Спектр цитокиновых дисфункций в генезе рецидивирующей герпес-вирусной инфекции. пути коррекции.
На правах рукописи
Зуйкова Ирина Николаевна
СПЕКТР ЦИТОКИНОВЫХ ДИСФУНКЦИЙ В ГЕНЕЗЕ РЕЦИДИВИРУЮЩЕЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ.
ПУТИ КОРРЕКЦИИ.
14.00.36 - аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва, 2007 г.
Работа выполнена в Государственном научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства»
Научные руководители:
доктор медицинских наук Шульженко А.Е.
доктор медицинских наук, профессор Каримова И.М.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Феденко Е.С.
доктор медицинских наук, профессор Кадагидзе З.Г.
Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук.
Защита диссертации состоится " 28 " ноября 2007 г. в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 208.017.01 в Государственном научном центре «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства» по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корпус 2. Факс (499) 617-10-27.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра «Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства».
Автореферат разослан " " 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук Л.С. Сеславина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Герпетическая инфекция занимает одно из ведущих мест среди вирусных заболеваний человека в связи с повсеместной распространенностью вируса и способностью к пожизненной персистенции у человека после первичного инфицирования. Одной из наиболее часто встречающихся форм рецидивирующей герпес-вирусной инфекции, вызванной вирусами простого герпеса (ВПГ) 1,2 типа, является генитальный герпес. За последние десять лет отмечено значительное увеличение частоты генитального герпеса, регистрирующейся в разных странах, что в значительной мере связано с распространением бессимптомной и недиагностированной форм герпетической инфекции [Борисенко К.К., 1997, Семенова Т.Б., 2003, Шульженко А.Е., 2003, Исаков В.А., 2006, Armstrong G., 2002, Corey L., 2004, Looker K., 2005]. По данным проведенных исследований более 80% сексуально активного населения России инфицированы генитальным герпесом, при этом клинические проявления в виде рецидивов отмечаются в 50-75% случаев [Масюкова С.А., 2000, Исаков В.А., 2004, Марченко Л.А., 2005].
Вирус простого герпеса обуславливает патологию беременности и родов, иногда приводя к спонтанным абортам, гибели плода, или вызывает генерализованную инфекцию новорожденных [Кузьмин В.Н., 2000, Масюкова С.А. и др., 2004, Редькин Ю.В. и др., 2006].
Способность к длительному персистированию возможна в связи с наличием у герпес-вирусов многочисленных механизмов, воздействующих на формирование противовирусной иммунной защиты и способствующих уклонению вируса от иммунологического надзора. В ряду факторов, играющих основную роль в противовирусной защите стоят цитотоксические лимфоциты, естественные киллеры, макрофаги, специфические антитела, система интерферона и интерлейкинов [Ковальчук Л.В. и др., 2001, Халдин А.А., 2001, Westra D., 2000, Ellermann-Eriksen. S et al., 2005]. В результате длительных мутаций вирусами герпеса выработаны многочисленные способы уклонения от иммунного контроля, касающиеся как нарушения работы клеточного звена защиты, так и цитокиновой сети. Индуцированная вирусами иммунная недостаточность способствует их активной репликации в течение длительного времени.
Цитокиновый ответ составляет основу специфических иммунных реакций и оказывает непосредственное влияние на механизмы иммунорезистентности при герпес-вирусной инфекции. Синтез таких цитокинов как ИФН-, ИФН-, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО- при ВПГ-инфекции приводит к активации основных антигенпрезентирующих клеток и развитию Th1-клеточного противовирусного иммунного ответа [Ершов Ф.И. и др., 2001, Ковальчук Л.В. и др., 2004, Paludan S., 2000, Imanishi J., 2000, Salazar-Mather T. et al., 2000, Mogensen S. et al., 2004].
Терапия и профилактика рецидивов генитального герпеса в настоящее время заключаются в применении препаратов как этиотропного, так и иммунотропного действия [Халдин А.А., 2001, Марченко Л.А. и др., 2005, Шульженко А.Е., 2005, Diaz-Mitoma F. et al., 1998, Miller R. et al., 2002, Brady R. et al., 2004, Barton S. et al., 2007]. Препараты, применяемые для терапии герпес-вирусной инфекции, составляют около 80% всех существующих противовирусных препаратов [Масюкова С.А., 2001, Corey L., 2004]. Однако общим недостатком ациклических нуклеозидов является неспособность полной элиминации вируса из организма. Кроме того, возможно развитие устойчивости к этой группе препаратов.
В последнее время в лечении и профилактике герпетических заболеваний перспективным стало применение препаратов, модулирующих ответ иммунной системы против вирусной инфекции [Хахалин Л.Н., 1998, Галегов Г.А. и др., 2002, Ершов Ф.И. и др., 2005]. При детальных исследованиях установлено, что противовирусный эффект этих препаратов опосредован индукцией не только ИФН, но и других про- и противовоспалительных цитокинов. В результате действие препаратов этой группы направлено на ограничение репликации вируса в инфицированных клетках, стимуляцию ВПГ-специфического иммунного ответа и предотвращение распространения вируса в здоровые клетки.
В настоящее время роль цитокинов в формировании противогерпетического иммунитета у больных рецидивирующим генитальным герпесом несомненна, однако сведения о них в литературе крайне ограничены и противоречивы. Поэтому, актуальной задачей остается изучение механизмов функционирования цитокиновой сети при рецидивирующей герпес-вирусной инфекции и поиск новых препаратов с противовирусной и иммуномодулирующей активностью для лечения этого заболевания.
Цель исследования
Изучение особенностей интерферонового и интерлейкинового профиля у пациентов с хронической часто рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией и коррекция выявленных нарушений.
Задачи исследования
- Изучить клинические особенности течения генитальной герпес-вирусной инфекции у пациентов с высокой частотой рецидивов.
- Исследовать закономерности клеточного и цитокинового ответа у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией в зависимости от продолжительности периода высокой частоты рецидивов.
- Оценить взаимосвязь нарушений в клеточном и интерфероновом, интерлейкиновом ответе у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.
- Исследовать изменения цитокинового ответа на фоне терапии индукторами интерферона у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.
- Провести сравнительный анализ клинической эффективности проводимой терапии и изменений цитокинового профиля у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.
Научная новизна работы
На основании данных клинического течения генитальной герпес-вирусной инфекции впервые определены основные различия по формированию клеточного и цитокинового ответа в группах больных с коротким и продолжительным периодом частых обострений герпес-вирусной инфекции.
Впервые показано, что при высокой частоте рецидивов более одного года формируется вторичная иммунная недостаточность. Выявлено, что при высокой частоте рецидивов более одного года снижается суммарный уровень киллерных клеток с фенотипом CD8+ и CD16+, играющих важную роль в иммунопатогенезе герпес-вирусной инфекции.
Благодаря сравнительному изучению получены новые данные о формировании более выраженной недостаточности продукции ИФН и тенденции к Th2-направленности цитокинового ответа у пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года.
