WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Флуоресцентные методы исследования опухолей век и конъюнктивы на основе эндогенных и экзогенных флуорофоров

На правах рукописи

Осипова Екатерина Александровна

Флуоресцентные методы исследования опухолей век и конъюнктивы на основе эндогенных и экзогенных флуорофоров

14.00.08 глазные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

2009

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН

Научный руководитель: член корр. РАМН, профессор

доктор медицинских наук Аветисов Сергей Эдуардович

Официальные оппоненты:

профессор, доктор медицинских наук Луцевич Екатерина Эммануиловна (Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова);

доктор медицинских наук Давыдов Дмитрий Викторович

(НИИ глазных болезней РАМН).

Ведущая организация: ФГУ МНТК «Микрохирургии глаза»

им. академика С.Н. Федорова.

Защита состоится «14» сентября 2009 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.040.01 при НИИ глазных болезней РАМН по адресу: 119021, г. Москва, ул. Россолимо, д.11А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ глазных болезней РАМН.

Автореферат разослан «____»________200 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Макашова Н.В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Ежегодная заболеваемость опухолями органа зрения составляет 100-120 на 1 млн. населения. Среди первичных опухолей первое место по частоте занимают опухоли придаточного аппарата глаза (от 8.7 до 15 человек на 100 тыс. населения) (Бровкина А. Ф. 2002). В связи с широким распространением опухолей придаточного аппарата глаза актуальным остается вопрос ранней и точной диагностики новообразований указанной локализации.

Диагностика новообразований кожи век и конъюнктивы базируется, в основном, на клинической картине и морфологическом исследовании. Гистологическое исследование краев раны после хирургического удаления базально-клеточного рака у 1039 больных показало, что при узловой и поверхностной формах наблюдалось отсутствие опухолевых клеток по краю разреза соответственно у 93.6 и 96.4% больных. При инфильтративной и мультицентричная формах эти показатели составили соответственно 18.6 и 33.3% (Sexton M. 1990).

В последние годы предпринимаются активные попытки создания неинвазивных оптических методов диагностики злокачественных опухолей, позволяющих, не травмируя объект исследования, получить о нем необходимую достоверную информацию (Bigio I. J. 1997, Wagnieres G. 1998, Hewett J. 2000, Scott M. A. 2000). Флуоресцентная диагностика (ФД) является наиболее перспективной и высоко чувствительной технологией обнаружения опухолей, локализующихся в поверхностных слоях кожи и слизистых оболочках (S. Andersson-Engels 1992). Методика основана на обнаружении эндогенных люминофоров, таких как коллаген, никотинамид аденин динуклеатид, составляющих основную часть спектра аутофлуоросценции в сине-зеленом диапазоне (Chwirot B. W. 1998, Hewett J. 2000), а также порфиринов и экзогенных фотосенсибилизаторов.

В настоящее время разработаны новые методы оптической диагностики, успешно применяемые при опухолях различной локализации: кожи, слизистых оболочек полости рта, пищевода, бронхов, мочевого пузыря и других органов. В литературе есть единичные описания применения этих методов диагностики при опухолях кожи век и конъюнктивы. Вместе с тем не выделены четкие диагностические критерии, не обоснованы основные принципы дифференциальной диагностики.

Цель исследования.

Изучить возможности использования эндогенных и экзогенных флуорофоров в исследовании опухолей век и конъюнктивы и выработать оптимальный подход к дифференциальной диагностике и определению границ доброкачественных и злокачественных опухолей указанной локализации с использованием флуоресцентных методов анализа.

Задачи исследования.

1. Отработать методику флуоресцентной спектроскопии и получения флуоресцентных изображений опухолей век и конъюнктивы.

2. Оценить роль спектроскопического исследования 5-АЛК индуцированной флуоресценции протопорфирина IX и флуоресценции экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенс» в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных опухолей век и конъюнктивы.

3. Разработать собственный подход к дифференциальной диагностике и объективному определению границ доброкачественных и злокачественных опухолей век и конъюнктивы на основе флуоресцентных методов исследования без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, усиливающих аутофлуоресценцию.

4. Сопоставить результаты флуоресцентных методов исследования опухолей век и конъюнктивы с использованием различных флуорофоров с клиническими диагнозами и гистологическими заключениями.

