WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Изучение полиморфных вариантов некоторых генов-кандидатов ибс у русских мужчин молодого и среднего возраста.

На правах рукописи

Голубева Александра Андреевна

Изучение полиморфных вариантов некоторых генов-кандидатов ИБС у русских мужчин молодого и среднего возраста.

14.00.06. – кардиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Абрам Львович Сыркин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Жанна Михайловна Сизова
доктор медицинских наук, профессор Сергей Николаевич Терещенко

Ведущее учреждение:

Государственный научно-исследовательский центр профилактической медицины Росздрава

Защита диссертации состоится «____» 2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д208.040.05 в Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова (119991 Москва, ул. Трубецкая, д.8 строение 2).

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова (117998, г.Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан « » 2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из основных направлений в здравоохранении является разработка эффективных мер профилактики заболеваний, на долю которых приходится наиболее высокий процент инвалидизации и смертности среди населения большинства высокоразвитых стран [Оганов Р.Г., 1999]. В первую очередь к ним относятся ишемическая болезнь сердца (ИБС). Давно известно, что факторами риска развития ИБС являются курение, ожирение, артериальная гипертензия (АГ), гиперхолестеринемия (ГХС), малоподвижный образ жизни, сахарный диабет. Однако, в последнее время появились работы, свидетельствующие, что наряду с факторами внешней среды существует также генетическая предрасположенность к этому заболеванию.

За последнее десятилетие был обнаружен целый ряд мутаций, приводящих к раннему развитию ИБС и инфаркта миокарда (ИМ). На сегодняшний день описано более 700 различных мутаций гена рецептора липопротеина низкой плотности (РЛПНП), изменяющих аминокислотную структуру белка, в результате которых нарушается взаимодействие этого рецептора с ЛПНП и липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП) [Hobbs HH, 1992; Мандельштам М.Ю, 2002]. Это является причиной семейной гиперхолестеринемии, что приводит к раннему развитию ИБС и ИМ. Мутация гена аполипопротеина В (АРОВ) 3500ArgGln приводит к замене аминокислоты аргинин на глутаминовую кислоту вблизи от центра связывания с РЛПНП. Это также нарушает взаимодействие рецептора с ЛПНП и приводит к такой же клинической картине что и мутации гена РЛПНП: ГХС и раннему развитию ИБС и ИМ [Hixson J.E, 1992]. Однако, эти мутации крайне редки: они встречаются с частотой не более чем 1 случай на 500-700 человек и поэтому не могут объяснить генетические основы этих заболеваний.

В ходе расшифровки генома человека были выявлены многочисленные полиморфные варианты ДНК, когда у разных людей в определенном положении находятся разные нуклеотиды. Такие изменения также являются мутациями, однако, поскольку они расположены в участках, некодирующих белки, либо они не нарушают аминокислотную структуру белков, их принято называть однонуклеотидными полиморфизмами или SNP. На сегодняшний день в геноме человека обнаружено более 1 000 000 SNP [Lander ES,2001] Отличающиеся варианты ДНК по определенному положению называют аллелями. Для сравнительного анализа проводят типирование SNP, у которых частота реже встречающегося аллеля превышает 5%. Хотя SNP и не меняют аминокислотную структуру белков, они могут изменять регуляторные участки генов и, таким образом, определять количество соответствующего белка, либо могут оказаться сцепленными с другими функционально-значимыми мутациями, которые пока остаются неизвестными.

Цель исследования: Изучить у больных ишемической болезнью сердца полиморфные варианты некоторых генов-кандидатов с целью оценить их роль в качестве маркеров возникновения заболевания.

Задачи исследования:

  1. Изучить распределение частот генотипов полиморфных маркеров, изучаемых генов-кандидатов ИБС: гена аполипопротеина Е (АРОЕ), гена липопротеинлипазы (LPL), гена белка переносчика эстерифицированного холестерина (CЕТР), гена синтазы окиси азота (еNOS), гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), гена фактора V (F5), гена протромбина (F2), гена ингибитора активатора плазминогена (PAI-1), гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE) у русских мужчин, проживающих в Москве и Подмосковье, страдающих ИБС и в контрольной группе;
  2. Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов ИБС с факторами риска заболевания;
  3. Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов ИБС с содержанием липидов в сыворотке крови (ОХС, ХСЛВП, ХСЛНП, ТГ);
  4. Провести анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов ИБС с показателями свертывающей системы крови (фибриноген, протромбиновый индекс (ПИ), активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)).

Научная новизна: У русских мужчин, проживающих в Москве и Подмосковье, с помощью современных методов исследования, впервые охарактеризованы частоты генотипов полиморфных вариантов генов-кандидатов одновременно нескольких систем. Проведен анализ ассоциаций полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов с риском развития ИБС, а также с показателями липидного спектра и свертывающей системы крови. Результаты настоящего исследования могут служить отправными данными для дальнейшего изучения и поиска генетических факторов риска ИБС.

Практическая значимость работы.

