Эндотоксинемия и системный воспалительный ответ у вич-инфицированных пациентов
На правах рукописи
БИККИНИНА
Олеся Ильмировна
ЭНДОТОКСИНЕМИЯ И СИСТЕМНЫЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ОТВЕТ
У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
14.01.09 – инфекционные болезни
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург – 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
Хасанова Гульшат Рашатовна кандидат медицинских наук доцент
Официальные оппоненты:
Буланьков Юрий Иванович доктор медицинских наук доцент
ФГБВОУ ВПО "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации, заведующий лабораторным отделением (диагностика ВИЧ-инфекции и вирусных гепатитов) центра клинической диагностики
Хаертынова Ильсияр Мансуровна доктор медицинских наук профессор
ГБОУ ДПО "Казанская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой инфекционных болезней
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Нижегородская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится 24 декабря 2013 года в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.01 на базе Федерального государственного бюджетного военного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова" Министерства обороны Российской Федерации (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ
Автореферат разослан «____» ноября 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук профессор
Пономаренко Геннадий Николаевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. В последние годы активно обсуждается роль хронической иммунной активации и воспаления в патогенезе необратимого поражения иммунной системы и прогрессирования ВИЧ-инфекции. Согласно гипотезе, выдвинутой в 1988 году M.S. Asher, H.W. Sheppard [Asher M.S. et al., 1988] и Z. Grossman с коллегами [Grossman Z. et al., 1993; Grossman Z. et al., 1997], решающую роль в патогенезе СПИДа играет избыточная активность иммунной системы с последующим ее истощением, что в конечном итоге, проявляется снижением уровня CD4-клеток. В настоящее время данная точка зрения поддерживается многими исследователями [Deeks S.G., et al., 2004; Giorgi J.V. et al., 2002; Hazenberg M.D. et al., 2003], однако споры о том, что же вызывает гиперактивацию иммунной системы, продолжаются.
По мнению J.M. Brenchley и соавторов [Brenchley J.M. et al., 2006] решающую роль в этом процессе может играть поступление в системный кровоток микробов и их компонентов в результате повышения проницаемости эпителиального барьера кишечника на фоне ВИЧ-инфекции. Этот феномен может объясняться длительно сохраняющимся воспалением стенки кишки на фоне сниженной экспрессии белков, обеспечивающих межэпителиальные связи, и массивной гибелью кишечного пула CD4-лимфоцитов еще в острой стадии заболевания [Gori A. et al., 2008; Paiardini M. et al., 2008].
Традиционно маркером микробной транслокации считается липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий (ЛПС) или эндотоксин [Brenchley J.M. et al., 2006]. ЛПС является мощнейшим биологически активным веществом, взаимодействие которого с комплексом СD14/TLR4/MD2 на поверхности макрофагов и других клеток миелоидного ряда индуцирует секрецию растворимого белка CD14(sCD14) и синтез провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF-), интерлейкин-6, интерлейкин-1 (IL-1). Все это запускает каскад воспалительных реакций, составляющих суть гиперактивации иммунной системы (в частности, ее врожденного звена) при хронической ВИЧ-инфекции [Brenchley J.M. et al., 2006; Marchetti G. et al., 2008].
Степень разработанности темы. Результаты многих работ по оценке возможного влияния микробной транслокации и гиперэндотоксинемии на прогрессирование ВИЧ-инфекции в разных этнических группах различаются между собой. К примеру, в большинстве исследований, проведенных в Северной Америке, была продемонстрирована связь уровня эндотоксина с гиперактивацией иммунной системы у ВИЧ-инфицированных людей [Brenchley J.M. et al., 2006, Jiang W. et al., 2009]. Сходные результаты были получены и группой итальянских ученых [Troseid M. et al., 2010]. Модификаторами эффекта в их наблюдениях явились расовые и этнические различия. В то же время, исследования, проведенные в Уганде, не выявили какой-либо ассоциации между уровнем циркулирующего ЛПС и скоростью прогрессирования ВИЧ-инфекции (УДД-II; для оценки уровня достоверности доказательств использовалась шкала Oxford Centre for Evidence-Based Medicine) [Redd A.D. et al., 2010]. В доступной нам отечественной литературе мы не нашли работ, посвященных комплексному исследованию эндотоксинемии и маркеров воспаления у больных ВИЧ-инфекцией.
Цель исследования. Оценка роли эндотоксина грамотрицательных бактерий в процессе активации механизмов хронического воспаления при ВИЧ-инфекции для оптимизации методов патогенетической терапии.
Задачи исследования.
- Оценить наличие и выраженность системной эндотоксинемии и уровень маркеров воспалительных реакций у больных ВИЧ-инфекцией.
- Исследовать взаимосвязь клинических и лабораторных маркеров прогрессирования ВИЧ-инфекции с показателями концентрации сывороточного эндотоксина и sCD14.
- Провести анализ изменений микробиоценоза кишечника и влияния нарушений стула на показатели ЛПС у пациентов с ВИЧ-инфекцией.
- Оценить влияние комплекса терапии, направленной на коррекцию гиперэндотоксинемии, на динамику клинико-лабораторных показателей анемии хронического заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Научная новизна исследования. Установлено, что гиперэндотоксинемия является характерным феноменом для течения ВИЧ-инфекции на всех стадиях заболевания.
На основании комплексной оценки выраженности эндотоксинемии и уровня маркеров воспаления выявлена достоверная взаимосвязь показателей системной эндотоксинемии при ВИЧ-инфекции с хроническими воспалительными реакциями.