5. Разработать и внедрить в клиническую работу практические рекомендации по проведения флуоресцентных методов исследования опухолей век и конъюнктивы.

Научная новизна.

Впервые, с помощью спектроскопии изучены особенности 5- АЛК индуцированной флуоресценции и флуоресценции фотосенсибилизатора «Фотосенс» в коже век и конъюнктиве, а также новообразованиях, локализующихся в этих тканях.

Разработан подход к флуоресцентному исследованию опухолей век и конъюнктивы, основанный на колориметрическом анализе аутофлуоресцентных изображений опухоли. Доказана эффективность его использования в дифференциальной диагностике и определении флуоресцентных границ доброкачественных и злокачественных опухолей век и конъюнктивы.

Практическая значимость работы.

В результате научного исследования разработана диагностическая методика, основанная на определении концентрации эндогенных люминофоров в ткани опухоли. Стал доступен подсчет интенсивности флуоресценции эндогенного протопорфирина IX без использования препаратов 5-аминолевулиновой кислоты, усиливающих его флуоресценцию; а также, возможность визуализации распределения эндогенного ПП IX в опухоли и в окружающих ее тканях. Разработаны и запатентованы устройство для получения аутофлуоресцентных изображений и программное обеспечение для их обработки, позволяющее реализовать методику на доступной аппаратуре.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Флуоресцентные методы исследования являются надежным, безопасным неинвазивным методом диффенциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей век и конъюнктивы.

2. Анализ аутофлуоресцентных изображений новообразований век и конъюнктивы позволяет проводить дифференциальную диагностику опухолей указанной локализации и определять их флуоресцентные границы без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, индуцирующих аутофлуоресценцию.

Основные положения работы доложены на:

1. Конференции молодых ученых «Клинические исследования в офтальмологии» г. Москва, Россия, 24 апреля 2006

2. Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» г. Москва, Россия, 24-26 марта 2007 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 2 в печатных изданиях, рецензируемых ВАК. Приоритетность исследований подтверждена одним патентом на изобретение, одним патентом на полезную модель, получено одно положительное решение на выдачу патента.

Внедрение результатов работы в практику.

Разработанные практические рекомендации внедрены в научно-клиническую практику НИИ глазных болезней РАМН и учитываются при проведении флуоресцентных исследований у пациентов с опухолями век и конъюнктивы. На базе НИИ глазных болезней РАМН продолжаются клинические испытания эффективности флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии новообразований кожи век и конъюнктивы с препаратами «Аласенс» и «Фотосенс».

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, описания материалов и методов исследований, 3 глав, отражающих результаты собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 50 отечественных и 119 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 28 рисунками, 13 графиками, 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа основана на анализе результатов клинического исследования флуоресцентных методов диагностики опухолей век и конъюнктивы.

Исследование проводилось в трех группах пациентов (всего 128 пациентов в возрасте от 18 до 83 лет (56±16.4). В I группу были включены 30 пациентов, у которых флуоресцентное исследование опухолей проводилось методом локальной лазерной спектроскопии флуоресценции экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенс». Распределение пациентов по гистогенезу опухолей представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение пациентов по гистогенезу опухоли в I группе.

Вид опухоли Количество пациентов
Абс. число %
Доброкачественные Эпителиальные 3 10.0
Из пигментных клеток 6 20.0
Из мягких тканей 1 3.3
Предраковые Эпителиальные 4 13.3
Злокачественные Эпителиальные 14 46.7
Опухоли кроветворной ткани 2 6.7

Во II группу были включены 53 пациента с опухолями век и конъюнктивы, у которых флуоресцентное исследование опухолей проводилось методом локальной лазерной спектроскопии флуоресценции эндогенного протопорфирина IX, индуцированного приемом препарата «Аласенс» (5-аминолевулиновой кислоты гидрохлорид) Распределение пациентов по гистогенезу опухоли представлено в таблице 2.

Таблица 2.

Распределение пациентов по гистогенезу опухоли во II группе.