  1. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов ИБС может быть использован для выявления лиц, угрожающих по развитию данного заболевания и последующего проведения донозологической профилактики.
  2. Данные об ассоциациях полиморфных маркеров генов-кандидатов ИБС можно рекомендовать в практике медико-генетического консультирования для определения риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений;
  3. Информация об ассоциациях полиморфных вариантов генов-кандидатов ИБС может быть использована в области генетической эпидемиологии, а также в популяционной генетике.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Наряду с факторами внешней среды, существует генетическая предрасположенность к ишемической болезни сердца.
  2. Для выявления молекулярно-генетических факторов, определяющих предрасположенность к ИБС, можно проводить анализ SNP, расположенных внутри и/или вблизи генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания.
  3. С развитием ишемической болезни сердца, у русских мужчин молодого и среднего возраста, ассоциированы полиморфные маркеры гена АРОЕ, еNOS, PAI-1.
  4. Внедрение молекулярно-генетичесикх исследований в клиническую практику даст возможность выявлять группы риска по развитию и неблагоприятному течению сердечно-сосудистых заболеваний.

Внедрение результатов работы: Методика определения полиморфных маркеров генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний внедрена в практику клиники кардиологии ММА им.И.М.Сеченова.

Апробация диссертации: проведена 05 декабря 2007 года на совместном заседании Кафедры профилактической и неотложной кардиологии ФППОВ, клиники кардиологии, отдела кардиологии НИЦ ММА им.И.М.Сеченова

Публикации: по теме диссертации опубликовано 4 печатных работ.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, включает 26 таблиц, 6 рисунков; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 160 работ отечественных и зарубежных авторов.

ОБЪЕКТ и методы исследования

Объект исследования. Всего обследовано 253 мужчины русской национальности, проживающих в Москве и Подмосковье. В основную группу включены 120 больных ишемической болезнью сердца, неродственных между собой и группой контроля, в возрасте до 55 лет (средний возраст на момент обследования 49,2±0,64). 85 пациентов имели в анамнезе перенесенный инфаркт миокарда, у 35 по данным селективной коронароангиографии был диагностирован коронарный атеросклероз.

В группу контроля включено 133 человека, в возрасте до 60 лет (средний возраст на момент обследования 49,4±0,82) без клинических и диагностических признаков ишемической болезни сердца (отрицательная проба при проведении нагрузочного теста). Пациенты, страдающие сахарным диабетом, тяжелыми сопутствующими заболеваниями были исключены из исследования. В контрольную группу также не были включены лица, страдающие сахарным диабетом и артериальной гипертензией.

Пациенты и здоровые лица проходили обследование, а при необходимости лечение в Клинике кардиологии ММА им.И.М.Сеченова в период с сентября 2005 по апрель 2007 год.

Методы исследования. Все лица, вошедшие в исследование прошли тщательное медицинское обследование. В числе параметров, ассоциирующихся с возникновением ИБС, анализировали набор стандартных факторов риска ИБС (возраст, пол, семейная история ИБС, курение, ожирение, наличие сопутствующих артериальной гипертонии, сахарного диабета и дислипидемии). Изучали характер течения ИБС (возраст, дебют заболевания, характер первых симптомов, длительность и особенности течения коронарной болезни). Группа мужчин, вошедших в контрольную группу также прошли медицинское обследование, включающее в себя сбор анамнеза, физикальное обследование, нагрузочный ЭКГ тредмил-тест для исключения ИБС. Оценивали наличие таких факторов риска ИБС, как семейная история коронарной болезни, курение, ожирение (по индексу массы тела: вес в кг/рост в м2.

Ожирение: Для оценки выраженности ожирения вычисляли индекс Кетле по формуле: индекс Кетле= Вес(кг)/рост(м). Под избыточным весом понимали индекс Кетле >25 кг/ м

Курение: Учитывался как факт курения, так и количество выкуриваемых в день сигарет.

Отягощенная наследственность: Оценка семейного анамнеза проводили на основе опроса больных с помощью стандартного опросника ВОЗ «Семейный анамнез». Регистрировали наличие у родственника первой степени родства (родители, родные братья и сестры, дети) наличие смерти от ИМ и инсульта. Семейный анамнез считали отягощенным при наличии у пациентов двух и более больных родственников.

Гиперлпидемия: Определение концентраций ОХС, ТГ, ХСЛПВП, ХСЛПНП проводилось стандартным ферментативным методом в лаборатории клинического центра ММА им. И.М.Сеченова.

Пациентам основной группы определение показателей липидов крови проводили однократно до назначения липидснижающей терапии. Пациенты, которые получали лечение липидснижающими препаратами до включения в исследование, не учитывались при анализе ассоциаций генов-кандидатов с показателями липидного спектра.

К гиперхолестеринемии относили значения ОХС 190 мг/дл, повышенным уровнем ХС ЛНП считали 115 мг/дл. Сниженным уровнем ХС ЛВП у мужчин считали значения ХС ЛВП40 мг/дл. К гипертриглицеридемии относили уровень ТГ150 мг/дл [ВНОК, 2003].

Генетическое обследование.

