Роль пцр - диагностики в проблеме верификации диагноза краснухи
На правах рукописи
Дарвина Ольга Валерьевна
Роль ПЦР - диагностики в проблеме верификации диагноза краснухи
14.01.09 – инфекционные болезни
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Первого Московского Государственного Медицинского Университета имени И.М.Сеченова Росздрава
Научные руководители:
Доктор медицинских наук,
профессор Волчкова
Елена Васильевна
Кандидат медицинских наук Чуланов
Владимир Петрович
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, Ермак
ведущий научный сотрудник Татьяна Никифоровна
Доктор медицинских наук, Погорельская Лидия
профессор Васильевна
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов»
Защита диссертации состоится «___»__________2010 в _______часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.05 при ГОУ ВПО Первого Московского Государственного Медицинского Университета имени И.М.Сеченова Росздрава (119991, г. Москва, ул. Трубецкая, дом 8,стр.2).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ПМГМУ им. И.М.Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, дом 49).
Автореферат разослан «__» __________ 2010г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор Волчкова Елена Васильевна
актуальность темы диссертации
Широкая распространенность вируса краснухи, высокая восприимчивость человека, преимущественное поражение детей, подростков и молодых взрослых, в том числе женщин детородного возраста, риск возникновения врожденных патологий при инфицировании беременных, определяют значение своевременной диагностики краснухи как актуальную проблему для здравоохранения многих стран мира.
Согласно программе Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), краснуха отнесена к числу нозологий, ликвидация которых возможна в ближайшем будущем. Региональный комитет ВОЗ для Европы признал элиминацию краснухи и предотвращение случаев врожденной краснушной инфекции приоритетной задачей программы “Здоровье для всех в XXI веке”, а так же Стратегического плана Европейского региона ВОЗ 2005–2010 гг.
Известно, что симптомокомплекс, характерный для краснухи (полилимфаденопатия, синдром сыпи) может наблюдаться при заболеваниях, вызванных другими возбудителями, такими как вирус кори, парвовирус В19, аденовирусы, энтеровирусы. Инаппарантная форма краснухи среди взрослых составляет более чем 50% от всех случаев заболевания, при этом во время беременности доля этой формы достигает 75-80%. Учитывая разнообразие и неспецифичность клинических проявлений краснухи, наличие острых и стертых форм заболевания, повсеместную распространенность, риск возникновения врождённой патологии плода, своевременная, доступная лабораторная диагностика данного заболевания приобретает особое значение.
Традиционно первостепенную роль в лабораторной диагностике краснухи отводят серологическим методам, направленным на обнаружение специфических антител, в частности иммуноферментному анализу (ИФА). Но данные методы получили распространение преимущественно в акушерской практике. Причём, первичное инфицирование определяется путем выявления вирусоспецифических антител класса IgM, сероконверсии или 4–кратного и более увеличения титра антител класса IgG в парных сыворотках периферической крови. Для уточнения срока давности развития инфекционного процесса, дифференциации первичной инфекции от вторичной, проводится определение авидности антител класса IgG к антигенам вируса краснухи. Однако при анализе результатов тестирования часто возникают затруднения в расшифровке полученных данных. Это может быть обусловлено парадоксально ранним появлением краснушных антител класса IgG, возможностью длительного персистирования антител класса IgM в периферической крови в течение многих месяцев и даже лет (особенно после вакцинации), а также наличием перекрестных, неспецифических реакций. В этих ситуациях в различных диагностических и научно–исследовательских центрах развитых стран мира в качестве подтверждающего теста успешно применяются молекулярно–биологические методы (ПЦР), направленные на прямое обнаружение РНК вируса краснухи (Rubella virus).
Необходимость улучшения клинической и лабораторной диагностики заболевания краснухой становится всё более значимой, учитывая изменяющиеся условия окружающей среды, полиморфизм клинических проявлений краснухи, трудности в дифференциально-диагностическом поиске. Наиболее перспективным является применение на практике молекулярно-генетических методов диагностики и, прежде всего полимеразной цепной реакции, которая позволяет выявлять наличие РНК вируса краснухи с первых дней острого периода заболевания. Количество исследований, посвященных изучению характера клинико-лабораторных проявлений краснухи в зависимости от стадии инфекционного процесса у взрослых пациентов в нашей стране очень ограничено. Нуждается также в уточнении диагностическая значимости при краснухе специфических методов ИФА и ПЦР диагностики на различных стадиях инфекционного процесса.
Всё это определяет актуальность изучения роли ПЦР-диагностики в верификации и ранней постановке диагноза краснухи, что позволит своевременно выявлять, изолировать больных и предпринимать необходимые меры профилактики.
