Уровень цитокинов и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с морфологическими изменениями печени у больных хроническими вирусными гепатитами в и с

На правах рукописи

Лазарева Анна Светославовна

Уровень цитокинов и субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с морфологическими изменениями печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С

14.00.10 – инфекционные болезни

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии

им. И.М. Сеченова Росздрава

Научные руководители:

член-корр. РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Сергей Григорьевич Пак

доктор медицинских наук,

профессор Михаил Валентинович Киселевский

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Валентин Иванович Покровский

доктор медицинских наук, профессор Наталья Михайловна Беляева

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО Российский Государственный медицинский Университет Росздрава

Защита диссертации состоится «_____»____________2008 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.05 при ГОУ ВПО Московской Медицинской академии им. И.М. Сеченова

Адрес:119992, Москва, ул. Трубецкая, д.8, строение 2

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке

ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

Актуальность темы. Парентеральные вирусные гепатиты, среди которых доминирующее место занимают гепатиты В и С, - одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения во всем мире. Заболевания распространены повсеместно и по данным ВОЗ в мире насчитывается около 400 млн. и 170 млн. инфицированных вирусом гепатита В и С соответственно. Эти инфекции являются основными в развитии хронических заболеваний печени, включая цирроз и гепатокарциному (Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г., 2003, Серов В.В., Апросина З.Г., 2002, Шерлок Ш., Дж. Дули, 2002).

Ключевую роль в патогенезе нарушения элиминации вируса и хронизации при вирусных гепатитах играют изменение состава и нарушение функции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию иммунопатологических реакций. Основой развития иммунокомплексных реакций являются нарушения цитокинового статуса, поскольку именно цитокины принимают непосредственное участие в развитии воспаления, иммунного ответа и регенерации печени (Никитин.В.Ю., Жданов К.В., 2004, Курамшин Д.Х., Толоконская Н.П, 2002, Апросина З.Г., Серов В.В., 2001, Ивашкин В.Г. и соавт., 2001, Ковальчук Л.В. с соавт., 2001 Носик Н.Н, 2000). Нарушение баланса Th1/Th2 цитокиновой продукции является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии и прогрессировании заболевания. (Наследникова И.О., Белобородова Е.В., 2005, Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003, Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004, Hempel G, 2000, McClary H, 2000, Gramenzi A, 2005). Отмечено, что длительная активация Th1-лимфоцитов с гиперпродукцией IFN- и TNF-a способствуют активному прогрессирующему течению заболевания и элиминации вируса, тогда как преобладание в патологическом процессе цитокинов, продуцируемых Th2-клетками, напротив, ассоциируется с вирусной персистенцией и хронизацией процесса (Ивашкин В.Т. и соавт., 2003, Серов В.В., Мухин Н.А., 2000, Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001, Абдурахманов Д.Т., 2002, Жукова Н.Г. и соавт., 2002). Нарушения продукции медиаторов ведут к дефектам Т- лимфоцитов, фагоцитирующих клеток и NK которые отвечают за гибель вирусинфицированных гепатоцитов при хронических вирусных гепатитах В и С (Семененко Т.А, 2002, Trobonjaca Z, 2002, Falasca K, 2006).

Напряжение местных реакций иммунной системы проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в паренхиме печени. Показана четкая корреляция между тяжестью течения процесса и выраженностью лимфоцитарной инфильтрации. Вслед за развитием воспалительного процесса в печени наблюдаются дистрофические и дегенеративные процессы, некроз гепатоцитов, а затем коллагенизация стромы на месте гибели участков паренхимы и в стенках сосудов (Покровский В.И., Непомнящих Г.И, 2003, Жданов К.В. и соавт., 2003, Mosnier JF, 1993).

Иммунная система печени включает в себя большинство компонентов, отвечающих за развитие врожденного иммунного ответа: натуральные киллеры (NK), натуральные киллеры-Т-клетки (NKT-клетки), дендритные клетки, макрофаги и эффекторы специфического иммунитета (Т-клетки) (Biron C. and Brossay L, 2001, Amaraa R, 2002, Trobonjaca Z, 2001). Взаимодействие Купферовских (или дендритных) клеток, NK, NKT, CD8 T- клеток между собой обеспечивают развитие адекватного иммунного ответа на вирусную инфекцию (Exley, M.A., Koziel, M.J. 2004, Park S.H.,2003, Mehta A, 2004, Cecere A, 2004).