Генетическое обследование проводили на базе НИИ физико-химической медицины, в лаборатории генетики человека.

ДНК лейкоцитов выделяли из 2 мл цельной крови с помощью набора Wizard (Promeda, USA) согласно инструкции производителя. Анализ полиморфных маркеров получали в ходе ПЦР-амплификации при помощи олигонуклеотидных пар праймеров с определенными последовательностями. Для идентификации точечных однонуклеотидных замен в исследуемых генах использовали подходящие смеси дезокси- и дидезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP и ddNTP) и следующие олигонуклеотидные зонды. Затем проводили реакцию термоциклического минисеквенирования. Очистку продуктов реакции минисеквенирования и секвенирования проводили с помощью SpectroCLEAN Kit (Sequenom, США) согласно инструкции фирмы-производителя.

Статистический анализ. Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel», и пакета прикладных программ «Statistica for Windows» v. 6.0, StatSoft Inc. (США), SPSS 13.0

Все полученные количественные анамнестические, клинические, лабораторные и инструментальные данные обработаны методом вариационной статистики. Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (), ошибка среднего (m), медиана (Ме), 95% доверительный интервал, для качественных данных - частоты (%).

Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали метод дисперсионного анализа ANOVA (для нескольких групп) и t-критерий Стъюдента для 2-х независимых выборок. Для сравнения непараметрических данных применяли методы Круаскала-Уоллиса (для нескольких групп), попарное сравнение с помощью критерии Манна-Уитни (для 2-х групп) для несвязанных совокупностей.

Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод 2 с поправкой Йетса на непрерывность, для вычисления, которого прибегали к построению «сетки 2х2» и «3х2», а также точный критерий Фишера для небольших выборок.

Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости).

Связь между изучаемыми показателями оценивалась по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента корреляции Пирсона (r) или Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t.

Для исследования влияние одной или нескольких независимых переменных на одну зависимую переменную использовался одномерный дисперсионный анализ (общий многофакторный).

Частоту аллелей вычисляли по формуле: f=n/2N, где n – количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды).

Относительный риск (ОР) заболеваемости вычисляли по методу Woolf по формуле

(a d) / (b c),

где а – количество больных, имеющих данный генотип;

b — количество больных, не имеющих данного генотипа;

c – количество здоровых индивидуумов с данным генотипом;

d – количество здоровых индивидуумов, не имеющих данного генотипа.

В том случае, когда один из показателей был равен 0, относительный риск вычисляли по формуле, модифицированной Haldane для малых чисел:

[(2a+1)(2d+1)]/[(2b+1)(2c+1)].

Для определения ассоциации качественных показателей с количественными показателями использовали многомерный многофакторный анализ (GLM). Оценка показателей учитывалась по двустороннему критерию «След Пиллая».

Результаты и обсуждение

1. Факторы риска ИБС.

На момент обследования средний возраст больных составлял 49,2±0,64 года. Средний возраст мужчин, вошедших в контрольную группу составил 49,4±0,82 года. Клиническая характеристика больных представлена в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительный анализ факторов риска в основной и контрольной группе.

Показатель Основная группа (n=120) Контрольная групп (n=133) р
Возраст 49,2±0,64 49,4±0,82
Курение, Да Нет Ранее 53,2 23,4 24,0 36,7 33,2 30,1 0,04 0,89 0,33
Отягощенная наследственность 51,7 12 0,01
ИМТ <25 кг/м2 ИМТ 25-29 кг/м2 ИМТ 30 кг/м2 50,8 26,7 22,5 62,4 24,8 12,8 0,41 0,36 0,02

Как следует из таблицы 1, между исследуемыми лицами не было выявлено межгрупповых различий по возрасту. Так, средний возраст в основной группе составил 49,2±0,64 года, в контрольной группе 49,4±0,82 Рассматриваемые группы статистически достоверно отличались по семейному анамнезу ИБС (в основной группе чаще встречался отягощенный семейный анамнез, чем в контрольной группе (51,7% у больных против 12% у здоровых, р=0,01). Количество курящих было больше в основной группе, чем в контрольной группы (53,2% против 36,7%; р=0,04).

Также группы отличались по ИМТ (ИМТ 30 кг/м2 достоверно чаще встречался у больных ИБС (22,5%, против 12,8% у здоровых, р=0,02).

При изучении показателей липидного спектра оказалось, что средний уровень ТГ у лиц обоих групп находился в рамках нормальных значений (менее 200 мг/дл) [Expert Panel on Detection, Evaluation and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults,2001], хотя у основной группы рассматриваемый показатель был достоверно выше, чем у контрольной (181±7,92 и 113±5,43, соответственно; р=0,01). Средний уровень общего ХС в основной группе несколько превышал нормальные значения в 200 мг/дл [Scandinavian Simvistatin Survival Study Group,1994] и достоверно отличался от показателя в контрольной группе (255±4,42 и 180±4,64, соответственно; р=0,03). Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительный анализ показателей липидного обмена в основной и контрольной группе

