Патоморфологические и патогенетические аспекты гриппа h1n1 калифорния в клинике и эксперименте
На правах рукописи
Дедов
Владимир Андреевич
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ГРИППА H1N1 КАЛИФОРНИЯ В КЛИНИКЕ И ЭКСПЕРИМЕНТЕ
14.03.02 – Патологическая анатомия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург – 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»
Научный руководитель:
Цинзерлинг Всеволод Александрович, доктор медицинских наук, профессор.
Официальные оппоненты:
Сидорин Василий Сергеевич, доктор медицинских наук, доцент; РНИНХИ им. проф. А.Л. Поленова; ведущий научный сотрудник;
Чупров Игорь Николаевич, доктор медицинских наук, доцент; ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения РФ; профессор кафедры патологической анатомии.
Ведущая организация:
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита диссертации состоится 26 июня 2013 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.02 при ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» МО РФ по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. ак. Лебедева, д. 6.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, Пироговская наб., д. 3.
Автореферат разослан «__» ________ 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
ЧИРСКИЙ Вадим Семёнович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Грипп широко распространен во всем мире, вызывая ежегодные эпидемии, принимающие, в некоторых случаях, глобальный характер (Деева Э.Г., 2008; Онищенко Г.Г., 2013; Покровский В.И., Киселев О.И., 2005; Ansart S. et al., 2005). В конце XX в. только в Соединенных Штатах Америки грипп приводил к 20000-40000 летальных исходов ежегодно (Ghendon Y., 1992). При этом помимо летальных исходов, непосредственно связанных с острым гриппом, инфекция приводит к усугублению фоновой соматической патологии и так называемой «скрытой» или «вторичной» смертности (Zambon M.C., 1999).
Экономические потери, связанные с гриппом оцениваются в миллиарды долларов только в США (Wood S.C. et al., 2000). По данным K.L. Nichol (2001) в США вакцинация позволяет сэкономить $30,35 на каждого вакцинированного. Это обусловлено сокращением числа обращений за медицинской помощью, уменьшением количества дней, пропущенных по болезни, и сохранением высокой производительности труда.
Тем не менее, несмотря на многочисленные успехи фармакотерапии и вакцинопрофилактики гриппа, его эпидемическое значение практически не уменьшается из-за непрерывного изменения генома вируса гриппа (Киселев О.И., 2009; Taubenberger J.K. et al., 1997; Zimmer S.M, Burke D.S., 2009). Актуальность проблемы гриппа также подтверждают эпидемиологические данные, согласно которым заболеваемость и смертность во время пандемии «свиного» гриппа 2009-2010 гг. сопоставимы с соответствующими показателями пандемий 1957 г. («Азиатский грипп»), 1968-1969 гг. («Гонконгский грипп») и даже 1918-1919 гг. («Испанский грипп») (Деева Э.Г., 2008; Киселев О.И., 2009; Киселев О.И. и соавт., 2010; Киселев О.И. и соавт., 2003; Sullivan S. J. et al., 2010).
Хотя основными способами диагностики являются вирусологический, клинический и эпидемиологический, во многих случаях посмертная морфологическая диагностика играет важную роль, особенно в случаях с атипичными клиническими проявлениями, когда в силу разных причин не были проведены прижизненные вирусологические исследования. Кроме того, без морфологических исследований у умерших практически невозможно решать важнейшие вопросы, связанные с пато- и танатогенезом гриппа, такие как выявление клеток-мишеней в органах дыхания, верификация внелегочных поражений и достоверное установление непосредственных причин смерти.
Однако многие аспекты патоморфологии гриппа в настоящее время изучены недостаточно. Критерии морфологической диагностики современного гриппа не вполне ясны. Диагностика гриппа подробно освещена в работах А.В. Цинзерлинга, опубликованных в 70-е гг. XX в. (Цинзерлинг А.В., 1970; Цинзерлинг А.В., 1977), однако для применения разработанных им положений в современных условиях необходимо провести сравнительную характеристику патоморфологических изменений, отмеченных при гриппе в 70-е гг. XX в. и наблюдаемых в настоящее время.