В экспериментальных работах по изучению противоопухолевого иммунитета была выявлена особая субпопуляция Т-клеток - T-регуляторные лимфоциты CD4+CD25+ (T рег.), которые проявляют гипопролиферативную способность, угнетают активацию и ингибируют секрецию цитокинов CD4+CD25 T-хелперами и CD8+ лимфоцитами. Все это препятствует развитию реакций, направленных на элиминацию чужеродного антигена (Peng G, 2008, Boettler T, 2005, Fu JL, 2006, Stoop JN, 2005, Xu D, 2006). Данные о роли Т рег. лимфоцитов печени при хронических вирусных гепатитах весьма малочисленны.

Несмотря на значительное количество работ, посвященных изучению показателей цитокинового профиля и иммунного статуса, данные об уровне и значимости цитокинов весьма противоречивы, кроме того, в большинстве работ изучалась только сывороточная концентрация отдельных цитокинов без определения стимулированной продукции цитокинов МНПК (Курамшин Д.Х., Толоконская Н.П, 2001, Наследникова И.О., 2005, Скляр Л.Ф, 2005, Abayli B, 2003, Fan X, 2000, Primiagi LS, 2003, Spanakis NE, 2002, Zekri AR, 2005). В настоящее время весьма малочисленны сведения о субпопуляциях иммунных клеток печени (NKT, NK, Т рег.), участвующих в элиминации вируса и повреждении клеток печени при хронических вирусных гепатитах. В связи с этим, актуальным представляется изучение механизмов, способствующих развитию и поддержанию длительной персистенции и хронизации при вирусных гепатитах.

Цель исследования: изучить особенности цитокинового профиля, субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и лейкоцитарной инфильтрации печени в сопоставлении с морфологическими изменениями в печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.

Задачи работы:

1. Изучить концентрацию цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с показателями гистологической активности и фиброза.
2. Изучить спонтанную продукцию цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различными показателями гистологической активности и фиброза.
3. Изучить индуцированную NDV и ФГА продукцию цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 МНПК у больных ХГВ и ХГС с различной активностью гепатита и выраженностью фиброза.
4. Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности и фиброза у больных хроническими вирусными гепатитами В и С.
5. Оценить морфологические изменения с определением гистологической активности и фиброза в ткани печени у больных ХГВ и ХГС по данным пункционной биопсии печени.
6. Исследовать особенности лейкоцитарной инфильтрации печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с активностью гепатита выраженностью фиброза.
7. Определить фенотип печень-ассоциированных лимфоцитов иммуногистохимическим и иммуноцитохимическим методом у больных ХГВ и ХГС.

Научная новизна. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С получены новые данные о стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК при различной активности гепатита и выраженности фиброза. В группе больных с выраженными морфологическими изменениями в печени определено достоверное угнетение способности МНПК продуцировать ряд цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-6) при стимуляции их NDV и ФГА.

Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами, что подтверждает необходимость изучения стимулированной продукции цитокинов для оценки цитокинового профиля.

Выявлено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса у больных с высокой гистологической активностью и выраженными морфологическими изменениями в печени.

Установлено отсутствие статистически значимых отличий содержания субпопуляций CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 лимфоцитов периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами по сравнению со здоровыми донорами.

У больных хроническими вирусными гепатитами В и С сопоставлен характер и интенсивность лейкоцитарной инфильтрации с активностью патологического процесса в печени. Установлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными хроническим вирусным гепатитом В.

Впервые расшифрован фенотип иммунных клеток лейкоцитарных инфильтратов паренхимы печени у больных ХГВ и ХГС, выявлены популяции Т- лимфоцитов CD3+, цитоксических лимфоцитов CD8+, Т рег. лимфоцитов CD4+CD25+, NK- клеток CD16+CD56+, NKT- клеток CD3+CD16+CD56+.

Практическая значимость. Для адекватной оценки активности инфекционного процесса необходимо проводить комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С, включающее в себя определение концентрации цитокинов не только в сыворотке крови, но и изучение стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, а также вычисление показателей иммунорегуляторного индекса.

При морфологическом исследовании гепатобиоптатов у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо определять не только гистологическую активность и выраженность фиброза, но и оценивать выраженность, распространенность и субпопуляционный состав лейкоцитарных инфильтратов печени.

