Дифференцированный подход к ведению больных хроническим гломерулонефритом с учетом генетической предрасположенности
На правах рукописи
БЕЛЯНСКАЯ
Татьяна Владимировна
Дифференцированный подход к ведению больных
хроническим гломерулонефритом
с учетом генетической предрасположенности
14.00.09 – педиатрия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2007
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор
Ильенко Лидия Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Цветкова Любовь Никифоровна;
доктор медицинских наук, профессор Ботвиньев Олег Константинович.
Ведущее учреждение:
Федеральное государственное учреждение «Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится « 11 » июня 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.02 в ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г.Москва, ул. Островитянова, д. 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ г.Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «18 апреля » 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат медицинских наук, доцент Л.В.Сапелкина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРТИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Предупреждение прогрессирования хронических заболеваний почек и поиск современных методов терапии являются одной из наиболее актуальных задач детской нефрологии (Шилов Е.М., 1995; Тареева И.Е., 2000; Чиж А.С., 2004).
Для изучения роли наследственных факторов в развитии полигенных заболеваний часто используется подход, основанный на определении полиморфных маркеров генов-кандидатов (Гузов И.С., 2006; Носиков В.В., 2005). В качестве генов-кандидатов, продукты экспрессии которых могут определять скорость прогрессирования почечной недостаточности, рассматривают в первую очередь гены, кодирующие компоненты ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) и системы синтеза оксида азота (NO) эндотелием. Регулируя системную и внутрипочечную гемодинамику, а также стимулируя гипертрофию и гиперплазию мезангиальных клеток и синтез межклеточного матрикса, продукты экпрессии этих генов участвуют в развитии нефросклероза (Шахмалова М.Ш., 1996; Тареева И.Е., 2000; Минушкина О.С., 2002; Чиж А.С., 2004; Ruiz-Ortega M., 1997; Shiavello T., 2001; Peters, 2000).
Из генов-кандидатов ренин-ангиотензин-альдостероновой системы наиболее изучен ген ангиотензинпревращающего фермента (ACE). Выявлен полиморфизм типа «вставка/отсутствие вставки - insert/delete – I/D” в 16 интроне (Wolf G., Mueller E., 1993; Yoshida H. 1996; Vasku A., Soucec M 1998). I/D полиморфизм ассоциирован с уровнем ангиотензинпревращающего фермента в плазме. В связи с этим было высказано предположение, что аллель D, у носителей которого наблюдается повышенный уровень АСЕ, является фактором риска артериальной гипертензии (Shunkert H., 1994; Ludwig E., 1995; Prisco D., 2000; Ruiz-Ortega M., 2001). Несомненна патогенетическая связь между заболеваниями почек и кардиоваскулярной патологией. Более того, своевременная диагностика и адекватное лечение последней играет первостепенную роль в снижении летальности нефрологических больных. В целом сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) могут быть как причиной, так и осложнением хронических заболеваний почек (Marre M., 1994; Gilles Pernod, 2004).
Результаты современных исследований демонстрируют повышение риска хронизации гломерулонефрита при высокой концентрации гомоцистеина в крови (Fadinger M., 1997; Guttormsen A.B., 1997; Liangoos O., Kreutz R., 1998; van Guldner C., 2001). В основе этого процесса лежит несколько механизмов: непосредственное токсическое воздействие гомоцистеина на эндотелий, активация гиперплазии гладкомышечного слоя сосудистой стенки. Гомоцистеин стимулирует агрегацию тромбоцитов, нарушает функцию тканевого активатора плазминогена, способствует связыванию липопротеина с фибрином, а также ингибирует функцию естественных антикоагулянтов, таких как антитромбин III и протеин С.
Повышению уровня гомоцистеина в крови способствует ряд факторов. Гипергомоцистеинемия может быть обусловлена генетическими дефектами ферментов, обеспечивающими процессы обмена гомоцистеина. К увеличению концентрации гомоцистеина в плазме крови ведет мутация гена 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), которая обусловливает дефект витамин В12-зависимого реметилирования гомоцистеина в метионин (Fowler B., 2001; van Guldener C., 2001; Fodinger M., 2001; Fu W., Dudman N., 2002). F.Cappuccio и соавт., 2002 г. получили данные о том, что уровень гомоцистеинемии выше у лиц с T/Т-генотипом по сравнению с C/С-генотипом, а также об этнических различиях уровня. У лиц, имеющих T/Т-генотип гена MTHFR, отмечаются не только высокий уровень гомоцистеина, но и повышение активности ренина плазмы (Liangos O., 1998; Hagen W., 2001; Wrone E.M., 2001).
В практическом и теоретическом отношении важно, что гипергомо-цистеинемия признана в качестве фактора риска как кардиальной патологии, так и маркером высокой вероятности развития и прогрессирования нефрита (Stein J, Mc Bride P., 1998, Sirrs S., 1999.; Isukahara H., 2000; Zou C., 2002).
Другим не менее значимым фактором, влияющим на риск развития нефросклероза, является повышение содержания в плазме крови ингибитора активатора плазминогена 1 типа (РАI-1), который являетсся основным компонентом фибринолитической системы (Sakwdey M., 1991; Steefanson, Lawrence D.A., 1996.; Rerolle I.P., 2000; Hamana K., 2002). При высокой концентрации PAI-1 в крови может увеличиваться риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и нефросклеротического процесса (Barnes J.L., 1995; Oikawa T., Freeman M., 1997; Brown N.J., 2000).