Цель исследования: изучение у больных краснухой в разные сроки заболевания информационной значимости выявления РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) в сопоставлении с рутинными серологическими методами исследования.
В соответствии с целью работы были сформулированы следующие задачи.
Задачи исследования:
- Изучить у больных краснухой в динамике инфекционного процесса в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) наличие РНК Rubella virus по данным молекулярно-генетического исследования (ПЦР).
- Исследовать продолжительность персистенции вируса краснухи в различных биологических средах организма в динамике заболевания.
- Изучить динамику серологических маркеров у больных краснухой (антитела класса IgM и IgG, авидности антител класса IgG ) на различных этапах заболевания.
- Определить диагностическую значимость серологической и ПЦР диагностики (выявление РНК Rubella virus) у больных краснухой в различные периоды инфекционного процесса в биологических средах организма.
- Проанализировать клинические и лабораторные данные у больных краснухой в сопоставлении с данными серологических и молекулярно-генетических (ПЦР) исследований на различных этапах заболевания.
Научная новизна.
Впервые методом ПЦР у больных краснухой определена длительность персистенции вируса краснухи в различных биологических средах организма (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазок из ротоглотки и носоглотки).
Доказана информативность выявления РНК Rubella virus в слюне больных методом ПЦР по сравнению с аналогичными исследованиями в плазме, лейкоцитах периферической крови, мазках из ротоглотки и носоглотки больных краснухой, что носит приоритетный характер.
Установлено, что диагностическая концентрация РНК вируса краснухи определяется в слюне уже с 1 дня появления сыпи и сохраняется до 10 дня, в то время как в плазме и лейкоцитах периферической крови данная концентрация сохраняется только до 6 дня после появления сыпи, что позволяет по новому взглянуть на эпидемиологические особенности распространения вируса краснухи.
Впервые, на основании комплексных исследований, установлено, что метод ПЦР может использоваться для верификации диагноза краснухи на ранних стадиях заболевания (1-2 сутки от появления сыпи) и при диагностически неясных случаях.
Практическая значимость.
На основании полученных результатов можно рекомендовать для своевременной диагностики в раннем периоде заболевания краснухой использовать информативный и неинвазивный метод лабораторной диагностики - исследование слюны на выявление РНК Rubella virus молекулярно-генетическим методом (ПЦР).
Для дифференциального диагноза первичного инфицирования вирусом краснухи от перенесенного ранее заболевания, учитывая вероятность парадоксально раннего появления антител к вирусу краснухи класса IgG и возможной длительной персистенции антител класса IgM можно рекомендовать определение авидности антител класса IgG для уточнения давности заболевания, что позволяет дифференцировать первичную инфекцию от перенесенной.
Проведенное исследование позволило установить сроки оптимального применения серологических и ПЦР методов для верификации диагноза краснухи.
Полученные результаты исследования позволяют рекомендовать использование ПЦР диагностики для верификации диагноза краснухи в практике врачей инфекционистов, врачей детских учреждений, а также акушеров – гинекологов.
Основные положения, выносимые на защиту диссертации.
- Результаты молекулярно-генетического исследования у больных краснухой позволили выявить наличие РНК вируса краснухи в различных биологических материалах (плазме, клетках крови (лейкоциты периферической крови), слюне и мазках из ротоглотки и носоглотки) но наиболее продолжительно и с большей достоверностью в слюне.
- Установлено, что выявление РНК Rubella virus в слюне возможно с 1по 10 день от появления сыпи, тогда как в плазме и лейкоцитах до 6 дня.
- Выявлено, что диагностика краснухи методом ПЦР наиболее значима в первые 2 суток после появления сыпи, а значение серодиагностики растет после 2 дня от появления сыпи.
- Результаты комплексного исследования больных краснухой позволили подтвердить значимость определение авидности антител класса IgG для установления давности инфекционного процесса.
Результаты внедрения в практику.
Результаты проведенного исследования и практические рекомендации используются на кафедре инфекционных болезней ПМГМУ им. И.М.Сеченова и ЦНИИЭ Роспотребнадзора города Москвы. Результаты исследования внедрены в лечебную деятельность инфекционных отделений инфекционной клинической больницы №2 г. Москвы
Апробация диссертации.
Апробация работы состоялась 3 июня 2010 г. на заседании кафедры инфекционных болезней медико-профилактического факультета ПМГМУ имени И.М. Сеченова.
Материалы диссертационной работы были доложены на заседании московского общества врачей-инфекционистов (11 мая 2010 года, ИКБ №1, г. Москва).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 3 научных работы.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав по материалам исследования, заключение, выводы и практические рекомендации. Диссертация изложена на 135 листах машинописного текста. Библиографический указатель содержит 122 источника литературы (47 отечественных и 75 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 14 таблицами, 27 рисунками, 3 фотографиями.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования.