Только совокупность полученных данных позволяет выбрать правильную тактику и провести адекватную терапию у больных ХГВ и ХГС.

Положения, выносимые на защиту:

1. Уровень цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных ХГВ и ХГС не отражает их реальную концентрацию в сыворотке крови.
2. Для оценки цитокинового профиля у больных хроническими вирусными гепатитами В и С необходимо изучение стимулированной продукции цитокинов МНПК.
3. Угнетение индуцированной NDV и ФГА продукции ряда цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-6) МНПК у больных как с минимальными, так и с выраженными морфологическими изменениями в печени отражает состояние иммунодефицита при ХГВ и ХГС.
4. Нарушение иммунного ответа подтверждается снижением иммунорегуляторного индекса во всех группах больных хроническими вирусными гепатитами В и С.
5. Выраженность и распространенность лейкоцитарной инфильтрации печени при хронических вирусных гепатитах более выражена при высокой гистологической активности.
6. У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация более выражена и раньше распространяется внутрь печеночной дольки, чем при хроническом вирусном гепатите В.
7. Расположение участков развития соединительной ткани совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации в печени у больных хроническими вирусными гепатитами.
8. Лейкоцитарные инфильтраты образуют в основном активированные лимфоциты, субпопуляционный состав которых представлен Т-лимфоцитами, цитотоксическими лимфоцитами, Т рег. лимфоцитами, NK-клетками, NKT-клетками.
9. Для оценки активности инфекционного процесса и назначения адекватной терапии необходимо комплексное обследование больных ХГВ и ХГС с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, иммунорегуляторного индекса и характера лейкоцитарной инфильтрации печени с определением фенотипа клеток, составляющих инфильтрацию.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международном Евро-Азиатском конгрессе по инфекционным болезням (Витебск, 2008г.). Диссертационная работа апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице печатного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов и списка использованной литературы (36 отечественных и 115 иностранных работ). Работа иллюстрирована 30 графиками и 45 таблицами.

В исследование вошли 37 больных вирусным гепатитом В и С, из них 13 больных хроническим гепатитом В и 24 больных хроническим вирусным гепатитом С. До момента обследования больные не получали противовирусной терапии. Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на выявлении синдромов гепато- и спленомегалии, холестаза и цитолиза. Этиологическая верификация диагноза проводилась на основании обнаружения в сыворотке крови ДНК вируса гепатита В (HBV) и РНК вируса гепатита С (HCV) с определением генотипа вируса с помощью ПЦР, а также серологических маркеров HBV (HBsAg, анти-HBcor IgM, анти-Hbcor суммарные) и HCV (анти-HCV IgG) с использованием ИФА.

Всем больным хроническими вирусными гепатитами В и С выполнена аспирационная пункционная биопсия печени по Менгини с последующим морфологическим исследованием биоптатов печени общепринятым методом полуколичественной оценки гистологической активности и фиброза по R. Knodell, адаптированной в отношении В и С гепатитов K. Ishak (Серов В.В., Танащук Е.Л., 2004). Все больные были разделены на группы по степени активности гепатита (от минимальной до высокой активности), по степени выраженности перипортальных некрозов (0-5 баллов), внутридольковой дегенерации (1-4 балла), портального воспаления (1-4 балла), фиброза (0-3 балла) вне зависимости от этиологии гепатита. Далее изучен цитокиновый профиль и показатели иммунного статуса у больных хроническими вирусными гепатитами В и С в сопоставлении с морфологическими изменениями печени.

Материалом исследования являлась венозная кровь, стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Для оценки цитокинового профиля у больных хроническими вирусными гепатитами В и С изучена концентрация цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6) в сыворотке крови, а также спонтанная и стимулированная NDV и ФГА продукция данных цитокинов МНПК. Мононуклеары периферической крови выделяли в стерильных условиях из цельной венозной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (=1,077 г/см3) (Натвиг Дж., 1980). Выделенные клетки культивировали в течение 36 ч при температуре 370 и 5% СО2 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 (“Вектор-Бест”, Новосибирск) без активатора, а также с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (“Difco”, Германия) или вируса болезни Ньюкасла (NDV) для активации лимфоцитов (Хаитов Р.М., 1995). Определение концентрации цитокинов производилось «сендвич»-методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (наборы реагентов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-6, IL-4 ООО «Протеиновый контур» С-Петербург).