Доказано, что повышение концентрации sСD14 (маркера активации эффекторных клеток при связывании с эндотоксином) коррелирует со степенью выраженности клинических (наличие оппортунистических инфекций) и лабораторных (снижение уровня CD4-клеток) маркеров иммуносупрессии.
Установлено, что применение комплексной патогенетической терапии, включающей бифидумбактерин, энтеросгель, урсодезоксихолевую кислоту, почечный чай, способствует снижению показателей системной эндотоксинемии у пациентов с ВИЧ-инфекцией. Назначение данного комплекса препаратов пациентам с анемией хронического заболевания, приводит к повышению уровня гемоглобина и уменьшению клинических проявлений анемии.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Выявленная связь показателей системной эндотоксинемии с маркерами воспалительных реакций доказывает роль эндотоксина грамотрицательных бактерий в развитии феномена гиперактивации иммунной системы и прогрессировании ВИЧ-инфекции.
Эндотоксин-опосредованная активация системных воспалительных реакций у больных ВИЧ-инфекцией подтверждает необходимость разработки и использования, наряду с антиретровирусной терапией, патогенетических методов лечения ВИЧ-инфекции, направленных на коррекцию гиперэндотоксинемии и купирование хронического воспаления в организме.
Высокая частота нарушений состояния микробиоценоза кишечника у ВИЧ-инфицированных пациентов может рассматриваться как причина повышения проницаемости стенки кишечника с последующим развитием гиперэндотоксинемии.
Значимые лечебные эффекты патогенетической терапии с использованием препаратов, входящих в состав «антиэндотоксиновой составляющей» (снижение показателей системной эндотоксинемии, повышение уровня гемоглобина, уменьшение клинических проявлений анемии) определяют необходимость её использования в комплексном лечении у ВИЧ-инфицированных пациентов с анемией хронического заболевания.
Методология и методы исследования. Методологической основой диссертационного исследования явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного рандомизированного открытого клинического исследования с использованием клинических, лабораторных, аналитических и статистических методов исследования.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. ВИЧ-инфекция независимо от стадии заболевания сопровождается гиперэндотоксинемией на фоне нарушений микробиоценоза кишечника.
2. Эндотоксин грамотрицательных бактерий выступает в качестве одного из факторов, способствующих активации системного воспалительного ответа и прогрессированию заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов.
3. Применение комплексной терапии, направленной на элиминацию эндотоксина из организма (энтеросгель, бифидумбактерин, урсодезоксихолевая кислота, почечный чай) способствует купированию симптомов анемии хронического заболевания у больных ВИЧ-инфекцией, не получающих антиретровирусную терапию.
Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов проведенного исследования определяется соответствием его дизайна критериям доказательной медицины, анализом репрезентативных выборок обследованных пациентов, достаточным объёмом выполненных наблюдений с использованием современных разноплановых методов исследования. Примененные статистические методы адекватны поставленным задачам, а сформулированные положения, выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из анализа полученных данных.
Результаты диссертационного исследования внедрены в работу поликлиники ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ», отделений РКИБ, а также в процесс преподавания на кафедре детских инфекций КГМУ и на кафедре инфекционных болезней КГМА.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 82-ой Всероссийской студенческой научной конференции (Казань, 2008), III, V Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2011, 2013 гг.), XVI, XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011, 2012 гг.), Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (Казань, 2011), 87-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2013), Российской научно-практической конференции «Инфекции и соматическая патология», приуроченной к 80-летию кафедры детских инфекций Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2013).
По материалам диссертационного исследования опубликовано 19 печатных работ, в том числе 6 статей в изданиях, входящих в перечень рецензируемых научных журналов ВАК РФ.
Личное участие автора в получении результатов. Личный вклад автора заключался в разработке плана исследования, наборе исследуемых и контрольной групп, получении информированного согласия на участие в исследовании, анализе компьютерной базы и амбулаторных карт пациентов, сборе анамнеза, проведении врачебного осмотра, наборе материала (сыворотки) для дополнительных исследований, отборе пациентов и проведении патогенетической терапии исследуемой группы, создании и наполнении баз данных, статистическая обработка результатов проводились лично автором на всех этапах диссертационного исследования. Формулировка выводов, положения, выносимого на защиту, принадлежит лично диссертанту.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста. Содержит 34 таблицы и 26 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций. Библиографический указатель включает 136 источников, из них 46 отечественных, 88 зарубежных, 2 электронных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на базе ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями» Министерства здравоохранения Республики Татарстан. Общая характеристика этапов работы выполнения работы представлена в таблице 1.
На первом этапе исследования было обследовано 232 пациента, состоящих на диспансерном учете в ГАУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ» МЗ РТ с диагнозом ВИЧ-инфекция. В исследуемую группу были включены пациенты в возрасте 18-60 лет, не получающие противовирусную терапию хронических вирусных гепатитов.
Контрольную группу составили 26 условно здоровых людей. Критериями включения в группу были: отсутствие жалоб, отсутствие хронических заболеваний и зависимости от психоактивных веществ (никотин, героин, алкоголь), отсутствие патологии при общеклиническом осмотре, соответствие показателей общего анализа крови физиологическим нормативам.
Были изучены клинико-лабораторные и социальные характеристики пациентов.