Набор материала проводился с 24.05.2006 по 10.07.2007 года на базе боксовых отделений инфекционной клинической больницы №2 г. Москвы.
Критериями включения в исследования являлось наличие входного диагноза краснухи при поступлении в ИКБ №2 или наличие симптомокомплекса клинических признаков схожих с клиническими проявлениями краснухи на момент поступления в ИКБ № 2.
В рамках данной работы всего обследовано 87 (100%) человек, из них 74 мужчин (85%) и 13 женщин (15%). По возрасту, пациенты распределялись следующим образом: от 14 до 17 лет – 13 человек, от 18 до 23 лет - 69 человек, от 24 до 29 лет – 4 человека и 1 больной в возрасте 42 лет.
Первоначально при поступлении в ИКБ № 2 все пациенты были разделены на 2 группы. I группа - 62 (71,3%) пациента, поступили в ИКБ № 2 с входным диагнозом краснуха. Остальные 25 (28,7%) обследованных больных поступили в стационар с различными направительными диагнозами и составили II группу.
Госпитализация больных в стационар осуществлялась с 1 по 4 день болезни, в большинстве случаев с 1 по 2 день, т.е. с момента появления первых клинических симптомов (сыпь, лихорадка различной степени выраженности, лимфаденопатия). В первый день болезни было госпитализировано 39 (45%) пациентов, на 2 день болезни госпитализировано 34 (39%) пациентов, на 3 день болезни 9 (10%) пациентов, на 4 день болезни 4 (5%) пациентов. На 5 день болезни был госпитализирован 1 пациент.
Больные наблюдались в периоде разгара заболевания, что совпадало с поступлением в стационар; ранней реконвалесценции (первый день нормальной температуры и/или исчезновение сыпи), перед выпиской из стационара, что соответствовало клиническому выздоровлению. Динамическое наблюдение и сбор клинического материала проводили трехкратно на первый, третий и пятый дни госпитализации. При этом первому дню госпитализации (период разгара заболевания) соответствовали 1–5 дни от момента появления сыпи, третьему дню (период ранней реконвалесценции) –– 3–8 дни, пятому (клиническое выздоровление) –– 5–10.
Пациентам проводились лабораторные исследования на базе клинической, биохимической и серологической лабораторий ИКБ № 2 по общепринятым методикам: развернутый клинический анализ крови (гемоглобин, эритроциты, тромбоциты, лейкоциты, лейкоцитарная формула и СОЭ), клинический анализ мочи, биохимические исследования (билирубин, АСТ, АЛТ), RW, ВИЧ.
На базе лаборатории молекулярных методов отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии (ОМДиЭ) ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора г. Москвы всем больным в динамике заболевания были проведены серологические и молекулярно-генетические исследования методом ПЦР. Идентификацию РНК вируса краснухи в образцах плазмы и лейкоцитов периферической крови, слюны, мазков из носо– и ротоглотки проводили методом ОТ–ПЦР с гибридизационно–флюоресцентной детекцией результатов анализа в режиме реального времени. Для тестирования использовали набор реагентов “АмплиСенс® Rubella virus –– FL”, разработанный в ФГУН “ЦНИИЭ” Роспотребнадзора (Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05501). Аналитическая чувствительность –– 400 копий РНК вируса краснухи в мл, аналитическая специфичность –– 100%.
Дополнительно мазок из носа, мазок из ротоглотки, пробы слюны и плазмы тестировались на ДНК парвовируса В19 (В19), ДНК вируса герпеса VI типа (ННV6), ДНК цитомегаловируса (CMV), ДНК вируса Эпштейна-Барр (EBV) методом ПЦР с гибридизационно–флюоресцентной детекцией результатов в режиме реального времени. Исследования проводились на тест-системах производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора: «АмплиСенс® Parvovirus B19 -FL», «АмплиСенс® CMV/EBV/HHV6-FL».
Серологические исследования, направленные на выявление специфических антител к антигенам Rubella virus классов IgM (качественное), IgG (количественное) и определение индекса авидности выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого использовали коммерческие ИФА тест–системы производства “Diagnostic systems Laboratories”, INC (США) и “Euroimmun AG” (Германия).
Дополнительно сыворотки крови всех больных были исследованы на наличие антител к антигенам кори, эпидемического паротита и парвовируса В19 классов IgM (качественным) и IgG (количественным) методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), с помощью коммерческих ИФА тест–систем производства “Diagnostic systems Laboratories”, INC (США) и Biotrin, (Ирландия).
