Градиентный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии как унифицированный метод определения наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ

На правах рукописи

ПЕРЕДЕРЯЕВ ОЛЕГ ИГОРЕВИЧ

Градиентный вариант Высокоэффективной жидкостной хроматографии как унифицированный метод определения Наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ

15.00.02. Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

МОСКВА – 2006

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия

им. И.М. Сеченова

Научный руководитель:

Академик РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

Берлянд Александр Семенович

кандидат фармацевтических наук, профессор

Изотов Борис Николаевич

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений РАСХН

Защита состоится «_____» __________________2006 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова (119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова, по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49

Автореферат разослан «_____»_________________2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Определение наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ остается одной из наиболее актуальных проблем современного анализа: за последние 20 лет произошел взрывной рост числа злоупотреблений веществами этих групп, существенно расширился диапазон используемых для этих целей веществ.

За последнее время списки наркотических средств и психотропных веществ претерпели относительно небольшие изменения (последний раз в 1998 году). Однако списки сильнодействующих веществ меняются достаточно регулярно в сторону добавления новых наименований. И после каждого такого изменения необходимо создавать и утверждать новые методические рекомендации по качественному и количественному определению вновь добавленных веществ. Принимая во внимание большую номенклатуру наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ такой подход не всегда является рациональным.

Другой не менее актуальной проблемой является разработка и внедрение скрининговых методов анализа сложных смесей веществ. Важность этой проблемы связана со значительным увеличением количества фальсифицированной продукции на рынке России. Особенно опасно появление такой продукции в сфере обращения лекарственных средств и продуктов питания (в т.ч. биологически активных добавок к пище).

Учитывая вышесказанное, актуальной является разработка унифицированных подходов к анализу наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также многокомпонентных лекарственных средств, биологически активных добавок к пище.

Цель и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлась разработка унифицированных методик анализа наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин, и биологически активных добавок к пище.

Задачи исследования:

1. Разработка методик пробоподготовки исследуемых объектов.
2. Разработка состава подвижной фазы и условий градиентного элюирования.
3. Выбор оптимального подхода к детектированию исследуемых веществ.
4. Расчет и оценка параметров пригодности хроматографической системы в выбранных условиях.
5. Использование разработанных методик в анализе наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин, и БАД к пище.

Научная новизна.

Впервые разработана методика ВЭЖХ, позволяющая за один анализ выявлять и оценивать содержание некоторых наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ (26 веществ), качественно и количественно определять состав ряда многокомпонентных лекарственных средств (20 торговых наименований, содержащих 14 компонентов), определить содержание индикаторных компонентов ряда БАД к пище (более 20 веществ).

Практическая значимость.

Предложен и внедрен метод, позволяющий в течение часа определить:

• присутствие или отсутствие в образце ряда наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также их содержание;
• качественный и количественный состав многокомпонентного лекарственного средства содержащего кодеин;
• подтвердить подлинность и оценить качество некоторых БАД к пище посредством определения индикаторных веществ различных компонентов БАД к пище.

Методика внедрена в экспертно-криминалистическом центре (ЭКЦ) при ГУВД г. Москвы и ЭКЦ МВД РФ для решения задач по определению наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ и выявлению фальсифицированных лекарственных средств. Разработаны методические рекомендации по определению наркотических средств, сильнодействующих и психотропных веществ ЭКЦ при ОУВД и ЭКЦ при УВД на метрополитене: «Общие рекомендации по использованию системы «Breeze» в ЭКЦ при ОУВД и УВД на Метрополитене».

Также методика был успешно применена в ГУ НИИ питания РАМН для определения различных веществ в составе БАД к пище: антоцианинов и антоцианидинов, органических кислот, витаминов (В1, В2, В6, РР, Вс (фолиевая кислота)), и других веществ (кофеин, теобромин, теофеллин, гингерол, гуггулостероны E и Z, бетулин, филлантин, цитринин и охратоксин А и др.).

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на XII (Москва, 2005 год) и XIII (Москва, 2006 год) Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» и IV-ой межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека» (Санкт-Петербург, 2006). Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (19 мая 2006 г.).

Публикации.

По результатам проведенных исследований опубликовано 8 печатных работ.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ государственной регистрации 01.200.110545).

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и 3 приложений.

Работа представлена на 104 страницах машинописного текста и иллюстрирована 11 таблицами и 38 рисунками.

Библиографический указатель включает 118 названий (34 из которых зарубежные).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методика пробоподготовки исследуемых объектов.
2. Составы подвижной фазы и условия градиентного элюирования.
3. Способы детектирования исследуемых веществ.
4. Пригодность предложенных хроматографических систем.
5. Возможность использования разработанных методик в анализе наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин, и БАД к пище.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования.