Таблица 1 - Этапы, методы и объем исследования
| Этапы | Методы | Объем |
| 1. Анализ показателей системной эндотоксинемии и маркеров воспаления у ВИЧ-инфицированных пациентов | Выборочное исследование в течение 2008-2012г.г. Лабораторные методы (параклинические, иммуноферментные, биохимические, ЛАЛ-тест), клинический анализ. Статистические методы | 232 пациента с ВИЧ-инфекцией Контрольная группа 26 человек |
| 2. Анализ нарушений микробиоценоза кишечника у пациентов с ВИЧ-инфекцией | Выборочное исследование. Лабораторные методы (микробиологические). Статистические методы | Исследуемая группа 317 пациентов |
| 3. Анализ эффективности лечения АХЗ с использованием «антиэндотоксиновой составляющей». | Выборочное исследование. Лабораторные методы, клинический анализ | Исследуемая группа 16 человек |
В исследуемую группу вошло практически равное количество мужчин и женщин, преобладал гемоконтактный путь заражения ВИЧ-инфекцией (59%). Больше половины пациентов (63%) находилось на стадиях вторичных заболеваний 4а и 4б по классификации В.И. Покровского, 2001. Самыми распространенными клиническими маркерами иммунодефицита были кандидозные поражения кожи и слизистых (26%) и туберкулез различной этиологии (16%). Среди хронических заболеваний ведущее место по распространенности в исследуемой группе занимали вирусные гепатиты (47%).
Все пациенты проходили обследование согласно стандарту диспансерного наблюдения для пациентов с ВИЧ-инфекцией. В частности, проводились полный и биохимический анализы крови, исследование иммунного статуса, количественное определение РНК ВИЧ методом ПЦР, определение серологических маркеров вирусных гепатитов, сифилиса, цитомегаловирусной инфекции и токсоплазмоза.
Дополнительно было проведено определение концентрации эндотоксина в сыворотке крови с использованием микро-ЛАЛ-теста «Charles River Endosafe, a Division of Charles River Laboratories, Inc.». С помощью иммуноферментных тест-систем проводилось определение концентрации растворимого рецептора СD14 (производство «Hycult biotech», Human ELISA), фактора некроза опухоли– (тест-система «Elisa-TNF-alfa» производитель ЗАО «Вектор-бест»), интерлейкина-1 тест-система «Elisa-IL-1-BETA» производства ЗАО «Вестор-бест»). Также с помощью биохимического анализатора «Pentra400» (тест-система «HORIBA ABX») определялся уровень С-реактивного белка. Все необходимые исследования проводились в лабораториях РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ и Республиканской клинической инфекционной больницы.
На втором этапе для анализа нарушений микробиоценоза кишечника в описательно поперечное исследование были включены 317 ВИЧ-инфицированных пациентов на разных стадиях ВИЧ-инфекции. Критериями отбора пациентов в исследуемую группу были: возраст старше 18 лет, отсутствие у пациентов острых заболеваний в течение месяца, предшествовавшего обследованию и отсутствие активных жалоб. В исследование не включались пациенты, получающие антибиотикотерапию. Больше половины пациентов находилась на 3-й стадии ВИЧ-инфекции (69%) (по классификации В.И. Покровского, 2001). У 90% пациентов на момент обследования уровень CD4-лимфоцитов был выше 200 в 1 мкл крови. Помимо основных лабораторных исследований, проводимых при диспансерном наблюдении, осуществлялось микробиологическое исследования кала путем посева нативного материала на питательные среды фирмы Becton Dickinson (BBL) (США). В качестве нормативов взяты данные по составу микрофлоры толстого кишечника у здоровых людей, представленные в Отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».
Для проведения третьего этапа исследования из общей группы были отобраны 16 человек с диагностированной анемией хронического заболевания. На данном этапе исследования оценивалась эффективность лечения АХЗ с использованием «антиэндотоксиновой составляющей» (АЭС). Комплекс препаратов включал в себя 1) бифидумбактерин («Биомед») - по 5 доз 3 раза в день за 30 минут до еды; 2) энтеросгель - по 1 ч.л. 3 раза в день за 1,5-2 часа до еды; 3) урсодезоксихолевую кислоту («Урсосан») – по 2 капсулы в день перед сном; 4) почечный чай – по 1 чашке 2-3 раза в день. Критериями включения в исследуемую группу явились: наличие анемии хронического заболевания, отсутствие на момент обследования острого заболевания, лечения противотуберкулезными препаратами, а также препаратами железа. Анемия хронического заболевания диагностировалась по критериям, предложенным Guenter Weiss (G. Weiss, 2005) при соответствии лабораторных показателей всем нижеперечисленным условиям: снижение уровня гемоглобина менее 120 г/л у женщин и менее 130 г/л у мужчин; показатель коэффициента насыщения трансферрина железом менее 0,2; уровень ферритина более 30 нг/мл и отношение растворимого рецептора трансферрина к log ферритина менее 1,5. Для этого были проведены дополнительные лабораторные исследования: определение концентрации сывороточного железа – биохимический метод, тест-система Iron (Fe) rx-series («RANDOX»), определение общей железосвязывающей способности сыворотки – биохимический метод, тест-система Total iron-binding capacity («RANDOX»), количественное определение ферритина – метод иммуноферментного анализа (ИФА), тест-система Ферритин-ИФА-БЕСТ (ЗАО «Вектор-Бест»), определение растворимого рецептора трансферрина – метод ИФА, реактив Human sTfR ELISA («BioVendor»).
