Состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови при профессиональном воздействии металлов-аллергенов и электромагнитных полей диапазона радиочастот.

На правах рукописи

СТАЦЕНКО ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

СОСТОЯНИЕ НУКЛЕОЛЯРНОГО АППАРАТА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ ПРОФЕССИОНАЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ МЕТАЛЛОВ-АЛЛЕРГЕНОВ И ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ ДИАПАЗОНА РАДИОЧАСТОТ.

14.00.50 - Медицина труда

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2006

Работа выполнена в Государственном учреждении научно-исследовательском институте медицины труда РАМН.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Л.А. Иванова

доктор медицинских наук, профессор Н.И. Измерова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор И.В. Яцына

доктор медицинских наук, профессор, Г.И. Козинец

заслуженный деятель науки РФ

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского.

Защита состоится «__»__________2006 г. в____часов на заседании диссертационного совета Д.001.012.01 при ГУ научно-исследовательском институте медицины труда РАМН по адресу: 105275 Москва, проспект Будённого, д.31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ медицины труда РАМН.

Автореферат разослан «__»_________2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук Н.Б.Рубцова

Актуальность проблемы: В условиях современного технического прогресса работники подвергаются комбинированному, комплексному воздействию различного рода антропогенных раздражителей, сочетанному влиянию вредных промышленно-экологических факторов различной природы: химических, физических и биологических, способных вызвать гамму патологических изменений и обусловливающих нарушения реактивности организма (С.М. Федоров и др., 2001; Н.Ф. Измеров, 2005).

В настоящее время с каждым годом увеличивается количество химических веществ, с которыми контактирует человек и в быту и на производстве. Постоянно накапливаются данные о растущем загрязнении окружающей среды за счет промышленных выбросов и возможности сенсибилизации к металлам, содержащимся в предметах бытового предназначения, вследствие особенностей производственной технологии. Это относится к никельсодержащим предметам, бытовым красителям, пищевым продуктам, что влияет на иммунный статус населения. В настоящее время широкое применение металлов в составе сплавов в стоматологической практике способствует росту распространенности сенсибилизации к серебру (42-94%), никелю (18-32%), кобальту (2%), хрому (2%), меди (2%), цинку (2%) (А.В.Кудрин и соавт., 2000). Все это способствует росту заболеваемости контактными дерматитами (Н.Ф. Измеров и др., 1993; А.А. Антоньев и др., 1996; Ю.К. Скрипкин и др., 1998; И.В. Яцына и др., 2001; Н.И. Измерова, 1994, 2003). Установлено, что в 92% причиной профессиональных заболеваний кожи являются химические вещества. Из них 50-52% приходится на долю металлов-сенсибилизаторов (соли хрома, никеля, кобальта) (Adams R., 1990; А.А. Антоньев и др., 1996; И.В. Яцына и др., 2000, 2004; Н.И. Измерова и др., 1994, 2003).

В современной литературе накоплен значительный фактический материал о воздействии металлов на структуры клеточного ядра. Появился целый ряд данных о токсическом действии большинства металлов (Cr, Ni, Co, As, Be, Cd, Sn, Pb и др.) на клеточный цикл и механизмы клеточной гибели (А.В. Кудрин и соавт., 2000; Anderson et all, 1994).

Исследования Anderson et all (1994), изучавших действие металлов на геном показали, что генотоксические свойства Cr, Ni, Co проявляются в их способности проникать в ядро, подавлять синтез ДНК, приводя к дисбалансу генов, регулирующих клеточный цикл и к увеличению числа хромосомных аберраций в лимфоцитах.

Однако, механизм мутагенного, канцерогенного и токсического действия металлов и их соединений на геном изучен в основном в эксперименте.

Другой серьезной проблемой, которой обеспокоено современное общество – возможность неблагоприятного воздействия электромагнитных полей радиочастотного диапазона (ЭМП РЧ) (ВОЗ, 2004; Рубцова Н.Б., 2005). К критическим органам и системам относят центральную нервную и кроветворную системы, глаза, гонады. Описаны эффекты со стороны сердечно-сосудистой и нейроэндокринной систем, иммунитета, обменных процессов (ВОЗ, 1984; Измеров Н.Ф. и др., 1999; Никитина В.Н., 1990, 2004; Суворов Г.А. и др., 1998; Рубцова и др., 2003). В литературе имеются данные о повреждающем действии ЭМП СВЧ и РЧ на генетический аппарат в виде хромосомных и/или хроматидных аберраций (Ю.А. Семин и др., 1995; Л.А. Иванова и др. 2006). В последние годы появились данные об индуцирующем влиянии ЭМП на процессы канцерогенеза (Goldsmith J.R., 1995; Szmigielski S., 1991; Hardell L. et all, 2003).