Цель исследования
Определить особенности морфологических изменений и патогенеза гриппа H1N1 Калифорния при его тяжелом клиническом течении в сравнении с экспериментальной инфекцией.
Задачи исследования
1. Дать характеристику структурных изменений в легких, головном мозге и сердце при летальных исходах, связанных с гриппом H1N1 Калифорния в сравнении с изменениями, наблюдавшимися при гриппе в предшествующие эпидемии.
2. Охарактеризовать вирусиндуцированные изменения клеток в пораженных органах и оценить их диагностическую значимость.
3. Описать структурные изменения у экспериментальных животных, зараженных разными штаммами вируса гриппа, и сравнить их с данными, полученными при изучении секционного материала.
4. Изучить возможность развития при гриппе генерализованной инфекции и дать ее морфологическую характеристику на секционном и экспериментальном материале.
5. На секционном материале умерших от гриппа выявить поражения обусловленные другими возбудителями, описать связанные с ними структурные изменения и оценить их роль в танатогенезе.
Научная новизна
Проведена подробная оценка цитопатического и цитопролиферативного эффекта вируса гриппа H1N1 Калифорния на секционном и экспериментальном материале. Дана подробная характеристика вирусиндуцированных изменений клеток мерцательного эпителия, альвеолоцитов и альвеолярных макрофагов.
На клиническом и экспериментальном материале доказана способность вируса гриппа H1N1 Калифорния вызывать генерализованную инфекцию с поражением головного мозга и сердца.
Продемонстрировано наличие вирусиндуцированных изменений клеток вплоть до 2-3 недели заболевания.
Показана возможность развития на поздних сроках гриппозной инфекции тяжелого генерализованного хламидиоза, явившегося причиной смерти.
Теоретическая и практическая значимость
Доказана способность вируса гриппа H1N1 Калифорния вызывать как цитопатические, так и пролиферативные изменения в клетках мерцательного эпителия, альвеолоцитах и альвеолярных макрофагах.
Доказано значение в патогенезе гриппа специфических изменений, индуцированных непосредственно вирусом гриппа, а также неспецифических изменений, связанных с системной воспалительной реакцией и активацией вторичной микробиоты, таких как диффузное альвеолярное повреждение, являющееся морфологическим эквивалентом острого респираторного дистресс-синдрома взрослых.
Обосновано применение экспериментальной модели гриппа H1N1 Калифорния на белых беспородных мышах для воспроизведения основных морфологических проявлений инфекции.
Методология и методы исследования
Выполнение работы базируется на представлениях школы члена-корреспондента РАМН профессора А.В. Цинзерлинга (1923-1995) о развитии при гриппе характерных морфологических изменений в легких, головном мозге и ряде внутренних органов, которые в зависимости от свойств возбудителя могут несколько варьировать. Представители этой школы придают первостепенное значение разграничению поражений, непосредственно связанных с вирусом гриппа, и разнообразных осложнений вызванного им заболевания.
Выбранные методы исследования являются классическими для патологоанатомов, изучающих инфекционную патологию: сопоставление морфологических и вирусологических данных на клиническом (аутопсийном) и экспериментальном материале. Принципиальным является использование методов, направленных на выявление возбудителей в тканях, и дифференцированная оценка тканевых реакций. В настоящем исследовании для достижения этих целей были использованы современные методологические подходы, прежде всего иммуногистохимические исследования.
Положения, выносимые на защиту
1. Морфологические проявления гриппа характеризуются как специфичными для гриппа изменениями клеток мерцательного эпителия, альвеолоцитов и альвеолярных макрофагов, так и неспецифичным диффузным альвеолярным повреждением (острым респираторным дистресс-синдромом взрослых).
2. Характерные для гриппа H1N1 Калифорния изменения клеток отличаются более выраженными пролиферативными изменениями и увеличением ядерно-цитоплазматического коэффициента по сравнению с соответствующими изменениями клеток, наблюдавшимися при гриппе в предшествующие эпидемии.
3. Вирус гриппа H1N1 Калифорния способен приводить к генерализованной инфекции с преимущественным поражением головного мозга и сердца.