Показатель ИБС (n=98) Контрольная группа (n=100) р
ХС (мг/дл) 255±4,42 180±4,64 0,03
ЛПВП (мг/дл) 37,7±1,24 47,2±3,4 0,24
ЛПНП (мг/дл) 136±3,81 138±10,3 0,68
ЛПОНП 39,2±1,88 31,6±2,51 0,12
ТГ (мг/дл) 181±7,92 113±5,43 0,01

Среди показателей свертывающей системы крои, мы исследовали уровень фибриногена, ПИ и АЧТВ. Пациенты, принимающие антиагреганты, антикоагулянты и другие препараты, оказывающие влияние на показатели коагулограммы не учитывались при анализе. Как следует из таблицы 3, уровень фибриногена не превышал нормальных значений (однако статистически достоверно был несколько выше в группе больных (3,19±0,07 против 1,96±0,09, р=0,03). Показатели ПИ и АЧТВ не превышали нормальных значений как в основной, так и в контрольной группе и статистически не отличались.

Таблица 3. Сравнительный анализ показателей свертывающей системы крови у основной и контрольной группы

Показатель ИБС (n= 98) Контрольная групп (n=84) р
Фибриноген 3,19±0,07 1,96±0,09 0,03
ПИ 98,2±0,99 89,3±0,77 0,45
АЧТВ 32,8±0,91 34,2±0,74 0,32

2. Анализ результатов генетического обследования

Основной подход к изучению роли молекулярно-генетических факторов в развитие ИБС связан с выявлением группы генов с потенциально наибольшим вкладом в патогенез заболевания. Мы исследовали гены-кандидаты одновременно нескольких систем: некоторые гены белков метаболизма и транспорта липидов (ген АРОЕ ген LPL, ген CETP), гены белков свертывающей системы крови (ген F2, ген MTHFR, ген F5, ген PAI-1), а также ген ACE и ген еNOS.

2.1 Анализ ассоциаций полиморфных маркеров Е2/Е3/Е4 гена аполипротеина Е с ИБС.

Ген АРОЕ активно изучается как один из наиболее известных генов-кандидатов, полиморфизм которого оказывает выраженное влияние на предрасположенность к ряду сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний. Полиморфизм гена АРОЕ, изученный в нашей работе, связан с двумя сцепленными точковыми мутациями в позициях 112 (Arg-Cis) и 158 (Arg-Cis).

Результаты проведенного анализа показали наличие трех аллельных вариантов (Е2, Е3, Е4) и 5 генотипов (Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4 и Е4/Е4) исследуемого локуса гена АРОЕ. В нашем исследовании отсутствовали лица с генотипами АРОЕ2/Е2.

На первом этапе мы определили частоту встречаемости полиморфных вариантов гена АРОЕ в основной и контрольной группе. Частоты генотипов в основной группе составили: АРОЕ2/3 (10,8), АРОЕ3/3 (47,8%), АРОЕ3/4 (18,7%), АРОЕ 2/4 (2,7%), АРОЕ 4/4 (0,8%). Частоты генотипов в контрольной группе составили: АРОЕ2/3 (12%), АРОЕ3/3 (62,4%), АРОЕ3/4 (10,2%), АРОЕ2/4 (0,8%), АРОЕ 4/4 (1,5%). При сравнении основной группы и контрольной группы по распределению частот генотипов оказалось, что в контрольной группе достоверно чаще преобладал генотип АРОЕ3/3 (р=0,04). При этом, относительный риск развития заболевания при данном генотипе снижен (ОР=0,51, 95%ДИ [0,26-0,89]. В основной группе генотип АРОЕ3/4 встречается достоверно чаще, чем в контрольной группе (р=0,04). При этом относительный риск развития ИБС, при наличии генотипа АРОЕ3/4, увеличивался практически в 3 раза (OР=2,89, 95%ДИ [1,36-4,89].

Рисунок 1. Распределение частот генотипов полиморфных маркеров гена АРОЕ в основной и контрольной группе.

В связи с тем, что мы получили достоверные результаты по распределению частот генотипов между основной группой и контрольной группой, мы проанализировали, существуют ли отличия по распределению частот генотипов у лиц с перенесенным ИМ и без ИМ.

Данные представлены на рисунке 2.

Рисунок 1 Распределение частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров гена АРОЕ у больных, перенесших ИМ и без ИМ.

При сравнении подгрупп больных между собой, выявлены достоверные различия среди лиц, перенесших ИМ. Генотип АРОЕ3/4 встречается чаще у пациентов, которые перенесли ИМ, чем в группе больных без перенесенного ИМ (20,0% против 8,6%; р =0,03). При этом риск развития ИМ повышен при наличии генотипа АРОЕ3/4 (OР =1,49 95%ДИ [1,12-2,24].

Полученные данные позволяют предположить, что именно аллель Е4 и генотип АРОЕ3/4 можно рассматривать как повышающие риск развития ИМ, но их действие на уровне популяции в целом не явно выражено из-за низкой частоты данного аллеля и генотипа.