Известно, что функциональное состояние клеток и, в частности, лимфоцитов можно оценивать, изучая морфологические особенности этих клеток (Погорелов В.М., 1992). Ядрышки или нуклеолы, как морфологическая структура ядра клетки, являются местом синтеза рибосомной РНК - функции рибосомных генов, локализованных в спутничных нитях ядрышкообразующих районов (ЯОР) акроцентрических хромосом групп D и G. Они образуются в интерфазе и реорганизуются в митозе. Их количество, форма и размеры отражают транскрипцию рибосомных генов, которая зависит от интенсивности клеточного метаболизма, степени клеточной дифференцировки и стадий клеточного цикла, а сами они определяют процессы синтеза белка на рибосомах ( Kamel et all., 1990).

В клинических условиях нарушения нуклеологенеза изучены в работах В.М.Погорелова, Г.И.Козинца (1992; 2002) на модели клеток опухолей из лимфоидной ткани. В.Н.Минеев с соавт. (2003) изучали апоптоз и активность рибосомных цистронов лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови при бронхиальной астме. Д.Ф.Каюмова (1993) выявила особенности нуклеолярного аппарата интерфазных лимфоцитов крови у лиц, занятых в производстве резино-технических изделий и ликвидаторов аварии на Чернобольской АЭС.

Однако, в доступной нам литературе не встретилось работ, посвященных изучению морфо-функциональных особенностей ядрышкового аппарата лимфоцитов при действии таких распространенных факторов химической и физической природы, особенно актуальных в настоящее время, как металлы-аллергены и ЭМП диапазона радиочастот. Это определило актуальность проведения исследований нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови на модели профаллергодерматов от воздействия металлов-аллергенов (соединения хрома, никеля, кобальта) и при профессиональном воздействии электромагнитных полей диапазона радиочастот для выявления раннего воздействия неблагоприятных факторов производственной среды на организм на уровне генетического аппарата клетки.

Диссертационная работа выполнена в рамках госбюджетной темы ГУ НИИ медицины труда РАМН №0203 «Новые клеточные технологии в клинике основных форм профессиональных заболеваний (патогенез, диагностика, лечение, профилактика)», темы №9027 «Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе патоморфоза заболеваний, возникающих в современных условиях промышленной экологии окружающей среды» и рамках НИР «Аналитическая цитохимия вариантов острых лейкозов» (совместно с лабораторией гемоцитологии ГНЦ РАМН)

Цель работы: изучить состояние нуклеолярного аппарата и морфометрические параметры лимфоцитов периферической крови у больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов (соединения Сr, Ni, Co) и у лиц, подвергавшихся профессиональному воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определить параметры нуклеологенеза в лимфоцитах крови методом цитохимической реакции с нитратом серебра у обследованных контингентов: больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся профессиональному воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.
2. Используя метод компьютерного анализа клеточного изображения, оценить геометрические и цветояркостные параметры лимфоцитов крови (площади клетки и ядерных структур) в обследованных группах.
3. По результатам определения ферментов, локализованных в цитоплазматических структурах клетки, оценить активность биоэнергетических процессов, уровень свободных радикалов и антиоксидантной защиты клетки, а также клеточную аллергическую и воспалительную реакции крови в обследованных группах.
4. Провести сопоставление полученных параметров нуклеологенеза в обследованных группах больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей радиочастот с результатами клинического обследования, и данными гематологических и цитохимических исследований.
5. Оценить перспективность использования параметров нуклеолярного аппарата как критериев повреждающего действия вредных факторов промышленной природы у лиц, имевших контакт с промышленными аллергенами и электромагнитными полями диапазона радиочастот.

Научная новизна работы

- В результате проведенных исследований получены новые данные о повреждающем действии вредных производственных факторов физической и химической природы на организм, на уровне рибосомных цистронов лимфоцитов крови.

- Впервые проведена комплексная оценка нуклеолярного аппарата лимфоцитов в сочетании с изменениями биохимического гомеостаза лимфоцитов.

• Выявлены особенности изменений рибосомного хроматина лимфоцитов у больных профаллергодерматозами и у лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей диапазона радиочастот.
• Выявлена взаимосвязь между изменениями нуклеолярного аппарата и уровнем активности биоэнергетических, свободно-радикальных процессов, антиоксидантной клеточной защиты.

Практическая значимость работы

• Сформирован комплекс лабораторных методов, характеризующих клетки на уровне генетического аппарата и функции цитоплазматических структур, который позволяет выявить повреждающее действие вредных факторов промышленной природы при воздействии на организм соединений металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот.
• По данным изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови предложены критерии выявления биологического эффекта воздействия металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот.
• Представленные в работе методы и предложенные диагностические критерии могут быть внедрены в практику предварительных и периодических медицинский осмотров для оценки повреждающего действия на организм вредных производственных факторов, для ранней диагностики и оценки тяжести заболевания при обследовании больных профаллергодерматозами.