1. Образцы, изымаемые в ходе оперативных мероприятий, проводимых сотрудниками министерства внутренних дел, содержащие в своем составе следующие наркотические средства, психотропные и сильнодействующие вещества: 6-моноацетилморфин, азалептин, амфетамин, бензобарбитал, героин, диазепам, ДМА (d, l-2,5-диметокси-альфа-метил-фенил-этиламин), ДОЮ (d, l-2,5-диметокси-4-бром-амфетамин), кетамин, клофелин, кодеин, кокаин, ЛСД (d-лизергид), МДМА, морфин, нитразепам, парацетамол, трамадол, тригексифенидил (циклодол), феназепам, фенобарбитал, хлоропирамин (супрастин), хлорохин.
2. Многокомпонентные лекарственные средства: Каффетин, Но-шпалгин, Нурофен плюс, Омнопон р-р д/и 1%, Паракодамол, Паркоцет, Пенталгин-ICN, Пенталгин-Н, Пенталгин-Н.С., Пенталгин-Нова, Пенталгин-ФК, Пенталгин-ФС, Пентальфен-МЭЗ, Пентамиалгин, Пиралгин, Проходол форте, Седал-М, Седальгин-Нео, Солпадеин, Тетралгин. В состав указанных лекарственных средств входили следующие исследуемые вещества: кодеин, морфин, парацетамол, кофеин, метамизол натрий, фенобарбитал, пропифеназон, дротаверин, ибупрофен, ацетилсалициловая кислота, напроксен, наркотин, папаверина гидрохлорид, тебаин.
3. Биологически активные добавки к пище, сертифицируемые в ГУ НИИ питания РАМН.

Стандартные образцы.

При исследовании многокомпонентных лекарственных средств и биологически активных добавок к пище в качестве стандартных образцов использовались образцы, приобретенные у компании «Sigma-Aldrich Co», а также предоставленные компаниями-производителями.

При исследовании наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ в качестве стандартных образцов использовались образцы, приобретенные у компании «Sigma-Aldrich Co», и образцы с заранее известным составом.

Хроматографические системы.

Хроматографическая система «Waters Alliance»: жидкостный хроматограф «Waters 2695 Separations Module Alliance» со встроенным дегазатором подвижной фазы, устройством автоматического ввода проб и термостатом колонки; диодно-матричным детектором «Waters 996». Управление системой и обработку полученных хроматограмм осуществляли при помощи программы Millenium 32.

Хроматографическая система «Agilent 1100 Series»: жидкостный хроматограф «Agilent 1100 Series» с дегазатором подвижной фазы, устройством автоматического ввода проб (с термостатом лотка) и термостатом колонки; диодно-матричным детектором «Agilent 1100 Series». Управление системой и обработку полученных хроматограмм осуществляли при помощи программы «Chemstation».

Условия хроматографирования и детектирования.

Cкрининговое определение наркотических средств,

сильнодействующих и психотропных веществ.

Состав подвижной фазы. Компонент A: ацетонитрил; компонент B: к 1 л дистиллированной деионизированной воды добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты и диэтиламин до рН 4,0;

Форма градиента: линейная

№	Время, мин	%A	%B
1	0	10	90
2	30	90	10
3	32	10	90
4	40	10	90

Скорость потока: 0,8 мл/мин;

Объем вводимой пробы: 5-100 мкл;

Колонка «Nova-Pak®» C18, 3,9x150 мм, 4 мкм; температура колонки 40°С.

Детектирование: режим сканирования с шагом 1,2 нм (диапазон сканирования - 200-500 нм).

Исследование многокомпонентных лекарственных средств

и БАД к пище.

Состав подвижной фазы: компонент A: ацетонитрил; компонент B: к необходимому объему дистиллированной деионизированной воды добавляли трифторуксусную кислоту до рН 3,0.

Форма градиента: линейная

№	Время, мин	%A	%B
1	0	5	95
2	30	90	10
3	32	5	95
4	40	5	95

Скорость потока: 0,9 мл/мин.

Объем вводимой пробы: 5-50 мкл.

Неподвижная фаза: колонка «Atlantis», С18, 4,6х250 мм, 5 мкм; температура термостата колонки 30°С.

Детектирование: 210 нм, 254 нм, 274 нм, 285 нм (для получения спектров использовали диапазон сканирования - 200-500 нм).