Мы не получили достоверных различий между генотипами АРОЕ 2/4 и АРОЕ4/4 в основной и контрольной группе, где также встречается аллель Е4, что вероятнее всего связано с низкой частотой встречаемости данных генотипов. Однако, это не исключает вклад аллеля Е4 в развитие ИБС у русских мужчин.

2.2 Анализ ассоциаций полиморфного маркера S447X гена LPL с ИБС.

Полиморфный маркер S447X гена LPL в настоящее время еще малоизучен. Однако известно, что вариант G полиморфизма S447X ассоциирован с благоприятными изменениями липидного спектра: пониженным уровнем ТГ и повышенным уровнем ХСЛПВП. Генотип G/G полиморфизма S447является защитным фактором[Jemaa R., 1995].

Частоты распределения генотипов полиморфизма S447X гена LPL в основной группе являются следующими: S447X С/С (84,2%), S447X G/С (10,8%), S447 XG/G (0,8%). Частоты распределения генотипов полиморфизма S447X гена LPL в контрольной группе составили: S447X С/С (80,5%), S447G/С (9,8%), S447 G/G (0,8%).

Как видно из рисунка 3, нами не было получено статистически значимых различий по частотам встречаемости генотипов полиморфного маркера S447 гена LPL в основной и контрольной группе.

При сравнении лиц с перенесенным ИМ и без ИМ по распределению частот генотипов достоверных отличий не обнаружено. Данные представлены на рисунке 4.

Рисунок 3.Распределение частот генотипов полиморфного маркера S447 гена LPL

 Распределение частот генотипов полиморфного маркера S447 гена LPLв-2

Рисунок 4. Распределение частот генотипов полиморфного маркера S447 гена LPLв подгруппах с ИМ и без ИМ.

Таким образом, у русских мужчин, полиморфный маркер S447X гена LPL не ассоциирован с риском развития ИБС.

2.3. Анализ ассоциаций полиморфизмов Taq1B и I405A гена СЕТР с ИБС.

Ген СЕТР, который изучался в нашей работе, представлен двумя полиморфными вариантами: Taq1B и I405V. В литературе имеется небольшое количество данных, изучающих данные полиморфные варианты гена СЕТР и их вклад в развитие ИБС и ИМ.

Частоты распределения генотипов полиморфизма Taq1B в группе больных являются следующими: Taq1В1В2 (30,0%); Taq1В2В2 (43,3%); Taq1В1В1 (21,7%). В группе контроля распределение было следующим: Taq1В1В2 (27,1 %); Taq1В2В2 (48,1%); Taq1В1В1 (18,0%). Генотип В1В1 несколько чаще встречается в группе ИБС, результат не является статистически достоверным (р>0,05). Генотип В2В2 чаще встречался в группе контроля, однако результат также не является статистически достоверным. Распределение частот генотипов полиморфизма I405A в основной группе является следующим: I405V I/I (42,5%); I405V I/V (38,3%); I405V V/V (9,2%). В контрольной группе распределение выглядело таким образом: I405V I/I (46,6 %); I405V I/V (32,3 %); I405V V/V (5,3%). В группе контроля несколько чаще встречался генотип II (42,5% против 46,6%, р>0,05), генотип VV чаще встречался в группе больных ИБС (9,2% против 5.3%; р>0,05).

По нашим данным генотип В1В1 полиморфизма Taq1B несколько чаще встречался в группе больных ИБС, что не противоречит раннее проведенным исследованиям [Inazu A,1990;InazuA,1994;KuivenchovenJ.A,1998]. Изучение полиморфизма I405V показало, что генотип II встречался чаще в группе здоровых людей, а генотип VV чаще встречался в группе ИБС. Наши результаты не противоречат литературным источникам, однако результаты являются статистически не достоверными [Borggreve SE, 2006; Isaacs A,2007;].

2.4 Анализ ассоциаций генов метаболизма и транспорта липидов с факторами риска ИБС и показателями липидов крови.

Одной из задач нашего исследования была попытка выявить взаимосвязь между определенными полиморфными вариантами генов АРОЕ, СЕТР, LPL и такими факторами риска ИБС, как ожирение, курение, отягощенная наследственность. При сравнении частот распределения полиморфных вариантов указанных генов и факторами риска ИБС (курение, ожирение, семейный анамнез) достоверной значимости получено не было (р>0,05).

Для выявления ассоциации между генами метаболизма и транспорта липидов и показателями липидов крови (ОХС, ТГ, ЛПВП, ЛПНП) мы использовали многомерный многофакторный анализ (процедура GLM в системе SPSS 13.0). Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4. Анализ ассоциаций генов APOE, LPL S447, CETP taq, CETP I405A c показателями липидов крови

Гены Значимость двустороння по критерию след Пиллая
АРОЕ 0,87
S447LPL 0,97
CETP taq 0,61
CETPI405A 0,81

Однако, мы не получили ассоциации между генами-кандидатами и показателями липидов крови. Возможно, с одной стороны это можно объяснить небольшим количеством людей, вошедших в исследуемые группы, а с другой стороны неравномерностью распределения генотипов в исследуемых группах.

2.5. Анализ ассоциаций G/T полиморфизма гена эндотелиальной синтазы оксида азота с ишемической болезнью сердца.

