста (выделение ДНК) | 633,7 | 725,5 |
| Себестоимость теста получения приманок* | 297,6 | 1138,5 |
| Себестоимость теста (приманка+выделение ДНК) | 931,3 | 1864,0 |
| Примечание: *Головин,2001 |
По результатам проведенных расчетов наиболее оптимальным является применение комбинированной диагностики фитофторозов: выделение ДНК из биоприманок, полученных согласно методике Головина С.Е. (2001). Себестоимость пробоподготовки одного образца согласно этому методу в 2,0 раза ниже себестоимости экстракции ДНК из корней-приманок, полученных по Дункану (Duncan,1990). Применение плавающих биоприманок, как образцов для выделения ДНК, позволяет сократить длительность пробоподготовки и последующего анализа до 3-4 дней. Тогда как использование зараженных корней для экстракции ДНК увеличивает продолжительность анализа до 5,5 недель.
7.2. Экономическая эффективность метода мультиплексной ПЦР в режиме реального времени при диагностике фитофторозов малины и земляники
Определение экономической эффективности мультиплексной ПЦР «в реальном времени» проводили в сравнении с классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени», когда идентификация возбудителей фитофторозов проходит в разных пробирках с использованием праймеров и зондов специфичных для вида.
Согласно полученным расчетам, затраты на диагностику основных возбудителей фитофторозных гнилей корней малины и земляники методом мультиплексной ПЦР «в реальном времени» составили 405,1 руб., раздельная идентификация четырех видов в режиме реального времени обходится дороже и составляет 1128,9 руб. (табл. 13).
Таблица 13 – Материальные затраты на диагностику основных возбудителей (4 вида) фитофторозных корневых гнилей малины и земляники различными методами, руб.
| Статья расхода | Классическая ПЦР (4 пары праймеров) | Раздельная идентификация ПЦР «в реальном времени» (4 пары праймеров, 4 зонда) | Мультиплексная ПЦР «в реальном времени» (1 пара праймеров, 4 зонда) |
| Коммунальные услуги, связанные с выполнением ПЦР | 6,2 | 5,9 | 3,1 |
| Амортизация оборудования | 168,9 | 268,2 | 67,2 |
| Амортизация помещения | 3,96 | 2,98 | 0,99 |
| Затраты на оплату труда специалиста | 437,7 | 308,6 | 121,5 |
| Расходные материалы | 178,9 | 78,4 | 45,0 |
| Сумма прямых затрат | 795,6 | 664,1 | 238,3 |
| Общепроизводственные затраты | 556,9 | 464,8 | 166,8 |
| Себестоимость теста | 1352,5 | 1128,9 | 405,1 |
| Себестоимость теста (в расчете на одного возбудителя) | 338,1 | 282,2 | 101,3 |
Тестирование образцов методом классической ПЦР составило 1352,5 руб. Метод мультиплексной ПЦР «в реальном времени» экономически эффективнее идентификации каждого возбудителя фитофтороза в отдельной пробирке в режиме реального времени в 2,7 раза. Увеличение себестоимости последнего связано с увеличением числа проводимых манипуляций и приобретением дополнительных расходных материалов.
Себестоимость анализа методом классической ПЦР в 3,3 раза дороже метода мультиплексной ПЦР «в реальном времени». При этом, применение данного метода дает возможность получения результата в течении 8,5 часов, тогда как продолжительность разработанного метода составляет 2 часа. Мультиплексная ПЦР «в реальном времени» по срокам проведения более чем в 3 раза быстрее классической ПЦР, что очень актуально для проведения фитосанитарной экспертизы, где получение результата в короткие сроки является одним из важнейших показателей метода.
Полученные данные показывают, что разработанная нами мультиплексная ПЦР «в реальном времени» может эффективно использоваться в комплексе с пробоподготовкой биоприманок, полученных по методике Головина С.Е. (2001) для диагностики возбудителей корневых гнилей рода Phytophthora.
ВЫВОДЫ
- В результате проведенных обследований насаждений малины и земляники, а также посадочного материала отечественного и импортного происхождения было установлено, что в большинстве случаев с корневыми гнилями этих культур ассоциировались оомицеты Ph. cactorum, Ph. nicotianaе, Ph. citricola.
- Применение молекулярных методов идентификации позволило подтвердить наличие в насаждениях малины карантинного объекта Ph. fragariae var. rubi, а в импортном посадочном материале этой культуры - Ph. syringae, Ph.cryptogea и ранее не выявленного в нашей стране вида Ph. tentaculata.
- Оптимальным методом выделения ДНК Phytophthora sрp. из чистых культур является пробоподготовка с использованием набора «ДНК-Экстран» (ЗАО «Синтол», Москва), что было подтверждено постановкой классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени». Постановка иммуноспецифической ПЦР также может служить методом выделения ДНК.
- Разработана система внутреннего положительного контроля, с применением фрагмента гена мыши, встроенного в вектор pTZ57R/T (Fermentas, США), для проведения классической ПЦР и ПЦР в режиме реального времени при диагностике возбудителей рода Phytophthora.
- Установлено, что оптимальное выделение ДНК из биоприманок для молекулярной диагностики фитофторозов достигается из образца массой 5 мг, отобранного в месте некроза или на границе здоровой и пораженной ткани приманки, со степенью некротизации не превышающей 10 %.