Полиморфизм гена ингибитора активатора плазминогена 1 типа PAI-1 определяет различия в транскрипции гена; при наличии аллеля 5G отмечаются более низкие концентрации PAI-1 в плазме крови. Существует связь между уровнем PAI-1 в плазме крови, разными вариантами полиморфизма PAI-1 и риском развития склеротических процессов в тканях почек. Более того, было обнаружено, что генетические варианты 4G\4G гена PAI-1 модулируют активацию PAI-1 антигена под влиянием ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (Xu Y., 1996; Wang A.Y., 2001; Приходина А.С. и др., 2005).
Диагностика и адекватная коррекция этих состояний чрезвычайно важна для прогнозирования течения и исхода хронического гломерулонефрита, уменьшения факторов риска развития нефросклероза. И ставит на повестку дня вопрос о возможности управления факторами риска прогрессирования нефросклероза.
Цель исследования:
Изучить диагностическую и прогностическую значимость полиморфных маркеров генов кандидатов у детей больных хроническим гломерулонефритом.
Исходя из поставленной цели, были разработаны следующие задачи.
Задачи исследования:
1. Установить наличие или отсутствие ассоциации полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы с генетической предрасположенностью к возникновению хронического гломерулонефрита.
2. Выявить взаимосвязь между клиническими особенностями, морфологическими вариантами течения хронического гломерулонефрита у детей и генотипами полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы.
3. Исследовать прогностическую значимость генотипов полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена, С677Т и А1298С гена метилентетрагидрофолатредуктазы в отношении развития хронического гломерулонефрита.
Определить концентрацию гомоцистеина в сыворотке крови у пациентов с хроническим гломерулонефритом.
4. Оценить эффективность дифференцированной терапии ингибиторами АПФ у больных хроническим гломерулонефритом в зависимости от генотипа полиморфных маркеров I/D гена ангиотензинпревращающего фермента (ACE), 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведенного исследования используются в практической работе в НЦЗД РАМН, НУЦ КДЦ и отделение нефрологии ДГКБ им. Н.Ф.Филатова, а также в педагогическом процессе на кафедре госпитальной педиатрии Московского факультета РГМУ (зав.каф.- проф.Л.И. Ильенко).
Публикации. По теме диссертации опубликовано восемь научных работ, содержащих основные положения данного исследования.
Апробация работы. Материалы работы доложены на VI съезде научного общества нефрологов России 14-17 ноября 2005 г., V Российском конгрессе по детской нефрологии 19-21 сентября 2006 г., на заседании кафедры госпитальной педиатрии Московского факультета с курсом ТМЛ ФУВ РГМУ 16 ноября 2006 года.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ИССЛЕДОВАНИЙ
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста, включает 53 таблицы, 32 рисунка, 4 диаграммы. Состоит из введения, обзора литературы, трех глав: объема и методов исследования собственных исследований; обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Список литературы содержит 205 источников, из них 26 отечественных и 179 зарубежных работ.
БАЗА ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
Настоящая работа была выполнена в отделении о нефрологии ДГКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова (зав. нефролог. отделением - Бояджан М.Б.), КДЦ НУЦ им. Н.Ф. Филатова (зав. отделением - д.м.н. Николаев С.Н.), Научного центра здоровья детей РАМН (зав. отделением – профессор, д.м.н. Цыгин А.Н.). Генетическое тестирование пациентов с ХГН и контрольной группы было проведено в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государс-твенного Научного Центра «ГосНИИГенетика»( директор – чл.-корр. РАН, проф. В.Г. Дебабов, зав. лабораторией – проф. В.В.Носиков). Морфологическое исследование ткани почки, полученной с помощью чрезкожной биопсии, проводилось на кафедре патологической анатомии (зав. кафедрой – академик РАН и РАМН, проф. М.А Пальцев) ММА им. И.М. Сеченова - проф. В.А. Варшавским и к.м.н. Е.П. Проскурневой.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обследовано 200 человек: основную группу составили 120 больных ХГН и контрольную группу - 80 человек без заболеваний почек и АГ.
В основную группу вошли 67 мальчиков и 53 девочки в возрасте от 0,5 до 17 лет (средний возраст – 10,91±4,53 лет). Детей в возрасте до 3 лет было 37 человек, от 4 до 6 лет - 19 человек, от 7 до 10 лет - 21 человек, а старше 11 лет -43 человека (табл.1).
Оценка клинических особенностей ХГН проводилась ретроспективно на основании данных анамнеза и по архивным материалам. Она включала изуче-ние особенностей дебюта заболевания, его клинических и морфологических вариантов, а также анализ течения ХГН.
Клинические синдромы в дебюте гломерулонефрита проанализированы у всех пациентов. У большинства больных заболевание манифестировало изолированным нефротическим синдромом – в 50 % случаях - 60 детей (протеинурия более 50мг/кг/24ч у детей в сочетании со снижением уровня альбумина менее 3,5 г/дл). Второе место занимал изолированный мочевой синдром (умеренные изменения наблюдались только в мочевом осадке в виде умеренной протеинурией и/или гематурией различной степени выраженности без гипоальбуминемии) - 28% (34 ребенка). На третьем месте – нефритический синдром (умеренные отеки, гипертензия острого периода, в анализах мочи преобладают гематурия в сочетании с умеренной протеинурией, биохимические показатели активности процесса невысокие) - 22 % (26 человек).