Исследования методом ПЦР диагностики на наличие вирусов краснухи, В19, ННV6, СМV, ЕВV, серологическое обследование на корь, эпидемический паротит, проводилось больным однократно при поступлении.
Клинические и лабораторные показатели регистрировались в специально разработанной карте и обрабатывались на персональном компьютере с использованием пакета программ Microsoft Excell (2003) корпорации Microsoft. При значительных колебаниях значений внутри групп указывалась медиана и стандартное отклонение (М ±s). Частотные признаки (число лиц с наличием или отсутствием признака) выражались в процентах.
Результаты исследования и их обсуждение.
Диагностика РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (в плазме, клетках крови – лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки) в различных сочетаниях проводилась всем 87 (100%) обследованных нами больных.
В результате полного комплексного обследования в I группе (62 пациента) больных окончательный диагноз краснухи был подтвержден у 60 пациентов на основании клинико-анамнестических и специфических лабораторных тестов (положительной ПЦР и серологических реакций). На основании клинико-лабораторных данных и отрицательных данных ПЦР к Rubella virus диагноз краснухи отвергнут у 2 пациентов и поставлен другой диагноз: ОРВИ - без лабораторного подтверждения.
Во II группе больных (25 больных) после получения результатов ПЦР диагностики и данных специфических серологических реакций диагноз краснуха был окончательно поставлен у 16 пациентов, остальным 9 больным выставлены другие диагнозы: корь- 2 больным с лабораторным подтверждением; аденовирусная инфекция – 1 больной, ОРВИ -5 пациентам, Скарлатина – 1пациент (всем больным без лабораторного подтверждения).
В результате проведенного комплексного клинико-лабораторного обследования диагноз краснухи из 87 (100%) обследованных больных был поставлен 76 (87%) пациентам.
Окончательно в исследование вошли 76 больных (64 мужчины и 12 женщин), у которых в результате комплексных молекулярно-генетических и специфических серологических реакций был подтвержден диагноз краснухи. Больные распределились по возрасту следующим образом: группа от 14 до 17 лет - 12 больных (15%), от 18 до 23лет – 60 больных (79%), от 24 до 29 лет -3 больных и 1 больная в возрасте 42 лет. Самую большую группу составили лица в возрасте от 18 до 23 лет. Средний возраст пациентов составил 19,5 лет.
Среди клинических симптомов, выраженных в периоде разгара заболевания, лихорадка была у 57 (75%) пациентов, полилимфоаденопатия и сыпь у 76 (100%) больных, заложенность носа у 72 (82%), боль в горле - 45 (60%) пациентов, налеты в ротоглотке- 1 больного, увеличение глоточных миндалин у 20 (26%) больных, гепатомегалия у 2, артлалгии у 6 пациентов, катаральные явления у 67 (88%)больных, энантема у 12 (16%) больных. Гиперемия лица - симптом «красного лица» или «симптом пощечин» общепризнанный симптом патогомоничный для В19 всего лишь у 5 больных, инъекция сосудов склер у 57(75%) больных.
Таким образом, клиническая картина наших больных в целом соответствует общепринятым представлениям о течении заболевания краснухой.
У 62 (81%) больных краснухой в периоде разгара заболевания в клиническом анализе крови уровень лейкоцитов был в пределах нормы. Наблюдалось небольшое снижение числа лейкоцитов у 9 (12%) пациентов, умеренный лейкоцитоз имел место у 5 (7%) пациентов. Среднее значение уровня лейкоцитов соответствовал норме - 5,7 кл ±2,25 кл х 109/л (М±s). По нашим наблюдениям, у большинства пациентов, 52 (70%) из 76(100%) больных, уровень лимфоцитов был в пределах нормы. Лимфоцитоз установлен у 12 (15%) больных. Среднее значение лимфоцитов в периферической крови составило 27±10,06 % (М±s), моноцитов 8±3,443 % (М±s). Ускорение СОЭ было выявлено у 4 пациентов, достигнув максимального значения 24 мм/ч у 1 больного. Следовательно, у большинства больных краснухой в периоде разгара заболевания гематологические показатели остаются в пределах нормы. В анализе мочи отмечалась незначительная альбуминурия, лейкоцитурия и микрогематурия. В дальнейшем все показатели нормализовались.
По данным зарубежных авторов, ПЦР диагностика на выявление РНК Rubella virus, рекомендуется с 1 до 4 суток с момента появления сыпи, в сыворотке крови, мазках из ротоглотки, в слюне, причём отсутствуют данные по преимуществам присущим тем или иным способам выявления. Данных по продолжительности выявления РНК R. virus в различных биологических средах организма в доступной отечественной литературе мы не нашли. Для решения вопроса об информационной значимости выявления РНК Rubella virus методом ПЦР в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки) в сопоставлении с рутинными серологическими методами исследования проведено соответствующее обследование 76 больных с краснухой.