4. Грипп H1N1 Калифорния может протекать как смешанная инфекция, но в 2009-11 гг. сочетание гриппа H1N1 Калифорния с бактериальной инфекцией встречалась редко; в то же время в единичном наблюдении было выявлено сочетание гриппа H1N1 Калифорния с генерализованным хламидиозом.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обеспечена использованием широкого набора морфологических методов, включая иммуногистохимическое и иммунофлуоресцентное исследование, а также электронную микроскопию, на клиническом и экспериментальном материале в сопоставлении с вирусологическими данными. При морфологической оценке характерных для гриппа клеток проведено морфометрическое исследование со статистической обработкой (критерий Стьюдента).
Полученные результаты опубликованы в 6 работах, из которых 3 работы опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендуемых Высшей аттестационной комиссией. Материалы доложены на всероссийской конференции памяти О.К. Хмельницкого (2011 г.), конференциях молодых ученых Санкт-Петербургского университета «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (2011-2012 гг.), научно-практической конференции, проведенной НИИ гриппа (2011 г.).
Личный вклад автора
Автор разработал план исследования, изучил литературные источники прежних лет, провел поиск современных источников, имеющих отношение к теме исследования. Автором проведен анализ протоколов патологоанатомических вскрытий из ряда больниц Санкт-Петербурга и Ленинградской области и изучены соответствующие микропрепараты. Иммуногистохимические исследования аутопсийного материала проведены совместно с сотрудниками НИИ Гриппа (д.б.н. И.Н. Жилинская) и использованы в диссертации в рамках совместной публикации. Разработан план и проведены морфометрические исследования и статистическая обработка их результатов.
Автор совместно с научным руководителем и сотрудником НИИ гриппа к.б.н. В.В. Зарубаевым принял участие в разработке плана экспериментального исследования, лично участвовал в заражении животных, их забое, заборе материала для вирусологического и гистологического исследований. Автор лично проводил гистологические исследования экспериментального материала.
Вирусологические и иммуногистохимические исследования были проведены совместно с к.б.н. В.В. Зарубаевым и д.б.н. И.Н. Жилинской и использованы в диссертации в рамках совместной публикации. В одном наблюдении иммуногистохимическое исследование было проведено совместно с к.м.н. В.Е. Каревым, иммунофлуоресцентное исследование было проведено совместно с к.м.н. Н.В. Семеновым, и электронно-микроскопическое исследование было проведено в НИИ гриппа совместно с к.б.н. В.В. Зарубаевым и к.б.н. А.К. Сироткиным.
Автор выражает признательность научному руководителю, д.м.н., проф., В.А. Цинзерлингу, д.б.н. И.Н. Жилинской, к.б.н. В.В. Зарубаеву, к.м.н. В.Е. Кареву, к.м.н. Н.В. Семенову и к.б.н. А.К. Сироткину за помощь в совместных исследованиях.
Публикации
По материалам диссертации автором опубликовано 6 печатных работ, в том числе 3 работы – в ведущих рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 113 страницах печатного текста, состоит из 4-х глав и содержит 41 рисунок и 3 таблицы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследования
В исследовании были использованы секционные материалы из стационаров Санкт-Петербурга, Ленинградской области, а также материалы, полученные при проведении экспериментов в НИИ гриппа.
Всего был проанализирован 31 случай летального исхода от гриппа H1N1 Калифорния, подтвержденный полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Анализ был основан на изучении протоколов патологоанатомических вскрытий и исследовании микропрепаратов, изготовленных по стандартным методикам с окраской гематоксилином-эозином. В части наблюдений были проведены дополнительные окрашивания реактивом Шиффа, по Ван-Гизону и по Романовскому.
В одном наблюдении были проведены иммунофлуоресцентное исследование непрямым методом Кунса с использованием антител против антигенов Chlamydia trachomatis (совместно с к.м.н., Н.В. Семеновым, СПб ГУЗ «Городской консультативно-диагностический центр (вирусологический)») и иммуногистохимические исследования (совместно с к.м.н. В.Е. Каревым – НИИ детских инфекций ФМБА России) с использованием антител против антигенов, вирусов герпеса 1 и 2 типов, цитомегалии, аденовирусов, микоплазмы пневмонии и Chlamydia trachomatis, а также СD68. Иммуногистохимические исследования проведены непрямым методом в соответствии с протоколами, рекомендованными производителями.
