Клинико-иммунологические особенности хронического вирусного гепатита с при hcv-моноинфекции и hcv-hiv-коинфекции
На правах рукописи
Романенко Олег Михайлович
КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С
ПРИ HCV-МОНОИНФЕКЦИИ И HCV-HIV-КОИНФЕКЦИИ
14.00.10 – инфекционные болезни
14.00.14 – патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Казань - 2005
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Казанская медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Научные руководители: доктор медицинских наук,
профессор Диляра Кабировна Баширова
доктор медицинских наук,
профессор Анатолий Павлович Цибулькин
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
профессор Диляра Шакировна Еналеева
доктор медицинских наук,
профессор Рустэм Салахович Фассахов
Ведущая организация: Санкт-Петербургская военно-медицинская академия.
Защита состоится «___»______________2005 г. в_____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.034.01 Государственного образовательного учреждения высшего образования «Казанский государственный университет академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49).
С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке ГОУ ВПО «Казанская медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 420012, г.Казань, ул. Бутлерова, 49).
Автореферат разослан «___»_________________2005 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор В.Х. Фазылов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние 10 лет HCV-инфекция становится ведущей среди всех вирусных гепатитов в виду высокой частоты хронизации, возможных исходов в цирроз и гепатоцеллюлярную карциному (Ивашкин В.Т., 1997; Сологуб Т.В., 1997; Соринсон С.Н., 1998; Блохина Н.П., 2002; Еналеева Д.Ш., Фазылов В.Х., Созинов А.С., 2003 и др.).
По данным многочисленных авторов частота инфицированности HCV-инфекцией превышает 3% населения планеты, представляет собой вирусную пандемию и 4-5 раз превышает число инфицированных вирусом HIV (Бобкова М.Р., 2002; Lavanchy D., Memahon B., 2000; Rondot-Thoraval F., 2000). Хотя пути трансмиссии обоих вирусов одинаковы, процент одновременного инфицирования вирусами HCV и HIV колеблется значительно от 15 до 90% в зависимости от пути инфицирования. Наиболее высокие проценты коинфицирования регистрируются при парентеральном пути заражения у потребителей инъекционных наркотиков (Шахгильдян И.В., 2003; Кравченко А.В., 2003; Покровский В.В., 2004).
Клинический спектр вирусного гепатита С гетерогенный, часто включает асимптомные и субклинические формы болезни. Однако, при наличии неблагоприятных кофакторов в виде ВИЧ инфекции, течение болезни может приобретать более агрессивный характер. Установлено, что коинфицирование вирусами HCV и HIV в значительной степени утяжеляет течение вирусного гепатита С и ускоряет процессы фиброзирования печени и развития цирроза (AlloryY., 2000; Winnock. M., 2004; Soto B., Sanchez-Quijano A., Rodrigo L. et al., 1997; Soriano V., 2002; Gregory Dore, Joe Sasadeusz, 2005).
Влияние HCV на течение ВИЧ-инфекции до настоящего времени является дискутабельным (Кравченко А.В., 2002).Отдельные авторы полагают, что наличие хронического гепатита С не отражается отрицательно на течении ВИЧ-инфекции (Zilberberg H., Stanislas Pol, Valerie Thiers et al., 2000). Вместе с тем большинство исследователей считают, что частота развития СПИДа и летального исхода, обусловленного так называемыми «СПИД-индикаторными» заболеваниями, существенно выше у лиц со смешанной инфекцией (Hayashi N., Mita E., 1999; Piroth L., Duong M., Qnantin C. et al., 1998; Маурицио Боначини, 2004). Более того, у больных смешанной инфекцией увеличение числа CD4-лимфоцитов после начала высокоактивной антиретровирусной терапии менее значимо, чем у пациентов только с ВИЧ-инфекцией (Greub G., Lebergerber B., Battegay M. et al., 2000). Вирусные гепатиты также влияют на течение ВИЧ-инфекции, приводя в частности, к уменьшению количества Т-хелперов/ индукторов (Кожевникова Г.М., Ющук Н.Д., 1998; Ивашкин В.Т., Маммаев С.Н., Лукина Е.А. и др., 2001). Иммуносупрессия, связанная с ВИЧ-инфекцией не может не сказываться на течение и клинические проявления HCV-инфекции. Точно также состояние печени не может не отражаться на функциональных показателях иммунитета и эффективности лечения ВИЧ-инфекции (Бобкова М.Р., 2002; Волчкова Е.В., 2004).
Многими учеными доказано, что в формировании различных вариантов течения и исходов НCV инфекции важная роль принадлежит состоянию иммунной системы пациента. Однако до настоящего времени нет единого мнения о механизмах специфического иммунного ответа не только при коинфекции, но и моноинфекции HCV. Следует отметить, что существуют некоторые противоречия в вопросах, связанных с корреляцией спектра антител и определением стадии или прогноза заболевания.
Выше изложенное послужило основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования - выявление клинико-биохимических и иммунологических особенностей течения хронического вирусного гепатита С при HCV- моно- и HCV-HIV-коинфекции.
Задачи исследования:
- Оценить клинико-биохимические особенности течения хронического вирусного гепатита С при HCV- моно и HCV-HIV-коинфекции.
- Изучить диагностическую значимость анти-HCV антител различной специфичности IgM и IgG классов в динамике при HCV-моно и HCV-HIV- коинфекции у больных хроническим вирусным гепатитом С
- Проанализировать значимость использования количественных показателей спектра анти-HCV IgG как циркулирующих в свободном, так и в связанном (в форме циркулирующих иммунных комплексов) виде для диагностики и оценки состояния гуморального иммунитета больных хроническим вирусным гепатитом С.
Научная новизна. Впервые на основе расширенного спектра методов определения специфических анти-HCV IgM и IgG антител даны сравнительные характеристики клинико-биохимических и иммунологических показателей в периоды обострения и ремиссии у больных хроническим вирусным гепатитом С.