Ген эндотелиальный NO-синтетазы расположен на хромосоме 7q35-36. Нами был изучен полиморфизм E298D, мононуклеотидная замена в экзоне 7, приводящая к аминокислотной замене глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту.

Частоты распределения генотипов полиморфного маркера гена NOS в основной группе составили: еNOS G/G (34,2%); еNOS G/T(43,3%); еNOS T/T-(10,0%). Частоты распределения генотипов гена NOS в контрольной группе следующие: еNOS G/G (56,4%); еNOS G/T(28,6%); еNOS T/T (4,5%). В основной группе достоверно чаще встречается генотип еNOS T/T (р=0,02), при этом относительный риск развития ИБС повышен в 2,5 раза (OР=2,29, 95%ДИ [1,13-4,34]. Генотип еNOS G/T встречается также значительно чаще в основной группе, чем в контрольной группе (р=0,02; OР=1,13, 95%ДИ [0,24-1,38]. Генотип еNOS G/G чаще встречается в контрольной группе, при этом снижен и относительный риск развития ИБС (р=0,05, ОР 0,20; 95% ДИ [0,18-0,48]. Распределение генотипов гена еNOS представлено на рисунке 5.

Рисунок 5. Распределение частот генотипов G\T гена NOS

При сравнении распределения частот генотипов между больными перенесшими инфаркт миокарда и больными, без инфаркта миокарда, оказалось, что генотип еNOS G/T достоверно чаще встречался у больных ИМ (49,4% против 28,6 %; р=0,01), по сравнению с группой больных без ИМ. Данные представлены на рисунке 6.

Рисунок 6. Распределение частот генотипов G\T гена NOS в подгруппах больных перенесших ИМ и в группе без ИМ.

Таким образом, в ходе нашего исследования, оказалось, что достоверно чаще аллель Т и генотип еNOS G/T и T/T встречаются в группе больных ИБС и именно у пациентов, перенесших инфаркт миокарда. Наши данные согласуются с результатами мировых исследований, которые также демонстрируют связь аллеля Т и генотипа ТТ с риском развития ИБС, в том числе ИМ (Ichihara S.,1998; Shimasaki Y.,1998; Hingorani A.D.,1999).

При изучении ассоциации между определенными полиморфными вариантами гена NOS и анализируемыми факторами риска ИБС (отягощенная наследственность, курение, ожирение) оказалось, что лица, страдающие ИБС и курящие достоверно чаще имеют генотип NOS Т/Т, чем пациенты, которые не курят. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительный анализ частот распределения генотипов гена еNOS среди курящих и некурящих лиц основной группы.

Курящие пациенты (n=50) Некурящие пациенты (n=28) р ОР 95%ДИ
еNOS G/G 24,8 18,3 0,34 0,12
еNOS G/T 12,2 19,8 0,48 0,28
еNOS T/T 38,6 14,3 0,01 1,12[1,21-19,8]

В контрольной группе нами не было получено статистически значимых различий по частоте встречаемости генотипов гена еNOS в группе курящих и некурящих. Для других факторов риска также не было получено статистически значимых различий.

Таким образом можно предположить, что сочетание такого фактора риска как курение и наличие аллеля Т и генотипа ТТ может увеличивать риск развития ИБС.

2.6. Анализ ассоциаций i/d полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента с ИБС.

Значительный интерес представляет изучение ассоциации между развитием сердечно–сосудистых заболеваний и вариантами генов, кодирующих белки и принимающих участие в регуляции кровяного давления и сосудистого тонуса. В первую очередь к таким белкам можно отнести белки ренин-ангиотензиновой системы. Ключевым белком данной системы является ангиотензинпревращающий фермент. В настоящее время выявлено три генотипа гена АПФ (на основе механизма вставки/делеции-вставка/отсутствие вставки 287-й пары нуклеотидов в 16 интроне): DD и II- гомозиготы и ID гетерозиготы [Rigat B.,1990].

Распределение частот генотипов и аллелей I/D полиморфизма в интроне 16 гена АСЕ в основной группе следующее: ACE I/I (25,8%), ACEI/D (45,8%), ACED/D (25,8%). В контрольной группе были получены следующие данные: ACE I/I (16,5%), ACEI/D (54,1%), ACED/D (24,8%). Мы не получили межгрупповых различий по генотипам DD, ID,II среди исследуемых групп (р>0,05). Также нами не было получено статистически значимых различий между пациентами, перенесшими ИМ и без ИМ.

При сравнении частот распределения генотипов гена АСЕ и факторов риска ИБС достоверной взаимосвязи получено не было (р>0,05).

Таким образом, у русских мужчин не выявлено ассоциации между I/D полиморфизмом гена АСЕ и развитием ИБС.

2.7. Гены-кандидаты белков свертывающей системы крови и анализ ассоциаций полиморфных вариантов с ИБС.