Материалы исследований легли в основу:

• Проекта пособия для врачей «Клинико-лабораторная оценка нуклеолярного аппарата и апоптоза лимфоцитов крови при профессиональном воздействии вредных химических и физических факторов»
• Проекта программы послевузовской профессиональной подготовки (образовательная программа, учебная программа, тестовые задания) по специальности «клиническая лабораторная диагностика» (шифр – 040107) (клиническая ординатура, 3456 часов)

Апробация работы проведена на заседании специалистов клинического отдела по изучению клинико-патогенетических основ профессиональных и производственно обусловленных заболеваний ГУ НИИ медицины труда РАМН (28.06.20006). Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2005); на 9-ом конгрессе ЕНА (Женева, Швейцария, 2004); на 28-ом Международном конгрессе по медицине труда (Милан, Италия, 2006); на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ медицины труда РАМН (Москва, 2005, 2006).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работы: Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка используемой литературы, содержащего 171 источников, из них 111 отечественных и 60 зарубежных авторов. Диссертация изложена на страницах ___машинописного текста, иллюстрирована___таблицами и ___рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В механизмах повреждающего действия металлов-аллергенов и ЭМП радиочастот важную роль играет нарушение структурно-биохимического гомеостаза, в основе которого лежит активация рибосомных цистронов, биоэнергетических, свободно-радикальных процессов и снижение антиоксидантной защиты клеток.
2. Высокая транскрипционная активность рибосомных цистронов, отражающая пролиферативный и белоксинтезирующий потенциал клетки отмечена у больных с распространенными формами профаллергодерматозов с выраженными клиническими проявлениями кожи.
3. Для оценки риска развития, ранней диагностики и оценки тяжести течения профзаболеваний целесообразно использование методического комплекса, характеризующего клетки на уровне генетического аппарата и функции цитоплазматических структур.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения поставленных задач проведено клинико-лабораторное обследование 127 человек, из которых: 72 - больные профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов (Cr, Ni, Co); 35 - подвергались профессиональному воздействию электромагнитных полей (ЭМП) диапазона радиочастот. В группу контроля вошли 20 практически здоровых людей.

Возрастной состав обследованных больных профаллеродерматозами был однородный. Преимущественно это были женщины от 40 до 60 лет. Общее клиническое обследование больных проводилось в дерматологическом отделении клиники ГУ НИИ медицины труда РАМН (зав. - проф. Измерова Н.И.). Обследованные больные профаллергодерматозами являлись работниками различных предприятий г. Москвы и Московской области, имевшими различные профессии. В число обследованных вошли строительные рабочие и работники производства строительных материалов (формовщики, бетонщики, плиточники, отделочники, маляры, штукатуры), а также работники, занятые обработкой металла (слесари, шлифовщики, токари, гальваники). Согласно санитарно-гигиеническим характеристикам условий труда основным фактором вредности у всех больных являлись металлы-сенсибилизаторы: соединения хрома, никеля, кобальта, входящие в состав цемента и различных легированных сталей. Диагноз профессионального заболевания кожи основывался на результатах осмотра кожных покровов, характеристике барьерной функции кожи с учетом профессионального маршрута больного, санитарно-гигиенической характеристики условий труда, выявленной повышенной чувствительности к промышленным аллергенам при кожном тестировании. Результаты кожного тестирования были подтверждены in vitro НСТ-тестом, стимулированным аллергенами (Cr, Ni, Co).

Обследованные больные профаллергодерматозами были разделены на две группы в зависимости от распространенности и выраженности патологического кожного процесса, характеристике барьерной функции кожи. Таким образом, в первую группу вошли 52 больных с локализованными формами профаллергодерматозов, а вторую группу составили 20 человек с распространенными формами профаллергодерматозов.

Группа лиц, без клинических проявлений, подвергавшихся профессиональному воздействию ЭМП радиочастот как физического фактора воздействия, состояла из 35 человек: 25 женщин и 10 мужчин в возрасте 35-50 лет (профессиональных пользователей ПЭВМ и использующих мобильные телефоны как средство профессиональной коммуникации). Все эти лица подвергались воздействию комплекса факторов, ведущим из которых является ЭМП радиочастот в сочетании с изменяющимися микроклиматическими условиями, шумом и высокой степенью психо-эмоционального напряжения. Уровни потока энергии (УПЭ) модулированного ЭМП у головы пользователя составляла 31-1400 мкВт/см2, что свидетельствует о превышении в отдельных случаях установленных временных допустимых уровнях ЭМП.