Доказана возможность у больных хроническим вирусным гепатитом С при HCV-HIV коинфицировании формирования ремиссии процесса только на основании клинико-биохимических показателей, при сохранении иммунологической активности.
Впервые использована модификация метода иммуноблотинга для количественной оценки уровня специфических анти-HCV IgM и IgG антител как в свободном виде, так и в виде специфических циркулирующих иммунных комплексов.
На основании современных иммунологических методик охарактеризовано состояние гуморального иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С в динамике заболевания. Доказано длительное сохранение функционального полноценного гуморального иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом С при моноинфицировании.
Впервые даны качественные и количественные характеристики состояния гуморального иммунитета к различным антигенам вируса гепатита С при HIV-формируемом иммунодефиците.
Практическая значимость. Апробированы и внедрены комплексные клинико-биохимические и иммунологические методики оценки фаз обострения и ремиссии у больных хроническим вирусным гепатитом С при HCV-моно- и HCV-HIV-коинфицировании.
Модифицированы и рекомендованы к практическому применению методы количественной оценки уровня специфических анти-HCV антител на основе использования иммуноблоттинга третьего поколения.
Оценены иммуногенность (способность к выработке специфических антител) и антигенность (способность взаимодействовать со специфическими антителами с формированием циркулирующих иммунных комплексов) основных структурных и неструктурных антигенов вируса гепатита С.
Доказаны высокие иммуногенные и антигенные потенции у core- и NS3 антигенов вируса гепатита С.
Доказана возможность ошибочной оценки в диагностике фаз обострения на фоне иммунодефицита у больных хроническим вирусным гепатитом С при HCV-HIV-коинфицировании.
Положения, выносимые на защиту:
1. Клинико-лабораторные сдвиги при хроническом вирусном гепатите С в периоды обострений однотипны в группах HCV-моно и HCV-HIV-коинфициро-ванных больных и характеризуются признаками поражения гепатоцитов на фоне стимуляции образования IgM и IgG классов антител ко всем изучаемым структурным и неструктурным антигенам вириона.
2. Клинико-биохимическая ремиссия хронического вирусного гепатита С часто, особенно в группах с длительным течением заболевания и у HCV-HIV-коинфицированных больных, формировалась без развития сопутствующей иммунологической ремиссии.
3. Модифицированные методы количественного учета выраженности реакций иммуноблоттинга позволили охарактеризовать не только степень иммуногенности отдельных белковых компонентов вируса гепатита С, но и их активность в формировании специфических циркулирующих иммунных ком-плексов.
4. Развитие иммунодефицита у больных хроническим вирусным гепатитом С при HCV-HIV-коинфицировании сочетается с подавлением иммунного ответа, проявляющегося не только в способности к образованию сывороточных антител, но и участию последних в образовании циркулирующих иммунных комплексов.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в практическую деятельность гепатологического отделения Городской инфекционной клинической больницы г. Казани, РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, в учебном процессе кафедры инфекционных болезней ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия ФА З и СР».
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: V Российской научно-практической конференции: Гепатит В, С и Д (Москва, 2003), на Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000),VШ съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням (С-Петербург, 2002);Научно-практической конференции с международным участием по инфекционным болезням (Харьков, 2003); pасширенного заседания предметно-проблемной комиссии КГМУ «Инфекционные болезни»» с участием сотрудников кафедры инфекционных болезней, клинической лабораторной диагностики, фтизиатрии и пульмонологии, аллергологии и иммунологии, эпидемиологии и дезинфектологии КГМА ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия ФА З и СР» (Казань, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит из введения, литературного обзора, 4-х глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 94 отечественных и 73 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 18 таблицами.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Для выполнения поставленных задач в течение 1999-2003 гг. на базе отделения вирусных гепатитов городской клинической инфекционной больницы №1 им. проф. А.Ф. Агафонова и Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИДом и ИЗ МЗ РТ обследован 151 больной хроническим вирусным гепатитом С: с HCV-моноинфекцией было 46 пациентов, с HCV-HIV-коинфекцией – 105 человек. Среди обследованных больных было 139 мужчин (92,05%) и 12 женщин (7,95%). Больные микст-гепатитами в группы исследования не включались.
Диагноз ХВГС устанавливали на основании клинико-эпидемиологиче-ских и лабораторных данных. У всех больных ВГС был верифицирован обнаружением маркеров HCV-инфекции – анти-HCV IgM, IgG методом ИФА, определением РНК – HCV в плазме крови методом ПЦР. Изучение количественного содержания спектра анти-HCV, циркулирующих в свободном и связанном виде в ЦИК проводили методом иммуноблоттинга.
В ходе наших исследований были использованы методы определения различных показателей функциональной активности печени (определение уровня общего билирубина и его фракций, активности аминотрансфераз, тимоловой пробы, протромбинового индекса, белковых фракций). Всем больным проведено ультразвуковое исследование печени. Определение активности гепатоцеллюлярных ферментов (гамма-глюта-милтранспептидазы, щелочной фосфатазы) проводились на базе лаборатории РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ с использованием многоканального фотометра FP-901 M фирмы «Лабсистемс». У всех пациентов многократно изучали показатели периферической крови с подсчетом форменных элементов.
Иммунологические исследования включали количественное определение субпопуляций лимфоцитов CD4, CD8, используя моноклональные антитела. Сывороточные иммуноглобулины А, М, G определяли методом турбидиметрии на биохимическом анализаторе ФП-901М по методике Т.И. Лукичевой и др. (1991), Н.М. Кудряшовой и др. (1993).
Диагностика ВИЧ-инфекции у всех обследованных устанавливался после скринингового, референтного и экспертного исследований на наличие специфических антител к ВИЧ в ИФА и иммуноблоте. Молекулярно-биологическая диагностика ВИЧ-инфекции проводилась методом полимеразной цепной реакции.