В результате молекулярно-генетических исследований (ПЦР) биологических образцов больных краснухой с 1 по 4 день после появления сыпи, РНК вируса краснухи определялась в плазме, лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наибольший процент выявления РНК Rubella virus у обследованных был в слюне(76%), сохраняясь на высоком уровне до 4 дня от появления сыпи. Тогда как наименьший процент обнаружения РНК Rubella virus был определен в плазме(19%) и лейкоцитах(17%) периферической крови.. (таб. №1)
Таблица №1.
Результаты молекулярно-генетических исследований биологических образцов от больных краснухой с 1 по 4 день после появления сыпи.
| Вид биологического образца | 1-4 день | |||
| Количество обследованных больных (n) | Количество проб | Количество положительных проб | % положительных проб | |
| Лейкоциты | 29 | 41* | 7 | 17** |
| Плазма | 65 | 86* | 17 | 19** |
| Слюна | 71 | 96* | 73 | 76** |
| Мазок из ротоглотки | 72 | 97* | 41 | 42** |
| Мазок из носоглотки | 55 | 79* | 40 | 50** |
| *примечание - часть больных обследовалась двукратно. ** примечание – указаны пробы с подтвержденным наличием РНК Rubella virus | ||||
Аналогичных исследований в отечественной литературе мы не встретили. Таким образом, можно сделать вывод, что при сравнении результатов ПЦР диагностики на наличие РНК Rubella virus в различных биологических средах (плазма крови, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из рото- и носоглотки) исследование слюны на выявление РНК Rubella virus методом ПЦР достаточно информативно. Представленные данные позволяют рекомендовать использование слюны как наиболее информативного биологического материала для подтверждения наличия РНК Rubella virus методом ПЦР, с целью подтверждения клинического диагноза краснуха в ранние сроки заболевания.
Молекулярно-генетических исследования (ПЦР) биологических образцов больных краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи подтвердили наличие РНК Rubella virus в плазме, лейкоцитах периферической крови, в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наиболее продолжительно и у большинства из обследованных вирус краснухи выявлялся в слюне (31%). Тогда как наименьший процент обнаружения РНК Rubella virus был установлен в плазме (2%) и лейкоцитах (6%) периферической крови. Наличие РНК Rubella virus в слюне подтверждалось до 10 дня после появления сыпи. Таким образом, определение РНК вируса краснухи в слюне методом ПЦР позволяет по - новому взглянуть на эпидемиологические особенностей распространения вируса краснухи (таб.№2).
Таблица №2
Результаты молекулярно-генетических исследований биологических образцов больных краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи.
| Вид биологического образца | 5-10 день | |||
| Количество больных (n) | Количество проб | Количество положительных проб | % положительных проб | |
| Лейкоциты | 23 | 32* | 2 | 6** |
| Плазма | 70 | 112* | 2 | 2** |
| Слюна | 71 | 115* | 36 | 31** |
| Мазок из ротоглотки | 67 | 106* | 16 | 15** |
| Мазок из носоглотки | 55 | 88* | 12 | 13** |
| *примечание - часть больных обследовалась двукратно. ** примечание – указаны пробы с подтвержденным наличием РНК Rubella virus | ||||
Молекулярно-генетические исследования (метод ПЦР) биологических образцов больных краснухой с 11 по 12 день после появления сыпи дали отрицательный результат, что подтвердило продолжительность персистенции РНК вируса краснухи в различных биологических материалах не позже 10 дня после появления сыпи.
Исследование слюны методом ПЦР с 1 по 12 день с момента появления сыпи у больных краснухой выявило, что наиболее большой процент выявления РНК Rubella virus приходится на первые 3 дня синдрома сыпи (до100% ), далее прослеживается тенденция к его уменьшению (таб. №3, рис. №1.)
Таблица №3
Результаты молекулярно-генетического исследования слюны у больных краснухой на наличие РНК вируса краснухи с 1 по 12 день от появления сыпи.
| Дни от появления сыпи | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Количество больных | 2 | 41 | 30 | 33 | 25 | 28 | 28 | 23 | 9 | 3 | 1 | 2 |
| % положительных результатов | 100 | 85 | 81 | 60 | 52 | 35 | 21 | 17 | 11 | 6 | 0 | 0 |
Рис1. Результаты молекулярно-генетического исследования (ПЦР) слюны у больных краснухой на наличие РНК Rubella virus с 1 по 12 день после появления сыпи.