Тест пригодности хроматографических систем

Хроматографическая система считалась пригодной, если выполнялись следующие условия:

а) порядок выхода пиков на хроматограмме стандартных образцов следующий: морфин, кодеин, героин, кокаин, тригексифенидил (для скринингового метода анализа наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ); морфин, кодеин, кофеин, папаверин, ацетилсалициловая кислота (для метода анализа многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин);

б) разрешение пиков на хроматограмме раствора стандартных образцов должно быть не менее: для морфина и кодеина - 4,0; для кодеина и героина (кодеина и кофеина) - 3,0; для героина и кокаина (кофеина и папаверина)- 5,0, для кокаина и тригексифенидила (папаверина и ацетилсалициловой кислоты) - 6,0;

в) коэффициент асимметрии пика кодеина, рассчитанный по хроматограмме раствора стандартного образца, должен быть не более 1,2; для кофеина не более 1,2 (для обоих методов);

г) эффективность колонки, рассчитанная по пику кодеина, должна быть не менее 5000 теоретических тарелок, для папаверина не менее 10000 теоретических тарелок (для обоих методов);

д) относительные стандартные отклонения площадей пиков, рассчитанные по результатам 5 вводов растворов стандартных образцов для анальгина, парацетамола, кофеина, ацетилсалициловой кислоты не должны превышать 2 %, для кодеина - 5 % (для метода анализа многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин) и для морфина, кодеина, героина, кокаина, тригексифенидила не должны превышать 5 % (для скринингового метода анализа наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ).

Пробоподготовка.

Пробоподготовка исследуемых образцов состояла из следующих этапов: растворение, разбавление (концентрирование) и фильтрование.

Скрининговое определение наркотических средств,

психотропных и сильнодействующих веществ:

Если исследуемый образец находился в твердом агрегатном состоянии, навеску образца растворяли в необходимом объеме подходящего растворителя (вода, метанол, смесь ацетонитрил-вода, подвижная фаза).

В тех случаях, когда исследуемый образец находился в растворе, анализировали либо непосредственно образец, либо его часть, предварительно разведенную в необходимом объеме подходящего растворителя.

Если исследуемый образец находился в растворе в следовых количествах, или был непригоден для анализа, то жидкость или выпаривали досуха, или проводили жидкость-жидкостную экстракцию подходящим экстрагентом, после чего экстракт также выпаривали досуха. Сухой остаток растворяли в необходимом объеме подходящего растворителя.

При постановке задачи определить наличие (или отсутствие) тех или иных веществ на поверхностях предоставленного изделия (качественное исследование), с поверхностей изделия делали смыв. Смыв упаривали досуха, а сухой остаток растворяли в 300 мкл подходящего растворителя.

Полученные растворы фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и исследовали.

Исследование многокомпонентных лекарственных средств

и БАД к пище.

Около 0,02 г (точная навеска) порошка растертых таблеток (или содержимого капсулы) помещали в мерную колбу на 50 мл и добавляли 30 мл метанола, встряхивали в течение 15 минут, доводили до метки метанолом и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и исследовали.

Скрининговое определение наркотических средств, сильнодействующих и психотропных веществ.

Анализ стандартных образцов для занесения в библиотеку, равно как и образцов поступивших на исследование, проводили строго в одних и тех же условиях.

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляли путем сравнения времени удерживания со стандартом и сравнения УФ-спектра каждого компонента анализируемого образца с имеющейся библиотекой. Библиотека создавалась путем анализа стандартных образцов и образцов с заранее известным составом.

Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки двумя способами:

1. С использованием аналитической длины волны – хроматограмма обрабатывалась на длине волны, характерной для каждого исследуемого соединения.
2. Без использования аналитической длины волны – обрабатывалась «максимальная» хроматограмма (в каждой точке отражалось значение той длины волны, поглощение на которой было максимальным).

На рисунке 1 представлена хроматограмма образца изъятого опия, основными компонентами которого являются морфин, кодеин, тебаин, папаверин и наркотин.

Рис. 1. Хроматограмма образца изъятого опия.

При помощи разработанной методики были обработаны и занесены в библиотеку более двух десятков соединений, аналитические длины волн и хроматографические характеристики которых представлены в таблице 1. Для большинства из них была показана возможность количественной оценки (таблица 2), а при анализе некоторых из них (кокаин, диазепам, ДМА, ДОБ, кетамин, клофелин, ЛСД, МДМА, трамадол и др.) она успешно проводилась. Выбор соединений определялся задачами, решаемыми лабораторией за отчетный период. Метрологическая оценка методики представлена в таблице 3.