Таблица 1
Общие сведения об обследованных пациентах
| Количество наблюдавшихся пациентов | Распределение обследованных в зависимости от характера патологии | Количество проведенных исследований | |||
| Показатель | Кол-во детей | Характер заболевания | Кол-во детей | Методы исследований | Кол-во детей |
| Возраст дебюта заболевания | Формы ХГН | Измерение АД | 120 | ||
| От 0 до 3 лет | 38 | МИНС | 48 | Клинический анализ мочи | 120 |
| От 4 до 6 лет | 19 | МезПГН | 44 | Клинический анализ крови | 112 |
| От 7 до 10 лет | 21 | МПГН | 10 | Определение суточной протеинурии | 120 |
| От 11 до 15 лет | 42 | ФСГС | 18 | Биохимический анализ крови | 120 |
| Итого | 120 | Итого | 120 | УЗИ почек | 120 |
| Клин.
с-мы в дебюте заболевания | Пациенты с ХПН | Рентген грудной клетки | 36 | ||
| Нефротический синдром | 60 | ||||
| Изолированный мочевой синдром | 34 | НСМИ | 1 | ||
| Гематурический синдром | МезПГН | 8 | Клиренс эндогенного креатинина | ||
| МПГН | 2 | ||||
| Итого | 120 | ФСГС | 3 | Нефробиопсия | 74 |
| Клинические синдромы в момент обследования в стационаре | Итого | 14 | Генетическоетестирование | ||
| Нефротическая форма | 67 | Всего | 134 | ||
| Смешанная форма | 39 | ЭКГ | 98 | ||
| Гематурическая форма | 14 | Эхо-кг | 43 | ||
| Итого | 120 | Консультация окулиста | 45 | ||
| Хроническая почечная недостаточность | 14 | Консультация невропатолога | 34 | ||
| Синдром артериальной гипертензии | 56 | Консультация генетика | 31 | ||
| Гематурия в дебюте заболевания | Итого | 1267 | |||
| Макрогематурия. | 8 | ||||
| Гематурия до 200 в п/зр | 11 | ||||
| Микрогематурия 41 | 41 | ||||
| Итого | 60 | ||||
| Всего | 490 | ||||
Повышение уровня креатинина крови (>110 мг/л) в дебюте гломерулонефрита имело место у 14 (11,6 %) пациентов (7 девочек и 7 мальчиков) из 120, у 4 из них это было расценено как проявление активности заболевания. Одному ребенку проведена пересадка почки. Средний возраст пациентов с почечной недостаточностью составлял 11,88±5,08 лет.
Синдром артериальной гипертензии встречался у 46,6% - 56 больных. При проведении анализа степени выраженности АГ обнаружено, что выраженная артериальная гипертензия отмечалась у 40 пациентов (71,4%), у 16 - умеренная артериальная гипертензия (28,57%).
Гематурия в начале гломерулонефрита наблюдалась у 60 (50,0%) больных из 120. Среди них у 8 (13,3%) отмечались эпизоды макрогематурии, 11(18,3%) детей имели гематурию до 200 в поле зрения и 41(68,3%) - микрогематурию.
Анализ клинических форм гломерулонефрита на момент первого обследования пациентов с ХГН показал, что нефротическая форма была выявлена у 67 пациентов(55,83%), смешанная форма у 39 детей с ГН(32,5%), гематурическая форма у 14 пациентов (11,6%).
Чрескожная пункционная биопсия почки с гистологическим, иммунофлюоресцентным и электронно-микроскопическим исследованием биоптатов была произведена у 74 пациентов с ХГН (61,6%). Средний возраст больных на момент биопсии был 5,03±3,95 лет.
Показанием для проведения биопсии почек являлось: абсолютная стероидрезистентность, дебют заболевания в подростковом возрасте, длительно персистирующая протеинурия или гематурия. Как показал опыт многих нефрологических школ, диагноз НСМИ у детей 1-14лет ставят в типичных случаях по характерным клинико-лабораторным, функциональным данным, быстрому положительному ответу на стероидную терапию, не прибегая к биопсии (Усов И.Р., 1987, Папаян А.В., 1989, Habib R., 1979, Barrat, 1993). Аналогичной тактики придерживались мы в своем исследовании. Однако двум больным была проведена нефробиопсия, учитывая длительную стероидрезистентность.
Основываясь на клинико-анамнестических данных, а также результатам проведенной нефробиопсии были выделены следующие формы гломерулонефрита: наибольшую группу составили пациенты с нефротическим синдромом с минимальными изменениями, что составило 48 человек, второе место составили дети с МезПГН - 44 ребенка, третье место - фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) - 18 пациентов, четвертое - мембранопролиферативный гломерулонефрит - 10 детей.
При анализе течения ХГН учитывали следующие факторы: выраженность АГ на протяжении заболевания, персистирование ПУ нефротического уровня в течение 6 и более месяцев. А также сочетание АГ и длительно персистирующей ПУ, уровень креатинина и мочевины, клиренс эндогенного креатинина, длительность гормональной терапии, изменение азотовыделительной функции почек, которая оценивалась по уровню креатинина в крови и мочевины.