Впервые отмечено снижение или отсутствие специфического клеточного ответа in vitro на антигены ВПГ-1 и 2 типа у 88,0% пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года.
Впервые показано, что комбинированная терапия Анафероном и ациклическими нуклеозидами благоприятно влияет на течение рецидива генитального герпеса, приводя к укорочению периода купирования общих и местных симптомов, ускорению процесса образования корочек.
Выявлено, что в начале рецидива генитального герпеса наблюдается развитие цитокинового ответа по Th-2 пути, при этом применение терапии, способствующей усилению экспрессии мРНК ИФН-гамма, способствует переключению иммунного ответа по Th-1 пути.
Впервые показана тенденция смещения цитокинового ответа у пациентов в сторону Th-1 пути (клеточного иммунного ответа) при положительном клиническом эффекте во время комбинированной терапии Анафероном. Обнаружено, что отрицательный клинический эффект наблюдается при отсутствии изменений в экспрессии генов цитокинов или тенденции изменения цитокинового ответа по Th-2 пути у данных пациентов.
Практическая значимость работы
Показано, что при высокой частоте рецидивов (10-12 раз в год) более одного года пациентам с генитальной герпес-вирусной инфекцией необходимо проведение комбинированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии в связи с формированием иммунной недостаточности.
Выявлена клиническая эффективность комбинированной терапии Анафероном и ациклическими нуклеозидами при рецидивирующем генитальном герпесе в виде сокращения продолжительности общих и местных симптомов, уменьшения периода образования корочек.
Комплексная терапия, включающая Анаферон и ациклический нуклеозид, показана для применения у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции и незначительным нарушением способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма.
Выявлена способность комбинированной терапии Анаферном и ациклическими нуклеозидами усиливать экспрессию мРНК ИФН-гамма и переключать цитокиновый ответ с Th-2 пути на более эффективный Th-1 путь у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции.
Определение эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии при рецидивирующем герпесе может осуществляться под контролем показателей экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10.
Исследование показателей цитокинового профиля и специфического клеточного ответа у пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом является адекватным методом оценки сложных взаимовлияний различных звеньев противовирусного иммунного ответа и эффективности выбора проводимой терапии.
Апробация диссертационной работы
По теме диссертации опубликовано 16 научных работ. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых в ГНЦ Институт Иммунологии ФМБА России (Москва, 2005), на IV научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 2006), на конференции «Герпес-вирусные инфекции в практике врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и неврологов» (Москва, 2006), на научно-практической конференции «Профилактика, диагностика, иммунокоррекция вирусных и бактериальных инфекций» (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, 2006), «Современные представления о роли ИППП в нарушениях репродуктивного здоровья» (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва, 2007), на Межрегиональной VI научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии и медицинской косметологии» (Хабаровск, 2007), на VIII Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007), на 2-м Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2007).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», главы «Результаты собственных исследований», заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 214 источников (98 отечественных, 116 иностранных). Текст иллюстрирован 35 таблицами и 14 рисунками, сопровождается клиническими примерами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
За период 2004-2006 года в работу включено 102 пациента с хронической рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией (ХРГВИ), которые проходили амбулаторное и стационарное обследование в ГНЦ Институте иммунологии ФМБА России и ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (отдел интерферонов) и получали лечение в ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России.
Критериями выбора пациентов для обследования являлись: 1) наличие высокой частоты рецидивов генитального герпеса - более 8 раз в год; 2) продолжительность генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года; 3) обследование в фазе обострения процесса или в периоде продромы, не более 48 часов от момента появления высыпаний; 4) отсутствие приема иммуномодулирующей терапии в течение последних 3 месяцев до включения в обследование. В процессе проведения обследования были сформированы 2 группы пациентов: I группа – 30 человек с частыми рецидивами менее одного года, II группа – 72 человека с частыми рецидивами более одного года.
Методы обследования больных
- Клиническое обследование: анамнез жизни и заболевания, выявление сопутствующей патологии, аллергологический анамнез, а также регулярный осмотр мест поражения. При осмотре выяснялись жалобы пациента (зуд, жжение, общее состояние, температура, миалгия и др.), оценивалось состояние кожных покровов и слизистых (наличие везикулезных элементов, изъязвлений, эпителизации, отечности, гиперемии).
- Клинический анализ крови (с подсчетом лейкоцитарной формулы).
- Исследование на наличие вируса простого герпеса с помощью мазка из области поражения методом ПЦР.
- Иммунный статус с определением следующих параметров:
- Субпопуляции лимфоцитов с фенотипом CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+ (B-лимфоциты), иммунорегуляторный индекс (ИРИ).
- Реакция торможения миграции лейкоцитов при взаимодействии со специфическими антигенами (ВПГ-1, ВПГ-2, St. Aureus)
- Иммуноглобулины классов А, M, G.
Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов проводилась методом иммунофенотипирования лимфоцитов с помощью моноклональных антител и проточной лазерной цитометрии с одинарной флюоресцентной меткой. В основе метода лежало взаимодействие моноклональных антител, меченных флюоресцентной меткой, с поверхностными антигенами лимфоцитов и последующий анализ образцов на проточном лазерном цитометре.
Оценка специфического клеточного ответа проводилась с помощью модифицированной реакции торможения миграции лейкоцитов – РТМЛ (Симонова А.В., Пинегин Б.В., 2006). С помощью модифицированного варианта РТМЛ оценивали ответ на поликлональный митоген (ФГА), специфические антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, St. aureus в плоскодонных 96-луночных планшетах. Количественный учет результатов после инкубации производили на инвертированном микроскопе (Leitz, Germany). Индекс подавления миграции (ИПМ) после изменения диаметра вычисляли по формуле:
ИПМ = ± [(D02/Dk2) - 1] 100%, где
D0 – средний диаметр для параллельных опытных культур,
Dk – средний диаметр для контрольных микрокультур.
Знак «+» указывал на усиление миграции, в процентах.
Знак «» указывал на подавление миграции, в процентах.
Содержание иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini и соавт.
- Определение расширенного интерферонового статуса, включающего следующие параметры:
- Уровень циркулирующего в крови ИФН (сывороточный ИФН);
- Уровень продукции спонтанно вырабатываемого ИФН;
- Уровень продукции ИФН-альфа лейкоцитами при индукции клеток крови in vitro вирусными индукторами (вирус болезни Ньюкасла - ВБН);
- Уровень продукции ИФН-гамма при индукции клеток крови in vitro митогенами (фитогемагглютинин — ФГА);
- Определение чувствительности к препаратам ИФН-альфа (Реаферон, Лейкинферон, человеческий лейкоцитарный ИФН - ЧЛИ, Роферон, Интрон), к препаратам ИФН-гамма (Гаммаферон);
- Определение чувствительности к индукторам ИФН (Ридостин, Циклоферон, Амиксин).