В нашей работе изучались следующие гены-кандидаты белков свертывающей системы крови: ген метилентетрагидрофолатредуктазы (С-677-T), ген фактора V (G-1691-A), ген протромбина (G-20210-A), ген ингибитора активатора плазминогена (PAI-1 5G/4G). Частота распределения полиморфных вариантов указанных генов в основной и контрольной группе представлены в таблице 5.

Исследуя наличие лейденовской мутации в гене FV, оказалось, что лейденовская мутация встречается чаще у пациентов, страдающих ИБС, однако результат не является статистически достоверным (р>0,05).

Также, мы не получили достоверных различий по наличию лейденовской мутации у лиц перенесших инфаркт миокарда, или без него. Исследуя ген MTHFR и ген протромбина среди основной и контрольной группы, мы также не получили статистически достоверных различий (р>0,05).

Таблица 5. Частота распределения полиморфных вариантов генов-кандидатов белков свертывающей системы крови в основной и контрольной группе.

Ген Генотипы Частота генотипа в группе больных ИБС, % Частота генотипов в контрольной группе, % Р ОР 95%ДИ
F2 АG 1,7 4,5 0,11 0,23
GG 97,5 93,2 0,87 0,11
F5 AG 3,3 1,5 0,20 1,04
GG 95,8 96,2 0,43 1,22
MTHFR CC 45,0 42,9 0,36 0,41
CT 43,3 46,6 0,32 0,86
TT 9,2 8,3 0,40 0,14
PAI 44 28,3 34,6 0,14 1,21
45 50,0 38,3 0,03 1,21 [1,11-14,23]
55 18,3 24,1 0,13 0,98

В нашем исследовании в качестве полиморфного маркера гена PAI-1 рассматривалась мононуклеотидная делеция /вставка в промоторной области гена (позиция 675 промотера)-4G(-675)5G.

Согласно нашим данным, достоверно чаще у больных ИБС встречался генотип PAI-14G/5G (р=0,03; ОР=1,21, 95%ДИ [1,10-12,21]. При разделении больных на подгруппы, именно в группе больных без инфаркта миокарда достоверно чаще встречался генотип PAI-14G/5G. Эти данные отличаются от опубликованных исследований, где именно аллель 4G ассоциировалась с инфарктом миокарда. [Erriksson P,1995; N.Ossei-Gerning,1997 ].

Таким образом, можно предположить, что у русских мужчин, молодого и среднего возраста, выявлена ассоциация полиморфного маркера PAI-1 4G/5G с развитием ишемической болезни сердца.

Таблица 6. Частота распределения полиморфных вариантов генов-кандидатов белков свертывающей системы крови в основной группе у лиц с перенесенным ИМ и без ИМ.

Ген Генотипы Частота генотипа в группе больных ИБС, ИМ; % Частота генотипов в группе ИБС Р ОР
F2 АG 2,4 1,2 0,67 0,86
GG 96,5 100,0 0,67 0,97
F5 AG 3,5 2,9 0,43 1,24
GG 95,3 97,1 0,30 0,98
MTHFR CC 43,5 48,6 0,30 0,90
CT 44,7 40,0 0,31 1,11
TT 9,4 8,6 0,44 1,20
PAI 44 30,6 22,9 0,18 1,34
45 44,7 62,9 0,03 0,70
55 22,4 8,6 0,88 0,61

При анализе ассоциаций полиморфных маркеров генов белков свертывающей системы крови с факторами риска ИБС мы не получили достоверно значимых различий (р>0,05). При анализе ассоциаций генов белков свертывающей системы крови и показателей коагулограммы, выявлена взаимосвязь гена MTHFR с показателями свертывающей системы крови. Данные представлены в таблице 7.

Таблица 7. Анализ ассоциаций генов F5, F2, MTHFR, PAI-1 c показателями свертывающей системы крови (ПИ, АЧТВ, фибриноген)

Гены Значимость двустороння по критерию след Пиллая
F2 0,90
F5 0,84
MTHFR <0,001
PAI-1 0,25

Анализируя средние показатели АЧТВ, фибриногена и ПИ, оказалось, что при генотипе СТ и TT гена MTHFR уровень АЧТВ несколько выше, чем при генотипе СС. Данные представлены в таблице 8.

Таблица 8. Средние показатели АЧТВ, фибриногена и ПИ при разных генотипах гена MTHFR.

Зависимая переменная MTHFR Среднее Стд. ошибка 95% доверительный интервал
Нижняя граница Верхняя граница
АЧТВ (сек.) CC 39,981 1,084 37,832 42,129
CT 41,453 1,074 39,325 43,581
TT 46,800 2,473 41,901 51,699
Фибриноген (г/л) CC 3,321 ,108 3,107 3,534
CT 3,030 ,107 2,819 3,241
TT 3,503 ,245 3,017 3,989
ПИ (%) CC 100,308 1,418 97,497 103,118
CT 98,434 1,405 95,650 101,218
TT 84,700 3,235 78,291 91,109

Таким образом выявлена ассоциация гена MTHFR с показателями АЧТВ и фибриногена (р<0,05).