Иммуносупрессивная терапия проводилась у 92 пациентов и в зависимости от тяжести заболевания включала: прием преднизолона внутрь и/или в виде «пульс»-терапии; цитостатиков – циклофосфана (внутрь или в виде «пульс»-терапии), азатиоприна – в качестве монотерапии или в сочетании с приемом глюкокортикостероидов, а также циклоспорина А.
Эффективность иммуносупрессивной терапии оценивали через 6-12 месяцев после начала лечения по следующим критериям:
для больных с НС – исчезновение НС или частичное уменьшение признаков НС с полным восстановлением или сохранением функции почек, а также снижение ПУ до 1-3 г/сут;
для больных с активным ХГН без НС – снижение ПУ не менее чем на 50% с сохранением или восстановлением функции почек.
В качестве популяционного контроля при проведении генетического тестирования использовали 80 человек (44 мужчин и 36 женщин) без хронических заболеваний почек и АГ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Общеклиническое обследование больных включало: тщательное изучение анамнеза заболевания, клинический анализ крови с подсчетом тромбоцитов, общий анализ мочи с микроскопией мочевого осадка, определение суточной протеинурии, исследование биохимических показателей крови – общего белка, альбумина, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, холестерина и триглицеридов, общего и прямого билирубина, трансаминаз, электролитов; скорости клубочковой фильтрации по клиренсу эндогенного креатинина (проба Реберга-Тареева) и суточной экскреции мочевой кислоты, а также рентгенографию органов грудной полости, ультразвуковое исследование почек, электро- и эхокардиографическое исследования (эхокардиография проведена только у части больных), консультации невропатолога, окулиста и, при необходимости, других специалистов.
АД измеряли в утренние часы, в положении больного сидя (после периода адаптации не менее 15 минут для достижения им состояния относительного покоя) не менее 3 раз, с расчетом среднего значения систолического АД (САД) и диастолического АД (ДАД). Под артериальной гипертензией (АГ) у детей понимали стойкое повышение артериального давления (АД) выше 95-го перцентиля для конкретного возраста и пола ребенка.
При определении морфологического варианта ХГН использовали классификацию В.В. Серова (1977 г.).
Для изучения генетической предрасположенности к возникновению ХГН исследовали ассоциацию полиморфного маркера (аллеля и генотипа) с фенотипом (клинически выраженной патологией).
Под ассоциацией понимали достоверно различающуюся частоту встречаемости исследуемых полиморфных маркеров у больных и у здоровых лиц одной и той же популяции. Идентификацию аллелей полиморфных маркеров проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим расщеплением ДНК в 2 % агарозном геле.
Для определения гомоцистеина в сыворотке крови была применена модификация методики электрохимической детекции гомоцистеина с использованием отечественных компонентов, производимых фирмами «БИОХРОМ» и «ЭЛСИКО».
При статистической обработке данных для протяженных переменных рассчитывали среднее арифметическое (М) и стандартное отклонение (). Для расчета статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий 2 по Пирсону. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05 р < 0,1 рассматривали как тенденцию к различию.
Для выявления и оценки связей между исследуемыми показателями, применялся непараметрический анализ ANOVA. О силе и направленности связи судили по величине и знаку коэффициента регрессии R. Достоверными считали корреляции с p<0,05.
Почечную выживаемость оценивали моментным методом Каплана-Мейера с учетом времени от начала заболевания (соответствует моменту появления мочевого синдрома) до исхода. В качестве исхода рассматривали увеличение концентрации сывороточного креатинина выше возрастной нормы и снижение клиренса креатинина ниже 60 мл/мин (по формуле Шварца).
Для оценки влияния одного или нескольких факторов на прогноз проводили соответственно монофакторный анализ с помощью регрессионной модели Кокса.
Результаты собственных исследований
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты генотипирования по локусам I/D гена АСЕ, С677Т и A1298C гена MTHFR, 4G/5G гена PAI-1 представлены в таблице 2.
Таблица 2
Частота аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR и PAI-1 у больных ХГН и в контрольной группе
| Контрольная группа (N = 80) | Больные ХГН (N = 120) | р | |||
| % | % | ||||
| ACE | Аллель I | 50 | 50 | нд | |
| Аллель D | 50 | 50 | нд | ||
| Генотип II | 27,5 | 21,6 | нд | ||
| Генотип ID | 45 | 56,6 | нд | ||
| Генотип DD | 27,5 | 21,6 | нд | ||
| MTHFR | Аллель C | 70 | 70,4 | нд | |
| Аллель T | 30 | 29,58 | нд | ||
| Генотип CC | 51,25 | 46,6 | нд | ||
| Генотип CT | 37,5 | 47,5 | нд | ||
| Генотип TT | 11,25 | 5,83 | нд | ||
| MTHFR | Аллель A | 62,5 | 55 | нд | |
| Аллель C | 37,5 | 45 | нд | ||
| Генотип AA | 32,5 | 22,5 | нд | ||
| Генотип AC | 60 | 65 | нд | ||
| Генотип CC | 7,5 | 12,5 | нд | ||
| PAI-1 | Аллель 4G | 59,35 | 59,3 | нд | |
| Аллель 5G | 40,65 | 40,62 | нд | ||
| Генотип 4G4G | 36,25 | 36,6 | нд | ||
| Генотип 4G5G | 46,25 | 39,1 | нд | ||
| Генотип 5G5G | 17,5 | 24,1 | нд | ||
При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов ACE, MTHFR и PAI-1 в контрольной группе и среди больных ХГН статистически достоверных различий выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данных полиморфных маркеров с генетической предрасположенностью к возникновению ХГН.