Изучение иммунного статуса у больных проводилось с помощью определения экспрессии поверхностных маркеров лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 при помощи моноклональных антител против соответствующих антигенов (Caltag Laboratories, США), результаты учитывали методом проточной цитофлюорометрии на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США).

Полученные при аспирационной биопсии печени гистологические препараты окрашивали гематоксилин-эозином для морфологического анализа и пикрофуксином по Ван-Гизону для выявления соединительной ткани. Иммуноцитохимическое исследование на мононуклеарных клетках, выделенных из печени, и иммуногистохимическое исследование на криосрезах проведено с использованием меченых моноклональных антител к поверхностным маркерам лимфоцитов (CD3/CD16CD56, CD4/CD25, CD8, CD20), дендритных клеток (CD1a) и макрофагов (CD14). Использовалось двойное окрашивание антителами, мечеными флюорохромами фикоэритрином (PE) и флюоресцеинизотиоционатом (FITC). Для морфологического исследования были приготовлены мазки из мононуклеарных лейкоцитов гепатобиоптатов, которые окрашивались эозин-азуром по Романовскому-Гимза и по Браше с контрольной обработкой РНК-азой. Световую микроскопию и фотографирование иммунных клеток печени в окрашенных мазках проводили с помощью фотовидеосистемы Axioplan 2 (фирмы Carl Zeiss, Германия).

Дополнительно проводилось ультразвуковое исследование печени.

Таким образом, каждому больному было проведено больше 40 специальных исследований для решения поставленных задач.

В качестве контроля по определяемым нами показателям цитокинового профиля и иммунного статуса мы обследовали группу здоровых лиц в количестве 10 человек (7 мужчин и 3 женщин в возрасте от 18 до 39 лет).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0) фирмы Statsoft Inc. и пакета программ Microsoft Exсel (2003) корпорации Microsoft. Гипотезу нормальности распределения во всех выборках проверяли по критерию Колмогорова-Смирнова. В связи с ненормальным распределением первичных данных, нами не использованы и не приведены значения средних величин со стандартным отклонением. Описание центральной тенденции количественных признаков в группах проводилось с использованием медианы (m), дисперсия признаков описывалась в виде минимального (мин) и максимального значений (макс). Для оценки достоверности различий выборок использовали критерий Манна-Уитни. Все различия считались достоверными при значении p<0,01 (Гланц С., 1999, Боровиков В., 2001).

Результаты исследования и их обсуждение.

Изменение цитокинового статуса в виде нарушения баланса Th1/Th2 цитокиновой продукции МНПК является одним из механизмов неадекватного иммунного ответа, играющего ключевую роль в развитии, прогрессировании и хронизации вирусного гепатита (Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003, Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004). В связи с этим представляло интерес изучить цитокиновый профиль в сопоставлении с гистологической активностью у больных с хроническими вирусными гепатитами В и С. Первоначально все больные с ХГВ и ХГС были разделены на группы по уровню активности гепатита в соответствии с ИГА. Значения ИГА 1-3 балла соответствуют минимальной степени активности, при ИГА 4-8 баллов делают заключение о низкой активности, показатели в пределах 9-12 баллов свидетельствуют об умеренной степени активности, а 13-18 баллов – о высокой степени активности хронического гепатита вне зависимости от его этиологии.

Ни в одной группе больных с различной степенью гистологической активности содержание исследуемых цитокинов IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови и их спонтанная продукция МНПК достоверно не отличалась от контрольной группы, при этом у больных с высоким уровнем гистологической активности определена явная тенденция к увеличению концентрации IL-6 в сыворотке крови и концентрации IL-1 при спонтанной продукции МНПК по сравнению с группой контроля. Установлено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IFN- МНПК у больных хроническими вирусными гепатитами с минимальной гистологической активностью, а при высокой степени гистологической активности наблюдалось статистически значимое снижение стимулированной NDV продукции целого ряда цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-6) МНПК и снижение стимулированной ФГА продукции TNF МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 1). Таблица1

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с уровнем гистологической активности

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Учитывая то, что индекс гистологической активности является интегративным показателем, складывающимся из следующих параметров: степень выраженности дистрофических и некротических изменений гепатоцитов, степени выраженности воспалительной инфильтрации портальных трактов и разрастания в печени соединительной ткани, представляло интерес изучить каждый параметр в отдельности в сопоставлении с цитокиновым профилем периферической крови.