Иммуногистохимическое выявление антигенов вируса гриппа было проведено совместно с д.б.н. И.Н. Жилинской (НИИ гриппа Минздрава России). Иммуногистохимическому анализу подвергнуты органы шести умерших. Материал (парафиновые срезы легких, сердца, головного мозга) обрабатывали моноклональными антителами к гемагглютинину и нуклеопротеину вируса гриппа H1N1 Калифорния и выявление проводили с использованием системы визуализации Novolink (Novocastra). Моноклональные антитела к указанным белкам вируса гриппа H1N1 Калифорния были получены в отделе диагностики НИИ гриппа. В качестве контроля использовали обработанный аналогичным образом материал (парафиновые срезы легких, сердца, головного мозга) больного с легочной патологией невирусной природы.
Морфометрические исследования проводили анализом микрофотографий в программе Adobe Photoshop. Для сравнения размеров клеток и их ядерно-цитоплазматических коэффициентов измеряли площади клеток и их ядер на изображениях с одинаковым разрешением, полученных при одинаковом увеличении (x600), в пикселях. Поскольку все сравниваемые микрофотографии были получены при одинаковом увеличении микроскопа и одинаковом разрешении получаемых изображений, пиксели можно было использовать в качестве условных единиц для сравнения площадей клеток и ядер. Для морфометрии было использовано 100 клеток из 10 наблюдений 2009 г. в сравнении со 100 клетками из 10 типичных музейных микропрепаратов, относящихся к 70-ым годам XX века. На основании полученных данных были вычислены средние значения и 95%-ные доверительные интервалы, использованные для сравнения площадей клеток и их ядерно-цитоплазматических коэффициентов.
В одном наблюдении было проведено электронно-микроскопическое исследование совместно с В.В. Зарубаевым и А.К. Сироткиным.
Фиксацию образцов размером не более 1 мм3 проводили в 2,5% глутаральдегиде, разведенном в 0,1 М (рН 7,4) какодилатном буфере, в течение 1 часа при 4оС с последующей отмывкой течение 10 минут в том же буфере. Постфиксацию осуществляли в 1% четырехокиси осмия, разведенной в 0,1М какодилатном буфере, в течение 1 часа при комнатной температуре с последующей отмывкой буфером течение 10 минут. Обезвоживание образцов проводили с использованием водных растворов этанола с возрастающей концентрацией. На этапе обезвоживания в 70о этаноле осуществляли контрастирование в 0,5% уранилацетате в течение 1 часа. Окончательное обезвоживание проводили в абсолютном ацетоне (два раза по 30 минут). Для заливки материала использовали смесь эпон-аралдит по общепринятой методике. Срезы (полутонкие и ультратонкие) изготавливали на ультрамикротоме LKB-III. Для подготовки препаратов использовали медные сетки «100 mesh». Перед просмотром проводили дополнительное контрастирование сеток цитратом свинца в течение 25 минут. Для просмотра микропрепаратов использовали электронный микроскоп JEM-100S (JEOL, Япония). Для фотосъемки использовали фотопленку ФТ-41МД. Оцифровку полученных изображений (негативов) проводили с использованием сканера Epson Perfection 4870 с их последующей компьютерной обработкой.
Экспериментальный материал был получен при моделировании гриппа на белых беспородных мышах совместно с к.м.н. В.В. Зарубаевым на базе НИИ гриппа Минздрава России.
Для эксперимента были использованы самки белых беспородных мышей массой 14-16 г, которых получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская область) и содержали в виварии на стандартном рационе. Отбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. До начала испытаний животных наблюдали в течение 2 недель.
Всего в эксперимент было включено 100 мышей, распределенных в следующие группы: 45 мышей интраназально заражали вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1) в физиологическом растворе; 45 мышей интраназально заражали вирусом гриппа A/WSN (H1N1) в физиологическом растворе; 5 мышам интраназально вводили физиологический раствор; 5 интактных мышей были включены в качестве отрицательного контроля.