В настоящей работе был использован комплекс клинико-лабораторных методов исследования, включающих гематологические, цитохимические, исследование нуклеолярного аппарата лимфоцитов методом серебрения, компьютерный анализ клеточного изображения.

Проведенные гематологические исследования включали количественную, морфологическую и функциональную оценку клеток периферической крови. Пробы капиллярной крови обследованных групп были исследованы при помощи гематологического счетчика НЕМА-screen 10. Наряду с подсчетом форменных элементов в обследованных группах проводилось морфологическое исследование клеток крови и подсчет лейкоцитарной формулы по общепринятой методике.

Активность нуклеолярного аппарата исследовали методом импрегнации ядерного хроматина серебром (Ag-ЯОР-реакция) по стандартной методике (Howell и Black,1980) в модификации В.М. Погорелова (1992). Метод является высокоспецифичным для выявления активных ядрышкообразующих районов (ЯОР).

В основе реакции лежит специфическое связывание ионов металла с нуклеолярными кислыми негистоновыми белками, среди которых наиболее изученными являются: нуклеолин (С23), нуклеофозмин ( В23), фибриллярин (В36), белок 100кД, РНК-полимераза-1 и др. Эти аргентофильные белки маркируют активные рибосомные гены, участвуют в процессах транскрипции и процессинга 45S пре-РНК до 18S и 28S субъединиц, формируя структуру ядрышка в интерфазе, и осуществляет транспорт прерибосомных частиц в цитоплазму. Продукт реакции выявляется в световом микроскопе в виде темно-коричневых преципитатов серебра (гранул), а ядрышки приобретают коричневый цвет. Анализировалось 50 клеток в каждом случае.

Для анализа изображений лимфоцитов в окрашенных мазках периферической крови использовалась исследовательская версия прибора автоматического скрининга клеток периферической крови (АСПЕК). Прибор создан совместно Радиотехническим институтом им. А.Л. Минца и лабораторией гемоцитологии (зав. –профессор Г.И. Козинец) ГНЦ РАМН. Версия настроена на сегментацию, измерение и распознавание клеток, ядер и ядрышек и способна снабжать исследователя информацией о геометрических, цветояркостных, текстурных и популяционных характеристиках клеток препарата. Прибор формирует из них графические диагностические образы.

В настоящей работе нами была предпринята попытка оценить изменения геометрических и цветояркостных параметров цифровых изображений лимфоцитов и их внутриклеточных структур (нуклеолярный аппарат) с точки зрения их применимости для автоматизации и объективизации процесса исследования. Для математического анализа цветояркостных характеристик ядрышек нами впервые апробированы модели цветовых пространств RGB и HSV.

Для оценки состояния ферментативной активности клеток крови использовали цитохимические методы определения ферментов. Состояние энергетического метаболизма лимфоцитов оценивали по активности ферментов, характеризующих энергетический обмен в клетках - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) – ключевого фермента цикла Кребса, маркера митохондрий и митохондриальной а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) – фермента цикла Кребса и компонента глицерофосфатного шунта, осуществляющего преемственность гликолиза и биологического окисления. Для характеристики системы «свободно-радикальные процессы – антиоксидантная защита клеток»: функциональную активность нейтрофилов, способность их микробицидных систем генерировать активные формы кислорода, оценивали цитохимическим методом бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия до формазана (НСТ-тест по методу Park и соавт., 1987). Ключевым ферментом антиоксидантной защиты является миелопероксидаза (МП), которая обезвреживает перекиси и гидроперекиси, образующиеся при свободно-радикальных реакциях из ненасыщенных жирных кислот на мембранах нейтрофилов при фагоцитозе и таким образом участвует в защите клеток от токсического воздействия. Для характеристики клеточной воспалительной и аллергической реакции крови оценивали активность щелочной и кислой фосфатаз. Щелочная фосфатаза (ЩФ) – маркер гидролазосом – является одним из основных звеньев микробицидной интралейкоцитарной системы, осуществляет гидролиз нуклеиновых кислот и фосфопротеинов клеточной оболочки. В настоящее время доказана информативность щелочной фосфатазы нейтрофилов как цитохимического критерия в выявлении инфекционного воспалительного процесса. Кислая фосфатаза (КФ) – маркер лизосом - осуществляет кислотный гидролиз бактерий, метаболитов, различных антигенов, с ней связан цитолитический эффект лимфоцитов при реализации аллергической реакции. Активность кислой и щелочной фосфатаз определяли по Goldberg и Barka (1987), миелопероксидазы – по Sato (1987). Активность дегидрогеназ определяли по Р.П. Нарциссову (1969).

Для характеристики иммунологических реакций при профаллергодерматозах с использованием цитохимических методов идентификации субпопуляции лимфоцитов (Л.А. Иванова, 1991) определяли абсолютное количества субпопуляций Т-клеток, осуществляющих реакции клеточного иммунитета, и В-лимфоцитов, которые, синтезируя антитела, участвуют в реакциях гуморальной системы иммунитета.