У больных с отсутствием перипортальных некрозов (0 баллов) достоверно выявлено только снижение индуцированной NDV продукции IFN- МНПК. В группах больных с выраженностью перипортальных некрозов 1, 2, 3, 4 балла ни один из исследуемых цитокинов не отличался от контрольной группы в сыворотке крови, при их спонтанной и стимулированной продукции МНПК. При выраженности перипортальных некрозов 5 баллов определено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IFN-, IFN-, TNF- МНПК и достоверное снижение стимулированной ФГА продукции TNF- МНПК, а также выявлена тенденция к увеличению спонтанной продукции TNF-, IL-1, IL-6 МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 2). Таблица2

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью перипортальных некрозов

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

В группе больных с выраженностью внутридольковой дегенерации и очаговых некрозов 1 балл определено достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN- МНПК по сравнению с контрольной группой. Ни в одной из групп больных с активностью 2, 3 балла внутридольковой дегенерации не было статистически значимых различий концентрации исследуемых цитокинов в сыворотке крови, при их спонтанной и индуцированной NDV и ФГА продукции по сравнению со здоровыми донорами. В группе 4 балла внутридольковой дегенерации определено достоверное снижение стимулированной NDV продукции IFN-, TNF-, IL-6 МНПК и стимулированной ФГА продукции TNF- МНПК, а также выявлена тенденция к повышению спонтанной продукции IL-1 МНПК по сравнению с контрольной группой (таблица 3). Таблица3

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью внутридольковой дегенерации

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Важнейшим показателем, входящим в состав интегративного индекса гистологической активности, является уровень портального воспаления, выраженный в баллах от 1 до 4. При анализе содержания IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 у больных хроническими вирусными гепатитами с выраженностью портального воспаления 1, 2 балла статистически значимых отличий содержания исследуемых цитокинов в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной NDV и ФГА продукции не установлено. Только у больных в группе 3 балла портального воспаления обнаружено достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN-, TNF-, IL-6 МНПК, а у больных с выраженностью портального воспаления 4 балла показана тенденция к повышению спонтанной продукции IL-1 МНПК по сравнению с контрольной группой (таблица 4).

Таблица4

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью портального воспаления

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

Следующим показателем, не входящим в состав интегративного индекса гистологической активности, но отображающим морфологические изменения печени, является фиброз, выраженный в баллах от 0 до 3. У больных с отсутствием фиброза и с выраженностью фиброза 1 балл не было выявлено статистически значимых отличий концентрации IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови, при спонтанной и стимулированной продукции МНПК по сравнению со здоровыми донорами. При выраженности фиброза 2 балла установлено достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN-, TNF-, IL-6 МНПК, а также выявлена явная тенденция к увеличению концентрации TNF-, IL-4 в сыворотке крови по сравнению с группой контроля. В группе больных 3 балла фиброза определено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции IFN-, TNF- МНПК и установлена тенденция к повышению спонтанной продукции IL-1 МНПК по сравнению со здоровыми донорами (таблица 5).

Таблица5

Выявленные изменения концентрации цитокинов периферической крови в сопоставлении с выраженностью фиброза

Примечание.*- достоверное различие с группой здоровых доноров (р<0,01)

В целом, анализируя концентрацию исследуемых цитокинов у больных ХГВ и ХГС установлено, что статистически значимые отличия от здоровых доноров выявлены только в отношении индуцированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК. У больных с минимальными морфологическими изменениями в печени определено достоверное снижение индуцированной NDV продукции IFN-, а в группе больных с выраженными морфологическими изменениями печени установлено статистически значимое снижение индуцированной NDV продукции целого ряда цитокинов: IFN-, IFN-, TNF-, IL-6 и индуцированной ФГА продукции TNF- МНПК по сравнению со здоровыми донорами. Несмотря на отсутствие достоверных отличий, обнаружены тенденции к увеличению концентрации IL-4, IL-6, TNF- в сыворотке крови и спонтанной продукции TNF-, IL-1, IL-6 МНПК у больных с выраженными морфологическими изменениями в ткани печени по сравнению с группой контроля.