Вид опухоли Количество пациентов
Абс. число %
Доброкачественные Эпителиальные 6 11.3
Из пигментных клеток 12 22.6
Из придатков кожи 3 5.7
Из мягких тканей 3 5.7
Предраковые Эпителиальные 6 11.3
Из пигментных клеток 5 9.4
Злокачественные Эпителиальные 13 24.5
Из пигментных клеток 3 5.7
Опухоли кроветворной ткани 2 3.8

В III группу были включены 48 пациентов, у которых флуоресцентное исследование опухолей проводилось оригинальным методом анализа аутофлуоресцентных изображений, полученных без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, усиливающих аутофлуоресценцию. Распределение пациентов по гистогенезу опухоли представлено в таблице 3.

Таблица 3.

Распределение пациентов по гистогенезу опухоли в III группе.

Вид опухоли Количество пациентов
Абс. число %
Доброкачественные Эпителиальные 5 10.4
Из пигментных клеток 11 22.9
Из придатков кожи 2 4.2
Из мягких тканей 2 4.2
Предраковые Эпителиальные 4 8.3
Из пигментных клеток 3 6.2
Злокачественные Эпителиальные 16 33.3
Из пигментных клеток 3 6.2
Опухоли кроветворной ткани 2 4.2

Учитывая возможность реализации методик флуоресцентного исследования опухолей на основе аутофлуоресценции и 5-АЛК индуцированной флуоресценции протопорфирина IX одновременно у одного пациента без влияния на результаты исследования, 35 пациентов были включены во II и III группы.

Методы обследования.

Во всех группах пациентов клиническая диагностика производилась с помощью биомикроскопии опухоли на щелевой лампе. Для документации во всех случаях осуществлялась фоторегистрация новообразований цифровой фотокамерой. Во всех случаях проводили хирургическое удаление или биопсию опухоли. Гистологическое исследование материала производилось на базе лаборатории патогистологии глаза НИИ глазных болезней РАМН (руководитель к.м.н. Г.Г. Зиангирова) и Отдела патологической анатомии опухолей человека Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина (руководитель профессор д.м.н. Н.Н. Петровичев).

Спектроскопическое исследование флуоресценции проводили с использованием лазерной электронно-спектральной установки ЛЭСА-01-«Биоспек» ГОСТ Р 50460-92 (Регистрационное удостоверение МЗ РФ №29/05020400/0617-00 от 27.07.2000). Для возбуждения флуоресценции применяли гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм и мощностью 25 мВт. Анализ полученных спектров проводили с помощью компьютерной программы LESA-Soft 9. Оценивали следующие показатели флуоресценции:

- фоновую флуоресценцию здоровых тканей глаза (кожи век и конъюнктивы)

- интенсивность флуоресценции опухоли,

- индекс контрастности флуоресценции в ткани опухоли, равный отношению интенсивности флуоресценции в ткани опухоли кожи век или конъюнктивы к интенсивности флуоресценции непораженной кожи век или конъюнктивы.

- динамика прироста флуоресценции в ткани опухоли.

Методом спектрометрии исследовали флуоресценцию в опухоли экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенс» и индуцированную приемом препарата 5-аминолевулиной кислоты «Аласенс» флуоресценцию эндогенного протопорфирина IX.

Препарат «Фотосенс» представляет собой раствор смеси натриевых солей сульфированного фталоцианина алюминия (от ди- до тетразамещенного) в дистиллированной воде. Доза введения препарата 0.2 мг/кг массы тела. Каждые сутки, в течение первой недели после введения препарата, спектроскопически определяли интенсивность его флуоресценции в коже век, конъюнктиве и в ткани опухоли. Затем, спектроскопию проводили на 10, 14, 20 и 30 день.

Введение препарата «Фотосенс» производилось с целью проведения курса фотодинамической терапии опухолей в рамках проспективного контролируемого открытого исследования эффективности фотодинамической терапии препаратом «Фотосенс» онкологических заболеваний глаз согласно протоколу № ОФТ-4 ОНК-ФС-2003. Клинические исследования проводили с разрешения Комитета по этике при Федеральном органе контроля качества и Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Для индукции флуоресценции эндогенного протопорфирина IX использовали препарат «Аласенс». Аласенс представляет собой стандартную субстанцию 5-аминолевулиновой кислоты, производства ФГУП « ГНЦ НИОПИК» (Рег. № 000148/01-2000 от 09.12.2000). Препарат давали перорально из расчета 15 мг/кг веса больного, растворяя его в обычной воде. Через каждый час после введения «Аласенса» в течение 3 часов проводили спектроскопию.