Таблица 1. Хроматографические характеристики и аналитические длины волн исследуемых наркотических средств, психотропных, сильнодействующих и сопутствующих веществ.

№		Наименование	tR, мин	ан, нм	к	N	As		R
	1	Парацетамол	2,5	284	0,88	3180	1,2	1,87 1,04 2,04 1,02 1,02 1,15 1,02 1,01 1,02 1,11 1,04 1,03 1,06 1,06 1,42 1,00 1,01 1,13 1,07 1,02 1,12 1,02 1,04 1,22 1,07	4,12 0,32 9,60 0,32 0,32 3,00 0,44 0,20 0,30 2,03 0,71 0,56 0,98 1,03 7,69 0,02 0,14 3,58 2,05 0,66 3,39 0,54 1,22 7,14 2,62
	2	6-моноацетилморфин	3,5	285	1,64	4190	1,1
	3	Морфин	3,6	285	1,70	4040	1,1
	4	Кетамин	6,0	269	3,48	8350	1,2
	5	Амфетамин	6,1	258	3,54	9150	1,2
	6	Кодеин	6,2	285	3,60	11900	1,1
	7	Клофелин	6,9	272	4,16	8960	1,2
	8	Тебаин	7,0	285	4,29	11200	1,1
	9	Героин	7,1	285	4,29	13700	1,1
	10	МДМА	7,2	286	4,36	12600	1,1
	11	Хлорохин	7,8	340	4,84	12100	1,2
	12	Папаверин	8,1	310	4,84	13500	1,2
	13	ДМА (d, L-2,5-диметокси-альфа-метил-фенил-этиламин)	8,3	291	5,19	14300	1,1
	14	Фенобарбитал	8,7	262	5,47	10100	1,2
	15	Наркотин	9,1	254	5,47	13200	1,1
	16	ДОБ (d, L-2,5-диметокси-4-бром-амфетамин)	12,4	296	8,20	17300	1,1
	17	Трамадол	12,4	272	8,21	19700	1,2
	18	Нитразепам	12,5	310	8,25	18100	1,1
	19	Кокаин	13,9	274	9,31	14700	1,1
	20	ЛСД (d-Лизергид)	14,7	314	9,92	18400	1,1
	21	Феназепам	15,0	318	10,13	19700	1,2
	22	Диазепам	16,6	314	11,32	21000	1,2
	23	Азалептин	16,9	290	11,52	23400	1,2
	24	Бензобарбитал	17,5	285	11,97	19300	1,1
	25	Тригексифенидил (Циклодол)	21,0	258	14,61	39700	1,2
	26	Хлоропирамин (Супрастин)	22,4	306	15,59	41700	1,1

где: tR – время удерживания, минуты; ан – аналитическая длина волны, нм;
к – коэффициент емкости; N – число теоретических тарелок; As – коэффициент асимметрии, – селективность; R – степень разделения, разрешение.

Таблица 2. Параметры количественного определения исследуемых наркотических средств, психотропных, сильнодействующих и сопутствующих веществ.

№	Наименование	Предел обнаружения (соотношение сигнал-шум 1:3), мг/л	Предел кол. определения (соотношение сигнал-шум 1:10), мг/л	Диапазон линейных концентр., мг/л	Коэфф. корр.
1	Азалептин	0,34	1,7	3,0-1000	0,99995
2	Амфетамин	0,17	0,9	1,0-1000	0,99998
3	Бензобарбитал	0,91	5,1	10,0-1000	0,99996
4	Героин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99998
5	Диазепам	0,87	3,1	5,0-1000	0,99996
6	ДМА	0,16	1,8	5,0-1000	0,99997
7	ДОБ	0,11	1,7	5,0-1000	0,99998
8	Кетамин	0,35	2,2	5,0-1000	0,99998
9	Клофелин	0,14	1,3	5,0-1000	0,99989
10	Кодеин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99995
11	Кокаин	0,35	1,9	5,0-1000	0,99998
12	ЛСД (d-Лизергид)	0,08	0,3	0,5-200	0,99999
13	МДМА	0,32	1,2	5,0-1000	0,99998
14	Морфин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99996
15	Нитразепам	0,93	4,1	10,0-1000	0,99997
16	Трамадол	0,57	2,5	5,0-1000	0,99998
17	Тригексифенидил	0,41	3,1	5,0-1000	0,99989
18	Феназепам	0,75	3,9	10,0-1000	0,99995
19	Фенобарбитал	0,91	5,3	10,0-1000	0,99998

Таблица 3. Метрологическая оценка количественного определения исследуемых наркотических средств, психотропных, сильнодействующих и сопутствующих веществ.