Титрование ИФН проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах с культурой диплоидных фибробластов человека (ДФЧ), полученных из музея клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва) и выращенных в ростовой среде до образования монослоя. В качестве индикаторного тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМК), который был получен из музея вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (г. Москва). За единицу активности ИФН (Ед/мл) принимали величину, обратную его максимальному разведению, которая защищала 50% клеток от цитопатического действия 100 ТЦД50 вируса. Для перевода полученной активности ИФН в международные единицы (МЕ) в каждом титровании использовался референс-препарат ИФН.
Показатели ИФН-альфа в норме соответствовали 80-640 Ед/мл, ИФН-гамма – 16-128 Ед/мл, сывороточного ИФН — <2-4 Ед/мл, спонтанно продуцируемого ИФН <2 Ед/мл (Мезенцева М.В., 2006).
Чувствительность к ИФН-индуцирующему воздействию индукторов ИФН оценивали по способности препаратов индуцировать ИФН, титры которого превышают титр спонтанно продуцируемого ИФН на один и более log2. Чувствительность к праймирующему воздействию препаратов ИФН оценивали по способности препаратов усиливать ИФН-индуцирующее воздействие стандартных индукторов на один и более log2.
- Цитокиновый профиль оценивали методом ОТ-ПЦР (определение активности мРНК цитокинов в мононуклеарах периферической крови методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции).
Выделение РНК проводили по методике P.Chomczynsky, N.Sacchi методом кислой гуанидин-тиоцинат-фенол-хлороформ экстракции. Обратная транскрипция и ПЦР-амплификация были выполнены в соответствии с методикой, предложенной Gelder. В работе были использованы пары праймеров для следующих цитокинов: ИФН-альфа, ИФН-гамма, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18, ФНО-альфа. В качестве контроля использовали -актин. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли электрофоретически в 2,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. Для идентификации нуклеотидных последовательностей использовали маркер для электрофореза фирмы Promega (G 1861).
После обследования пациенты из II группы с продолжительностью периода частых рецидивов более одного года были распределены на три равночисленные группы, в которых была изучена взаимосвязь между эффективностью проводимой терапии и параметрами иммунного, интерферонового статусов и цитокинового профиля. Оценку эффективности противовирусной и иммуномодулирующей терапии проводили с использованием нового отечественного препарата Анаферон (НПФ «Материа Медика Холдинг», Россия) и стандартного противовирусного препарата Ацикловир (Stada Arzneimittel, Германия) согласно схемам, описанным ниже.
Схема приема препарата Анаферон: по 1 таблетке 8 раз в день в течение 3 дней, по 1 таблетке 7 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 6 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 5 раз в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 4 раза в день в течение 2 дней, по 1 таблетке 3 раза в день в течение 10 дней, рассасывая в ротовой полости (полный курс – 21 день, 98 таблеток).
Схема приема препарата Ацикловир: по 1 таблетке (200 мг) 5 раз в сутки в течение 7 дней.
1 группа пациентов получала монотерапию Анафероном по выше приведенной схеме.
2 группа пациентов получала комбинированную терапию Ацикловиром и Анафероном по выше приведенной схеме.
3 группа пациентов получала стандартную базисную терапию Ацикловиром по выше приведенной схеме.
Клиническая эффективность терапии оценивалась по 4 основным критериям:
- уменьшение степени тяжести клинического течения рецидива;
- уменьшение продолжительности рецидива;
- удлинение периода ремиссии генитального герпеса;
- уменьшение тяжести последующих рецидивов.
Все клинические параметры оценивали в течение 6 месяцев после окончания курса лечения. Степень тяжести последующих рецидивов оценивали в баллах путем анкетного опроса больных. Для определения частоты и длительности рецидивов заболевания проводили осмотр всех пациентов, включенных в исследование.
Статистические методы обработки полученных данных
Статистическую обработку данных проводили стандартным пакетом STATISTICA 5.11. Во время исследования использовались варианты количественного и качественного анализа. При расчетах количественных изменений, произошедших в одной группе до и после лечения, использовались параметрический (парный критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Уилкоксона) методы. При анализе качественных показателей были применены непараметрические критерии X2 (хи - квадрат) и критерий Манна – Уитни. Кроме этого, связь признаков определялась методом регрессионного анализа и вычисления коэффициента корреляции Пирсона (параметрические методы), а также вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (непараметрический метод).
Результаты исследования
I. Клинико-иммунологическая характеристика пациентов с ХРГВИ
В исследование включено 102 пациента, страдающих генитальной формой хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции, из них 29 мужчин (28,5%) и 73 женщины (71,5%) в возрасте от 18 до 65 лет. Средний возраст пациентов составил 38,2±4,1 лет. Как среди мужчин, так и среди женщин, преобладали пациенты в возрасте от 18 до 40 лет. Среди обследованных пациенток 35,6% составили молодые женщины в возрасте 18-29 лет, при этом среди мужчин большую долю (41,4%) составили пациенты в возрастном диапазоне 30-39 лет. В целом, во всех возрастных группах достоверно чаще обращались к врачу женщины.
Длительность генитальной герпес-вирусной инфекции у всех больных, включенных в исследование, составила в среднем 7,3±2,4 года. Около 30% пациентов страдали заболеванием от 1,5 до 3-х лет, а 29,4% пациентов – более 8 лет. У 7,8% пациентов длительность заболевания не превышала 1,5 года, у 21,6% – генитальный герпес наблюдался от 3 до 5 лет, у 9,8% – от 5 до 8 лет.
По локализации у 79,3% мужчин и 50,7% женщин высыпания возникали только в области гениталий, у 6,8% мужчин и 15,1% женщин наблюдалось экстрагенитальное поражение с очагами в области ягодиц, параанальной, лобковой области и внутренней поверхности бедер. Смешанное поражение (генитальная и экстрагенитальная локализация) выявлено у 13,8% мужчин и 31,5% женщин. Отмечено, что среди мужчин достоверно чаще распространена генитальная локализация высыпаний (р<0,05).
Провоцирующими рецидивы факторами у женщин являлись сексуальные контакты, взаимосвязь с менструальным циклом и стресс. У мужчин ведущей причиной обострения заболевания являлись переутомление, употребление алкогольных напитков и стресс. На взаимосвязь обострений с переохлаждением и простудными заболеваниями мужчины и женщины указывали одинаково часто - 48,3% и 53,4%, соответственно.
Анализ ранее проводимой терапии у обследуемых пациентов показал, что около 23% пациентов использовали только местную терапию (мазь с ацикловиром, интерфероном, растворы антисептиков). Выявлено, что у 17,6% больных прием специфических ациклических нуклеозидов в период рецидива заменялся на препараты из групп интерфероногенов и иммуномодуляторов. Только около 60% пациентов использовали ациклические нуклеозиды, при этом более половины из них применяли Ацикловир, часть пациентов (4 человека) ранее использовала Фамвир (таб. 1).
Таблица 1.