Анализ клинических особенностей ХГН, скорости прогрессирования почечной недостаточности и эффективности терапии ингибиторами АПФ проводили в группах больных, выделенных в зависимости от генотипов исследуемых полиморфных маркеров:
- для гена ACE – группы II, ID и DD;
- для гена PAI-1 – группы 4G/4G,4G/5G,5G/5G;
- для гена MTHFR – группа CC,CT,TT-С677Т и группа AA,AC,CC-А1298С.
Принимая во внимание имеющиеся в литературе данные об ассоциации определенных аллелей генов АСЕ, MTHFR, PAI-1 с заболеваниями почек, мы объединили в отдельную группу носителей так называемых «неблагоприятных» аллелей – аллеля D гена ACE, аллеля 4G гена PAI-1, аллеля Т гена MTHFR(C677T) и аллеля С гена MTHFR(А1298С). В результате были выделены 2 комбинированные группы.
В первую группу (группа D+4G+T+C) включены носители сочетания аллеля D (генотипы ID или DD), аллеля 4G (генотипы 4G/4G или 4G/5G) и аллеля T (генотипы TT или CT) и аллеля С(генотипы СА или СС).
Во вторую группу вошли носители оставшихся сочетаний генотипов.
Известно, что сочетание носительства двух гетерозиготных генотипов СТ и АС гена MTHFR увеличивает риск развития гипергомоцистеинемии.
Характеристика клинических особенностей ХГН в зависимости от генотипа полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 и MTHFR. Высокая частота гетерозиготного генотипа ID гена АСЕ отмечалась в группе больных ХГН, дебют заболевания которых произошел в возрасте от 1 до 3 лет (2 = 5,16, р=0,02). В то время как поздний дебют заболевания (школьный возраст - от 7 до 10 лет) был ассоциирован с генотипом СС(А1298С) MTHFR(2 = 4,16, р=0,04).
Следует отметить, что пациенты, у которых был выявлен нефротический синдром в момент первого обследования в клинике чаще имели генотип ID гена ACE (2 =3,83, р=0,03), аллель 5G ( 2=5,03,p=0,02) или генотип 5G5G гена PAI-1( 2=4,64,p=0,03). Гематурическая форма ХГН была ассоциирована с генотипом 4G4G (2 =3,89, р=0,048) и аллелем 4G (2 =5,29, р=0,02) гена PAI-1.
Таким образом, наличие 5G5G генотипа PAI-1 определяет риск развития НС даже у детей, дебютировавших изолированным мочевым синдромом.
В то время как наличие 4G4G генотипа гена PAI-1 определяет более благоприятное течение ХГН в виде гематурической формы.
При изучении групп больных с рецидивирующим течением ХГН выявлена ассоциация с аллелем 5G (р=0,04) и генотипом 5G5G (р=0,05) гена PAI-1.
Аллель D гена АСЕ (р=0,02) чаще встречалась у пациентов со стероидзависимой формой ХГН. А генотип CT гена MTHFR был ассоциирован с стероидзависимой (р=0,004) и стероидчувствительной формой ХГН (р=0,01).
Высокая частота гетерозиготного генотипа ID гена АСЕ отмечалась в группе больных ХГН, с началом заболевания от 1 до 3 лет (2 = 5,16, р=0,02). В то время как поздний дебют заболевания (школьный возраст - от 7 до 10 лет) ассоциирован с генотипом СС (А1298С) MTHFR (2 = 4,16, р=0,04).
Характеристика морфлогических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 и MTHFR. Чрескожная пункционная биопсия почки была произведена у 74 пациентов с ХГН (61,6%).
Одним из ключевых звеньев поддержания равновесия между факторами вазоконстрикции и вазодилятации является ангиотензин-превращаюший фермент (АСЕ). Его участие в регуляции сосудистого тонуса реализуется через синтез ангиотезиногена-II.
Нами выявлено, что генотип ID достоверно чаще встречался среди пациентов с НСМИ, что позволило нам предположить влияние ID генотипа на развитие данной формы заболевания (табл. 3).
Таблица 3
Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена АСЕ
| Генотипы гена АСЕ | |||||
| АллельI | Аллель D | Генотип II | Генотип ID | Генотип DD | |
| НСМИ | 44,79 | 55,2 | 12,5* | 64,58** | 22,9 |
| ФСГС | 47,2 | 52,7 | 22,2 | 50 | 27,7 |
| МезПГН | 44,3 | 55,68 | 29,54 | 52,7 | 18,18 |
| МПГН | 55 | 45 | 30 | 50 | 20 |
| Контр.гр. | 50 | 50 | 27,5 | 45 | 27,5 |
*-Р=0,04, 2 = 4,02 у пациентов с НСМИ
**р=0,03, 2 =4,56 у пациентов с НСМИ
Роль активации системы коагуляции в патогенезе гломерулонефрита и его исходе достаточно известна. Однако системная и локальная гиперкоагуляция может быть обусловлена различными факторами. Если при, так называемых, пролиферативных нефритах (мезангиопролиферативный, мембранопролиферативный) тригерным фактором гиперкоагуляции является дисфункция эндотелия, то при болезни с «минимальными изменениями» (НСМИ) и фокальносегментарном гломерулосклерозе (ФСГС) активация коагуляции связана, прежде всего, с потерей профибринолитических белков. В нашем исследовании выявлена ассоциация аллеля 4G и генотипа 4G4G с МезПГН, а аллеля 5G и генотипа 5G5G с НСМИ и ФСГС. Такое распределение генотипов в разных группах мы можем объяснить различной ролью дисфункции эндотелия в патогенезе пролиферативных и непролиферативных гломерулонефритов (табл. 4).