Анализ частоты обнаружения РНК вируса краснухи в различном клиническом материале при помощи ПЦР в разные сроки заболевания показал, что наиболее информативным в первые четыре дня с момента появления сыпи (период разгара заболевания) оказалось выявление РНК R. virus в слюне. Следует отметить, что с пятого дня после появления сыпи частота обнаружения РНК вируса краснухи значительно снижалась во всех типах клинического материала. Полученные данные не противоречат результатам многолетних исследований отечественных и зарубежных авторов, подтверждающих то, что вирус краснухи с наибольшей вероятностью может быть выявлен из образцов, собранных впервые 3–5 дней от момента появления сыпи.
Проведенный анализ результатов данного исследования свидетельствует о том, что применение молекулярно–биологических методов (ПЦР), направленных на выявление РНК Rubella virus в различном клиническом материале (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носо– и ротоглотки) позволяет в короткие сроки при однократном тестировании лабораторно подтвердить диагноз краснухи в первые дни заболевания.
Для решения поставленной задачи изучения динамики серологических маркеров у больных краснухой были проведены иммунологические тесты на определение специфических антител к вирусу краснухи классов IgМ, IgG.
Антитела к антигенам Rubella virus класса IgМ до 4 дня от появления сыпи были выявлены у 47 пациентов, количество положительных проб составило 59%, причём вирусоспецифические антитела этого класса присутствовали в сыворотке крови начиная со 2 дня болезни всего лишь у 11 человек. Антитела к антигенам R. virus класса IgG до 4 дня от появления сыпи были обнаружены у 38 пациентов начиная со 2 дня от появления сыпи, что составило 43% положительных проб (таб. №4).
Таблица№4
Результаты серологических исследований у больных краснухой на наличие специфических антител классов IgМ и IgGс 1 по 4 и с 5 по 10 день после появления сыпи.
| Специфические серологические реакции | 1-4 день после появления сыпи | ||||||
| Количество обследованных больных | Количество проб | Количество положительных проб | % положительных результатов | ||||
| Антитела класса IgМ | 69 | 92* | 55 | 59 | |||
| Антитела класса IgG | 71 | 94* | 41 | 43 | |||
| Специфические серологические реакции | 5-10 день после появления сыпи | ||||||
| Количество обследованных больных | Количество проб | Количество положительных проб | % положительных результатов | ||||
| Антитела класса IgМ | 68 | 115* | 110 | 95 | |||
| Антитела класса IgG | 68 | 115* | 105 | 91 | |||
| *примечание - часть больных обследовалась двукратно. | |||||||
В результате проведенных исследований серологических маркеров у больных краснухой с 5 по 10 день после появления сыпи антитела к антигенам Rubella virus класса IgМ были определены у 65 пациентов, что составило 95% положительных проб. Антитела к антигенам Rubella virus класса IgG с 5 по 10 день от появления сыпи были установлены у 65 пациентов, что составило 91% положительных проб, т.е. прослеживалась тенденция к нарастанию количества положительных проб с одновременным ростом титра антител к антигенам R. virus класса IgG (таб. №4).
Таким образом, диагностическое значение определения вирусоспецифических антител для подтверждения диагноза краснухи увеличивается со сроком болезни.
При серологическом исследовании на антитела к антигенам вируса краснухи классов IgМ и IgG с 11 по 12 день синдрома сыпи положительный результат достиг 100%. Следовательно, результаты наших исследований показывают, что для верификации диагноза краснухи диагностическая значимость серологических методов исследования возрастает на поздних сроках заболевания краснухой.
Результаты серологических исследований сыворотки крови у больных краснухой на наличие специфических антител к антигенам Rubella virus класса IgМ с 1 по 12 день от появления сыпи показали, что в первый день синдрома сыпи антитела к антигенам R.virus класса IgМ не определялись в 100% случаев. Начиналось со 2 дня после появления сыпи количество положительных проб увеличилось до 42%. К 5-6 суткам синдрома сыпи количество положительных проб, подтверждающих наличие специфических антител к антигенам R.virus класса IgМ достигло100% и в дальнейшем сохранялось на высоком уровне. По результатам серологических исследований сыворотки крови у больных краснухой на наличие специфических антител к антигенам Rubella virus класса IgG 1 по 12 день от появления сыпи мы видим, что количество положительных проб подтверждающих наличие специфических антител к антигенам R.virus класса IgG резко возрастает с 4-5 дня после появления сыпи, достигая максимальных значений к 7-8 дню, в дальнейшем сохраняясь на данном уровне (таб. №5, рис. №2, 3).