Характеристика ранее используемой терапии до включения в обследование пациентов с генитальным герпесом (n=102)
| Группы препаратов | Частота применения (количество и % пациентов) | |
| Только местная терапия | 23 чел | 22,5% |
| Ациклические нуклеозиды | 61 чел | 59,9% |
| - Ацикловир | - 35 чел | - 34,3% |
| - Валтрекс | - 22 чел | - 21,6% |
| - Фамвир | - 4 чел | - 3,9% |
| Препараты других групп (индук- торы ИФН, иммуномодуляторы) | 18 чел | 17,6% |
Оценивая способ применения противовирусной терапии пациентами до начала обследования выявлено, что в 98% случаев лечение проводилось эпизодически (в периоды обострения герпес-вирусной инфекции). Только в 2% случаев в анамнезе пациентам назначалась супрессивная терапия продолжительностью до 3-х месяцев.
Изучение особенностей клинического течения герпес-вирусной инфекции у обследуемых пациентов показало, что такие параметры как длительность заболевания, локализация высыпаний, продолжительность и тяжесть рецидивов, учащение рецидивов от дебюта заболевания носили индивидуальный характер. Однако анализ продолжительности периода частых рецидивов генитального герпеса показал, что около 30% обратившихся пациентов жаловались на появление обострений заболевания с частотой 1 раз в месяц в течение последнего одного года. В это же время у большинства пациентов (70,9%) высокая частота рецидивов наблюдалась в течение более продолжительного времени (более одного года). Это позволило распределить их на группы с различной продолжительностью периода высокой частоты рецидивов заболевания (таб. 2).
Таблица 2.
Распределение пациентов с генитальным герпесом на группы в зависимости от продолжительности периода высокой частоты рецидивов
| Параметры | I группа | II группа |
| Период частых рецидивов (до 1 раза в месяц) | В течение или менее одного года | Более одного года (2-5 лет) |
| Число пациентов абс (%) | 30 чел (29,1%) | 72 чел (70,9%) |
| Длительность заболевания 1 | 4,2±1,5 | 9,7±2,8* |
* - разница между группами достоверна (p<0,05)
1 – длительность заболевания от момента появления первого рецидива
Таким образом, в зависимости от продолжительности частых рецидивов до 1 раза в месяц все обследуемые пациенты были разделены на две группы:
- I группа – 30 пациентов (29,1%) с частыми рецидивами менее одного года;
- II группа – 72 пациента (70,9%) с частыми рецидивами более одного года (в течение последних 2-5 лет).
Выделение таких групп способствовало более полному анализу результатов исследования, так как учитывало параметры клинического течения генитальной герпес-вирусной инфекции у обследуемых больных.
Как показал проведенный нами анализ сопутствующих заболеваний у пациентов I группы с высокой частотой рецидивов в течение последнего года, чаще встречаются урогенитальные инфекции - в 60,0%. По спектру сопутствующей урогенитальной микрофлоры у женщин наиболее часто встречались Ureaplasma urealyticum, HPV 16/18 типа, Gardnerella vaginalis, Candida albicans, у мужчин - Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Candida albicans. Во II группе у 38,8% пациентов также выявлены сопутствующие урогенитальные инфекции.
Из таблицы 3 видно, что пациенты II группы преимущественно страдают рецидивирующими воспалительными заболеваниями верхних дыхательных путей (62,5%), заболеваниями щитовидной железы (29,2%). По данным литературы у больных с часто рецидивирующими формами генитального герпеса часто выявляются нарушения в щитовидной железе (Щеголева В.И., Халдин А.А., 2003). У данной категории больных ВПГ рассматривается как триггерный фактор развития аутоиммунного процесса в щитовидной железе. Встречаемость заболеваний желудочно-кишечного тракта одинакова в обеих группах (таб. 3).
Таблица 3.
Частота встречаемости сопутствующих заболеваний внутри групп пациентов с генитальным герпесом
| Заболевания | I группа (n=30) | II группа (n=72) |
| Хр. рецидивирующий тонзиллит, фарингит, бронхит | 11 чел (36,6%) | 45 чел (62,5%)* |
| Патология щитовидной железы | 3 чел (10,0%) | 21 чел (29,2%)* |
| Заболевания ЖКТ | 26 чел (86,6%) | 58 чел (80,5%) |
| Урогенитальные инфекции | 18 чел (60,0%)* | 28 чел (38,8%) |
* - достоверность различий между группами пациентов p<0,05 (2- критерий)
Изучение состояния клеточного иммунного ответа показало, что в начале обострения у пациентов I группы с высокой частотой рецидивов в течение одного года достоверно выше относительное и абсолютное содержание цитотоксических CD8+ лимфоцитов (среднее значение – 38,4±1,3%, 822,5±35,7/мкл) и натуральных киллеров (среднее значение – 13,0±0,8%, 271,7±26,8/мкл) по сравнению с пациентами II группы (p<0,05, таб. 4).
Таблица 4.
Показатели иммунного статуса у пациентов I и II групп в фазу обострения герпес-вирусной инфекции
| Показатели | Норма | I группа (n=30) | II группа (n=72) |
| Лейкоциты (*109/л) | 4,0-9,0 | 6,3±1,7 | 6,7±1,7 |
| Лимфоциты, % | 19-37 | 34,9±2,5 | 32,2±1,8 |
| Лимфоциты (*109/л) | 1200-3000 | 2138,0±86,4 | 2076,7±70,4 |
| CD3+, % | 55-80 | 72,3±1,4 | 74,4±0,8 |
| CD3+, кл/мкл | 800-2200 | 1542,2±67,8 | 1537,7±51,6 |
| CD4+, % | 31-51 | 37,6±1,4* | 46,1±0,9* |
| CD4+, кл/мкл | 600-1600 | 795,1±40,1* | 951,9±33,9* |
| CD8+, % | 19-40 | 38,4±1,3* | 27,0±0,9* |
| CD8+, кл/мкл | 300-800 | 822,5±35,7* | 564,9±29,2* |
| ИРИ | 1,0-2,5 | 0,99±0,10* | 1,81±0,06* |
| NK (CD16+), % | 6-20 | 13,0±0,8* | 7,8±0,6* |
| NK (CD16+), кл/мкл | 150-500 | 271,7±26,8* | 160,6±14,3* |
| Сумма киллеров (CD8+ и CD16+), % | >45% | 49,2±1,8* | 32,6±1,6* |
| B-лимф (CD19+), % | 5-19 | 6,0±0,6 | 7,2±0,5 |
| B-лимф, кл/мкл | 100-500 | 125,3±11,6 | 147,4±9,4 |
| IgA, мг% | 100-350 | 216,9±15,7 | 187,68±11,3 |
| IgM, мг% | 80-250 | 143,7±10,1 | 157,78±9,5 |
| IgG, мг% | 900-1800 | 1244,8±53,8 | 1203,32±43,7 |
* - достоверность различий между группами пациентов p<0,05
Уровень естественных киллеров с фенотипом CD16+ у пациентов II группы был значительно ниже показателей I группы, а относительное и абсолютное содержание Т-хелперов (CD4+) сохранялось в пределах нормальных значений и превышало результаты I группы (951,9±33,9/мкл, 46,1±0,9%, p<0,05). Также получены достоверные различия по значению ИРИ, который был снижен в I группе пациентов.