Результаты исследования и их обсуждение
Характеристика показателей системной эндотоксинемии и маркеров воспаления у больных ВИЧ-инфекцией
Анализ материала исследуемой группы показал, что эндотоксинемия была характерна для всех пациентов с ВИЧ-инфекцией; причем у большинства из них (52%) концентрация сывороточного эндотоксина превышала максимальный уровень, зарегистрированный нами в контрольной группе (рисунок 1).
 |  |
| Рисунок 1 – Показатели уровня ЛПС в исследуемой и контрольной группах | Рисунок 2 - Показатели уровня sCD14 в исследуемой и контрольной группах |
При этом маркер активации клеток миелоидного ряда ЛПС растворимый белок sCD14, также в большинстве случаев (52%) превышал максимальные показатели контрольной группы (рисунок 2). Значимой корреляционной взаимосвязи между sCD14 и уровнем ЛПС установлено не было (r=0,12, p=0,24).
Для определения возможной связи эндотоксинемии с иммуносупрессией мы оценили изучаемые показатели в разных группах больных. Все пациенты были поделены на группы в зависимости от наличия клинических и лабораторных признаков иммуносупрессии. Сравнительный анализ показателя эндотоксина при разных степенях иммуносупрессии (в соответствии с классификацией CDC) не выявил достоверных различий в группах (p>0,05). Одинаково высокие показатели концентрации эндотоксина, статистически значимо отличающиеся от показателей здоровых людей, отмечались во всех группах пациентов независимо от уровня иммуносупрессии. Корреляционный анализ не выявил статистически значимой связи уровня эндотоксина со степенью иммуносупрессии (r=0,04, p=0,52).
Также были проанализированы показатели эндотоксинемии и sCD14 у больных на разных стадиях заболевания (таблица 2).
Повышение концентрации сывороточного эндотоксина было выявлено у пациентов, как на третьей, так и на четвертой стадиях ВИЧ-инфекции. Но достоверной разницы между показателями эндотоксина крови у больных на разных клинических стадиях заболевания выявлено не было. Показатели sCD14 также были повышены у пациентов на 3-й и 4-й стадиях ВИЧ-инфекции по сравнению с группой контроля; при этом показатели sCD14 в группе больных на 4-й стадии заболевания статистически значимо превышали показатели пациентов, находящихся на третьей стадии заболевания (р=0,0004).
Таблица 2 – Концентрация ЛПС и sCD14 у больных на разных стадиях
ВИЧ-инфекции
| Стадия ВИЧ-инфекции (по В.И.Покровскому, 2001) | Концентрация эндотоксина EU/ml, Mе [25%-75%] (n-кол-во иссл-ий) | р1 | Концентрация sCD14, пг/мл Mе [25%-75%] (n-кол-во иссл-ий) | р2 |
| 2б, 2в стадии | 0,48 [0,48-0,48], n=2 | 0,26 | 1,89 [1,63-2,16], n=2 | 0,87 |
| 3 стадия | 1,36 [0,6-3,84], n=77 | 0,0002* | 2,46 [1,9-3,06], n=30 | 0,002* |
| 4 стадия, в т.ч. | 1,5 [0,68-3,05], n=151 | 0,000001* | 3,17 [2,69-3,76]**, n=57 | 0,000001* |
| 4а, прогрессирование | 1,72 [0,96-3,05], n=60 | 0,000001* | 2,99 [2,61-3,38], n=19 | 0,000001* |
| 4а, ремиссия | 4,84 [1,52-6,09], n=5 | 0,036* | - | - |
| 4б, прогрессирование | 1,36 [0,68-2,42], n=75 | 0,000073* | 3,27 [2,92-5,77], n=34 | 0,000001* |
| 4б, ремиссия | 3,05 [2,42-3,84], n=5 | 0,000012* | - | - |
| 4в | 1,16 [0,68-3,84], n=6 | 0,038* | 2,61 [2,52-3,16], n=4 | 0,0042* |
| 5 стадия | 0,36 [0,24-0,48], n=2 | 0,085 | - | - |
| Контрольная группа | 0,68 [0,48-0,68], n=26 | - | 1,91 [1,67-2,22], n=26 | - |
p1– уровень статистической значимости разницы показателей ЛПС с группой контроля
p2– уровень статистической значимости разницы показателей sCD14 с группой контроля
*- уровень статистической значимости различий показателей с группой контроля
**-уровень статистической значимости различий с показателями пациентов с 3 стадией заболевания р=0,0004
В зависимости от наличия клинических проявлений иммуносупрессии (оппортунистических инфекций) все пациенты были разделены на 2 группы. В первую группу вошло 139 больных без признаков оппортунистических инфекций, во вторую – 93 больных с различными клиническими проявлениями оппортунистических инфекций, среди них кандидозные поражения кожи и слизистых, волосистая лейкоплакия языка и туберкулез.
Статистический анализ исследуемых показателей выявил следующие результаты. Уровень эндотоксина в обеих группах был статистически выше контрольных показателей (р<0,05). Достоверных различий между показателями в группах выявлено не было (р=0,19). Таким образом, ни снижение уровня CD4-клеток, ни наличие у больных оппортунистических инфекций не влияло на концентрацию эндотоксина в сыворотке крови.
Исследование концентрации растворимого рецептора sCD14 (рисунок 3) в группах пациентов с различным уровнем иммуносупрессии позволило выявить обратную корреляцию показателей уровня CD4-клеток с концентрацией sCD14 у обследованных больных (r=-0,21, p=0,046).