Таблица 4
Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена PAI-1
| Генотипы гена PAI-1 | |||||
| Аллель4G | Аллель 5G | Генотип 4G4G | Генотип 4G5G | Генотип 5G5G | |
| НСМИ | 41,8 | 58,14# | 19,76 | 44,2** | 36,04## |
| ФСГС | 36,1 | 63,8* | 16,6 | 38,8 | 44,4** |
| МезПГН | 77,2© | 22,7 | 61,3©© | 31,8 | 6,8 |
| МПГН | 60 | 40 | 30 | 60 | 10 |
| Контр.гр. | 59,35 | 40,65 | 36,25 | 46,25 | 17,5 |
- # аллель 5G (2 =6,69; р=0,01) НСМИ
- # # генотип 5G5G (2 =7,21; р=0,007) у больных НСМИ
- *Аллель5G (2 =6,43; р=0,01) ФСГС
- ** генотипа 5G5G (2 =5,38; р=0,02) у больных ФСГС
- © аллели 4G (2 =8,07; р=0,004)
- ©© генотипа 4G4G (2 =5,38; р=0,007) у больных МезПГН
Установлена высокая степень ассоциации между развитием НСМИ и генотипами СТ гена MTHFR (табл. 5).
Таблица 5
Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена MTHFR(C677T)
| Генотипы гена МТHFR | |||||
| Аллель C | Аллель T | Генотип CC | Генотип CT | Генотип TT | |
| НСМИ | 67,7 | 32,9 | 37,5 | 60,4* | 2,08 |
| ФСГС | 72,2 | 27,7 | 50 | 44,4 | 5,5 |
| МезПГН | 72,2 | 27,2 | 54,54 | 36,36 | 9,09 |
| МПГН | 70 | 30 | 50 | 40 | 10 |
| Контр.гр. | 70 | 30 | 51,25 | 37,5 | 11,25 |
СТ генотип р=0,01, 2 =6,34 у пациентов с НСМИ.
Таблица 6
Частота морфологических вариантов ХГН в зависимости от генотипов полиморфных маркеров гена MTHFR(A1298C)
| Генотипы гена МТHFR | |||||
| Аллель A | Аллель C | Генотип AA | Генотип AC | Генотип CC | |
| НСМИ | 40,6 | 59,37* | 29,1 | 60,4 | 10,4 |
| ФСГС | 52,7 | 47,2 | 22,2 | 61,1 | 16,6 |
| МезПГН | 53,4 | 46,5 | 15,9© | 75 | 9,09 |
| МПГН | 45 | 55 | 20 | 50 | 30# |
| Контр.гр. | 62,5 | 37,5 | 32,5 | 60 | 7,5 |
* аллелем С( р=0,0007, 2 = 11,51) у пациентов с НСМИ
© Генотип АА (p=0,04, 2=4,00) у пациентов с МезПГН
# Генотип СС (р=0,02,2=5,00) у пациентов МПГН
Проведенные исследования свидетельствуют, что установлена высокая степень корреляции между развитием ФСГС и аллелем 5G и генотипом 5G5G гена PAI-1(p=0,01 и p=0,02); развитием МезПГН и аллелем 4G и генотипом 4G4G PAI-1 (p=0,004 и р=0,007); развитием МПГН и генотипом СС (А1298С) MTHFR(р=0,02,2=5,00).
Для формирования НСМИ наиболее характерно сочетание генотипов ID АСЕ (p=0,03); аллеля 5G и генотипа 5G5G PAI-1 (p=0,01 и р=0,007); аллеля С(А1298С) и генотипа СТ (С677Т) MTHFR (p=0,0007 и р=0,01). Таблица 3,4,5,6.
Клиническая картина больных с почечной недостаточностью. Среди обследованных детей у 14 (11,6 %) пациентов было диагностировано нарушение функции почек (7 мальчиков и 7 девочек). Причем скорость прогрессирования процесса у мальчиков была выше (4,71+4,04 лет), чем у девочек (6,6+5,09лет) (р>0,05). Средний уровень креатинина составил 147,1+90,09 ммоль/л, клиренс креатинина - 60,4+20,83 мл/мин. Следует отметить, что наиболее частым морфологическим вариантом был МезПГН (50,7%).
Необходимо подчеркнуть, что у больных с генотипом DD сроки наступления почечной недостаточности несколько сокращались по сравнению с больными - носителями других генотипов (4,96±4,57 vs 7,13±3,84). Причем более выражены эти изменения были у девочек (6,9±4,95 vs 4,96±3,82).
При проведении анализа Каплан-Мейера в двух сформированных группах носителей «неблагоприятных» генотипов DD гена АСЕ и 4G4G гена PAI-1, мы получили достоверно выраженное прогрессирование заболевания у детей - носителей двух «неблагоприятных» генотипов одновременно (2=.9,1;р=0,008) (схема 1).