Исследование спектра анти-HСV в сыворотках крови проводили методом ИФА на тест-системах «РекомбиБест анти-ВГС» ЗАО «Вектор-Бест» с последующим определением спектра антител к структурным и неструктурным белкам HCV в иммуноблоте «INNO-LIATM HCV Ab III update» фирмы «INNO GENETICS» (Бельгия). Денситометрию стрипов иммуноблота проводили в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).
При оптимизации метода получения ЦИК из сывороток крови использовали следующие концентрации полиэтиленгликоля с молекулярным весом 6000 (ПЭГ-6000): 7%, 14% и 21%, которые служили для определения содержания ЦИК различной молекулярной массы по оптической плотности (Герасимов И.Г., Зоркова Е.В, 2001).
Антитела к вирусу гепатита С определяли с использованием иммуноблот тест-системы 3-го покoления INNO-LIA™ HCV Ab III update фирмы Innogenetics (Бельгия) на стрипах с линейно нанесенными на нейлоновую мембрану серологически информативных синтетическими конформационных аналогов эпитопов вируса. Результаты реакции оценивали визуально и инструментально в отраженном свете на сканере Sharp Jx-330 c использованием программы Image Master 10 Prime, версия 3,00 (Pharmacia Biotech). Интенсивность окрашенных полос (количественный анализ сканированных фракций) выражалась в оптических единицах плотности (Pixel). Полученные результаты обрабатывали с использованием программы Microsoft Exсel и представляли в виде табличных данных и линейных графических изображений.
Циркулирующие иммунные комплексы исследовали методом преципитации полиэтиленгликолем – 6000 по M. Dygeon и др. (1977).
Статистическая обработка данных производилась на персональном компьютере IBM HC «Pentium», с использованием программ «MS Excel-97» и программы «Статис-Мед». При этом использовались параметрические методы оценки результатов – вычисление средней арифметической (М), среднеквадратического отклонения, средней ошибки средней арифметической (m). Оценка различий между сопоставляемыми группами по избранным критериям осуществлялась по критерию Стьюдента. Достоверность изменений признавалась при вероятности ошибки р меньше или равно 0,05.
Результаты собственных исследований и их обсуждение
Периоды обострения у больных ХВГС как при HCV-моноинфициро-вании, так и при HCV-HIV-коинфицировании характеризовались достаточной скудностью клинической симптоматики с преимущественно неспецифической (внепеченочной) картиной проявления. Однако, если признаки увеличения печени и слабость встречались примерно с одинаковой частотой в обеих группах (от 70 до 85%), то для моноинфицированных больных ХВГС более типичным были боли в правом подреберье и постоянная желтушность склер (таблица 1). У коинфицированных больных особенность клинической картины формировали симптомы типичные, прежде всего, для HIV инфицирования. Это были лимфаденопатия, различные высыпания на коже и слизистых, а также эпизоды лихорадки и диарреи. Частота и выраженность их проявления имели связь со стадией развития ВИЧ-инфекции.
Тем не менее, отклонения биохимических показателей в периоды обострения заболевания в обеих изучаемых группах практически не различались между собой и были связаны с увеличением активности цитолитических форм энзимов (АлАТ и АсАТ) на фоне незначительного увеличения концентрации билирубина (таблица 2).
Таблица 1
Частота проявлений клинических симптомов у больных в фазу обострения
хронического вирусного гепатита С с HCV-моноинфекцией
и HCV-HIV-коинфекцией (в %)
| Клинические проявления | HCV (n=46) | HCV+HIV (n=105) |
| Астено-вегетативный синдром | 82,6 | 83,0 |
| Лимфаденопатия | 17,4 | 85,7 |
| Боли/тяжесть в правом подреберье | 65,2 | 50,5 |
| Гепатомегалия | 87,0 | 86,7 |
| Кожные проявления (acnae, пятнистая сыпь) | 19,6 | 31,4 |
| Бронхо-легочный синдром | 10,8 | 28,6 |
| Артралгии | 8,7 | 2,9 |
| Жидкий стул | 6,5 | 23,8 |
| Снижение массы тела | 10,8 | 17,1 |
Таблица 2
Основные биохимические показатели больных хроническим вирусным
гепатитом С при HCV-моно (n=46) и HCV-HIV-коинфекции (n=105)
| Лабораторные показатели | Период заболевания | |||
| обострение | ремиссия | |||
| HCV | HCV-HIV | HCV | HCV-HIV | |
| Билирубин общий (мкм/л) | 26,9±2,4 | 20,1±2,9 | 19,4±3,3 | 12,39±2,4 |
| АлАТ (МЕ/л) | 179,69±19,6 | 181,7±15,0 | 47,6±12,45 | 45,5±11,6 |
| АсАТ (МЕ/л) | 149,2±18,6 | 140,5±12,9 | 25,6±10,6 | 37,4±14,8 |
| Тимоловая проба (y.e.) | 9,7±1,5 | 7,3±1,4 | 8,8±1,7 | 8,0±0,5 |
Обострение HCV инфекции в обеих группах, как и следовало ожидать, сопровождалось стимуляцией репликативной активности вируса. Вирусная РНК периферической крови методом ПЦР обнаруживалась у 76% больных ХВГС с моноинфекцией HCV и у 79% больных с HCV-HIV-коинфекцией. Повышение концентрации вирусных антигенов в фазу обострения стимулировало специфический иммунный ответ с увеличением числа больных, содержащих в крови анти-HCV антитела класса IgM. При этом частота положительных проб крови была абсолютно идентичной в обеих группах и достигала высокой частоты – свыше 90%.