В настоящее время установлено, что колебания концентрации цитокинов в сыворотке крови до уровня 50 пг/мл находятся в пределах физиологических значений и не могут рассматриваться как повышение по сравнению со здоровыми донорами (Тугуз А.Р., 2001, Abayli B, 2003, Guida M, 2007). Время циркуляции свободных цитокинов в системном кровотоке колеблется от десятков минут до нескольких часов, кроме того, цитокины могут присутствовать в крови больных в “скрытых” комплексах, неопределяемых ИФА, при этом в связанном состоянии цитокины не инактивированы, а нековалентный характер связывания с рецепторами обеспечивает возможность диссоциации цитокинов, что может сопровождаться повторным увеличением их концентрации в сыворотке крови (Тугуз А.Р. и соавт., 2001,2002). Низкие уровни цитокинов могут быть обусловлены высоким содержанием растворимых рецепторов к этим цитокинам, так как уровень свободных рецепторов превышает концентрацию цитокинов в сыворотке крови в десятки – сотни раз (Тугуз А.Р. и соавт., 2002, Barash J. et al., 2003, Chodorowska G. et al., 2003, Fulop AK, 2001). Таким образом, определяемый методом ИФА уровень цитокинов в сыворотке крови не отражает истинную концентрацию цитокинов в сыворотке крови. По нашему мнению, у больных ХГВ и ХГС диагностическое значение имеет не только определение концентрации свободных цитокинов в сыворотке крови, а установление функциональных резервов МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию (Тугуз А.Р., 2002, Dong Y, 2004, Gramenzi A, 2005, Sarih M, 2000, Tajimi M, 2006). Достоверное снижение индуцированной NDV продукции ряда цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-6) МНПК у больных как с минимальными, так и с выраженными морфологическими изменениями в печени подтверждает суждение о хроническом вирусном гепатите как об иммунокомпрометированном состоянии и отражает снижение функциональной способности МНПК вырабатывать цитокины в ответ на вирусную инфекцию (Fan X, 2000, Falasca K, 2006, Gramenzi A, 2005, Hyodo N, 2003, Malaguarnera M, 1997, McClary H, 2000, Streetz KL, 2001). Уменьшение продукции IFN- приводит к нарушению противовирусной защиты организма, что способствует длительной персистенции вируса и хронизации гепатита (Torre F, 2004, Trobonjaca Z, 2001). Установленное нами снижение способности МНПК вырабатывать TNF в ответ на стимуляцию ФГА у больных хроническими вирусными гепатитами с высокой гистологической активностью свидетельствует о неполноценности клеточного звена иммунитета, что приводит к нарушению активации цитотоксических лимфоцитов и реализации апоптотической гибели клеток, в первую очередь вирусинфицированных (Хаитов Р.М., 2001, Буеверов А.О. и соавт., 2000, Ataseven H, 2006, Cecere A, 2004, Jia HY, 2002).

Анализируя относительное содержание субпопуляций лимфоцитов периферической крови и иммунорегуляторный индекс у больных ХГВ и ХГС в сопоставлении с выраженностью морфологических изменений в печени, статистически значимые отличия по сравнению со здоровыми донорами выявлены только в отношении иммунорегуляторного индекса у больных с высокой активностью гепатита (m=1,2; от 0,9 до 1,2) и в группе больных с выраженностью перипортальных некрозов 5 баллов (m=1,1; от 0,7 до 1,2) по сравнению с группой контроля (m=1,75; от 1,2 до 2,3), при этом во всех группах больных определена тенденция к снижению иммунорегуляторного индекса, что является отражением состояния иммунодефицита. Несмотря на отсутствие статистически значимых отличий, во всех группах больных выявлена тенденция к снижению содержания лимфоцитов, экспрессирующих маркеры CD16+ (натуральные киллеры) и CD4+ (Т-хелперы), что свидетельствует о недостаточности клеточного звена иммунитета, как врожденного, так и приобретенного и может способствовать длительной персистенции вирусов и хронизации вирусных гепатитов (Ивашкин В.Г, 2001, Курамшин Д.Х., 2002, Никитин.В.Ю, 2004, Ющук Н.Д, 2005, Abo T, 2000, Jacobson Brown P.M, 2001, Chang K.M, 2001). Нарушение процессов активации и пролиферации Т- и В- лимфоцитов у большинства больных находит отражение в снижении содержания лимфоцитов, несущих маркер CD38 по сравнению со здоровыми донорами.