Статистическая обработка результатов включала использование стандартных методов вариационной статистики. Для выявления и подтверждения достоверности различий показателей в сравниваемых группах, с учетом объема выборки и неопределенности характера распределения, использовался непараметрический U-тест по Манн-Уитни. Для обнаружения и установления характера и силы связей между изучаемыми показателями использовался корреляционный анализ (вычисление коэффициентов корреляции Спирмена).

Статистический анализ полученных результатов в разделе морфометрических исследований проводили с помощью компьютерной программы «АСПЕК», результаты анализа автоматически импортировались в Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Гематологические исследования.

Как показали результаты исследования, при профессиональном воздействии таких изучаемых факторов, как металлы- аллергены и электромагнитные поля радиочастотного диапазона, гематологические показатели (количество клеток крови и морфологический состав) остаются в пределах нормальных значений (табл.1).

Таблица 1

Показатели морфологического состава крови в обследованных группах (М±m)

Группы

лейко-циты (х109/л)

лимфо-циты(х109/л)

п/я нейтр. (х109/л)

с/я нейтр. (х109/л)

эозино-филы (х109/л)

базо-филы (х109/л)

моно-циты (х109/л)

эритроциты, (х1012/л)

гемоглобин (г/л)

м

ж

м

ж

1. Больные с локализованными формами ПАД, n = 52

Абс.

6,28± 0,33

1,85 ±0,12*

0,20± 0,03

3,66 ±0,23

0,17 ±0,02*

0,03 ±0,01

0,34± 0,04

4,72±0,14

4,23 ±0,11

146,1±0,5

138,4±1,01

%

-

29,81± 1,40

3,19± 0,44

57,89± 0, 36

3,00± 0,46

0,48± 0,15

5,44± 0,60

-

-

-

-

2. Больные с распространенными формами ПАД, n = 20

Абс.

6,47± 0,6

2,05± 0,25*

0,16± 0,04

3,61± 0,43

0,18± 0,05*

0,01± 0,0*

0,49± 0,08*

4,56±0,19

4,14± 0,29

145,2±0,8

144,3±0,7

%

-

31,71± 2,01

2,57± 0,79

55,43± 1,75

2,43± 0,88

0,14± 0,0

7,71± 0,95

-

-

-

-

3. Лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП радиочастот, n = 35

Абс.

6,29± 0,25

1,9± 0,06*

0,12± 0,01

3,99± 0,22

0,13± 0,02

0,003± 0,0*

0,36± 0,04

4,71±0,1

4,20± 0,07

144,3±0,09

138,9±0,5

%

-

27,77± 1,25

1,89± 0,17

62,26± 1,28

2,09± 0,27

0,06± 0,04

5,69± 0,43

-

-

-

-

4. Норма

Абс.

6,4 ±0,57

2,4 ±0,72

0,038 ±0,04

3,75± 0,72

0,13± 0,012

0,02 ±0,004

0,35 ±0,03

4,7 ±0,35

4,14 ±0,017

149,7 ±0,04

127,2 ±0,05

%

-

32,8 ±0,3

4,97 ±0,109

59,6± 0,11

2,56 ±0,07

0,47 ±0,008

5,65 ±0,103

-

-

-

-

* - достоверные отличия от группы контроля при Р<0,05

Однако, при статистической обработке материала были отмечены достоверные по сравнению с нормой изменения в уровне лимфоцитов во всех обследованных группах в сторону лимфопении. Также отмечается увеличение количества эозинофилов в группах больных профаллергодерматозами, что свидетельствует о заинтересованности этих фракций лейкоцитов. Так, содержание лимфоцитов уменьшается в группе 1 до 1,85±0,12, в группе 2 до 2,05±0,25, в группе 3 до 1,9±0,06 при 2,4±0,72 в контроле (Р<0,05). Повышенное количество эозинофилов отмечалось в группе 1 до 0,17±0,02 и в группе 2 до 0,18±0,05 при 0,13±0,012 в контроле (Р<0,05).

Лимфоцит, будучи центральной клеткой иммунитета, участвует в реализации ответной реакции организма на воздействия факторов внешней среды. У людей, контактирующих с ЭМП чаще, чем в контроле может диагностироваться снижение иммунитета (В.Н. Никитина, 2003); нарушения иммунного гомеостаза токсико-аллергической направленности лежат в основе патогенеза профаллергодерматозов (И.В. Яцына, 2000). Эти положения подтверждаются выявленной тенденцией к лимфопении в обследованных группах, которая у больных профаллергодерматозами сочетается с эозинофилией, что свидетельствует об аллергической направленности патологического процесса.