Рисунок 3 – Корреляция уровня sCD14 c показателями CD4-лимфоцитов
Также было проведено сравнение показателей sCD14 в группах больных в зависимости от наличия клинических признаков иммуносупрессии (симптомокомплекса оппортунистических инфекций). В обеих исследуемых группах уровень sCD14 статистически значимо превышал верхний норматив контрольной группы (p<0,05). Тем не менее, стоит отметить, что в группе пациентов с оппортунистическими заболеваниями уровень показателя sCD14 значимо превышал значения данного показателя в группе пациентов без оппортунистических инфекций (р=0,0049). Была также установлена положительная корреляция уровня sCD14 с наличием оппортунистических инфекций (r=0,34 p=0,0007). Анализ полученных результатов показал, что наличие клинических и (или) лабораторных признаков иммуносупрессии не ассоциируется с высоким уровнем плазменного эндотоксина. В то же время, уровень sCD14 напрямую связан с наличием и выраженностью клинических и лабораторных маркеров иммуносупрессии.
Известным барьером на пути эндотоксина в системный кровоток являются клеточные факторы врожденного иммунитета, в том числе печеночные макрофаги – клетки Купфера. Поэтому мы решили проследить возможную связь факта наличия у пациента вирусных гепатитов с уровнем сывороточного эндотоксина и рецептора sCD14. Результаты проведенного анализа показали, что высокие уровни эндотоксина и sCD14 не связаны с наличием хронических гепатитов (p=0,9 и р=0,46, соответственно при сравнении показателей групп больных с хроническим вирусным гепатитом и без него).
Стартовым моментом для запуска каскада воспалительных реакций эндотоксином грамотрицательных бактерий является связывание ЛПС с CD14/TLR4-рецепторами моноцитов, сопровождаемое выбросом растворимых CD14-рецепторов (sCD14). Результатом этого взаимодействия является активация эффекторной клетки с выбросом провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли, IL-1, IL-6 и др.) [Brenchley J.M., et al., 2006; Marchetti G., et al. 2010]. Оценка концентрации маркеров воспалительных реакций в исследуемой нами группе позволила получить следующие результаты.
В большинстве случаев у пациентов отмечалось повышение показателей IL-1 (63%), TNF- (34%), С-РБ (26%), СОЭ (74%). При этом показатели в исследуемой группе значимо превышали показатели контрольной группы (р=0,000008 для IL-1, р=0,0001 для TNF-, р=0,0067 для С-РБ).
Несмотря на это положительная корреляция эндотоксина установлена только с IL-1 (r=0,27, p=0,0007). Для растворимого рецептора sCD14 выявлено большее количество достоверных взаимосвязей с маркерами системного воспаления (r=0,35 p=0,007 для TNF-, r=0,21 p=0,04 для лейкоцитов, r=0,21 p=0,04 для СОЭ).
Изучение взаимосвязи лабораторных и клинических проявлений иммуносупрессии с маркерами воспаления установило четкие взаимосвязи между прогрессированием заболевания и нарастанием иммуносупрессии. К примеру, установлена положительная корреляция факта наличия оппортунистических инфекций с TNF- (r=0,34; p=0,005), С-РБ (r=0,21; p=0,004), СОЭ (r=0,23; p=0,0004). Положительная корреляция была выявлена также и для уровня вирусной нагрузки с такими маркерами воспалительного ответа, как IL-1 (r=0,18; p=0,024), С-РБ (r=0,26; p=0,0005), СОЭ (r=0,28; p=0,000011), что косвенно подтверждает факт участия вируса в процессах нарушения целостности слизистой кишечного тракта. В то же время, это может свидетельствовать и о способности вируса самостоятельно (минуя механизмы, связанные с участием TLR4) активировать иммунную систему.
Характеристика микробиоценоза кишечника у пациентов с ВИЧ-инфекцией
Проведенное исследование позволило выявить высокую частоту нарушений микробиоценоза кишечника (МБК) у больных с ВИЧ-инфекцией вне зависимости от стадии заболевания (таблица 3). В целом нарушения МБК выявлены у 94% пациентов.
У подавляющего большинства обследованных (80%) отмечалось снижение содержания представителей облигатной кишечной микрофлоры, преимущественно анаэробов – бифидобактерий. Более, чем у половины пациентов (57%) наблюдался избыточный рост условно-патогенной флоры (УПФ) (S. аureus и грибов рода Candida). Нужно отметить, что у пациентов на второй (т.е. острой) стадии заболевания отмечалась довольно высокая частота избыточного роста УПФ, в т.ч., гемолизирующей E.сoli и грибов рода Candida (p<0,1). Дальнейшее прогрессирование заболевания до 4-й клинической стадии не ассоциируется с дальнейшим увеличением частоты избыточной колонизации кишечника УПФ.