Наиболее выраженные изменения выявлены при высоком уровне активности гепатита, когда наблюдается не только снижение субпопуляций лимфоцитов, отвечающих за развитие клеточного иммунного ответа (CD3+, CD4+, CD16+ лимфоцитов) и иммунорегуляторного индекса, но и снижение содержания лимфоцитов CD20+, отвечающих за развитие гуморального иммунитета, а также снижается содержание активационных молекул CD38+ и молекул антигенной презентации HLADR+. Снижение HLADR+ лимфоцитов может приводить к нарушению представления антигена, что в конечном итоге препятствует развитию приобретенных иммунных реакций (Змушко Е.И, 2001, Ивашкин В.Г, 2001, Курамшин Д.Х, 2002, Собчак Д.М, 2004). У больных ХГВ и ХГС при максимальной выраженности портального воспаления в печени увеличивается количество В-лимфоцитов периферической крови (CD20+) и лимфоцитов, экспрессирующих активационные молекулы CD25, CD38, HLADR, что рассматривается как проявление системного иммунного ответа на фоне местной иммунной реакции в виде лимфоидной инфильтрации ткани печени.

Следовательно, нами установлено нарушение врожденного и приобретенного звена клеточного иммунного ответа у больных ХГВ и ХГС. Достоверное снижение иммунорегуляторного индекса является важнейшим показателем, свидетельствующим о состоянии иммунодефицита у больных ХГВ и ХГС, что находит отражение в снижении резервных функциональных способностей МНПК вырабатывать цитокины в ответ на стимуляцию.

Напряжение местных реакций иммунной системы у больных хроническими вирусными гепатитами проявляется в виде гиперплазии лимфоидной ткани в паренхиме печени (Апросина З.Г.,1995, Дмитреева Е.В., 2003, Покровский В.И., 2003, Cecere A, 2004).

В результате проведенных нами исследований установлено, что лейкоцитарные инфильтраты печени у больных ХГВ и ХГС представлены преимущественно лимфоидными клетками, среди которых большая часть активированных лимфоцитов. Выраженность лимфоидной инфильтрации определяет гистологическую активность. На начальных этапах заболевания происходит инфильтрация соединительной ткани лейкоцитами в области портальных трактов, а при умеренной и высокой активности гепатита инфильтрация распространяется внутрь изменённых печёночных долек. У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация выражена больше и распространяется внутрь долек уже на ранних этапах развития инфекционного процесса по сравнению с больными хроническим вирусным гепатитом В.

При изучении фенотипа клеток лейкоцитарных инфильтратов печени больных хроническими вирусными гепатитами В и С методом иммуноцитохимии и иммуногистохимии обнаружены субпопуляции лимфоцитов, обладающих цитотоксичностью в отношении вирусинфицированных гепатоцитов. Эти клетки представлены субпопуляциями лимфоцитов, являющимися эффекторами врожденного (NK-клетки CD16+CD56+, NKT-клетки CD3+CD16+CD56+) и приобретенного (CTL CD8+) иммунитета, что может свидетельствовать об участии как специфического, так и неспецифического звеньев иммунитета в элиминации вирустрансформированных клеток печени. Известно, что цитотоксические клетки вызывают некроз и апоптоз инфицированных гепатоцитов, затем на месте разрушенных клеток печени развивается соединительная ткань (Дмитреева Е.В., 2003, Покровский В.И., 2003, Змушко Е.И, 2001, Cecere A, 2004). Этим объясняется совпадение локализации и выраженности развития соединительной ткани с областью лейкоцитарной инфильтрации в гепатобиоптатах у больных ХГВ и ХГС. Наряду с этим в лейкоцитарных инфильтратах мы выявили участки, представленные Трег. лимфоцитами CD4/CD25. Эта субпопуляция лимфоцитов формируется в ответ на избыточную секрецию IL-2, оказывает супрессивное действие на CTL и NK. Первоначально в результате продукции IL-2 активированными лимфоцитами происходит активация цитотоксических клеток CTL и NK, но избыточная продукция IL-2 приводит к формированию субпопуляции Т рег. лимфоцитов, оказывающих супрессивное влияние на эффекторы врожденного и приобретенного иммунитета. Очевидно, с субпопуляцией Трег. лимфоцитов может быть связано нарушение элиминации вируса, хронизация при вирусных гепатитах В и С.