У пациентов обеих групп изучен такой показатель как «сумма киллеров», который отражает цитотоксический потенциал лимфоцитов в крови. Данный показатель равен сумме относительного содержания цитотоксических лимфоцитов и натуральных киллеров и должен составлять более 45% (Симонова А.В., 2001). В I группе у 83,3% пациентов (25 человек) сумма киллеров превышала 45% в первые сутки обострения герпес-вирусной инфекции и в среднем составляла 49,2±1,8%. Во II группе только у 4,2% пациентов (3 человека) сумма киллеров имела должный уровень. Большая часть пациентов этой группы 95,8% имела достоверно более низкое содержание киллеров в среднем 32,6±1,6% (p<0,02) по сравнению с показателями I группы.
Таким образом, у пациентов с высокой частотой рецидивов менее одного года отмечено увеличение суммарного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+ и CD16+, выполняющих цитотоксическую функцию, в фазу активации герпес-вирусной инфекции. При течении генитального герпеса с высокой частотой рецидивов более одного года содержание этих клеток достоверно снижается.
В период обострения герпес-вирусной инфекции показатели интерферонового статуса у всех больных генитальным герпесом были снижены за счет индуцированной альфа- и гамма-фракции интерферона (таб. 5). Не отмечено повышения уровня сывороточного интерферона у пациентов всех групп на фоне активации герпес-вирусной инфекции. Спонтанная интерфероновая реакция лейкоцитов также не имела различий между пациентами обеих групп и не превышала значения нормы (таб. 5).
Таблица 5.
Показатели интерферонового статуса у пациентов I и II групп в фазу обострения герпес-вирусной инфекции
| Показатели | Титр ИФН в норме (ЕД/мл) | I группа (n=30) | II группа (n=72) |
| сыв ИФН, (log2) | <2 - 4 | 0,82±0,19 | 0,68±0,13 |
| спонт ИФН, (log2) | <2 | 0,18±0,08 | 0,06±0,02 |
| ИФН-альфа, (титр, Ед/мл) | 80 – 640 | 42,64±6,20* | 16,63±3,50 |
| ИФН-гамма, (титр, Ед/мл) | 32 – 128 | 18,23±3,07 | 12,11±1,52 |
* - достоверность различий между группами р<0,05
Уровень стимулированного ИФН-альфа у пациентов I группы в среднем был выше по сравнению с показателями II группы (42,64±6,20 и 16,63±3,50 Ед/мл, соответственно, p<0,05). Однако ни в одной группе эти показатели не достигали нижней границы нормы. Стимулированная выработка ИФН-гамма была снижена у пациентов II группы (12,11±1,52 Ед/мл) и менее значительно пациентов I группы (18,23±3,07 Ед/мл), что является проявлением ИФН-недостаточности у пациентов с часто рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией.
Кроме того, у 43,3% пациентов I группы и 63,9% пациентов II группы отмечалась низкая чувствительность к препаратам ИФН-альфа. Аналогично снижение чувствительности к препарату ИФН-гамма и индукторам ИФН наблюдалось у 46,6% и 66,7% пациентов I группы и 55,6% и 69,4% II группы, соответственно (различия не достоверны).
Для более подробного выяснения направленности изменений в иммунном ответе пациентов с генитальным герпесом, использовался метод оценки экспрессии генов ряда цитокинов по продукции их мРНК. Получено, что у больных по сравнению со здоровыми добровольцами, повышалась экспрессия мРНК ИФН-, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, ИЛ-18, ИЛ-4. При этом выявлено снижение синтеза мРНК ИЛ-12 у всех обследованных пациентов по сравнению со здоровыми донорами (таб.6).
Таблица 6.
Показатели экспрессии мРНК цитокинов у пациентов I и II групп в фазу обострения герпес-вирусной инфекции
| Показатели | Здоровые добровольцы (n=40) | I группа (n=30) | II группа (n=72) |
| ИФН- | 2,0% | 100% (30 чел)* | 100% (72 чел)* |
| ИФН- | 30,0% | 23,3% (7 чел) | 20,8% (15 чел) |
| ИЛ-1 | 35,0% | 60,0% (18 чел) * | 86,1% (62 чел)* # |
| ФНО- | 75, 0% | 66,7% (20 чел)# | 44,4% (32 чел)* |
| ИЛ-6 | 20,0% | 36,7% (11 чел) | 52,7% (38 чел) * # |
| ИЛ-8 | 10,0% | 90,0% (27 чел)* | 91,6% (66 чел)* |
| ИЛ-2 | 0% | 40,0% (12 чел)* # | 13,8% (10 чел)* |
| ИЛ-12 | 70,0% | 6,6% (2 чел)* | 5,5% (4 чел)* |
| ИЛ-18 | 30,0% | 100% (30 чел)* | 95,8% (69 чел)* |
| ИЛ-4 | 0% | 13,3% (4 чел) | 36,1% (26 чел)* # |
| ИЛ-10 | 20,0% | 20,0% (6 чел) | 20,8% (15 чел) |
# - достоверность различий между группами пациентов p<0,05 (2- критерий)
* - достоверность различий по сравнению со здоровыми добровольцами p<0,03 (2- критерий)
При сравнении показателей цитокинового профиля пациентов с рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекцией в начале рецидива можно наблюдать следующие закономерности (рис. 1):
- у пациентов I группы тенденция к превалированию ИФН-, ИЛ-18, ИЛ-8, ФНО-, ИЛ-1, ИЛ-2 – что указывает на активацию макрофагально-моноцитарного звена и Th1-лимфоцитов;
- у пациентов II группы тенденция к превалированию ИФН-, ИЛ-1, ИЛ-18, ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-4 – что указывает на активацию макрофагально-моноцитарного звена и Th2-лимфоцитов.
Рисунок 1. Различия в экспрессии мРНК цитокинов у пациентов I и II группы в фазу обострения герпес-вирусной инфекции
* - различия достоверны по сравнению со здоровыми добровольцами p<0,03
# - различия достоверны между группами пациентов p<0,05 (2- критерий)
При сравнении данных, полученных разными методами, отмечено, что нарушение выработки ИФН-гамма у пациентов обеих групп происходило на уровне транскрипции гена этого цитокина (отсутствие мРНК). Синтез ИФН-альфа был нарушен у данных пациентов на посттранскрипционном уровне (на этапе продукции).
В связи с выявленной недостаточностью в клеточной защите у 25 пациентов II группы была проведена оценка специфического клеточного ответа на герпес-вирусные антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, стафилококковый антиген. Выявлено, что для 68,0% пациентов характерно снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2. Отмечено, также снижение клеточного ответа на поликлональный митоген (ФГА) у 68,0% пациентов (таб. 7).