Вирусы были получены в НИИ гриппа Минздрава России. Для заражения животных была использована вируссодержащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов. Из нее готовили серию 10-кратных разведений на физиологическом растворе, после чего инфекционная активность вируса в заражающем материале была определена в отдельном эксперименте при помощи титрования по летальности на животных. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (Reed L.J., Muench H., 1938). Заражение животных проводили интраназально под легким эфирным наркозом в дозе 1 LD50. На 3, 7 и 14 сутки после заражения 10 животных из каждой группы выводили из эксперимента, из них 5 животных использовали для определения титра вируса в ткани легких и 5 животных – для гистологического исследования.
Для определения инфекционного титра вируса гриппа легкие мышей, извлеченные на 3 сутки после инфицирования, гомогенизировали в десятикратном объеме стерильного физиологического фосфатного буфера и из гомогенатов получали серию десятикратных разведений в том же буфере. При определении титра вируса гриппа использовали культуру клеток MDCK, выращенных на 96 луночных панелях в среде МЕМ. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената от 100 до 10-7 и инкубировали в термостате в течение 48 часов. По окончании срока инкубации культуральную жидкость переносили в лунки планшета для иммунологических реакций, после чего добавляли равный объем 1% куриных эритроцитов физиологическом растворе.
Титр вируса оценивали по реакции гемагглютинации (РГА) эритроцитов. За значение титра принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации. Для сравнения титров определяли их средние значения с 95%-ными доверительными интервалами.
Для гистологического исследования получали парафиновые срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином, в некоторых наблюдениях проводили окраску реактивом Шиффа по стандартным методикам.
При морфометрическом исследовании в микропрепаратах определяли площадь безвоздушных очагов в процентах к площади легких. Для сравнения площади безвоздушных очагов в разных группах определяли ее средние значения с 95%-ными доверительными интервалами.
На экспериментальном материале также проводили иммуногистохимическое исследование с использованием антител против антигенов вируса гриппа, предназначенных для работы с мышами (первичные антитела – кроличьи антитела против нуклеопротеина вируса гриппа (Abcam, ab91648); вторичные антитела – козьи противокроличьи антитела, меченные пероксидазой (Abcam, ab6112)). Антитела использовали, следуя инструкциям изготовителя.
Результаты собственных исследований
и обсуждение полученных результатов
Всего был проанализирован 31 летальный исход с подтвержденным гриппом H1N1 Калифорния.
Среди умерших было 20 мужчин и 11 женщин, из них в возрасте от 15 до 20 лет – 1 человек, от 21 года до 25 лет – 2 человека, от 26 до 30 лет – 9 человек, от 31 года до 35 лет – 6 человек, от 36 лет до 40 лет – 4 человека, от 41 года до 45 лет – 2 человека, от 46 лет до 50 лет – 3 человека, от 51 года до 55 лет – 3 человека, от 61 года до 65 лет – 1 человек. Продолжительность заболевания до наступления летального исхода составила: менее 3 суток – в 1 наблюдении, от 3 суток до 7 суток – в 2 наблюдениях, от 8 суток до 14 суток – в 10 наблюдениях, от 15 суток до 21 дня – в 12 наблюдениях, от 22 до 28 суток – в 4 наблюдениях, от 29 до 35 суток – в 1 наблюдении и от 36 до 42 суток – в 1 наблюдении. 25 человек умерло ноябре-декабре 2009 г., 6 человек – в феврале-марте 2011 г.
Во всех летально закончившихся наблюдениях макроскопически отмечались резкое полнокровие и серозный отек, укладывавшиеся в картину респираторного дистресс синдрома взрослого типа.
Микроскопически отмечались тяжелые поражения преимущественно респираторных отделов легких, а также бронхов разного калибра и трахеи. При этом наблюдались «гриппозные» изменения клеток эпителия и альвеолярных макрофагов. Общий характер морфологических изменений, обусловленных актуальным штаммом вируса гриппа, был сходен с описаниями, сделанными А.В. Цинзерлингом и представителями его школы в конце 1960-х – начале 1970-х гг. При этом, в отличие от описаний предшествующих лет, такие изменения прослеживались вплоть до третьей недели от начала заболевания. Вместе с тем отмечались и ранее подробно не описанные эпителиальные, макрофагальные и эндотелиальные клетки с крупными светлыми ядрами. Часть из таких клеток имела 2 и более ядер, на поздних сроках от начала заболевания было отмечено наличие симпластических структур. Такие клетки были условно обозначены как гриппозные клетки 2 типа.