Введение препарата «Аласенс» производилось в рамках клинического испытания эффективности флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии с препаратом «Аласенс», проведение которого было разрешено Локальным комитетом по биомедицинской этике Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ глазных болезней РАМН (протокол №4 от 10.04.2008).

В процессе проведения работы был разработан оригинальный подход к флуоресцентному исследованию опухолей век и конъюнктивы на основе анализа аутофлуоресцентных изображений опухоли, полученных без использования экзогенных фотосенсибилизаторов и препаратов, усиливающих аутофлуоресценцию. Для реализации этого подхода было разработано устройство для получения флуоресцентных изображений (Патент № 64783 от 10.07.07.) и программное обеспечение для их обработки (CancerPlot, регистрационный № 4859). Аутофлуоресцентные изображения новообразований получали путем фотографирования зоны интереса цифровой фотокамерой с цветной (RGB) матрицей при возбуждении флуоресценции светом с длиной волн 390-433 нм. После обработки цифрового изображения флуоресценции опухоли вычисляли превышение аутофлуоресценции протопорфирина IX по формуле:

Rdiff=((Rtum – Rnorm)/ Rnorm )*100%, где

Rdiff -коэффициент колориметрического отхода по красному каналу, Rtum - доля участия красного канала в изображении опухоли, Rnorm - доля участия красного канала в изображении здоровой кожи век или конъюнктивы.

Оценка результатов исследования производилась путем сопоставления результатов спектроскопии и анализа аутофлуоресцентных изображений опухоли с данными гистологического исследования удаленного новообразования или биопсии. При этом определялись чувствительность и специфичность методик. Для статистической обработки результатов исследований проводили расчеты среднего арифметического, среднего квадратического отклонения, средней ошибки средней арифметической величины, медианы и квартилей (для ассиметрично распределенных массивов данных), критерия достоверности и коэффициента корреляции массивов двух величин. Расчет производился с помощью персонального компьютера.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Результаты флуоресцентного исследования опухолей век и конъюнктивы с использованием метода локальной лазерной спектроскопии флуоресценции экзогенного фотосенсибилизатора «Фотосенс».

Сопоставление графических кривых, демонстрирующих кинетику выгорания «Фотосенса», введенного в дозе 0.2 мг/кг массы тела, в различные сроки проведения спектроскопии, наглядно показывало скорость выгорания фотосенсибилизатора из кожи век и конъюнктивы. Максимальная концентрация препарата наблюдалась через сутки после его введения, характеризовалась высокой дисперсией значений в пределах одной ткани и составила 184.8±103.1 ед. для конъюнктивы свода, 137,5±65.0 ед. для кожи век и 78,3±44.9 ед. для бульбарной конъюнктивы. В последующем, в течение месяца наблюдалось постепенное снижение уровня флуоресценции. Бульбарная конъюнктива характеризовалась большей скоростью выгорания ФС на фоне низких значений интенсивности его флуоресценции. К 20-м суткам в анализируемых тканях отмечалось снижение интенсивности флуоресценции препарата ниже значения средней терапевтической концентрации С2, равной 4,0 х 10-4 мг/мл, а, следовательно, и уменьшался риск развития фототоксических реакций. Тем не менее, необходимость тщательного соблюдения охранного светового режима сохранялась в течение первого месяца с момента введения препарата. Таким образом, введение препарата «Фотосенс» в дозе 0.2 мг/кг массы тела на протяжении 20 дней обеспечивает высокую концентрацию фотосенсибилизатора «Фотосенс» в коже век и конъюнктиве, превышающую значения средней терапевтической концентрации.

Анализ спектроскопических показателей флуоресцентного исследования базально-клеточного рака показал, что максимальная интенсивность флуоресценции Фотосенса в опухоли наблюдается через сутки после введения препарата. Благодаря меньшей скорости выгорания ФС из ткани БКР, по сравнению с кожей век, к 3 суткам с момента введения препарата достигается высокий флуоресцентный контраст опухоли. Так, если через сутки после введения



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.