Таблица 3 – Характеристика изменений состояния МБК у пациентов на разных стадиях ВИЧ-инфекции
| Характеристика нарушений МБК | Число больных | |||
| 2 стадия (n=13) | 3 стадия (n=217) | 4 стадия (n=87) | Все пациенты (n=317) | |
| Нарушения МБК | 12 (92%±7,7) | 203 (93%±1,7) | 83 (95%±2,2) | 298 (94%±1,3) |
| Снижение представителей облигатной кишечной микрофлоры, в т.ч.: | 8 (62%±14,0) | 174 (80%±2,7) | 73 (84%±3,9) | 255 (80%±2,2) |
| Бифидобактерии <109 КОЕ/г | 7 (54%±13,8) | 151 (70%±3,1) | 65 (75%±4,7) | 223 (70%±2,6) |
| Лактобактерии <107 КОЕ/г | 2 (15%±10,4) | 52 (24%±2,9) | 23 (26%±4,7) | 78 (25%±2,4) |
| E.сoli лакзопозитивные<107 КОЕ/г | 4 (31%±13,3) | 72 (33%±3,2) | 30 (34%±5,1) | 106 (33%±7,01) |
| Избыточный рост УПФ, в т.ч.: | 10 (77%±12,2) | 124 (57%±3,35) | 47 (54%±5,3)* | 181 (57%±2,8) |
| S.aureus | 3 (23%±12,1) | 53 (24%±2,9) | 26 (30%±4,9) | 82 (26%±2,7) |
| E.сoli гемолизирующие | 4 (31%±13,3) | 30 (14%±2,3) | 7 (8%±2,9)* | 41 (13%±1,9) |
| Klebsiella spp. >103 КОЕ/г | 2 (15%±10,4) | 42 (19%±2,7) | 9 (10%±3,3) | 53 (17%±2,1) |
| Enterobacter spp>103 КОЕ/г | 1 (8%±7,7) | 10 (5%±1,4) | 6 (7%±2,7) | 17 (5%±1,3) |
| Candida spp..>104 КОЕ/г | 6 (46%±14,4) | 43 (20%±2,7) | 18 (21%±4,3)* | 67 (21%±2,3) |
* - статистическая значимость разницы относительных показателей с показателями группы больных на 2-й стадии заболевания p< 0,1
Анализ изменений микробиоценоза кишечника в зависимости от степени иммуносупрессии выявил тенденцию к большей выраженности изменений МБК у больных с числом CD4-клеток ниже 200 в 1 мкл. В этой группе больных статистически значимо чаще отмечается избыточный рост УПФ, в том числе грибов рода Candida (p<0,05). Примечательно, что наличие у больных оппортунистических инфекций практически не повлияло на состав микрофлоры кишечника.
Анализ выраженности микробиологических изменений показал, что, независимо от клинической стадии заболевания, среди пациентов обследуемых групп примерно в равной степени регистрировались нарушения МБК 1, 2 и 3-й степеней (p>0,1). Обращает на себя внимание тенденция к усугублению нарушений МБК на фоне нарастания иммуносупрессии; при этом у больных с уровнем CD4-клеток менее 200 в 1 мкл значимо реже относительно группы сравнения встречаются нарушения МБК 1-й степени и растет доля более выраженных нарушений.
Анализ взаимосвязи показателей эндотоксинемии в зависимости от нарушений стула показал, что высокий уровень сывороточного эндотоксина положительно коррелировал с нарушениями стула (r=0,12, p=0,009),что, на наш взгляд подтверждает «кишечное» происхождение эндотоксинемии в исследуемой группе.
Изучение эффективности лечения анемии хронического заболевания с использованием «антиэндотоксиновой составляющей»
Одним из компонентов хронического воспаления является анемия хронического заболевания. В патогенезе АХЗ решающую роль играет многоплановое воздействие на процессы созревания и продолжительность жизни эритроцитов цитокинов, индуцирующихся в процессе системного воспалительного ответа, универсальным стимулятором которого является эндотоксин грамотрицательных микроорганизмов. В соответствии с приведенными в нашем исследовании результатами эндотоксин играет определенную роль и в развитии системных воспалительных реакций у пациентов с ВИЧ-инфекцией. В связи с этим была предпринята попытка выяснить эффективность комплекса терапии, направленной на элиминацию ЛПС из организма, в лечении анемии хронического заболевания. 4-недельный курс терапии включал: 1) Бифидумбактерин («Биомед») - по 5 доз 3 раза в день за 30 минут до еды; 2) Энтеросгель - по 1 ч.л. 3 раза в день за 1,5-2 часа до еды; 3) Урсодезоксихолевую кислоту («Урсосан») – по 2 капсулы в день перед сном; 4) почечный чай – по 1 чашке 2-3 раза в день.
На момент начала лечения самыми частыми жалобами в группе были жалобы на слабость, утомляемость, сонливость, т.е. жалобы, типичные для больных с анемией.
В результате проведенного лечения наблюдалось статистически значимое снижение эндотоксина сыворотки (р=0,009) и уровня sCD14 (р=0,02). Если до начала лечения уровень эндотоксина был выше максимальных показателей контрольной группы у 4 пациентов (25%), то после курса лечения у всех 16 пациентов показатели эндотоксина «укладывались» в рамки показателей здоровых людей. Высокий уровень sCD14 (по сравнению с показателями контрольной группы) до лечения был зарегистрирован у 4 человек (25%). Комплекс проведенной терапии позволил снизить этот показатель до уровня показателей контрольной группы у 2 пациентов. Нужно отметить, что на фоне лечения отмечалась также тенденция к снижению показателя IL-1.
На фоне лечения отмечалось значимое повышение показателей гемоглобина в группе (p=0,003). Повышение уровня гемоглобина после курса лечения отмечено у 75% пациентов, при этом у 50% из них анемия купировалась полностью.
У пациентов в группе лечения также отмечалась небольшая тенденция к росту CD4-лимфоцитов (p>0,05). Все больные после проведенного лечения отметили общее улучшение самочувствия, нормализацию стула. Ухудшения состояния не отмечено ни у одного больного. Уровень вирусной нагрузки достоверно не изменился.