Схема 1
С помощью монофакторного анализа почечной выживаемости (регрессионная модель Кокса) были выделены факторы, обладающие неблагоприятным прогностическим значением. Ими оказались
- носительство генотипа 4G4G (р=0,027),
- комбинации аллелей D+4G (р=0,01),
- возраст начала заболевания старше 9 лет (р=0,029)
- длительно (более 6 месяцев) сохраняющаяся ПУ нефротического уровня(р=0,001) (табл. 7).
Таблица 7
Монофакторный анализ влияния клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса)
| Фактор | Влияние фактора на выживаемость, (р) |
| Наличие аллеля D гена ACE | 0 |
| Наличие аллеля Т и С гена MTHFR | 0 |
| Наличие генотипа 4G4G гена PAI-1 | (0,027) |
| Наличие комбинации аллелей D+4G | (0,010) |
| Мужской пол | 0 |
| Возраст начала заболевания | (0,029) |
| Наличие АГ на момент первого обследования | 0 |
| Уровень протеинурии в дебюте заболевания | 0 |
| Персистирование ПУ в течение 6 и более месяцев | (0,001) |
| Отсутствие АГ на протяжении ХГН | 0 |
0 – показатель не влияет на выживаемость; – показатель ухудшает выживаемость; – показатель улучшает выживаемость
Анализ ассоциации полиморфных маркеров генов АСЕ, PAI-1 с эффективностью терапии ингибиторами АПФ. Изучение ассоциации полиморфных маркеров генов ACE, PAI-1 с эффективностью терапии ингибиторами АПФ проводилось у 53 больных ХГН. Среди них было 26 мальчиков и 27 девочек. Средний возраст больных составил 11,28± 4,7 лет, давность заболевания – 4,76±3,85 лет.
Чрезкожная пункционная биопсия почки была выполнена у 31 пациента. Морфологические варианты гломерулонефрита (ГН) распределялись следующим образом: мезангиопролиферативный ГН был выявлен у 16 (30,18%) больных, минимальные изменения – у 20 (37,73 %), фокально-сегментарный гломерулосклероз – у 13 (24,52 %), МПГН-4 (7,54 %).
Пациентам была назначена терапия эналаприлом в дозе 0,04-0,8 мг/кг с целью коррекции артериальной гипертензии; с антипротеинурической целью доза ингибиторов АПФ составляла 0,04-0,11мг/кг.
Исследования, включавшие измерение АД, а также определение уровня суточной ПУ, креатинина, альбумина, калия, натрия, мочевой кислоты в крови, гемоглобина, экскреции мочевой кислоты проводили до назначения ингибиторов АПФ и затем в динамике через 1, 3, и 6 месяцев от начала лечения.
При сравнении исходных значений АД у носителей генотипа DD наблюдались более высокие цифры АД по сравнению с носителями генотипа ID и II, но данные различия не были статистически значимыми. У больных в группах 4G4G,4G5G,5G5G (ген PAI-1) достоверного снижения АД не отмечалось.
Антипротеинурический эффект на терапию ингибиторами АПФ был достигнут к 3 месяцу лечения во всех группах, однако статистически значимого снижения ПУ у пациентов, разделенных в соответствии с генотипами гена АСЕ, получено не было. У больных, выделенных в группы в соответствии с генотипами гена PAI-1, исходные значения ПУ не отличались. На фоне терапии ингибиторами АПФ у пациентов с генотипом 4G4G наблюдались разнонаправленные изменения ПУ, в то время как у больных с генотипом 4G5G отмечалось четкое достоверное снижение ПУ.
Гомоцистеинемия у пациентов с ХГН. Определение концентрации гомоцистеина проводилось у 18 больных НСМИ, трем из них (двое детей с стероидзависимой формой и один ребенок с острым течением стероидчувствительного НСМИ) обследование проводилось в активный период заболевания. Гипергомоцистеинемия (22,96+6,5) была зафиксирована у всех детей по сравнению с контрольной группой (7,8+1,78) (р=0,005) (график 1).
График 1
Принято считать, что при сочетанном носительстве гетерозиготных генотипов обоих полиморфных маркеров С677Т и А1298С гена MTHFR повышается риск развития гипергомоцистеинемии как и при наличии гомозиготного генотипа ТТ C677T. Сформировав две группы, в первую из которых входили дети с сочетанным носительством гетерозиготных генотипов, а во вторую - с отсутствием такового и, проведя анализ влияния полиморфных маркеров гена MTHFR на концентрацию гомоцистеина в сыворотке крови, мы не выявили ассоциации между уровнем гомоцистеина и данными генотипами (график 2).
График 2
ВЫВОДЫ
- Доказано, что у больных хроническим гломерулонефритом отсутствует ассоциация полиморфных маркеров I|D гена АСЕ, 4G5G гена PAI-1, С677Т и А1298С гена MTHFR c генетической предрасположенностью к возникновению ХГН. Однако выявлена ассоциация данных полиморфных локусов с факторами неблагоприятного течения ХГН, которая дает возможность определить особенности течения и прогноз хронического гломерулонефрита.
- Выявлены ассоциативные связи между развитием рецидивирующего течения заболевания ГН и генотипом 5G/5G гена PAI-1(р=0,05), стероидзависимой формой ХГН и аллелем D гена АСЕ (p=0,02) и генотипом СТ гена MTHFR-С677Т(р=0,004).