Мерцательный эпителий дыхательных путей был преимущественно сохранен. Очаги нейтрофильной инфильтрации, расцененные как признаки бактериальной суперинфекции, отмечены только в 12 из 31 (37%) случая.
Ведущее значение для формирования острой дыхательной недостаточности имел респираторный дистресс синдром, проявлявшийся в резком полнокровии сосудов, серозном экссудате в просвете альвеол, их неравномерной воздушности. Закономерно выявлялись также гиалиновые мембраны и диссеминированное внутрисосудистое свертывание.
Кроме того, в отдельных наблюдениях отмечалось набухание клеток эндотелия и умеренная периваскулярная лимфоцитарная инфильтрация в миокарде, головном мозге, печени и почках, сходные с описывавшимися ранее как проявления генерализации гриппа.
При иммуногистохимическом анализе, гемагглютинин (НА) и нуклеопротеин (NР) были выявлены в тканях легких, сердца и головного мозга. Вирусные антигены обнаруживались в различных клетках легких: в эпителии альвеол и бронхиол, в эндотелии кровеносных сосудов разного калибра (капиллярах и артериолах), и в альвеолярных макрофагах. Наличие вирусных антигенов регистрировали также в эндотелии кровеносных сосудов миокарда и в периваскулярных макрофагах. В головном мозге HA и NP были выявлены в глиальных клетках, нейронах и в эндотелии некоторых микрососудов. Следует отметить, что локализация вирусных антигенов в эпителии альвеол и бронхиол и в эндотелии кровеносных сосудов отмечена во всех проанализированных наблюдениях, тогда как поражения сосудов сердца и тканей мозга регистрировалось лишь в единичных случаях.
Результаты морфометрического исследования «гриппозных» клеток приведены в Таблице 1, из данных которой следует, что по сравнению с клетками типичными для гриппа 70-ых годов (архивные микропрепараты типичных наблюдений тех лет) при летальных исходах от гриппа A H1N1 Калифорния, пораженные вирусом альвеолярные макрофаги и клетки альвеолярного эпителия имели достоверно большие размеры и ядерно-цитоплазматический коэффициент.
Таблица 1. Площади и ядерно-цитоплазматические коэффициенты гриппозных клеток 1 и 2 типа (n = 50, p < 0,05)
| Морфологические характеристики | Гриппозные клетки 1 типа | Гриппозные клетки 2 типа |
| Площадь (условные единицы) | 14273,6±1099,8 | 19715,3±1436,4 |
| Ядерно-цитоплазматический коэффициент | 0,274±0,014 | 0,347±0,016 |
В одном наблюдении пациент В., 31 год, смерть на 35 сутки от начала заболевания (клинически и вирусологически подтвержденного гриппа). При посмертном вирусологическом исследовании РНК вируса гриппа не было выявлено. При микроскопическом исследовании в просветах большинства альвеол обнаруживались макрофаги с вакуолизированной цитоплазмой, содержавшей Шифф-положительные включения, определявшиеся и внутриклеточно. При иммунофлуоресцентном и иммуногистохимическом исследованиях в значительном количестве был выявлен антиген Chlamydia trachomatis. Типичные элементарные и ретикулярные тельца этого возбудителя были выявлены в легких и при электронно-микроскопическом исследовании. Кроме того, при иммунофлюресцентном исследовании хламидийный антиген был выявлен в ткани головного мозга, а их ретикулярные тельца в эндотелии кровеносного сосуда. Комплексный анализ клинических, лабораторных и морфологических данных позволил сделать вывод, что пациент умер от генерализованного хламидиоза на поздних сроках гриппозной инфекции.