В связи с тем, что часть больных получала также АРВТ, мы проанализировали исследуемые показатели отдельно в группах пациентов, получающих и не получающих АРВТ (6 человек и 10 человек, соответственно). Наиболее убедительные результаты получены у больных, не принимающих АРВТ. У них, несмотря на малый размер выборки, отмечено статистически значимое снижение уровня ЛПС и IL-1 (p<0,05). Так же, как и в общей группе, здесь была выявлена тенденция к снижению уровня вирусной нагрузки и росту абсолютного числа CD4 клеток. Примечательно статистически значимое повышение показателей гемоглобина на фоне терапии с использованием «антиэндотоксиновой составляющей» у больных, не получающих АРВТ. В группе пациентов на АРВТ выявлена лишь тенденция к росту гемоглобина. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности использования комплекса терапии, направленной на элиминацию ЛПС из организма, в лечении АХЗ, по крайней мере, у больных, не получающих АРВТ, что, на наш взгляд, является подтверждением роли эндотоксина грамотрицательных бактерий в патогенезе хронического воспаления при ВИЧ-инфекции.
ВЫВОДЫ
- Для больных ВИЧ-инфекцией на всех стадиях заболевания характерно повышение показателей сывороточного эндотоксина и sCD14 параллельно с высокими показателями маркеров системного воспаления (IL-1, TNF-, С-РБ).
- Эндотоксин выступает в качестве одного из факторов, вызывающих активацию системного воспалительного ответа у ВИЧ-инфицированных больных, что подтверждается положительными корреляционными связями ЛПС с IL-1 (r =0,27 p=0,0007); sCD14 с TNF- (r=0,35, p=0,007) и количеством лейкоцитов периферической крови (r=0,21, p=0,04) и СОЭ (r= 0,27, p=0,013).
- Высокие уровни sCD14 ассоциированы с прогрессированием заболевания, о чем свидетельствуют: обратная корреляция показателя sCD14 в исследуемой группе с уровнем CD4-клеток (r=-0,21, p=0,046), прямая корреляция - с наличием оппортунистических инфекций (r=0,34, p=0,0007) и более высокие показатели sCD14 у больных на 4 стадии заболевания при сравнении с пациентами на 3 стадии заболевания (Ме [25%-75%] = 3,17 [2,69-3,76] и 2,46 [1,9-3,06], соответственно; p=0,0004). Для эндотоксина такая связь не выявлена.
- У большинства пациентов (94%) ВИЧ-инфекция ассоциируется с изменениями микробиоценоза кишечника, характеризующимися преимущественно, дефицитом содержания представителей облигатной микрофлоры (у 80% пациентов) и избыточным ростом условно-патогенной флоры (у 57% пациентов). Степень выраженности выявленных изменений не зависит от клинической стадии заболевания и наличия оппортунистических инфекций. Снижение CD4-клеток ассоциировано с большей частотой избыточного роста условно-патогенной флоры и большей выраженностью микробиологических изменений.
- Выявлена достоверная взаимосвязь нарушений стула c концентрацией эндотоксина в сыворотке крови (r=0,12, p=0,009); при этом концентрация липополисахарида в группе больных с нарушениями стула статистически значимо превышает таковую в группе без нарушений стула (Ме [25%-75%] = 2,32 [0,96-3,84] и 1,4 [0,68-3,05], соответственно; p=0,03), что свидетельствует о «кишечном» происхождении гиперэндотоксинемии при ВИЧ-инфекции.
- Использование комплекса, включающего энтеросгель, бифидумбактерин, почечный чай и урсодезоксихолевую кислоту, в лечении больных c анемией хронического заболевания, не получающих антиретровирусную терапию, привело к статистически значимому снижению концентрации эндотоксина сыворотки (р=0,01) и уровня IL-1 (p=0,04). На фоне лечения достигнуто значимое повышение показателей гемоглобина в группе (Ме [25%-75%] = 109 [98-113] и 123,5 [121-128] - до и после лечения, соответственно; р=0,005).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для лечения больных с анемией хронического заболевания рекомендуется в дополнение к АРВТ использование в течение 4 недель комплекса терапии, включающей бифидумбактерин («Биомед») - по 5 доз 3 раза в день за 30 минут до еды; энтеросгель - по 1 ч.л. 3 раза в день за 1,5-2 часа до еды; урсодезоксихолевую кислоту («Урсосан») – по 2 капсулы в день перед сном; почечный чай – по 1 чашке 2-3 раза в день.
2. Рекомендуется включение в стандарты обследования пациентов с ВИЧ-инфекцией исследования кала на дисбиоз с последующей коррекцией выявленных изменений.
ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ
Перспективы дальнейшей разработки темы лежат в продолжении изучения роли различных факторов, способствующих активации воспалительных реакций при ВИЧ-инфекции и прогрессированию заболевания. Определенный интерес представляет исследование генетических полиморфизмов TLR4, которые могут оказывать влияние на способность эффекторных клеток активироваться под действием ЛПС. Разработка новых методов патогенетической терапии, направленной на подавление избыточного воспалительного ответа, отчасти, обусловленного эндотоксином, будет способствовать увеличению продолжительности жизни пациентов с ВИЧ-инфекцией и повышению ее качества.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Биккинина, О.И. Анемия у ВИЧ-инфицированных пациентов / О.И. Биккинина, Г.Р. Хасанова // Сборник тезисов 82-ой Всероссийской студенческой научной конференции. – Казань, 2008. – С. 95.
2. Биккинина, О.И. Изменение эритроцитарных индексов у больных анемией на разных стадиях ВИЧ-инфекции / О.И. Биккинина, Е.Ю. Степанова // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые в медицине». – Казань, 2009. – С. 58-59.
3. Степанова, Е.Ю. Вероятность развития анемии у больных ВИЧ-инфекцией / Е.Ю. Степанова, Г.Р. Хасанова, В.А. Анохин, О.И. Биккинина, Е.В. Головин // «Инфекционные болезни». – 2010. - № 3. – С. 9-12.