Образование антител класса IgG к структурным и неструктурным белкам HCV в период обострения имело определенные особенности. Прежде всего, следует отметить более низкую регистрируемую частоту ответа анти-core антител класса IgG в обеих группах больных, хотя у пациентов с коинфекцией выявляемость антител данной специфичности на 14% превышала таковую при моноинфицировании (таблица 3). Иммунный ответ на неструктурные белки HCV оказался существенно более высоким, и анти-NS3 и анти-NS4 антитела в обеих группах выявлялись практически с одинаковой частотой от 87 до 91%. В частоте обнаружения анти-NS5 антител отмечен провал у больных с коинфекцией HCV-HIV; у них процент положительно реагирующих сывороток составлял 65% при 85% в группе моноинфицированных.
Таблица 3
Частота выявления анти-HCV в сыворотке крови больных хроническим
вирусным гепатитом С в период обострения и ремиссии при HCV-моно-
и HCV-HIV-коинфекции методом ИФА (в %)
| Показатели | Период обострения | Период ремиссии | |||
| HCV | HCV+HIV | HCV | HCV+HIV | ||
| Анти HCV lgM | 91,2 | 91,3 | 41,7 | 52,9 | |
| Анти HCV lgG | -core | 55,9 | 69,6 | 33,3 | 88,2 |
| -NS3 | 88,2 | 86,9 | 25,0 | 70,6 | |
| -NS4 | 91,2 | 86,9 | 66,6 | 67,6 | |
| -NS5 | 85,2 | 65,2 | 50,0 | 58,8 | |
Таким образом, фаза обострения ХВГС как при HCV-моноинфицирова-нии, так и в случае HCV-HIV-коинфекции имеет клинические, биохимические и иммунологические признаки. По ряду иммунологических критериев данная фаза напоминает острую стадию заболевания; прежде всего по частоте (свыше 90%) определения анти-HCV антител класса IgM, что отражает наличие активной репликации HCV. Особенностью же фазы обострения инфекции оказалась высокая частота выявления антител класса IgG к неструктурным белкам вириона.
Фаза клинической ремиссии достигалась в среднем через 1-3 месяца интенсивной терапии и сопровождалась значительным снижением показателей АлАТ и АсАТ, хотя они при этом редко достигали нормальных величин и, со значительным разбросом, оставались в среднем на величинах в 1,5-2 раза превышающих показатели здорового человека.
Достижение фазы ремиссии сопровождалось также характерными иммунологическими проявлениями. Выраженность иммунного ответа гуморального типа ослабевала и частота анти-HCV IgM сероположительных лиц в группе больных ХВГС при HCV-моноинфицировании снижалась более чем в 2 раза. Не менее выраженным было снижение образования антител класса IgG к структурным (core) и неструктурным (NS3, NS5 и в меньшей степени NS4) белкам.
Ремиссия у больных в группе HCV-HIV-коинфекции имела некоторые особенности. Иммунологические признаки ее проявления оказались менее выраженными. У более половины обследованных в период клинической ремиссии продолжали определяться анти-HCV IgM антитела. Образование же антивирусных антител класса IgG почти не снижалось, как в отношении структурных, так и неструктурных HCV белков. Следовательно, в группе больных ХВГС на фоне HCV+HIV-коинфицирования полноценной ремиссии, подтвержденной серологическими данными, не наступало.
Применение в наших исследованиях метода иммуноблоттинга с использованием тест-систем 3-го поколения позволило не только воспользоваться высокой специфичностью метода, но и достичь увеличения его чувствительности. Как и следовало ожидать, число положительно реагирующих в обеих группах больных в период обострения заболевания было высоким и практически по всем типам тестируемых антигенов достигало 100%, и только в группе HCV-HIV-коинфицирования на антигены NS5 составляло 95,1%. Данное исследование еще раз подтвердило 100% инфицирование вирусом HCV всех обследуемых больных. Кроме того, использование метода иммуноблоттинга послужило основой для проведения дальнейших исследований по переходу от качественных характеристик иммунного ответа к количественным.
Количественная оценка выраженности иммунного ответа на антигены HCV методом иммуноблоттинга свидетельствовала о далеких от однотипности результатах. Так, максимальная выраженность иммунного ответа у больных ХВГС в фазу обострения зарегистрирована на антиген NS3 (таблица 4). Уровень содержания анти-NS3 антител класса IgG в сыворотке крови составил 25,11±1,95 ед.оп.пл. При этом выраженность ответов на антигены NS4 и NS5 была многократно ниже. Количественные показатели ответа на core-антиген при этом занимали промежуточное положение. Некоторые несовпадения результатов по частоте выявления специфических антител класса IgG к антигенам HCV в фазу обострения ХВГС, полученные методами ИФА и иммуноблоттинга, связаны с различиями в специфичности и чувствительности применяемых методов. Однако и в этом случае частота сероположительных пациентов по антителам к неструктурным белкам в методах ИФА и иммуноблота оказалась близкой (86-91%) и 100% соответственно. Количественная же оценка выраженности иммунного ответа методом иммунного блоттинга указывала в большей степени на иммуногенность различных антигенов вируса. Таким образом, максимальной иммуногенностью в наших исследованиях в фазу обострения ХВГС обладали неструктурный NS3 и нуклеокапсидный (core) вирусные белки.
Таблица 4
Спектр свободных и связанных в ЦИК анти-HCV IgG сыворотки крови больных ХВГ С (n=32)
| Показатели | Период обострения | Период ремиссии | |||
| сыворотка | ЦИК | сыворотка | ЦИК | ||
| Анти HCV lgG | -core | 16,50±0,54 | 5,98±0,33 | 14,75±0,33* | 6,50±0,42 |
| -NS3 | 25,11±1,95 | 17,51±0,69 | 26,42±1,50 | 16,96±0,37 | |
| -NS4 | 8,49±0,41 | 10,67±0,32 | 9,09±0,51 | 8,55±0,90 | |
| -NS5 | 6,39±0,52 | 0 | 6,38±0,47 | 0 | |
| * – признак достоверности полученных изменений | |||||
Особый интерес представляет сравнение данных, полученных при идентификации специфических анти-HCV антител класса IgG методами ИФА и иммуноблоттинга (количественная оценка) в фазу ремиссии. Процент ИФА-поло-жительных ответов существенно снижается ко всем испытуемым антигенам HCV, в то время как количественные показатели выраженности антителообразования на все неструктурные белки вириона не изменялись. Достоверное снижение (P<0,05) отмечено только для анти-core антител с 16,50±0,54 до 14,75±0,33 ед.опт. пл.