Таблица№5
Результаты серологических исследований сыворотки крови на наличие антител класса IgM у больных краснухой с 1 по 12 день от появления сыпи.
| Дни от появления сыпи | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9-12 | |
| Количество больных | 2 | 34 | 24 | 32 | 23 | 29 | 25 | 24 | 14 |
| Количество положительных проб на IgM АТ | 0 | 14 | 18 | 30 | 23 | 29 | 24 | 22 | 12 |
| % положительных результатов | 0 | 41 | 75 | 93 | 100 | 100 | 96 | 91 | 85 |
| Дни от появления сыпи | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 - 12 | |
| Количество больных | 2 | 34 | 26 | 32 | 23 | 29 | 25 | 24 | 14 |
| Количество положительных проб на IgG АТ | 0 | 12 | 10 | 22 | 18 | 26 | 24 | 24 | 14 |
| % положительных результатов | 0 | 35 | 38 | 68 | 78 | 89 | 96 | 100 | 100 |
Рис.2. Результаты серологических исследований сыворотки крови на антитела к антигенам вируса краснухи класса IgM у больных краснухой с 1 по 12 день синдрома сыпи.
Рис.3. Результаты серологических исследований сыворотки крови на антитела к антигенам вируса краснухи класса IgG у больных краснухой с 1 по 12 день синдрома сыпи.
При проведении рутинных серологических исследований могут возникать сложности в расшифровке полученных данных и установлении стадии инфекционного процесса. Учитывая возможность длительной персистенции специфических IgM после первичной инфекции, парадоксально раннее появление специфических антител класса IgG, для уточнения срока давности развития инфекционного процесса целесообразно определять авидность IgG к антигенам вируса краснухи (ВОЗ 2005-07гг.). Нами также была определена авидность вирусоспецифических антител класса IgG. Антитела с низкой авидностью (индекс авидности до 40%), позволяющие говорить об острой инфекции были определены у 73 ( 87 %) из 83 больных. Высокая авидность выявлена у 10 (12 %) пациентов, т.е. эти антитела носили анамнестический характер и не имели отношения к данному заболеванию. Нами была выделена группа из 17 пациентов, у которых по результатам серологических исследований до 4 дня синдрома сыпи было подтверждено наличие специфических антител к Rubella virus класса IgG, тогда как специфические антитела к Rubella virus класса IgM выявлены не были. Для уточнения срока давности развития инфекционного процесса целесообразно было определить авидность антител к Rubella virus класса IgG. Проведенное нами исследование индекса авидности показало наличие низкоавидных антител у 7 пациентов, что может быть обусловлено редким парадоксально ранним появлением краснушных антител класса IgG. Определение низкого индекса авидности позволило предположить острую стадию инфекционного процесса в данной группе больных. При дальнейших исследованиях методом ПЦР наличие РНК Rubella virus было выявлено в 6 из 7 случаев. У одного пациента с низкоавидными антителами, несмотря на отсутствие вирусной РНК, при дальнейших исследованиях были выявлены специфические IgM на фоне незначительного нарастания титра IgG, что позволило подтвердить диагноз краснухи. Высокоавидные антитела были установлены в 10 тестируемых образцах и носили анамнестический характер, что совпало с отрицательными данными молекулярно-генетического исследования и позволило снять диагноз краснухи.
Эффективность выявления вирусоспецифических антител классов IgМ и IgG возрастает с увеличением временного интервала от момента появления сыпи. Это обусловлено особенностями развития гуморального иммунитета при краснушной инфекции, а также аналитической чувствительностью используемых ИФА–тестов. Полученные данные подтверждают рекомендации ВОЗ, указывающие на то, что ИФА–тесты, направленные на выявление вирусоспецифических антител класса IgM наиболее чувствительны в период с 4 по 28 день после появления сыпи. В первые 72 часа от момента появления сыпи до 50% исследований на IgM к вирусу краснухи могут давать ложноотрицательный результат.
При ретроспективном обследовании или позднем поступлении больных возможно обследование на наличие специфических антител к антигенам вируса краснухи класса IgМ и IgG в сыворотке крови с одновременным определением авидности антител класса IgG.
Проведённые комплексные лабораторные исследования в динамике инфекционного процесса показали, что у больных краснухой в ранние сроки болезни –– первые 3 дня с момента появления сыпи –– наибольшее диагностическое значение имело выявление РНК Rubella virus в слюне, тогда как начиная с 4 дня эффективность обнаружения вирусной РНК снижалась, наряду с возрастанием значения определения вирусоспецифических антител к антигенам вируса краснухи классов IgМ и IgG. Это подчеркивает целесообразность использования молекулярно–биологических методов (ПЦР) для диагностики краснухи в первые дни заболевания. Наибольшая частота выявления вируса в слюне, по сравнению с образцами плазмы и лейкоцитов крови, мазками из носо– и ротоглотки, простата забора данного биоматериала и отсутствие инвазивных медицинских манипуляций позволяет рекомендовать именно слюну как оптимальный клинический материал для исследования методом ПЦР на РНК Rubella virus. (рис. №4).