Результаты вирусологического исследования экспериментального материала приведены в Таблице 2. Как следует из приведенных данных, модельные вирусы эффективно размножались в ткани легких животных, достигая на 3 сутки после инфицирования титров 6,1 – 6,2 log10 EID50/20 мг ткани в зависимости от использованного штамма. С течением времени инфекционная активность вирусов снижалась, и к 14 суткам опыта вирус A/WSN (H1N1) практически не выделялся из легких. Активность вируса A/California/07/09 (H1N1), была несколько выше, однако и она существенно падала по сравнению с исходным значением (3 сутки).
Таблица 2. Динамика репликации (титра) вирусов гриппа
A/California/07/09 (H1N1) и A/WSN (H1N1) в ткани легких зараженных животных
(инфицирующая доза вирусов – 1 LD50)
| A/California/07/09 (H1N1) | A/WSN (H1N1) | ||||
| 3 сутки | 7 сутки | 14 сутки | 3 сутки | 7 сутки | 14 сутки |
| 6,20±0,18 | 4,10±0,17 | 1,30±0,30 | 6,10±0,26 | 4,70±0,46 | 0,60±0,22 |
При гистологическом исследовании микропрепаратов контрольных животных значимых патологических изменений не выявлено.
При гистологическом исследовании микропрепаратов экспериментальных животных, инфицированных обоими штаммами вируса, отмечено нарастание воспалительной инфильтрации в легких (Таблица 3), на ранних сроках представленной преимущественно гнойно-макрофагальным экссудатом в просвете бронхов и перибронхиально.
Таблица 3. Площадь безвоздушных очагов в легких (в процентах площади среза)
| Группа животных | Срок забоя (сутки) | Средняя площадь безвоздушной ткани (проценты) |
| Группа интраназального инфицирования вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1) | 3 | 11,87 23,2 34,53 |
| 7 | 17,63 53 88,37 | |
| 14 | 47* | |
| Группа интраназального инфицирования вирусом гриппа A/WSN (H1N1) | 3 | -2,47 5,8 14,07 |
| 7 | 7,89 32 56,11 | |
| 14 | 22,53 33,2 43,87 | |
| Группа интраназального введения физиологического раствора | 3 | -0,42 3,6 7,62 |
| 7 | 3,65 8,8 13,95 | |
| 14 | 4,34 12,8 21,26 | |
| Интактные животные | - | -6,92 8 22,92 |
Приведены средние показатели по 5 животным в каждой группе, подстрочными индексами указаны 95%-ные доверительные интервалы
*На данный срок выжило 1 животное
На более поздних сроках отмечалось спадение отдельных альвеол с преимущественно мононуклеарной межуточной инфильтрацией. Клетки бронхиального эпителия подвергались выраженным дистрофическим изменениям, но в случае штамма A/California/07/09 (H1N1) практически не слущивались. Часть альвеолярных макрофагов приобретала увеличенные в размерах светлые ядра, что делало их сходными с гриппозными клетками 2 типа, описанными нами на аутопсийном материале, однако цитоплазма таких клеток прослеживалась не всегда отчетливо.
В миокарде отдельных животных отмечались явления васкулита.
Со стороны головного мозга зараженных вирусом мышей, начиная с 3 суток, закономерно определялось набухание эндотелия кровеносных сосудов мягких мозговых оболочек и их полнокровие, а также умеренная мононуклеарная инфильтрация. В веществе головного мозга наряду с дистрофическими и некробиотическими изменениями нервных клеток, особенно при заражении нейротропным штаммом A/WSN (H1N1), определялись небольшие скопления глиальных клеток.
Наличие антигена вируса гриппа в легких, мягкой мозговой оболочке и веществе головного мозга экспериментальных животных было подтверждено на 3 сутки после заражения при иммуногистохимическом исследовании.
Таким образом, в эксперименте удалось воспроизвести морфологические изменения, сходные с наблюдавшимися на аутопсийном материале умерших от гриппа H1N1 Калифорния. Также удалось подтвердить способность данного вируса приводить к внелегочным поражениям. Вместе с тем, в эксперименте не удается воспроизвести острый респираторный дистресс-синдром. Определенные отличия имеются и в характере вирусиндуцированных изменений эпителиальных клеток и макрофагов.