№	Наименование	Х ном, мг	Хср, мг	S2	S	SХср		t (, f)	х	%
1	Азалептин	50	50,7	1,200	1,095	0,490	0,05	2,78	0,960	1,89
2	Амфетамин	50	51,1	0,800	0,894	0,400	0,05	2,78	0,784	1,53
3	Бензобарбитал	50	50,32	0,897	0,947	0,424	0,05	2,78	0,830	1,65
4	Героин	10	10,08	0,062	0,249	0,111	0,05	2,78	0,218	2,17
5	Диазепам	50	50,82	1,267	1,126	0,503	0,05	2,78	0,987	1,94
6	ДМА	5	4,976	0,008	0,087	0,039	0,05	2,78	0,077	1,54
7	ДОБ	5	5,11	0,012	0,108	0,048	0,05	2,78	0,095	1,86
8	Кетамин	5	5,124	0,010	0,099	0,044	0,05	2,78	0,087	1,70
9	Клофелин	5	5,032	0,005	0,068	0,030	0,05	2,78	0,059	1,18
10	Кодеин	10	10,128	0,055	0,235	0,105	0,05	2,78	0,206	2,03
11	Кокаин	10	10,022	0,018	0,134	0,060	0,05	2,78	0,117	1,17
12	ЛСД (d-Лизергид)	1	1,006	0,000	0,021	0,009	0,05	2,78	0,018	1,81
13	МДМА	10	10,04	0,048	0,219	0,098	0,05	2,78	0,192	1,91
14	Морфин	10	10,06	0,023	0,152	0,068	0,05	2,78	0,133	1,32
15	Нитразепам	50	50,66	0,598	0,773	0,346	0,05	2,78	0,678	1,34
16	Трамадол	50	50,12	1,177	1,085	0,485	0,05	2,78	0,951	1,90
17	Тригексифенидил	50	50,7	0,625	0,791	0,354	0,05	2,78	0,693	1,37
18	Феназепам	50	50,18	1,067	1,033	0,462	0,05	2,78	0,905	1,80
19	Фенобарбитал	50	50,46	0,853	0,924	0,413	0,05	2,78	0,810	1,60

где: Х ном – истинное содержание; Хср – средний результат; S2 – дисперсия;
S – стандартное отклонение; SХср – стандартное отклонение среднего результата; – уровень значимости; t (,f) – коэффициент Стьюдента;
х – полуширина доверительного интервала; % – относительная ошибка среднего результата.

Таким образом, ВЭЖХ при использовании адекватного детектирования может быть использована в качестве скринингового метода идентификации и количественного определения наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ.

Определение компонентов лекарственных средств, содержащих кодеин и морфин, а также биологически активных добавок к пище.

Анализ стандартных образцов для занесения в библиотеку, равно как и образцов поступивших лекарственных средств и БАД к пище, проводили в одних и тех же условиях.

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляли путем сравнения времени удерживания со стандартом и УФ-спектра каждого компонента анализируемого образца с имеющейся библиотекой. Библиотека создавалась путем анализа только стандартных образцов.

Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки.

На рисунках 2 и 3 представлены хроматограммы лекарственного средства Седальгин-Нео. Аналогичные хроматограммы получаются при анализе лекарственных средств: Пенталгин-Н.С., Пенталгин-Нова, Пенталгин-ICN, Пенталгин-ФК, Пенталгин-ФС, Пентальфен-МЭЗ, Пентамиалгин, Седал-М.

На рисунке 2 четко видны три преобладающих компонента (анальгин, парацетамол, кофеин), а также два минорных компонента (фенобарбитал и кодеин). При рассмотрении увеличенного варианта хроматограммы (рисунок 3), видно полное разделение пиков, а интенсивность сигнала как фенобарбитала, так и кодеина достаточна для количественного определения при этой длине волны.

Рис. 2. Хроматограмма лекарственного средства Седальгин-Нео.

Рис. 3. Увеличенная хроматограмма лекарственного средства Седальгин-Нео.

Хроматографические характеристики исследованных лекарственных средств представлены в таблице 4, параметры количественного определения представлены в таблице 5, метрологическая оценка методики представлена в таблице 6.

Таблица 4. Хроматографические характеристики компонентов

исследуемых лекарственных средств.