Таблица 7.
Характеристика специфического клеточного ответа на различные антигены у пациентов в фазу обострения (n=25)
| Ответ на антигены | ФГА (положитель-ный контроль) | ВПГ-1 | ВПГ-2 | St. aureus |
| Отсутствие ответа 3 | 0 | 19чел /76,0% | 17чел /68,0% | 7чел /28,0% |
| Сниженный ответ 2 | 17чел /68,0% | 3чел /12,0% | 5чел /20,0% | 8чел /32,0% |
| Нормальный ответ 1 | 8чел /32,0% | 3чел /12,0% | 3чел /12,0% | 10чел /40,0% |
1 – значения индекса подавления миграции (в %) соответствуют показателям доноров
2 – индекс подавления миграции ниже значений М-1,5 для доноров
3 – индекс подавления миграции менее 20%
Кроме того, выявлено снижение и отсутствие ответа на другие специфические антигены, в частности стафилококковый, у 60,0% пациентов, что связано с наличием сопутствующих хронических воспалительных заболеваний бактериальной этиологии в различной локализации.
В фазу ремиссии заболевания сохранялось выявленное снижение или отсутствие ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 у 68,0% и 64,0% пациентов, соответственно. При этом клеточный ответ на митоген ФГА также оставался сниженным у 56,0% пациентов, что является показателем выраженной функциональной недостаточности лейкоцитов при часто рецидивирующей генитальной герпес-вирусной инфекции.
Таким образом, снижение суммарного содержания киллерных клеток (CD8+ и CD16+), недостаточность стимулированной ИФН-реакции лейкоцитов периферической крови как в отношении ИФН-, так и в отношении ИФН-, снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2, тенденция направленности цитокинового ответа по Th2-типу являются иммунопатогенетической особенностью противовирусного ответа у пациентов с высокой частотой рецидивов более года. С учетом формирования иммунной недостаточности пациентам с генитальной герпес-вирусной инфекцией при высокой частоте рецидивов более одного года показано проведение противовирусной и иммуномодулирующей терапии.
II. Изучение эффективности иммуномодулирующей терапии
Оценку клинической эффективности терапии проводили 72 пациентам с рецидивирующим генитальным герпесом и высокой частотой рецидивов более одного года. В качестве иммунокорригирующего препарата, влияющего на синтез цитокинов, выбран отечественный препарат Анаферон, в котором активное действующее вещество представляет собой сверхмалые дозы антител к ИФН-. Экспериментальным путем показано, что действие Анаферона основано на индукции эндогенных ИФН- и ИФН-, и влиянии на экспрессию функционально сопряженных с ними цитокинов, в том числе ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 (Мартюшев-Поклад А.В. и др., 2003). Пациенты были распределены методом случайной выборки на три группы по 24 человека. 1-я группа получала монотерапию Анафероном по схеме (см. выше) в течение 21 дня. 2-я группа принимала комплексную терапию Анафероном по схеме в течение 21 дня и Ацикловиром в течение 7 дней. Пациенты 3-ей группы (контрольная) получали стандартную терапию Ацикловиром в течение 7 дней. Клиническое обследование пациентов включало регулярный осмотр мест поражения с оценкой состояния кожных покровов и слизистых. Выяснялись выраженность и продолжительность местных симптомов (зуд, болезненность, жжение, покалывание), симптомов интоксикации (температура, миалгия, головная боль, озноб, слабость).
До начала лечения выраженность местных симптомов рецидива генитального герпеса у пациентов 1 группы колебалась от 1,77 до 2,37 баллов, во 2 группе - от 1,75 до 2,58 баллов, в 3 группе – от 2,00 до 2,55 баллов (для покалывания и зуда, соответственно). На начало рецидива наиболее выражены были зуд и болезненность в области поражения у пациентов всех групп.
Купирование местных симптомов на фоне лечения наиболее эффективно происходило у пациентов 2-й группы. Достоверные изменения касались укорочения продолжительности зуда и жжения (в среднем – на 0,6 и 0,9 дня, p<0,05) при сравнении с контрольной группой, принимавшей Ацикловир. У пациентов, принимавших только Анаферон, купирование зуда, боли и покалывания в области высыпаний происходило достоверно медленнее по отношению к контрольной группе (в среднем на 1,7, 2,0 и 1,2 день, соответственно).
Важными критериями эффективности влияния лечения на течение рецидива герпес-вирусной инфекции являются время, необходимое для образования корочек и сроки полного выздоровления (полной реэпителизации). В ходе проведения сочетанной терапии Анафероном с Ацикловиром период образования корочек составил около 3,0 дней и достоверно отличался от показателей 3-й контрольной и 1-й группы (p<0,05). У пациентов, принимавших только Анаферон, период формирования корочек, как и период полной реэпителизации оказались наиболее продолжительными (таб. 8).
Таблица 8.
Сроки образования корочек и полной реэпителизации у пациентов генитальным герпесом в ходе лечения
| Параметры | 1 группа n=24 | 2 группа n=24 | 3 группа n=24 |
| Время, необходимое для образования корочек, дни (M±m) | 5,48±0,31* | 3,02±0,23#* | 3,68±0,22 |
| Время достижения полной реэпителизации, дни (M±m) | 6,78±0,32* | 5,37±0,38# | 5,50±0,32 |
# - достоверность различий между группами p<0,05
* - достоверность различий с контрольной группой (3 группа) p<0,05
При изучении периода до наступления первого рецидива получено, что пациенты, получавшие комплексную терапию, имели среднюю продолжительность ремиссии в среднем 52,1±8,1 дней (медиана периода – 43 дня), достоверно отличавшуюся от показателя в других группах пациентов. В группах пациентов, получавших монотерапию Анафероном или Ацикловиром, этот период был в 2 раза короче – 30,0±2,9 и 28,9±2,3 дней, соответственно.
В целом, клиническая эффективность в отдаленном периоде наблюдения у пациентов, получавших комбинированную терапию, отмечена в 70,8% случаев, включая как увеличение периода ремиссии, так и уменьшение тяжести последующих обострений. В контрольной группе и группе с монотерапией Анафероном клиническая эффективность составила 8,3% и 16,7%, соответственно (таб. 9).
Таблица 9.
Результаты клинической эффективности проводимой терапии в отдаленном периоде в обследуемых группах
| Параметры эффективности | 1 группа n=24 | 2 группа n=24 | 3 группа n=24 |
| Увеличение периода ремиссии (в 2 и более раза) | 4,2% (1 чел) | 45,8% (11 чел)* | 8,3% (2 чел) |
| Уменьшение тяжести последующих рецидивов | 12,5% (3 чел) | 58,3% (14 чел)* | 0 |
| Отсутствие эффекта | 83,3% (21 чел) | 29,2% (7 чел) | 91,7% (22 чел) |
* - достоверность различий с контрольной группой (3 группа) p<0,05
Достоверного изменения показателей субпопуляций лимфоцитов и уровня иммуноглобулинов A, M, G на фоне лечения выявлено не было во всех группах пациентов. Изучение показателей расширенного интерферонового статуса в динамике показало, что в результате лечения показатели сывороточного ИФН, как и спонтанная интерфероновая реакция лейкоцитов не изменились и сохранялись в норме почти у всех пациентов, получавших терапию.