- На основе выровненных последовательностей гена Ypt1 возбудителей фитофторозов малины и земляники подобраны праймеры универсальные для рода Phytophthora sрp. и меченные флуоресцентными красителями (НЕХ, FAM, Су5, ROХ) зонды, специфичные для Ph. cactorum, Ph. fragariae, Ph nicotianae, Ph. citricola, соответственно.
- Подобранные праймеры и зонды позволяют проводить мультиплексную ПЦР «в реальном времени» для выявления и идентификации четырех видов оомицетов Ph. nicotianae, Ph. citricola, Ph. fragariae и Ph. cactorum в одной пробирке. Чувствительность мультиплексной ПЦР «в реальном времени» составила не менее 3,3х10-7 мг/мл.
- Разработанная мультиплексная ПЦР «в реальном времени» может эффективно использоваться в комплексе с методом плавающих биоприманок, что позволяет сократить длительность пробоподготовки и последующего анализа до 3-4 дней и уменьшить его себестоимость в 3,3 раза.
Рекомендации по практическому применению
- Для диагностики Phytophthora spp. в почве (в том числе и карантинного вида Ph. fragariae) следует использовать сочетание двух методов: плавающих биоприманок (Головин, 2001) и метода ПЦР (в классическом формате и в режиме реального времени).
- При тестировании методом ПЦР для повышения достоверности получаемых результатов выделение ДНК из биоприманок следует проводить согласно методике описанной J.J. Doyle, J.L. Doyle (1990), при этом оптимальная навеска биоприманки 5 мг (допустимо до 15мг), оптимальная степень некротизации до 10% (допустимо до 25%).
- С целью сохранения образцов не рекомендуется замораживать биоприманки до -20С, кратковременное замораживание в течение 1-2 суток приводит к получению ложноотрицательных результатов. В большинстве случаев рекомендуется хранить зараженные приманки при +4°С не более 2 суток.
- Для амплификации внутреннего положительного контроля (ВПК) в классической ПЦР концентрация вносимой плазмиды должна составлять 0,1 нг/реакцию, при постановке ПЦР в режиме реального времени наиболее оптимальным количеством плазмиды является 0,0005 нг/реакцию.
- С целью выявления и дифференциации основных возбудителей фитофторозов методом ПЦР «в реальном времени» в качестве мишени для разработки праймеров и проб необходимо выбирать наиболее вариабельный участок возбудителей Phytophthora spp. ген ras-related protein Ypt1.
- Для диагностики фитофторозов малины и земляники рекомендуется использовать оптимизированные методы пробоподготовки биоприманок в сочетании с мультиплексной ПЦР «в реальном времени» и классической ПЦР с последующим секвенированием гена Ypt1.
Список публикаций по теме диссертации
- Александров, И.Н. Фитофторозные гнили корней земляники/И.Н. Александров, М.Б. Копина, И.П. Дудченко//Карантин растений, наука и практика. – 2013. – №3. – С. 49-55.
- Дудченко, И.П. Микобиота посадочного материала малины/И.П. Дудченко, О.В. Скрипка, М.Б. Носкина//Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2010. – №1. – С. 99.
- Копина, М.Б. Сочетание метода биоприманок и ПЦР «в реальном времени» для диагностики корневых гнилей малины и земляники, вызываемых оомицетами рода Phytophthora/М.Б. Копина, Е.С. Мазурин, С.Е. Головин//Плодоводство и ягодоводство России. – 2012. – Т.29, №1. – С. 245-252.
- Мазурин, Е.С. Контроль достоверности результатов фитосанитарной экспертизы при использовании молекулярных методов диагностики/Е.С. Мазурин, М.Б. Копина, Н.А. Шероколава//Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство. – 2012. – №3. – С. 31-38.
- Носкина, М.Б., Патогенный комплекс грибов посадочного материала малины/М.Б. Носкина, О.В. Скрипка, И.П. Дудченко, Т.А. Сурина, С.В. Никифоров//Плодоводство и ягодоводство России.–2010.–Т.24, №2.–С. 431- 436.
- Скрипка, О.В. Видовой состав микрофлоры насаждений земляники и малины Московской области/О.В. Скрипка, И.Н. Александров, И.П. Дудченко, Т.А. Сурина, С.В. Никифоров, М.Б. Носкина//Защита и карантин растений. – 2010. – №3. – С.55- 57.
- Сурина, Т.А. Диагностика возбудителей рода Phytophthora методом ПЦР «в реальном времени»/Т.А. Сурина, М.Б. Копина, Е.С. Мазурин //Современная микология в России. Тезисы докладов третьего съезда микологов России. – 2012. – Т.3. – С.97.
- Kopina, M. Development of molecular markers and probes for detection of P. ramorum, P.nicotianae, P. citricola, P. fragariae and P. cactorum/M. Kopina, T. Surina, E. Mazurin //Abstract working party “6th IUFRO Working Party 7.02.09 Phytophthora in Forests and Natural Ecosystems”. – Cordoba, Spain, 2012. – Р. 94-95.
- Prihodko, J. Using DNA Sequencing for Diagnosis of Certain Pests of Quarantine Concern for the Russian Federation / J. Prihodko, E. Mazurin, N. Sherokolava, M. Kopina//Summaries of presentation and posters “QBOL–EPPO Conference on DNA Barcoding and diagnosis methods for plant pests”. – Harlem, Netherland, 2012. – P. 30