Отсутствие выраженных количественных изменений в уровне образования сывороточных анти-HCV специфических антител в периоды течения заболевания длительностью от 1 до 3 месяцев (в переход из фазы обострения в фазу ремиссии) заставило нас провести сравнительные исследования в анализируемых группах на более длительных сроках течения заболевания – в динамике до 5 лет. При этом обнаружена интересная и многократно повторяющаяся закономерность. Количественное содержание анти-core IgG в сыворотке больных ХВГС было максимальным в течение первого года заболевания в обеих группах (как HCV-моноинфицированных, так и HCV-HIV-коинфицированных) больных, с последующим постепенным снижением их концентрации к трем-пяти годам болезни. При этом снижение уровня анти-core антител отмечалось не только в группе HCV-HIV-коинфицирования, но и в группе HCV-моноинфек-ции. Напротив, концентрация анти-NS3 IgG антител в сыворотке больных с годами не только не снижалась, а даже возрастала, что закономерно отмечалось также в обеих группах больных. Выраженность иммунного ответа на оставшиеся неструктурные белки (NS4 и NS5) при небольших колебаниях мало изменялась на указанных сроках наблюдения (таблица 5).
Таблица 5
Количественная характеристика анти-HCV антител класса IgG в сыворотке
и в составе ЦИК при HCV-моно и HCV-HIV-коинфекции на различных сроках течения хронического вирусного гепатита С ( в ед. опт. пл.)
| Специфичность антител к антигенам HCV (анти-) | Группа HCV-моноинфекции | Группа HCV+HIV-коинфекции | |||||
| до 1 года | 1-3 года | 3-5 лет | до 1 года | 1-3 года | 3-5 лет | ||
| n=10 | n=9 | n=8 | n=14 | n=60 | n=31 | ||
| сыворотка | -core | 18,67±0,70 | 17,89±1,00 | 15,14±0,54* | 16,3±0,36 | 14,60±0,70 | 14,09±0,40* |
| -NS3 | 19,44±0,64 | 23,25±1,11* | 24,11±0,49* | 20,11±0,78 | 20,87±0,62 | 22,15±0,69 | |
| ЦИК | -core | 2,19±0,36 | 4,30±0,54 | 5,45± 0,43* | 3,96 ± 0,22 | 4,51 ± 0,35 | 4,69±0,24 |
| -NS3 | 9,21±0,90 | 15,24±0,68 | 19,06±1,10* | 14,76±0,47 | 13,53±0,41 | 14,07±0,29 | |
Представленная закономерность сохранялась в обеих исследуемых группах до периода развития выраженного иммунодефицита, который соответствовал переходу ВИЧ инфекции в IIIА стадию у коинфицированных больных ХВГС. На фоне иммунодефицита, подтвержденного снижением числа CD4+ клеток с 0,620±0,04 до 0,305±0,05, падение уровня анти-core IgG антител было максимальным и достигало 10,89±0,59 ед.опт. пл. (P<0.001). В указанную стадию развития ВИЧ-инфекции изменялся даже характер ответа на NS3 антигены. Вместо постоянного увеличения уровня сывороточных анти-NS3 антител IgG класса, наблюдаемого в динамике течения ХВГС, в IIIА стадию ВИЧ-инфекции нами отмечено достоверное его снижение. Особенно выраженным было снижение содержания анти-NS5 сывороточных IgG антител (до 1,63±0,33 ед.опт.пл.; P<0.001).
Следовательно, обнаруженные нами стандартные изменения антителообразования в динамике ХВГС в виде снижения уровня анти-core антител и постепенного увеличения содержания анти-NS3 антител не были связаны с возможностью прогрессирующего иммунодефицита. Выраженный иммунодефицит в IIIА стадию HIV-инфицирования сопровождался падением образования анти-HCV антител практически всех специфичностей.
Как показали наши предварительные исследования у больных обеих обследуемых групп отмечалось увеличение уровня ЦИК с 0,01-0,04 у.е. в норме до 0,135±0,04 у.е. у больных ХВГС. Однако необходимо себе ясно представлять, что выделение ЦИК с помощью полиэтиленгликоля ни только не обеспечивает какой-либо специфичности, но и не может чаще всего свидетельствовать об истинной доле ЦИК в составе выделенного компонента. Поэтому стандартные исследования по определению концентрации ЦИК в у.е. мы дополнили диссоциацией ЦИК и выделением из их состава иммуноглобулиновой фракции с последующим определением в последней уровня специфических анти-HCV антител. Основным требованием подтверждения происхождения определяемых анти-HCV антител из состава ЦИК является сохранение в испытуемой сыворотке прежних уровней антител после выделения ЦИК. Добавочные контрольные исследования подтвердили, что титры, остающихся в сыворотке специфических антител, не менялись после выделения ЦИК и оставались равными титрам в исходном состоянии.
Полученные результаты, прежде всего, свидетельствовали о способности анти-HCV антител класса IgG различной специфичности входить в состав ЦИК больных ХВГС. Качественный метод иммуноблоттинга позволил обнаружить 100% их участие в формировании ЦИК с NS3 антигенами. Достаточно частым (87-90%) было участие в образовании специфических ЦИК антител класса IgG к антигенам core. Интересно, что участие в образовании специфических ЦИК анти-NS4 антител было менее выраженным, и практически полностью отсутствовали иммунные комплексы, построенные на основе IgG антител к NS5 неструктурным белкам.
Материалы исследований свидетельствовали также о высоких не только иммуногенных свойствах неструктурного белка NS3, но и о выраженных его антигенных потенциях, что проявлялось в формировании максимального уровня ЦИК с антигенами данной специфичности.