Показатели синтеза ИФН-альфа лейкоцитами крови в ответ на стимуляцию ВБН на фоне лечения имели сходный характер изменений во всех группах. Так, к 8-м суткам этот показатель имел тенденцию к снижению, а к 21-м суткам увеличивался, наиболее значимо в группе пациентов, получавших терапию Ацикловиром и Анафероном.
Рисунок 2. Динамика уровня индуцированной продукции ИФН-альфа и гамма на фоне лечения
Выработка ИФН-гамма лейкоцитами периферической крови в ответ на стимуляцию ФГА на 8-е сутки лечения в среднем по группам незначительно изменялась, оставаясь меньше показателей здоровых добровольцев. К моменту окончания курса лечения уровень выработки ИФН-гамма у пациентов, получавших комбинированную терапию, имел тенденцию к восстановлению (среднее значение по группе 25,7±1,9 МЕ/мл). В группе пациентов, получавших монотерапию Анафероном, способность лейкоцитов к продукции ИФН-гамма имела тенденцию к снижению среднего по группе показателя на 8-е и 21-е сутки лечения (рис.2).
Исследование влияния терапии на параметры интерферонового статуса показало различную эффективность восстановления продукции ИФН в зависимости от исходных показателей. Выявлено, что у 66,7% пациентов 2-й группы наиболее выражено восстановление продукции ИФН-гамма происходило при исходно незначительно сниженной выработке – исходный титр 16-32 МЕ/мл (в среднем 14,7±1,2 МЕ/мл). При более существенном исходном нарушении синтеза ИФН-гамма (титр 2-8 МЕ/мл, среднее значение 8,8±1,4 МЕ/мл) получено отсутствие эффекта (рис. 3).
Рисунок 3. Динамика показателей продукции ИФН-гамма на фоне лечения в зависимости от исходных показателей у пациентов 2- и 3-й групп
* - достоверность изменений до и после лечения p<0,05
В контрольной группе не наблюдалось восстановления способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма на фоне терапии при любом исходном уровне выработки. Поэтому максимальную эффективность комбинированной терапии Анафероном и Ацикловиром следует ожидать при ее назначении пациентам с исходно незначительно сниженным уровнем продукции ИФН-гамма (титр 16-32 МЕ/мл).
Кроме того, при проведении лечения Анафероном отмечено достоверное повышение чувствительности к препаратам ИФН- у 50,0% и препаратам ИФН- у 41,6% пациентов 2-й группы.
Таким образом, отсутствие клинического эффекта наблюдалось у больных при совокупном изменении следующих параметров: повышение циркулирующего и спонтанно вырабатываемого ИФН, снижение или отсутствие восстановления способности лейкоцитов к продукции ИФН-, ИФН-. И наоборот, нормализация большинства параметров ИФН статуса соответствовала хорошему или удовлетворительному клиническому эффекту.
Изучение цитокинового профиля обследованных больных в процессе лечения показало, что сохранялась активность мРНК ИФН- и ИЛ-18 во всех группах обследованных пациентов. Наиболее значимые изменения по группам касались активности мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-10. В группе, получавшей комбинированную терапию Анафероном и Ацикловиром, активность мРНК ИФН-гамма достоверно увеличивалась к 8-м суткам лечения и сохранялась на значимом уровне к окончанию лечения. В остальных двух группах отмечалось снижение этого показателя (рис. 4).
Рисунок 4. Динамика экспрессии мРНК ИФН-гамма и ИЛ-2 на фоне лечения
* - достоверность изменений до и после лечения p<0,05
Аналогичные изменения касались синтеза мРНК ИЛ-2 - повышение синтеза мРНК ИЛ-2 к моменту завершения лечения в группе с комбинированной терапией и снижение этого параметра в остальных группах.
Продукция мРНК ИЛ-12, одного из важных противовирусных цитокинов, была снижена во всех группах и имела тенденцию к повышению только у пациентов, получавших лечения Ацикловиром и Анафероном. При этом уровень синтеза мРНК ИЛ-10 в этой группе практически не изменился во время лечения. В двух других группах активность мРНК ИЛ-10 достоверно повышалась (рис. 5).
Рисунок 5.Динамика экспрессии мРНК ИЛ-12 и ИЛ-10 на фоне лечения
* - достоверность изменений до и после лечения p<0,05
Снижение синтеза мРНК ИФН-, ИЛ-2 и повышение активности мРНК ИЛ-10 на фоне лечения свидетельствуют о сохранении нарушений в клеточном звене и активации гуморального ответа у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией.
Среди пациентов, получавших комбинированную терапию Анафероном и Ацикловиром, отмечена экспрессия мРНК ИФН-гамма на 8-е и/или 21-е сутки лечения у 17 человек (66,7%). Нами были изучены изменения цитокинового профиля на фоне лечения у пациентов с положительной выработкой мРНК ИФН-гамма. Для сравнения выбраны 26 человек (из 1 и 3 групп, получавших лечения Анафероном или Ацикловиром) с отсутствием экспрессии мРНК ИФН-гамма на фоне лечения.
В случае отсутствия активности мРНК ИФН-гамма цитокиновый ответ к 8-м суткам лечения развивался с увеличением синтеза мРНК ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, на 21-е сутки также сохранялась активация Th-2-ответа на герпес-вирусную инфекцию. У пациентов с положительной экспрессией мРНК ИФН-гамма возникшая парадоксальная активация гуморального ответа на 8-е сутки переключается к 21-м суткам на Th-1 ответ (рис. 6).
Рисунок 6. Динамика экспрессии мРНК цитокинов у пациентов с наличием (+) и отсутствием (-) синтеза мРНК ИФН-гамма на фоне лечения
* - достоверность изменений до и после лечения p<0,05
Проведенные исследования изменений цитокинового профиля пациентов с генитальным герпесом в зависимости от клинического эффекта показали, что в результате лечения положительный эффект (ускорение процесса заживления, быстрое купирование местных симптомов, удлинение периода ремиссии) наблюдался при закономерностях, представленных в таблице 10. Снижению активности герпес-вирусной инфекции сопутствовала тенденция к увеличению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, нормализация синтеза мРНК ИЛ-8, ФНО-, ИЛ-4 и ИЛ-10. Сохранение повышенной активности мРНК ИЛ-1, ИЛ-6 у данных пациентов свидетельствовало о хроническом течении заболевания с частыми обострениями. При отрицательном клиническом эффекте отмечалась тенденция к снижению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-, повышение синтеза мРНК ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-4 и ИЛ-10 и сохранение повышенного уровня синтеза мРНК ИЛ-8.