Таким образом, из приведенных выше данных следует, что у русских мужчин молодого и среднего возраста не выявлено статистически значимых различий по частоте встречаемости полиморфных маркеров генов LPL, CETP, ACE, F2, F5, MTHFR. Обнаружена ассоциация полиморфных маркеров АРОЕ3/4, NOS T/T, PAI-14G/5G с ишемической болезнью сердца в изученной нами популяции. Эти данные еще раз показывают необходимость дальнейших исследований в данном направлении с целью выявления новых полиморфных вариантов генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний.

ВЫВОДЫ

  1. У русских мужчин, проживающих в Москве и Подмосковье были обнаружены различия между больными ИБС и здоровыми людьми по следующим изученным генам: АРОЕ, еNOS, PAI.
  2. В группе больных ИБС не различающихся по давности и возрасту ИБС достоверно чаще встречались генотипы АРОЕ3/4, NOST/T среди лиц, перенесших ИМ;
  3. Полиморфный маркер 4G/5G гена PAI-1 достоверно чаще встречался среди лиц, страдающих ИБС без перенесенного ИМ;
  4. Пациенты, страдающие ИБС и курящие достоверно чаще имеют генотип T/T гена NOS
  5. Выявлена ассоциация гена MTHFR с уровнем АЧТВ у пациентов, страдающих ИБС;
  6. Полученные данные могут быть использованы при скрининговым исследовании для выявления лиц угрожающих развитие ИБС с целью проведения первичной профилактики заболевания;

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ

  1. Результаты исследования применимы в практическом здравоохранении для проведения донозологической профилактики сердечно-сосудистых заболеваний;
  2. Информация по распределению частот генотипов и аллелей среди русских мужчин, проживающих в Москве и Подмосковье может быть использована в области генетической эпидемиологии, в популяционной и эволюционной генетике для углубленного описания генофонда народонаселения.

Список работ по теме диссертации

  1. Зайкина А.А. Савинецкая Г.А., Маршева О.В., Погода Т.В., Генерозов Э.В., Сыркин А.Л. Полиморфизм генов-кандидатов и их вклад в развитие ИБС у мужчин // В сборнике XIV Российского национального конгресса"Человек и лекарство". Тез. докл. — Москва, 2007 г.— с. 96
  2. Зайкина А.А, Савинецкая Г.А., Герок Д.В., Маршева О.В., Погода Т.В.,. Генерозов Э.В, Сыркин А.Л.. // Генетический полиморфизм при ишемической болезни сердца// Кардиология, 2008. т.48. №1. с.62-65
  3. Голубева А.А., Савинецкая Г.А., Погода Т.В., Терехов В.Н., Потиевский Б.Г., Генерозов Э.В., Сыркин А.Л. Изучение некоторых генов-кандидатов и их вклад в развитие ишемической болезни сердца// В сборнике XV Российского национального конгресса"Человек и лекарство". Тез. докл. — Москва, 2008 г.— с. 394
  4. Сильвестрова Г.А., Голубева А.А., Сыркин А.Л., Генерозов Э.В., Погода Т.В., Терехов В.Н., Потиевский Б.Г. Полиморфизм генов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и гена-NO-синтетазы и их влияние на развитие артериальной гипертонии у русских мужчин московской популяции//. В сборнике XV Российского национального конгресса"Человек и лекарство". Тез. докл. — Москва, 2008 г.— с.417

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ Артериальная гипертензия
АД АРС Артериальное давление Активированный протеин С
АЧТВ Активированное частичное тромбопластиновое время
BТЭ Венозная тромбоэмболия
ГХС ДНК Гиперхолестеринемия Дезоксирибонуклеиновая кислота
ИБС Ишемическая болезнь сердца
ИМ Инфаркт миокарда
ИМТ Индекс массы тела
ИНС Индекс нарушения сократимости
КАГ Коронароангиография
КДР Конечный диастолический размер
КФК Креатинфосфосфаткиназа
ЛПВП Липопротеины высокой плотности
ЛПНП Липопротеины низкой плотности
ЛПОНП Липопротеины очень низкой плотности
ОЛН Острая левожелудочковая недостаточность
ОПСС Общее периферическое сопротивление сосудов
ПИ Протромбиновый индекс
РЛПНП Рецептор липопротеинов низкой плотности
СНС Симпатическая нервная система
ССЗ Сердечно-сосудистые заболевания
СГХС Семейная гиперхолестеринемия
ТГ Триглицериды
ФВЛЖ Фракция выброса левого желудочка
ФР Фактор риска
ХМ Хиломикроны
ХС Холестерин
ЧСС Частота сердечных сокращений
ЭКГ Электрокардиография
ЭХО КГ Эхокардиографическое исследование
АСЕ АРОВ Ангиотензинпревращающий фермент Аполипопротеин В
АРОЕ Аполипопротеин Е
СЕТР Белок переносчик эстерифицированного холестерина
F2 Протромбин
F5 Фактор свертывания 5
LPL Липопротеинлипаза
MTHFR Метилентетагидрофолатредуктаза
NOS Синтаза окиси азота
PAI Ингибитор активатор плазминогена
SNP Однонуклеотидные полиморфизмы


 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.