№	Наименование	tR, мин	к	N	As		R
1	Морфин	6,41	1,85	47653	1,2	1,36 1,07 1,05 1,21 1,02 1,20 1,15 1,20 1,07 1,01 1,29 1,13 1,21	4,97 1,37 0,93 3,80 0,63 6,24 4,25 4,91 2,20 0,22 10,05 5,04 8,95
2	Метамизол натрий	7,90	2,51	82377	1,1
3	Кодеин	8,31	2,69	92360	1,1
4	Парацетамол	8,59	2,82	57399	1,2
5	Тебаин	9,92	3,41	41961	1,2
6	Кофеин	10,11	3,49	89239	1,1
7	Папаверина гидрохлорид	11,67	4,19	128463	1,2
8	Наркотин	13,05	4,80	134469	1,1
9	Ацетилсалициловая кислота	15,26	5,78	82425	1,1
10	Дротаверин	16,14	6,17	151134	1,2
11	Фенобарбитал	16,21	6,20	235074	1,1
12	Пропифеназон	20,21	7,98	153429	1,1
13	Напроксен	22,48	8,99	119606	1,2
14	Ибупрофен	26,73	10,88	249723	1,2

где: tR – время удерживания, минуты; к – коэффициент емкости;
N – число теоретических тарелок; – селективность; R – степень разделения, разрешение.

Таблица 5. Параметры количественного определения

компонентов исследуемых лекарственных средств.

№	Наименование	Предел обнаружения (соотношение сигнал-шум 1:3), мг/л	Предел кол. определения (соотношение сигнал-шум 1:10), мг/л	Диапазон линейных концентр. мг/л	Коэфф. корреляции
1	Морфин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99989
2	Метамизол натрий	0,49	2,4	5,0-1000	0,99995
3	Кодеин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99997
4	Парацетамол	1,18	4,6	2,0-1000	0,99999
5	Тебаин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99997
6	Кофеин	0,17	1,1	2,0-1000	0,99996
7	Папаверина гидрохлорид	0,41	2,8	5,0-1000	0,99997
8	Наркотин	0,11	0,6	1,0-1000	0,99998
9	Ацетилсалициловая кислота	0,51	3,1	5,0-1000	0,99998
10	Дротаверин	0,68	3,8	5,0-1000	0,99989
11	Фенобарбитал	0,91	4,1	10,0-1000	0,99995
12	Пропифеназон	0,34	2,1	5,0-1000	0,99998
13	Напроксен	0,41	2,8	5,0-1000	0,99999
14	Ибупрофен	0,74	3,2	5,0-1000	0,99998

Таблица 6. Метрологическая оценка количественного определения исследуемых наркотических средств, психотропных, сильнодействующих и сопутствующих веществ.

№	Наименование	Х ном, мг	Хср, мг	S2	S	SХср		t (, f)	х	%
1	Морфин	10	10,2	0,025	0,158	0,071	0,05	2,78	0,139	1,39
2	Метамизол натрий	200	199,4	16,800	4,099	1,833	0,05	2,78	3,593	1,80
3	Кодеин	10	10,12	0,217	0,466	0,208	0,05	2,78	0,408	4,03
4	Парацетамол	200	200,2	11,200	3,347	1,497	0,05	2,78	2,933	1,47
5	Тебаин	5	5,02	0,012	0,110	0,049	0,05	2,78	0,096	1,91
6	Кофеин	100	101,4	5,300	2,302	1,030	0,05	2,78	2,018	1,99
7	Папаверина гидрохлорид	200	201,4	15,300	3,912	1,749	0,05	2,78	3,429	1,70
8	Наркотин	5	5,1	0,010	0,100	0,045	0,05	2,78	0,088	1,72
9	Ацетилсалициловая кислота	200	197,2	12,700	3,564	1,594	0,05	2,78	3,124	1,58
10	Дротаверин	100	101,6	5,300	2,302	1,030	0,05	2,78	2,018	1,97
11	Фенобарбитал	50	50,6	1,800	1,342	0,600	0,05	2,78	1,176	2,28
12	Пропифеназон	10	10,12	0,067	0,259	0,116	0,05	2,78	0,227	2,24
13	Напроксен	100	101,1	7,700	2,775	1,241	0,05	2,78	2,432	2,38
14	Ибупрофен	100	99,8	3,700	1,924	0,860	0,05	2,78	1,686	1,69

где: Х ном – истинное содержание; Хср – средний результат; S2 – дисперсия;
S – стандартное отклонение; SХср – стандартное отклонение среднего результата; – уровень значимости; t (,f) – коэффициент Стьюдента;
х – полуширина доверительного интервала; % – относительная ошибка среднего результата.