Таблица 10.
Эффективность терапии пациентов с генитальным герпесом в зависимости от изменений показателей цитокинового статуса
| Показатели | Положительный клинический эффект | Отрицательный клинический эффект | ||
| До лечения | После лечения | До лечения | После лечения | |
| мРНК ИФН- | / | |||
| мРНК ИЛ-2 | ||||
| мРНК ИЛ-12 | ||||
| мРНК ФНО- | ||||
| мРНК ИЛ-1 | не изм. | |||
| мРНК ИЛ-6 | / | |||
| мРНК ИЛ-8 | не изм | |||
| мРНК ИЛ-4 | незначит. | /не изм | ||
| мРНК ИЛ-10 | ||||
- повышение синтеза мРНК - уровень синтеза в норме (здоровые добровольцы)
- снижение синтеза мРНК не изм. – нет изменений в синтезе мРНК
Таким образом, изучение показателей цитокинового профиля у пациентов с генитальным герпесом может являться информативным методом оценки эффективности проводимой терапии.
ВЫВОДЫ
- У 83,3% пациентов с высокой частотой рецидивов генитального герпеса менее одного года отмечалось адекватное повышение суммарного уровня киллерных клеток с фенотипом CD8+ и CD16+ до 49,2%. При высокой частоте рецидивов более одного года суммарное содержание киллеров было снижено и составило 32,6%.
- В фазу обострения генитального герпеса при высокой частоте рецидивов более одного года выявлено снижение или отсутствие специфического клеточного ответа на антигены ВПГ-1 и ВПГ-2 в 88,0% случаев. В фазу ремиссии заболевания нормализация клеточного ответа на антигены ВПГ-1 отмечена у 20,0% и ВПГ-2 у 24,0% пациентов.
- У пациентов с высокой частотой рецидивов генитального герпеса менее одного года выявлен цитокиновый ответ с тенденцией к активации макрофагально-моноцитарного звена и Th1-пути. Пациенты с высокой частотой рецидивов более одного года имеют тенденцию к цитокиновому ответу по Th2-пути.
- Проведение комплексной терапии Анафероном и Ацикловиром пациентам с высокой частотой рецидивов более одного года приводило к нормализации продукции ИФН-гамма в 66,7% случаев и чувствительности к препаратам ИФН-гамма в 50,0%, увеличению активности мРНК ИФН-гамма в 70,8%, ИЛ-12 в 12,5% и ИЛ-2 в 41,7%, что сопровождалось положительным клиническим эффектом (увеличением периода ремиссии, снижением тяжести рецидивов генитального герпеса).
- Усиление экспрессии мРНК ИФН-гамма у 70,8% пациентов на фоне комплексной терапии способствовало переключению цитокинового ответа по Th-1 пути. Отсутствие синтеза мРНК ИФН-гамма у пациентов контрольной группы или при монотерапии Анафероном сопровождалось развитием цитокинового ответа по Th-2 пути.
- У пациентов с высокой частотой рецидивов более одного года выявлена корреляционная взаимосвязь между положительным клиническим эффектом лечения Анафероном и Ацикловиром и цитокиновым ответом с тенденцией к увеличению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12. Отрицательный клинический эффект коррелировал с цитокиновым ответом по Th-2 типу с тенденцией к снижению экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12, повышению синтеза мРНК ИЛ-10.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- В связи с формированием иммунной недостаточности пациентам с высокой частотой рецидивов (>10 раз в год) генитальной герпес-вирусной инфекции более одного года необходимо проведение комбинированной противовирусной и иммуномодулирующей терапии.
- Комплексная терапия, включающая Анаферон и ациклический нуклеозид, показана для применения у пациентов с высокой частотой рецидивов генитальной герпес-вирусной инфекции и незначительным нарушением способности лейкоцитов к продукции ИФН-гамма.
- Исследование показателей цитокинового профиля методом определения экспрессии мРНК ИФН-гамма, ИЛ-2, ИЛ-12 и ИЛ-10 у пациентов с рецидивирующим генитальным герпесом является информативным тестом оценки эффективности проводимой иммунокорригирующей терапии.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
- Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Галавит в терапии хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции». Новые лекарства, 2003, № 3, с 23-27.
- Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Галавит в комплексной терапии больных с хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией». Materia Medica, 2003, №4, с. 94-102.
- Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Эффективность препарата Анаферон у больных с хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекцией», Материалы XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2005, с. 724.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Продукция интерферонов и цитокинов при рецидивирующем генитальном герпесе». Материалы научно – практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Курск, 2006, с. 167-168.
- Зуйкова И.Н. «Хроническая рецидивирующая герпес-вирусная инфекция – иммунологическое понимание проблемы» материалы к конференции «Герпес-вирусные инфекции в практике врачей акушеров-гинекологов, дерматовенерологов и неврологов», Москва, 2006, с. 33-40.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Психосоциальные аспекты генитальной герпес-вирусной инфекции». Российский журнал кожных и венерических болезней, 2007, N 1. - Прил. Герпес: с. 13-18.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е., Смольников А.В. «Эффективность применения препарата Фамвир в лечении хронической герпес-вирусной инфекции». Клиническая дерматология и венерология, 2007, №1, с. 39-45.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Новые возможности этиотропного лечения больных с высокой частотой рецидивирующего генитального герпеса». Российский журнал кожных и венерических болезней. 2007, N 3. - Прил. Герпес: с. 24-29.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Дифференциальная диагностика атипичной формы генитальной герпес-вирусной инфекции с аллергодерматозами и подходы к терапии». Российский аллергологический журнал, 2007, № 1, с. 20-29.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Особенности клеточного и цитокинового ответа при генитальной герпес-вирусной инфекции с высокой частотой рецидивов». Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с.293.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Новые подходы к применению индукторов интерферона у пациентов с генитальной герпес-вирусной инфекцией». Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с.294.
- Чирвон Е.А., Зуйкова И.Н., Муругин В.В., Симонова А.В., Шульженко А.Е., Пинегин Б.В. «Герпес-вирусная инфекция – оценка иммунного ответа на антигены HSVI, HSVII». Материалы VIII Конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 2007, Москва, с.305.
- Шульженко А.Е., Зуйкова И.Н. «Современные подходы к диагностике и лечению герпес-вирусных инфекций». Лечащий врач, 2007, №5, с.52-55.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Цитокиновый профиль у пациентов с генитальной формой хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции на фоне терапии Анафероном». Материалы VI международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств», 2007, Москва, с. 63.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Эффективность применения препарата Анаферон в комплексной терапии генитального герпеса». Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2007, № 7, с. 144-149.
- Зуйкова И.Н., Шульженко А.Е. «Клинико-иммунологические особенности течения генитальной формы хронической рецидивирующей герпес-вирусной инфекции на фоне терапии Анафероном». Материалы II Национального конгресса терапевтов, 2007, Москва, с. 129.