Чрезвычайно важными оказались результаты исследований по изменению количественных показателей уровня специфических анти-HCV IgG в составе ЦИК на длительных сроках наблюдения (таблица 5). Особенностью динамики изменений показателей содержания анти-core и анти-NS3 IgG антител в составе ЦИК у моноинфицированных больных ХВГС было постепенное и достоверное увеличение их количества к 4-5 годам течения заболевания. При этом наиболее выраженным было увеличение в ЦИК содержания анти-NS3 антител (более чем 2-х кратное), что по направленности точно соответствовало изменению их уровня в сыворотке ХВГС данной группы. Одновременное значительное увеличение содержания анти-NS3 антител класса IgG как в сыворотке, так и в составе ЦИК в длительной динамике течения ХВГС свидетельствует о постепенно возрастающей стимуляции иммунного ответа на данный антиген. Указанные антитела не могут рассматриваться как протективные но, несомненно, являются следствием сохранения репликации вируса HCV. Одновременное увеличение в составе ЦИК анти-core IgG антител, содержание которых в сыворотке постепенно снижалось, казалось бы несет в себе необъяснимые противоречия. Однако, результаты исследований по аналогичной методике выделения антител из состава ЦИК (Рязанова Г.А., Коксин В.П., Мустафин И.Г. и др., 2002) указали на быстрый и преимущественный переход специфических IgG антител в состав ЦИК вплоть до полного исчезновения их из крови. Увеличенный же уровень перехода как анти-core, так и анти-NS3 антител в динамике ХВГС может быть связанным как с выраженностью репликации вируса и уровнем циркулирующего антигена, так и с возможностью повышения аффинности связывания антител.
Неструктурные белки NS5, обладая иммуногенными свойствами, однако, практически не участвовали в формировании специфических ЦИК, что могло отражать определенные трудности взаимодействия их с антителами в связи с особенностями той формы вирусного антигена, в которой HCV присутствует в крови больных ХВГС.
При сравнении полученных данных с результатами изменения содержания анти-core и анти-NS3 IgG антител в составе ЦИК у HCV-HIV-коинфици-рованных больных ХВГС отмечено, что показатели в последней группе больных не имели тенденции к увеличению, а совершали недостоверные колебания около исходных значений в течение всего периода наблюдения. Если же за основу показателей взять стадийность ВИЧ инфекции, то обнаруживается, как и в сыворотке, постепенное снижение количества в составе ЦИК как анти-core, так и анти-NS3 антител с 5,29±0,35 до 3,9±0,42 ед.опт.пл. (P<0,01) и с 12,13±0,4 до 9,17±0,32 ед.опт.пл. (P<0,001) соответственно по мере развития иммунодефицита. Кроме того, на стадии IIIА течения ВИЧ инфекции у HCV-HIV-коинфи-цированных больных с ХВГС в составе ЦИК не определялись ни анти-NS4, ни анти-NS5 антитела IgG класса. Поскольку анти-NS4 IgG антитела на этой стадии ВИЧ-инфицирования определялись в сыворотке в достаточных концентрациях (7,04±0,56 ед.опт.пл.), полученный результат может свидетельствовать не только о том, что развивающийся иммунодефицит тормозит образование антител, но и влияет также на взаимосвязь последних с циркулирующими вирусными антигенами (возможно за счет уменьшения сродства антител к антигену).
Анализируя полученные данные, следует отметить, что наибольшей иммуногенностью среди белковых антигенов HCV обладают NS3 и core, они приводят к образованию наибольших концентраций специфических антител в составе анти-HCV иммуноглобулинов G. Ответ анти-NS3 антител оказывался наиболее устойчивым в динамике наблюдения за больными ХВГС. Более того, по мере прогрессирования заболевания при HCV-моноинфекции наблюдалось медленное, но устойчивое нарастание их синтеза. NS3 белок оказался и высокоантигенным, поскольку анти-NS3 антитела были представлены в составе специфических ЦИК на максимальном уровне. Анти-core IgG антитела имели несколько меньшую способность формировать специфические иммунные комплексы, однако динамика их изменений при ХВГС соответствовала таковой на NS3 компонент. Выраженность иммунного ответа на неструктурные NS4 и NS5 белки была наиболее низкой, а NS5 компонент проявлял наименьшую устойчивость и практически не формировал циркулирующих иммунных комплексов.
Фаза обострения ХВГС характеризуется необычно высокой частотой (свыше 90% больных) появления в диагностическом титре анти-HCV антител класса IgM. Подобные особенности иммунного ответа при обострении ХВГС нашли подтверждение в современной научной литературе (Рахманова А.Г., Неверов В.А., Кирпичникова Г.И. и др., 2002]. Отличием фазы обострения от острой стадии ВГС является высокая частота определения антител к неструктурным белкам вируса.
Клиническая ремиссия сопровождается значительным снижением признаков цитолиза гепатоцитов (выраженное снижение активности ферментов АлАТ и АсАТ) на фоне интенсивного лечения. Однако, клинической ремиссии не сопутствовала полноценная иммунологическая ремиссия. О последнем свидетельствовало сохранение у половины больных определяемого в ИФА уровня сывороточных анти-HCV IgM антител и практически отсутствие снижения частоты положительных ИФА ответов на неструктурные вирусные антигены, особенно отчетливо выраженные у больных в группе HCV-HIV-коинфекции. В пользу сохранения иммунного ответа и наличия вирусного антигена в крови больных ХВГС в периоды клинико-биохимической ремиссии свидетельствовало также сохранение количественных показателей образования специфических анти-core, -NS3, -NS4 и -NS5 IgG антител и, что особенно существенно, сохранение формирования специфических ЦИК к основным антигенам HCV. О наличии постоянной HCV антигенной стимуляции свидетельствует и длительная динамика нарастания выраженности иммунного ответа на NS3 белок у больных ХВГС.