Анализируя у больных профессиональными аллергодерматозами структуру популяций циркулирующих в крови лимфоцитов, мы выявили определенные закономерности изменений количества и соотношений субпопуляций В- и Т- лимфоцитов, характеризующие иммунопатологические реакции, выраженность которых дает представление о клеточных механизмах и их роли, лежащей в основе клинических проявлений этой патологии (табл.2). Оказалось, что уменьшение содержания лимфоцитов в крови у больных профаллергодерматозами с локализованными формами (группа1) и распространенными формами (группа 2) происходит за счет уменьшения Т-хелперов до 0,73±0,10х109/л (Р<0,05) в группе 1, во 2 группе отмечается тенденция к уменьшению до 0,93±0,07х109/л при 1,024±0,05х109/л в контроле. Увеличилось количество Т-супрессоров до 0,66±0,14х109/л в группе 1 и до 0,59±0,22х109/л в группе 2 при 0,352±0,02х109/л в контроле и Т0-лимфоцитов до 0,20±0,05х109/л в группе 1 (тенденция) и до 0,32±0,11х109/л в контроле (Р<0,05). Содержание В-лимфоцитов оказалось сниженным в группе 1 до 0,30±0,04х109/л, во 2 группе отмечалась тенденция к повышению до 0,47±0,09х109/л при 0,445±0,03х109/л в контроле (Р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют об иммунологических нарушениях Т- и В-систем лимфоцитов, что согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что в основе иммунологических расстройств при аллергических дерматозах, вызванных металлами, центральную роль играют нарушения нормальной иммунорегуляции (И.В. Яцына, 1995, 2000; А.А. Антоньев и др. 1996).

Таблица 2

Показатели субпопуляций лимфоцитов в группах больных профаллеродерматозами (М±m).

Группы	Общее кол-во лимфоцитов 109/л	Субпопуляции лимфоцитов (х 109/л)
		Вл	Тх	Тс	То
1.Больные с локализованными формами ПАД (n=52)	1,89±0,12*	0,30±0,04*	0,73±0,10*	0,66±0,14*	0,20±0,05
2.Больные с распространенными формами ПАД (n=20)	2,3±0,21	0,47±0,09	0,93±0,07	0,59±0,22*	0,32±0,11*
3.Контроль (n=20)	2,4±0,72	0,445±0,03	1,024±0,05	0,352±0,02	0,103±0,03

*- достоверные отличия от группы контроля при Р<0,05.

Результаты исследования нуклеолярного аппарата лимфоцитов.

Как свидетельствуют результаты исследования, в обследованных группах отмечаются значительные изменения нуклеолярного аппарата лимфоцитов крови как по количеству, так и по качеству аргентофильного материала в нуклеолах ядер (табл. 3).

Лимфоциты обследованных групп всегда были Ag-позитивны. Анализ результатов показал, что в обследованных группах активность нуклеолярного аппарата лимфоцитов была выше, чем в контрольной группе, о чем свидетельствует увеличение таких параметров, как общее количество гранул и коэффициент К1.

Наиболее высокая активность рибосомных генов в лимфоцитах отмечена в группе больных с распространенными формами профаллергодерматозов: количество гранул увеличивалось до 496 ±13,95 при 232 ±4,987 в контроле (Р<0,05); соответственно увеличивался коэффициент К1.

В группе обследованных больных с локализованными формами профаллергодерматозов количество гранул серебра было также достоверно увеличено до 362 ±5,81 против контроля 232 ±4,987. Следует отметить, что при действии на организм производственных физических факторов (ЭМП радиочастот), активность рибосомных генов была также достоверно повышена (по количеству гранул серебра) и составляла 389 ±11,96 по сравнению c контролем. Однако, значение нуклеолярного коэффициента в лимфоцитах ни в одной из обследованных групп не изменялось, оставаясь равным контрольному.

Таблица 3

Группы		Кол-во нуклеол на клетку	Кол-во Ag- гранул на клетку (К1)	Количество Ag- гранул в нуклеолах на 100 клеток
				Всего	крупных	средних	мелких
Больные профаллергодерматозами	1.Распространенные формы (N=20)	1,05±0,01	4,96±0,14* **	496±13,95*, **	160±6,98* **	159±7,87* **	177±8,42 *, **
	2.Локализован-ные формы (N=52)	1,03±0,004	3,62±0,06*	362±5,81*	133±3,26*	136±3,95*	93±3,18
3.Лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП радиочастот (N=35)		1,02±0,004	3,89±0,12*	389±11,96*	106±6,56*	134±4,70*	150±8,21*
4.Контроль (N=20)		1,00±0,004	2,32±0,050	232±4,987	10±1,633	113±2,737	109±4,9

Нуклеолярные параметры лимфоцитов периферической крови в обследованных группах (М±m).