Относительная погрешность определения составила от 1,39 % до 4,03 %. Полученные средние значения близки к номинальным. Поскольку в общем случае ГФ XI издания при дозировке таблеток и капсул от 0,001 г до 0,01 г дает допуск на отклонение в содержании действующего вещества ±10%, от 0,01 г до 0,1 г – ±7,5%, от 0,1 г и более – ±5% разработанная методика пригодна для анализа таблеток и капсул, содержащих исследованные вещества, по разделу нормативной документации «количественное определение».

Применение разработанного метода в анализе биологически-активных добавок к пище

Анализ стандартных образцов для занесения в библиотеку, равно как и образцов поступивших лекарственных средств и БАД к пище, проводили в одних и тех же условиях.

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляли путем сравнения времени удерживания со стандартом и УФ-спектра каждого компонента анализируемого образца с имеющейся библиотекой. Библиотека создавалась путем анализа только стандартных образцов.

Количественное определение проводили методом абсолютной градуировки.

На рисунке 4 представлена хроматограмма метанольного экстракта БАД к пище, в состав которого входит Имбирь лекарственный (Zingiber officinale Roscoe). Индикаторным компонентов имбиря является гингерол.

Рис. 4. Хроматограмма метанольного экстракта БАД к пище, в состав которого входит Имбирь лекарственный (Zingiber officinale Roscoe).

Хроматографические характеристики исследованных компонентов биологически активных добавок к пище представлены в таблице 7, параметры количественного определения представлены в таблице 8, метрологическая оценка методики представлена в таблице 9.

Таблица 7. Хроматографические характеристики некоторых исследуемых веществ в БАД к пище.

№	Наименование	tR, мин	к	N	As		R
1	Тиамин хлорид	3,509	0,56	5947	1,1	1,46 1,13 1,51 1,10 1,04 1,14 1,27 1,10 1,77	5,87 2,22 9,02 2,61 1,16 4,02 8,37 3,57 29,18
2	Пиридоксин гидрохлорид	5,122	1,28	7681	1,3
3	Никотинамид	5,788	1,57	6357	1,3
4	Теофеллин	8,720	2,88	19159	1,1
5	Теобромин	9,635	3,28	21943	1,1
6	Фолиевая кислота	10,042	3,46	36918	1,1
7	Рибофвлавин	11,450	4,09	31041	1,1
8	Дигидрокверцетин	14,589	5,48	41192	1,1
9	Гингерол	16,015	6,12	52197	1,1
10	Филантин	28,418	11,63	127854	1,2

где: tR – время удерживания, минуты;; к – коэффициент емкости; N – число теоретических тарелок; – селективность; R – степень разделения, разрешение.

Таблица 8. Параметры количественного определения некоторых исследуемых веществ в БАД к пище.

№	Наименование	Предел обнаружения (соотношение сигнал-шум 1:3), мг/л	Предел кол. определения (соотношение сигнал-шум 1:10), мг/л	Диапазон линейных концентр. мг/л	Коэфф. корреляции
1	Тиамин хлорид	1,4	6,1	10,0-1000	0,99991
2	Пиридоксин гидрохлорид	2,1	5,0	10,0-1000	0,99995
3	Никотинамид	2,3	5,5	10,0-1000	0,99998
4	Теофеллин	0,18	1,2	5,0-1000	0,99997
5	Теобромин	0,18	1,2	5,0-1000	0,99998
6	Фолиевая кислота	0,51	2,4	5,0-1000	0,99996
7	Рибофвлавин	0,081	0,4	0,5-1000	0,99997
8	Дигидрокверцетин	0,58	3,1	5,0-1000	0,99998
9	Гингерол	0,35	2,7	5,0-1000	0,99998
10	Филантин	0,41	2,4	5,0-1000	0,99998

Таблица 9. Метрологическая оценка количественного определения исследуемых наркотических средств, психотропных, сильнодействующих и сопутствующих веществ.

№	Наименование	Х ном, мг	Хср, мг	S2	S	SХср		t (, f)	х	%
1	Тиамин хлорид	100	99,2	6,200	2,490	1,114	0,05	2,78	2,183	2,20
2	Пиридоксин гидрохлорид	100	101,4	5,300	2,302	1,030	0,05	2,78	2,018	1,95
3	Никотинамид	100	101,8	5,700	2,387	1,068	0,05	2,78	2,093	2,06
4	Теофеллин	100	99,22	3,592	1,895	0,848	0,05	2,78	1,661	1,67
5	Теобромин	100	101,7	3,950	1,987	0,889	0,05	2,78	1,742	1,71
6	Фолиевая кислота	100	103,4	3,300	1,817	0,812	0,05	2,78	1,592	1,54
7	Рибофвлавин	100	100,8	1,700	1,304	0,583	0,05	2,78	1,143	1,13
8	Дигидрокверцетин	100	101,6	4,300	2,074	0,927	0,05	2,78	1,818	1,79
9	Гингерол	2	2,02	0,002	0,045	0,020	0,05	2,78	0,039	1,94
10	Филантин	2	1,92	0,002	0,045	0,020	0,05	2,78	0,039	2,04