4. Хасанова, Г.Р. Уровень эндотоксина у ВИЧ-инфицированных пациентов с анемией / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина // Журнал инфекционной патологии. – Иркутск, 2010. - Том 17 - № 3. - С. 164-165.
5. Хасанова, Г.Р. Влияние эндотоксинемии на развитие анемии хронического заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, Ф.И. Нагимова // Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2011. – С. 45.
6. Хасанова, Г.Р. Показатели эндотоксинемии и антиэндотоксинового иммунитета у больных ВИЧ-инфекцией, употребляющих психоактивные вещества / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина Ф.И. Нагимова, Н.И. Галиуллин // Материалы Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики». - Казань, 2011. – С. 13-14.
7. Анохин, В.А. Показатели сывороточного эндотоксина у больных ВИЧ-инфекцией не зависят от коинфицирования вирусами парентеральных гепатитов / В.А. Анохин, Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина // Материалы Межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей. Актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики». - Казань, 2011. – С. 5.
8. Хасанова, Г.Р. Кишечный эндотоксин как вероятный индуктор системного воспалительного ответа при ВИЧ-инфекции / Г.Р. Хасанова, В.А. Анохин, О.И. Биккинина и др. // Практическая медицина. – 2012. - №1. – С. 52-55.
9. Биккинина, О.И. Нарушения микробиоценоза кишечника у пациентов у пациентов с ВИЧ-инфекцией / О.И. Биккинина, Е.Ю. Котляр, Г.Р. Хасанова и др. // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2012. - С. 55.
10. Биккинина, О.И. Повышение уровня провоспалительного цитокина интерлейкина-1 у больных с ВИЧ-инфекцией / О.И. Биккинина, Г.Р. Хасанова // Материалы IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - Москва, 2012. - С.409.
11. Хасанова, Г.Р. Состояние микробиоценоза кишечника у ВИЧ-инфицированных пациентов / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина // Материалы XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». - Казань, 2012. - С. 43.
12. Хасанова, Г.Р. Нарушение микробиоценоза кишечника у больных ВИЧ-инфекцией / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, В.А. Анохин, С.В. Халиуллина, М.Ю. Яковлев // Казанский медицинский журнал. - 2013. - Том 94. - № 1. – С. 34-39.
13. Биккинина, О.И. Эндотоксинемия и повышение провоспалительных цитокинов при ВИЧ-инфекции / О.И. Биккинина, Г.Р. Хасанова // Материалы 87-й Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых, посвященной 155-летию со дня рождения Л.О. Даркшевича. - Казань, 2013. – С. 130.
14. Хасанова, Г.Р. Микробная транслокация и активация воспалительных реакций у больных ВИЧ-инфекцией / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина // Материалы заочной научно-практической конференции "Микробиология в современной медицине". – Казань, 2013. – С. 120-122
15. Хасанова, Г.Р. Системный воспалительный ответ и прогрессирование ВИЧ-инфекции / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, В.А. Анохин, Л.Б. Акчурина, И.И. Ахметов // Вестник современной клинической медицины. - 2013. - Том 6. - № 3. – С. 21-27.
16. Хасанова, Г.Р. Эффективность лечения анемии хронического заболевания с использованием «Антиэндотоксиновой составляющей» у больных ВИЧ-инфекцией / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, Ф.И. Нагимова // Вестник современной клинической медицины. - 2013. - Том 6. - № 3. – С. 93.
17. Хасанова, Г.Р. Эндотоксиновая агрессия в индукции персистирующего синдрома системного воспалительного ответа у ВИЧ-инфицированных больных / Г.Р. Хасанова, И.Л. Аниховская, О.И. Биккинина, В.А. Анохин, М.Ю. Яковлев // Материалы IV Всероссийского съезда патологоанатомов. - Белгород, 2013. – С. 141-143.
18. Хасанова, Г.Р. Депрессия у молодых ВИЧ-инфицированных пациентов связана с анемией / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, В.А. Анохин // Казанский медицинский журнал. – 2013. – Том 94. - № 4. – С. 445-450.
19. Хасанова, Г.Р. / Микробная транслокация и системный воспалительный ответ при ВИЧ-инфекции / Г.Р. Хасанова, О.И. Биккинина, В.А. Анохин // Саратовский научно-медицинский журнал. – 2013. – Том 9. - № 3. – С. 508-512.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
| АРВТ | антиретровирусная терапия |
| АХЗ | анемия хронического заболевания |
| АЭС | антиэндотоксиновая составляющая |
| ВИЧ | вирус иммунодефицита человека |
| ИФА | иммуноферментный анализ |
| КГМА | Казанская государственная медицинская академия |
| КГМУ | Казанский государственный медицинский университет |
| ЛАЛ тест | лимулюс-лизат - тест |
| ЛПС (LPS) | липополисахарид |
| МБК | микробиоценоз кишечника |
| ПЦР | полимеразная цепная реакция |
| РКИБ | Республиканская клиническая инфекционная больница |
| РНК | рибонуклеиновая кислота |
| СОЭ | скорость оседания эритроцитов |
| СПИД | синдром приобретенного иммунодефицита |
| С-РБ | С-реактивный белок |
| УПФ | условно-патогенная флора |
| CD4 | CD4-лимфоциты |
| IL-1 | интерлейкин-1 |
| sCD14 | растворимый рецептор CD14 |
| TLR-4 | Toll-like4-рецептор |
| TNF- | фактор некроза опухоли - |