Рис.4. Сопоставление результатов выявления РНК Rubella virus (слюна) и антител к антигенам R. Virus классов IgМ и IgG (сыворотка крови) у больных краснухой в динамике инфекционного процесса.
Анализируя полученные данные результатов комплексных серологических и молекулярно-генетических исследований сыворотки крови и слюны у больных краснухой в динамике инфекционного процесса, установлено, что для лабораторного подтверждения диагноза краснухи в первые дни заболевания целесообразно исследование слюны методом ПЦР на РНК Rubella virus. Комплексный подход к лабораторной диагностике краснухи с применением молекулярно–биологических (ПЦР) и серологических (ИФА) методов позволит своевременно верифицировать диагноз при поступлении в стационар, а также уточнять сроки заболевания.
Следовательно, РНК Rubella virus методом ПЦР выявлялась в плазме, клетках крови (лейкоцитах периферической крови), в слюне, мазке из ротоглотки и носоглотки с различной частотой, но наиболее продолжительно и у большинства из обследованных вирус краснухи сохраняется в слюне, что соответствует современным представлениям об особенностях циркуляции данного возбудителя в макроорганизме и позволяет ему сохраняться и распространяться в человеческих популяциях.
ВЫВОДЫ.
- Методом ПЦР установлена персистенция РНК вируса краснухи в различных биологических средах (плазма, лейкоциты периферической крови, слюна, мазки из носоглотки и ротоглотки).
- РНК Rubella virus выявлялась в различных биологических средах в зависимости от дня появления сыпи от 1 до 10 дня.
- Наиболее раннее и продолжительное выявление РНК вируса краснухи наблюдалось в слюне пациентов (до 10 дня после появления сыпи), в то время как в плазме и клетках крови - только до 6 дня после появления сыпи.
- Молекулярно-генетическое исследование (ПЦР) является основным методом для верификации диагноза краснухи в ранние сроки у диагностически неясных больных, учитывая полиморфизм клинических проявлений краснухи.
- Специфические антитела к вирусу краснухи класса Ig M и IgG в сыворотке крови выявлялись начиная со 2 дня от появления сыпи на низком уровне, и в дальнейшем прослеживалась тенденция к нарастанию титра данных антител, достигая максимума к 5-6 суткам после появления сыпи.
- В периоде разгара заболевания и периоде ранней реконвалесценции присутствие низкоавидных антител класса IgG могут в совокупности с другими маркерами использоваться для верификации диагноза краснухи, особенно в случае парадоксально рано появившихся антител клпсса Ig G и/или длительной персистенции антител класса Ig M.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
В диагностически неясных случаях у больных с симптомами краснухи целесообразно применять метод молекулярно-генетического исследования (ПЦР), который позволяет в короткие сроки при однократном исследовании подтвердить диагноз краснухи, особенно в случае проведения дифференциально-диагностического поиска. В раннем периоде заболевания краснухой можно использовать информативный и неинвазивный метод лабораторной диагностики - исследование слюны на наличие РНК Rubella virus вместо серологических методов исследования. Для уточнения давности заболевания в случае дифференциально-диагностически неясных случаев можно рекомендовать определение авидности антител класса IgG, что позволяет дифференцировать первичную инфекцию от перенесенной.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1.Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Литвинова О.Г., Чуланов В.П., Волчкова Е.В. Диагностические возможности ПЦР и специфических серологических методов в верификации диагноза краснухи. / Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москва, 30 марта- 1 апреля 2009г.)//Инфекционные болезни, Научно-практический журнал Национального научного общества инфекционистов, 2009, том 7, приложение 1, стр.55.
2.Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Чуланов В.П., Литвинова О.Г., Иванова И.В., Алленов М.Н., Волчкова Е.В. Диагностические возможности ПЦР и специфических серологических методов в верификации диагноза краснухи. / Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням (Москва, 29-31 марта 2010г.)//Инфекционные болезни, Научно-практический журнал Национального научного общества инфекционистов, 2010, том 8, приложение 1, стр.88.
3. Домонова Э.А., Дарвина О.В., Шипулина О.Ю., Сафонова А.П., Шипулин Г.А., Литвинова О.Г., Бурчик М.А., Чуланов В.П., Волчкова E.В. Значение серологических и молекулярно–биологических методов диагностики краснухи.// Инфекционные болезни, Научно-практический журнал Национального научного общества инфекционистов, 2010, том 8, №3, с.29-33.