В целом, лейкоцитарные инфильтраты печени у больных хроническими вирусными гепатитами В и С представлены преимущественно следующими субпопуляциями лимфоцитов: Т-лимфоциты (CD3+), NKT-клетки (CD3+CD16+CD56+), NK-клетки (CD16+CD56+), Т рег. лимфоциты (CD4+CD25+), цитотксические лимфоциты (CD8+).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что изучение выраженности, распространенности и субпопуляционного состава лейкоцитарных инфильтратов печени у больных ХГВ и ХГС имеет важное значение для оценки активности, прогноза течения хронического гепатита и выбора тактики лечения.

Выводы.

1. Установлено отсутствие статистически значимых отличий концентрации IFN-, IFN-, TNF-, IL-1, IL-4, IL-6 в сыворотке крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С по сравнению со здоровыми донорами, т.к. методом ИФА определяют только уровень свободных цитокинов, не соответствующий их реальной концентрации в сыворотке крови.
2. Установлено достоверное снижение стимулированной NDV и ФГА продукции ряда цитокинов (IFN-, IFN-, TNF-, IL-6) МНПК у больных как с минимальной активностью гепатита, так и с высокой степенью гистологической активности, что отражает состояние иммунодефицита при ХГВ и ХГС.
3. Изучение субпопуляций лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLADR, CD20, CD38 периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами В и С не выявило статистически значимых отличий от здоровых доноров.
4. У больных хроническими вирусными гепатитами В и С с выраженными морфологическими изменениями в печени определено статистически значимое снижение иммунорегуляторного индекса по сравнению с группой контроля.
5. Выраженность и распространенность лейкоцитарной инфильтрации печени при хронических вирусных гепатитах более выражена при высокой гистологической активности.
6. У больных хроническим вирусным гепатитом С лейкоцитарная инфильтрация более выражена и раньше распространяется внутрь печеночной дольки, чем при хроническом вирусном гепатите В.
7. Расположение участков соединительной ткани совпадает с конфигурацией области лейкоцитарной инфильтрации в печени у больных хроническими вирусными гепатитами.
8. Лейкоцитарные инфильтраты в основном состоят из активированных лимфоцитов, субпопуляционный состав которых представлен Т-лимфоцитами, цитотоксическими лимфоцитами, Т рег. лимфоцитами, NK-клетками, NKT-клетками.
9. Для оценки активности инфекционного процесса и назначения адекватной терапии необходимо комплексное обследование больных ХГВ и ХГС с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, иммунорегуляторного индекса и характера лейкоцитарной инфильтрации печени с определением фенотипа клеток, составляющих инфильтрацию.

Выявленные изменения цитокинового профиля и иммунного статуса, а также изучение лимфоидной инфильтрации печени позволяет рекомендовать комплексное обследование больных хроническими вирусными гепатитами В и С с определением стимулированной NDV и ФГА продукции цитокинов МНПК, вычисление показателей иммунорегуляторного индекса, а также морфологическое исследование гепатобиоптатов с определением выраженности, распространенности лейкоцитарных инфильтратов и установлением их субпопуляционного состава для оценки активности патологического процесса и проведения адекватной терапии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Умбетова К.Т., Алленов М.Н., Свиридова М.Б., Иванова И.В., Волчкова Е.В., Лазарева А.С. Динамика аутоантител при острых вирусных гепатитах. // Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию лечебного факультета МГМСУ.- Москва 2004г.- с.322.

2. Лазарева А.С., Умбетова К.Т. Уровень цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С. // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке».- Москва 2005г.- с.277.

3. Умбетова К.Т., Волчкова Е.В., Киселевский М.В., Чжан М.Ю., Петрова Е.В., Лазарева А.С. Цитокиновый профиль у больных хроническими вирусными гепатитами. // Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции « Вирусные гепатиты- проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики».- Москва 2005г.- с. 424.

4. Лазарева А.С., Чжан М.Ю., Умбетова К.Т., Петрова Е.В., Волчкова Е.В., Алленов М.Н., Верескунова Н.В., Пак С.Г., Киселевский М.В. Особенности иммунного статуса и цитокинового профиля у больных вирусными гепатитами В и С. // Военно-медицинский журнал.- 2006г., том 327- №3.- с.66-67.

5. Умбетова К.Т., Лазарева А.С., Пархоменко Ю.Г., Волчкова Е.В. Цитокиновый профиль в сыворотке крови и резервные возможности мононуклеаров периферической крови у больных хроническими вирусными гепатитами различной этиологии. // Медицинский журнал Западного Казахстана.- 2007г.- 3(15).- с. 26-34.