Генотип 5G5G гена PAI-1 определяет риск развития НС. Пациенты с 4G4G генотипом гена PAI-1 имеют более благоприятное течение ХГН в виде гематурической формы.
Выявлены достоверные связи
- Установлена высокая степень ассоциации между развитием ФСГС и аллелью 5G и генотипом 5G5G гена PAI-1(p=0,01 и p=0,02).
- Развитием МезПГН и аллелью 4G и генотипом 4G4G PAI-1 (p=0,004 и р=0,007).
- Для формирования НСМИ наиболее характерным сочетанием генотипов ID АСЕ (p=0,03); аллеля 5G и генотипа 5G5G PAI-1 (p=0,01 и р=0,007); аллеля С(А1298С) и генотипа СТ (С677Т) MTHFR (p=0,0007 и р=0,01).
- Обнаружено, что генотип 4G4G и комбинация аллелей D АСЕ + 4G РАI-1 являются прогностически неблагоприятными факторами развития ХГН (p=0,027 и p=0,01). Не выявлена ассоциация между уровнем гомоцистеина и носительством полиморфных маркеров.
- Проведенный анализ показал, что антипротеинурический ответ на терапию ингибиторами АПФ максимально выражен в группе пациентов с генотипом 4G5G PAI-1. Четкой ассоциации исследуемых полиморфных маркеров генов ACE и PAI-1 со степенью выраженности антигипертензивного эффекта ингибиторов АПФ не обнаружено; лучший ответ на терапию получен у гетерозигот ID ACE и 4G5G PAI-1.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. В амбулаторно-поликлинических условиях у детей, составляющих группу риска по возможному развитию нефрита, рекомендуется проводить скрининг исследование для определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови. При выявлении гипергомоцистеинемии, в дальнейшем направлять пациентов на консультацию к нефрологу в специализированные учреждения.
2. На основании проведенного исследования, в качестве оценки прогноза заболевания целесообразно использовать исследование полиморфных маркеров I/D гена ACE, 4G5G гена PAI-1 и СT(C677T) и АC(A1298C) гена MTHFR в нефрологических отделениях стационаров.
3. Дополнительным критерием к назначению ингибиторов АПФ может служить комбинация «неблагоприятных» аллелей – аллеля D гена ACE и аллеля 4G гена PAI-1.
4. У пациентов с генотипом 4G5G PAI-1 при хроническом гломерулонефрите, даже при отсутствии АГ, показано назначение блокаторов АПФ с антипротеинурической целью.
5. При выявлении повышенного содержания гомоцистеина в сыворотке крови (свыше16мкмоль/л) всем пациентам с хроническим гломерулонефритом необходимо проведение специфической коррекционной терапии с целью профилактики нефросклероза - фолиевой кислоты, витамина В6, витамин В12.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Белянская Т.В., Петросян.Э.К., Ильенко Л.И. Полиморфизм гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы четвертого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 25-27 октября 2005 г.). С.179, 180.
2. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Ильенко Л.И., Бабунова Н.Б., Бровкин А.Н. Генетический полиморфизм метилнтетрагидрофолатредуктазы у больных хроническим гломерулонефритом // Материалы четвертого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 25-27 октября 2005 г.). С. 180.
3. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Гипергомоцистеинемия у детей с хроническим гломерулонефритом // Материалы пятого Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, октябрь 2006 г.). С. 254.
4. Белянская Т.В., Петросян Э.К., Чудаковад Д.А., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е. «Полиморфизм гена PAI-1 как маркер активности эндотелия у детей с разными формами гломерулонефрита // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии (Воронеж, 19-21 сентября 2006 г.). С. 34, 35.
5. Петросян Э.К, Белянская Т.В, Горашко Н.М. Полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента у детей с нефротическим синдромом // Материалы VI съезда научного общества нефрологов России (Москва, 14-17 ноября 2005 г.). С. 40, 41.
6. Петросян Э.К., Белянская Т.В., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е. Полиморфизм гена белка апоптоза MDM-2 у детей со стероидчувствительным и стероидрезистентным нефротическим синдромом // Материалы V Российского конгресса по детской нефрологии (Воронеж, 19-21 сентября 2006 г.). С. 172-174.
7. Петросян Э.К., Белянская Т.В., Цыгин А.Н., Ильенко Л.И., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Полиморфный маркер 4G\5G гена PAI-1 у детей с хроническим гломерулонефритом // Нефрология. 2006 г. Т. 10. № 4. С. 56-61.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АСЕ ген ангиотензинпревращающего фермента
АГ артериальная гипертония
ГН гломерулонефрит
НСМИ нефротический синдром с минимальными изменениями
МПГН мембранопролиферативный гломерулонефрит
МезПГН мезангиопролиферативный гломерулонефрит
НС нефротический синдром
ПУ протеинурия
РАСС ренин-ангиотензин-альдостероновая система
ФСГС фокально-сегментарный гломерулосклероз
ХГН хронический гломерулонефрит
ХПН хроническая почечная недостаточность
Hcy гомоцистеинемия
MTHFR метилтетрагидрофолатредуктаза
PAI-1 ингибитор активатора плазминогена-1
АГ артериальная гипертензия
Анг-II ангиотензин II
АД артериальное давление