В факте одновременного наличия клинико-биохимической ремиссии и выраженного гуморального иммунного ответа на антигены HCV нет ничего противоречивого, поскольку, по мнению большинства исследователей (Бобкова М.Р., 2002; Chany M., Leissinger C., Lagier R. et al., 1996), вирус HCV не проявляет прямой гепатоцитотоксичности, повреждение же клеток опосредуется реакциями клеточного, но не гуморального иммунитета (Fanning L., Kenny E., Sheehan M. et al., 1999). Поэтому снижение выраженности воспалительного ответа в печени на основе проведенного лечения способно дать клинико-биохимические признаки ремиссии заболевания, хотя в этот же период могут продолжаться и выраженный иммунный ответ и репликация вируса. О возможности подобного сочетания у больных ХВГС свидетельствовали опубликованные результаты, полученные с использованием других методических приемов. В ряде исследований не было обнаружено прямых корреляций между нагрузкой HCV РНК и уровнем сывороточного АлАТ (Fanning L., Kenny E., Sheehan M. et al., 1999], а упорная HCV виремия не всегда сопровождается клиническими проявлениями (Thomas D., Astemborski J., Vlahov D. et al., 2000).
Как мы уже указывали выше на сегодня отсутствуют прямые доказательства противовирусного действия анти-HCV IgG антител. Однако, значительное увеличение уровня циркулирующих иммунных комплексов, содержащих в высоких концентрациях антитела специфичные к широкому набору антигенных белков HCV, косвенно свидетельствуют о таких возможностях. Циркулирующие иммунные комплексы, агрегируя вирусы и способствуя их дальнейшему повреждению системой комплемента или путем фагоцитоза, снижают уровень виремии (Самерханова Л.Ч., 1987; Тьерри Пойнард, Ман-Фунг Ен, Влад Ратзиу, Чинг Лунг Лай, 2004).
Чрезвычайно интересными были изменения в изучаемых показателях гуморального иммунного ответа на ведущие антигенные структуры вируса HCV на стадиях прогрессирования ВИЧ-инфекции у коинфицированных больных ХВГС. Наибольшей степени выраженности они достигли в IIIА стадию ВИЧ (таблица 6).
Таблица 6
Количественная характеристика анти-HCV антител класса IgG в сыворотке
и в составе ЦИК крови больных хроническим вирусным гепатитом при HCV-HIV-коинфекции в зависимости от стадий ВИЧ-инфекции (в ед.опт.пл.)
| Материал исследования | Анти-HCV | Стадия ВИЧ-инфекции | ||
| II Б (n=15) | II В (n=18) | III А (n=8) | ||
| сыворотка | -core | 15,15±0,31 | 13,71±0,60 | 10,89±0,59* |
| -NS3 | 20,21±0,44 | 20,53±0,51 | 18,49±0,43* | |
| ЦИК | -core | 5,29±0,35 | 4,03±0,37 | 3,90±0,42* |
| -NS3 | 12,13±0,40 | 11,83±0,21 | 9,17±0,32* | |
Иммунодефицит, подтвержденный снижением числа CD4+ клеток, сопровождался подавлением гуморального иммунного ответа как на «сильные» в антигенном отношении (NS3, core), так и на «слабые» – (NS4 и NS5) компоненты вируса. С одной стороны это может привести к затруднению диагностики HCV-коинфицирования у больных инфицированных HIV в стадию развития выраженного иммунодефицита. С другой стороны снижение уровня специфических противовирусных IgG антител в этот период может неоправданно восприниматься как развитие фазы иммунологической ремиссии у больных ХВГС.
Не менее важным являются факты значительного снижения уровня ЦИК, включающих антитела к иммуногенно-сильным антигенам вируса, и практически полного исчезновения ЦИК с участием антител к белкам NS4 и NS5. Согласно вышеприведенным данным это может привести вторично к увеличению HCV виремии. В пользу последнего нашего положения могут свидетельствовать данные о значительном увеличении HCV-вирусной нагрузки у HCV-HIV-коинфицированных больных ХВГС на фоне развивающегося иммунодефицита (Eyster M., Alter H.J., Aledort L.M., 1991; Eyster M., Fried M., Di Bisceglie A., Goedert J., 1994; Nelson D., Marousis C., Davis G. et al., 1997; Nelson K., Thomas D., 2001).
Выводы
- Клинико-лабораторные сдвиги в период обострения хронического вирусного гепатита С не различались по выраженности в группах HCV-моно-инфицированных и HCV-HIV-коинфицированных больных (до стадии развития иммунодефицита).
- Иммунологически период обострения хронического вирусного гепатита С, сопровождающийся репликацией вируса и высокой частотой анти-HCV IgM антительного ответа, характеризовался кроме того, стимуляцией IgG гуморального иммунного ответа в основном на неструктурные белки вируса.
- Клинико-биохимическая ремиссия часто, особенно в группе HCV-HIV-коинфицированных больных, не сопровождалась соответствующей иммунологической ремиссией.
- Хроническое течение вирусного гепатита С длительное время не приводит к снижению выраженности гуморального иммунного ответа.
- Количественные характеристики уровня образования специфических анти-HCV сывороточных антител класса IgG свидетельствовали о том, что неструктурный NS3 и core вирусные белки обладали наибольшей иммуногенностью.
- Специфические анти-HCV антитела класса IgG образуют с антигенами вируса иммунные комплексы, циркулирующие в крови, что может иметь патогенетическое значение во взаимоотношении хозяин - вирус.
- Формирование специфических анти-HCV циркулирующих иммун-ных комплексов не нарушается даже при снижении уровня сывороточных анти-HCV антител.
- Развитие иммунодефицита у больных хронического вирусного гепатита С при HCV-HIV-коинфицировании сочетается с подавлением иммунного ответа, проявляющегося не только в способности к образованию сывороточных антител, но и участию последних в образовании циркулирующих иммунных комплексов.