ВЫВОДЫ
1. Морфологические проявления гриппа в 2009-2011 гг. характеризуются как широко известными неспецифическими изменениями, которые могут быть обозначены как диффузное альвеолярное повреждение или острый респираторный дистресс-синдром взрослых, так и мало описанными в литературе специфичными для гриппа изменениями клеток мерцательного эпителия, альвеолоцитов и альвеолярных макрофагов.
2. Характерные для гриппа H1N1 Калифорния изменения клеток, имеющие диагностическое значение, включают более выраженные пролиферативные изменения с образованием симпластоподобных многоядерных структур и увеличением ядерно-цитоплазматического коэффициента по сравнению с изменениями клеток, наблюдавшимися при гриппе в предшествующие эпидемии.
3. Заражение белых беспородных мышей вирусом гриппа H1N1 Калифорния позволяет воспроизвести патологический процесс в легких, сходный с наблюдаемым у человека.
4. При гриппе H1N1 Калифорния возможна генерализация инфекции с преимущественным поражением головного мозга и сердца, что подтверждено на секционном и экспериментальном материале с применением гистологического и иммуногистохимического исследований.
5. Возможно сочетание гриппа H1N1 Калифорния с бактериальными инфекциями, но, в отличие от эпидемического гриппа прошлых лет, осложнение гриппа H1N1 Калифорния бактериальными пневмониями встречается относительно редко; при этом в единичном наблюдении показана возможность развития при гриппе H1N1 Калифорния генерализованного хламидиоза.
Практические рекомендации
1. При гистологическом исследовании секционного материала с подозрением на грипп необходимо обращать особое внимание на цитопатические и пролиферативные изменения альвеолоцитов, альвеолярных макрофагов, клеток респираторного эпителия и эндотелия сосудов, уделяя особе внимание характерной для гриппа трансформации клеток.
2. При летальных исходах от гриппа необходимо проводить тщательное гистологическое и иммуногистохимическое исследование, направленное на выявление возможной генерализации гриппа с поражением головного мозга и сердца.
3. Многие аспекты патоморфологии и патогенеза гриппа, вызванного разными штаммами возбудителя, оптимально изучать в модели на белых беспородных мышах.
4. Исследование секционного материала с подтвержденным гриппом, особенно на поздних сроках, должно быть направлено на выявление других инфекций, к присоединению и обострению которых может приводить грипп, в частности хламидиоза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Патогенетические аспекты гриппа в период эпидемии, вызванной вирусом H1N1v в 2009-2010 гг. / В.А. Цинзерлинг, С.Л. Воробьев, В.В. Зарубаев, С.В. Беляевская, Е.В. Эсауленко, И.В. Григорьева, В.А. Дедов [и соавт.] // Архив патологии. – 2011. – Т. 73, №6. – С. 21-25.
2. Клинико-морфологические сопоставления в случаях летальных исходов при гриппе в 2009-11 годах / С.А. Гладков, И.В. Григорьева, В.А. Дедов, Е.В. Эсауленко, В.А. Цинзерлинг // Журнал инфектологии. – 2011. – Т. 3, №4. – С. 55-61.
3. Дедов В.А. Патоморфологические особенности гриппа H1N1 Калифорния на аутопсийном материале и в экспериментальной модели на белых беспородных мышах / В.А. Дедов // Сборник научных трудов XIV Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье». – СПб., 2011. – С. 83.
4. Цинзерлинг В.А. Экспериментальные модели поражений нервной системы при генерализованном гриппе / В.А. Цинзерлинг, В.В. Зарубаев, В.А. Дедов // Цинзерлинг В.А. Инфекционные поражение нервной системы: вопросы этиологии, патогенеза и диагностики. Руководство для врачей / В.А. Цинзерлинг, М.Л. Чухловина. – СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2011. – С. 382-414.
5. Цинзерлинг В.А. Патоморфологические и патогенетические аспекты гриппа H1N1 Калифорния / В.А. Цинзерлинг, В.А. Дедов // Вестник СПбГУ. Серия: Медицина. – 2012. – №1. – С. 41-48.
6. Дедов В.А. Особенности патоморфологии гриппа H1N1 Калифорния в аутопсийном материале 2009-2011 гг. и в эксперименте / В.А. Дедов // Сборник научных трудов XV Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина – Человек и его здоровье». – СПб., 2012. – С. 355.