* - достоверные отличия от группы контроля при P<0,05

** - достоверные отличия от группы с локальными формами 2 и 3 при P<0,05

Известно, что обогащение нуклеол аргентофильными белками является сигналом клеточной пролиферации, а количество этих белков положительно коррелирует с ее скоростью (Derenzini et al., 1995). Однако, как показали исследования Scholzen, Gerdes (2000), любой морфологический маркер пролиферации свидетельствует о пролиферативном потенциале клеток, но не о том, что эти клетки делятся in vivo.

Рис 1. Показатели нуклеологенеза лимфоцитов крови в обследованных группах.

Помимо абсолютного количества гранул, в наших исследованиях мы оценивали вклад их особенностей в структуру коэффициента К1, выделяя крупные, средние и мелкие гранулы серебра (табл.4).

Нами было обнаружено, что увеличение общего количества гранул в обследованных группах происходило, в основном, за счет увеличения доли крупных гранул в 7 и более раз.

Таким образом, согласно полученным данным, представляется следующая картина: в интерфазных лимфоцитах периферической крови обследованных групп по сравнению с контрольной группой увеличивается число и размер Ag-положительных ядрышкообразующих районов хромосом в нуклеолах. При этом, выявленные изменения носят однотипный характер вне зависимости от природы фактора, только разной степени выраженности.

Полученные данные говорят о том, что количественный и качественный состав Ag-материала в нуклеолах лимфоцитов отражает существенные изменениях активности нуклеолярного аппарата этих клеток в обследованных группах. При этом, изменения носят «извращенный» характер и могут свидетельствовать о повреждающем действии этих факторов на генетическую активность лимфоцитов. Наибольшая активность наблюдалась при действии химических вредных факторов, в группе больных профаллергодерматозами, особенно у больных с клинически выраженными, распространенными формами профаллергодерматозов.

Таблица 4

Средний удельный вес Аg-гранул каждого размера в нуклеолах

лимфоцитов в обследованных группах (%)

Группы		Процент Ag- гранул каждого размера
		Крупных	Средних	Мелких
Больные профаллергодерматозами	1.Распространенные формы (N=20)	32	32	36
	2.Локализованные формы (N=52)	37	37	26
3.Лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП РЧ (N=35)		28	34	38
4.Контроль (N=20)		4	49	47

Из литературным источников известно, что размер преципитата серебра имеет существенное значение. Во-первых, активность рибосомных цисторонов зависит от уровня клеточного метаболизма, белкового синтеза, определяющего функциональное состояние клетки (Н.Н. Мамаев и др., 2002).

Во-вторых, размер ЯОР в нуклеолах лимфоцитов периферической крови человека отражает количество активных копий рибосомных генов, поэтому определение этого размера может использоваться в качестве меры геномной дозы активно работающих рибосомных генов (Н.А. Ляпунова и др., 2001).

В третьих: содержание аргентофильных белков в ядрышке, их структура (полимеры или мономеры), пространственная локализация и функции закономерно изменяются в динамике клеточного цикла и таким образом, такие характеристики могут маркировать каждую стадию клеточного цикла(Chou and Yung, 1995; Laurincik et al., 2000). Возможно, что действие таких факторов, как металлы-аллергены и ЭМП диапазона радиочастот могут блокировать клетки в одной из фаз клеточного цикла (G1, G2, S).

В четвертых, повышение аргентофильности ядрышек, не связанной с пролиферацией клеток, может объясняться амплификацией рибосомной ДНК (как на примере, В12 и фолиеводефицитных анемиях) (Н.Н. Мамаев, С.Е. Мамаева, 1992).

Наконец, характеристики нуклеолярного аппарата с учетом морфометрических параметров клетки (лимфоцита) могут отражать процессы интерфазной запрограмированной гибели клеток- апоптоза (Д.Ф. Каюмова, 1993; В.М. Погорелов, 1992; И.А. Пашкевич, 2002).

Компьютерная морфометрия лимфоцитов периферической крови, окрашенных нитратом серебра в обследованных группах.

Апробировав алгоритм исследовательской версии «АСПЕК» для анализа изображения лимфоцитов, мы оценили геометрические и цветояркостные характеристики клетки и ее нуклеолярного аппарата (табл.5). Это стало возможным с развитием компьютерной видеомикроскопии.