Практические рекомендации
1. Фазу обострения хронического вирусного гепатита С от острого вирусного гепатита С отличает высокая частота обнаружения специфических IgG антител к неструктурным белкам вируса.
2. У больных хроническим вирусным гепатитом С при HCV-HIV коинфекции фазу ремиссии следует оценивать преимущественно по клинико-биохимическим признакам.
3. Количественное определение анти-NS3, -NS4 и -NS5 IgG специфических антител, циркулирующих как в свободном, так и в связанном виде в ЦИК, способно достаточно точно охарактеризовать состояние гуморального иммунитета больных хроническим вирусным гепатитом С.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Фазылов В.Х. Клинико-лабораторная характеристика ВИЧ-инфици-рованных больных с коинфекцией парентеральных вирусных гепатитов / В.Х. Фазылов, О.М. Романенко, Р.В. Хамзина //Тез. докл. 5-го Российской научно-практ. конференции «Гепатит В, С и Д – проблемы диагностики, лечения и профилактики. - М., 2003. – С. 299-301.
- Рязанова Г.А. Активность антител к нативной дезоксирибонуклеиновой кислоте в сыворотках крови инфицированных вирусом иммунодефицита в ранний период заболевания /Г.А. Рязанова, В.П. Коксин, Р.В. Хамзина, В.Г. Винтер, О.М. Романенко //Ж. Медицинская иммунология. - 2003. - Т. 5, №5-6. – С. 625-628.
- Хасанова Г.Р. Эпидемиологические аспекты врожденной ВИЧ-инфекции /Г.Р. Хасанова, И.А. Дижонова, О.М. Романенко //Материалы Юбилейной научно-практ. конференции, посвящ. 70-ле-тию кафедры детских инфекционных болезней КГМУ: Микроэкология матери и ребенка, принципы диагностики и лечения. - Казань, 2002. – С. 86-88.
- Коксин В.П. Мониторинг некоторых иммунологических показателей на различных стадиях ВИЧ-инфекции /В.П. Коксин, И.Г. Мустафин И.Г., Ткачева Н.В., И.М. Хаертынова, Г.А. Рязанова, О.М. Романенко //Материалы III съезда иммунологов и аллергологов стран СНГ. - Сочи, Россия, 2000. - Т. 1, №2. – С. 88-89.
- Хаертынова И.М. Мониторинг активности анти-ВИЧ антител к белкам генов gag, pol и env ВИЧ при антиретровирусной терапии ВИЧ-больных /И.М. Хаертынова, Л.И. Бадриева, Д.К. Баширова, В.П. Кокcин, И.Г. Мустафин, Г.А. Рязанова, Э.А. Замятина, О.М. Романенко, Е.В. Курмашева //Тез. докл. VII Российско-итальянской конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика». - С-Петербург, 2000. – С. 274.
- Романенко О.М. Микробиологический мониторинг ВИЧ-инфициро-ванных в Республике Татарстан /О.М. Романенко, Л.Н. Килина, Е.Н. Шахбазова, Е.В. Курмашева //Российский журнал ВИЧ СПИД и родственные проблемы. – 2001. - Т.5, №1. – С.93
- Рязанова Г.А. Выявление скрытых анти-ВИЧ антител в циркулирующих иммунных /Г.А. Рязанова, В.П. Коксин, И.Г. Мустафин, И.М. Хаертынова, О.М. Романенко, Э.А. Замятина //Тез. докл. III съезда биохимического общества. - С-Петербург, 2002. - С. 211.
- Баширова Д.К. Ретроспективный анализ клинических признаков ВИЧ-инфекции / Д.К. Баширова, О.М. Романенко, Ф.К. Сиразиева, Э.А. Замятина, И.М. Хаертынова //Тез. докл. научной конференции и VIII съезда итало-российского общества по инфекционным болезням: Проблема инфекции в клинической медицине. - С.Петербург, 2002. – С. 393-395.
- Хаертынова И.М. Клинические и биохимические особенности HCV-инфекции и коррекция их амиксином /И.М. Хаертынова, Д.К. Баширова, О.М. Романенко, Н.И. Николаева //Тез. докл. научно-практ. конференции с международным участием: Гепатиты в практике терапевта, семейного врача и инфекциониста. Современные методы диагностики и терапии. - Харьков, 2003. - С. 271-274.
- Хаертынова И.М. Опыт применения амиксина при лечении хронического гепатита С у больных, употребляющих наркотики инъекционно /И.М. Хаертынова, О.М. Романенко, Л.И. Бадриева //Материалы международной конференции: «Наркозависимость и медико-социальные последствия. Стратегия профилактики и терапии». - Казань, 2003. – С. 204-205.
- Баширова Д.К. Ретроспективная диагностик острой фазы ВИЧ-инфекции /ДК. Баширова, И.М. Хаертынова, Э.А. Замятина, О.М. Романенко, Ф.К. Сиразиева //Каз. мед. журнал, 2004, №6, с. 417-420.
- Романенко О.М. Течение хронического вирусного гепатита С у больных ВИЧ-инфекцией /О.М. Романенко //Каз. мед. журнал, 2005, №1, с. 8-12.
- Баширова Д.К. Клинико-иммунологические особенности течения хронического вирусного гепатита С при HCV-моно-инфекции и HCV+HIV-коин-фекции /Д.К. Баширова, О.М. Романенко, И.М. Хаертынова, А.П. Цибулькин //Каз. мед. журнал. Казань, 2005, №2, с. 142-149.
Отпечатано в ООО «Печатный двор».
Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207 Тел. 72-74-59, 41-76-41, 41-76-51.
Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.01.
Выдана Приволжским межрегиональным
территориальным управлением МПТР РФ.
Подписано в печать 29.06.05 г. Усл.п.л.1,0 л. Заказ №К-113. Тираж 100 экз.
Формат 60Х84 1/16. Бумага офсетная. Печать – ризография.