где: Х ном – истинное содержание; Хср – средний результат; S2 – дисперсия;
S – стандартное отклонение; SХср – стандартное отклонение среднего результата; – уровень значимости; t (,f) – коэффициент Стьюдента;
х – полуширина доверительного интервала; % – относительная ошибка среднего результата.

Относительная погрешность определения составила от 1,13 % до 2,20 %. Полученные средние значения близки к номинальным. Такая погрешность также укладывается в требования ГФ XI. Разработанная методика пригодна для количественного определения индикаторных компонентов биологически активных добавок к пище и их установления подлинности.

Выводы

1. При подготовке образца к анализу рационально использовать такие универсальные растворители как вода, метанол и их смеси. Выбор растворителя также должен определяться не только растворяющей способностью исследуемых веществ, но и общим составом образца.
2. При создании унифицированных методик ВЭЖХ рационально использовать в качестве подвижной фазы смеси типа ацетонитрил-водный буферный раствор (или подкисленную воду) с рН 3,0-4,0 (как наиболее универсальный элюэнт); а в качестве неподвижной фазы – сорбенты типа С18 (как наиболее универсальный сорбент). Для совместного определения веществ с сильно различающимся хроматографическим поведением необходимо применение широкого градиента концентрации органической составляющей подвижной фазы: от 5 до 90%.
3. Для надежной идентификации в скрининговых методах анализа необходимо совпадение с библиотекой двух характеристических параметров: времени удерживания и УФ-спектра компонента.
4. В разработанных унифицированных хроматографических условиях эффективность колонок составила от 3000 т.т. до 250000 т.т. Относительное стандартное отклонение при 5 повторных введениях не более 4,1%. Пределы обнаружения исследуемых веществ составили от 0,081 мг/л и до 2,3 мг/л, пределы количественного определения – от 0,5 мг/л и до 1000 мг/л. Это соответствует современным требованиям к параметрам пригодности хроматографической системы.
5. Разработанные методики анализа успешно применены для скринингового качественного и количественного анализа наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ, а также для установления подлинности и количественного определения многокомпонентных лекарственных средств, содержащих кодеин, и биологически активных добавок к пище. Время разделения исследуемых веществ на хроматограмме составило не более 30 минут.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Передеряев О. И., Арзамасцев А.П. Градиентный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии как универсальный метод определения группы соединений // Сборник материалов XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 18-22 апреля 2005 г.), С. 784-785.
2. Передеряев О.И., Дмитриева О. С. Определение гуггулостеронов E и Z в составе биологически активных добавок к пище, содержащих Commiphora mukul // Сборник материалов IV-ой межрегиональной научно-практической конференции «Питание здорового и больного человека», Санкт-Петербург, 2006, С. 156-157.
3. Передеряев О. И. Градиентный вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии как метод определения оптимальных условий изократического варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 03-07 апреля 2006 г., С. 571.
4. Передеряев О. И., Арзамасцев А.П. Определение кодеинсодержащих лекарственных средств методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 03-07 апреля 2006 г., С. 571-572.
5. Дмитриева О. С., Передеряев О. И., Бессонов В. В., Харлампович Т. А., Курмаева Е. И. Изучение эффективности различных способов экстракции антоцианинов из объектов, содержащих плоды черники // Сборник материалов XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 03-07 апреля 2006 г., С. 519.
6. Метод одновременного определения содержания цитринина и охратоксина А в зерне и зернопродуктах / Эллер К.И., Пименова В.В., Киселева М.Г., Передеряев О.И., Аксенов И.В., Медведев Ю.В. // Вопросы питания, 2006., - №4. - т.75. - С.53-57.
7. Передеряев О. И., Арзамасцев А.П. Возможности оптимизации определения наркотических средств, психотропных и сильнодействующих веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Аспирант и соискатель, 2006., - №4. - С.81-85.
8. Передеряев О. И., Арзамасцев А.П. Определение многокомпонентных лекарственных средств содержащих кодеин методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Естественные и технические науки, 2006., - №3. - т.23. - С.104-107.