Морфометрическая оценка нуклеолярного аппарата лимфоцитов осуществлялась по следующим параметрам: площадь клетки (S cell) мкм2, нуклеолярный коэффициент (NC) усл.ед., площадь ядрышка (S nucl.) мкм2, цитоплазмо-ядрышковое отношение (ECN-li) усл.ед. Оценивались цветояркостные характеристики ядрышка лимфоцитов: в цветовых пространствах RGB, HSV. В наших исследованиях нам не удалось получить достоверных различий в получаемых показателях, но необходимо отметить, что размер лимфоцитов имеет тенденцию к уменьшению в обследованных группах, а размер ядрышка уменьшается в группе больных профаллергодерматозами. В частности, в группе 1 S cell составил 45,470±14,616, в группе 3 составил 47,513±27,350 при 60,188±18,335 в контроле (рис. 3), а размер ядрышка (S nucl.) составил 2,117±0,5 в группе 1 и 2,18±0,93 в группе 2 при 2,32±0,63 в контроле. В группе обследованных лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей радиочастот этот показатель имеет тенденцию к увеличению: 2,468±0,824 по сравнению с контролем (рис. 2)

Результаты морфометрического исследования варьируют в широких пределах, что свидетельствует о выраженной морфологической и функциональной гетерогенности лимфоцитов периферической крови не только в отношении самой и клетки, но и в отношении нуклеолярного аппарата.

Рис. 2. Среднеарифметические значения площади ядрышек (усл.ед.) лимфоцитов периферической крови в обследованных группах.

Ось ординат – площадь клетки (усл. ед.); ось абсцисс – группы обследованных: 1 – больные с локализованными формами ПАД, 2 – больные с распространенными формами ПАД, 3 – лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП радиочастот, 4- контроль

Рис. 3. Среднеарифметические значения площади (усл.ед.) лимфоцитов периферической крови в обследованных группах.

Ось ординат – площадь клетки (усл. ед.); ось абсцисс – группы обследованных: 1 – больные с локализованными формами ПАД, 2 – больные с распространенными формами ПАД, 3 – лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП радиочастот, 4- контроль

Таблица 5

Геометрические и цветояркостные параметры лимфоцитов периферической крови в обследованных группах (М±)

Группы	Параметры
	S cell (мкм2)	NC	ECN-li (у.е.)	S nucl (мкм2)	R mx	G mx	B mx	H mx	S mx	V mx
1.Больные с локализованными формами ПАД (n=52)	45,470± 14,616	1,046± 0,048	23,115± 9,335	2,117± 0,520	175,15± 41,608	59,513± 39,603	0,700± 2,272	172,38± 27,545	234,08± 38,493	175,15± 41,605
2.Больные с распространенными формами ПАД (n=20)	59,139± 31,530	1,072± 0,033	28,075± 6,951	2,181± 0,931	183,49± 12,585	58,054± 39,297	3,755± 3,572	181,63± 7,419	249,66± 6,014	183,49± 12,585
3.Лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП РЧ (n=35)	47,513± 27,350	1,036± 0,048	18,321± 5,276	2,468± 0,824	187,30± 15,245	39,658± 20,091	0,650± 2,376	180,60± 4,913	250,37± 6,313	187,33± 15,229
4.Контроль (n=20)	60,188± 18,335	1,110± 0,157	27,313± 11,555	2,324±0,632	195,06± 22,318	81,706± 45,879	6,694± 9,695	187,00± 7,310	246,21± 10,917	195,06± 22,318

S cell (мкм2)- площадь клетки; NC – количество ядрышек (нуклеолярный коэффициент); ECN-li (у.е.)– цитоплазмо-ядрышковое отношение; S nucl (мкм2)– площадь ядрышка; R mx- красный ; G mx - зеленый ; B mx -голубой ; H mx - цветность; S mx - насыщенность; V mx - яркость

Результаты цитохимического исследования циркулирующих клеток крови (табл. 6)

При изучении системы «свободно-радикальное окисление- антиоксидантная защита» в обследованных группах выявлены однонаправленные изменения : увеличение уровня генерации свободных радикалов и снижение уровня антиоксидантной защиты. Во всех обследованных группах был повышен НСТ-тест: в 1 группе до 14,26±1,15 ед., в группе 2 - до16,6 ±3,46 ед., в 3 группе – до 16,05±1,37 ед. при 5,7±0,64 ед. (P<0,05). Следует отметить наиболее высокие показатели спонтанного НСТ-теста в группе обследованных больных с клинически выраженными распространенными формами профаллергодерматозов - 16,6 ±3,46, что достоверно выше, чем в группе 1 (P<0,05). Оценка состояния антиоксидантной клеточной защиты выявила достоверное снижение активности миелопероксидазы: в 1 группе до 1,92±0,5 ед., в группе 2 - до1,63±0,07 ед., в 3 группе – до 1,83±0,09 ед. при 2,03±0,04 в контроле (P<0,05), при этом активность миелопероксидазы была наиболее угнетена в группе обследованных больных с клинически выраженными распространенными формами профаллергодерматозов – до 1,63, что достоверно ниже, чем в группе 1 (P<0,05). С учетом угнетения активности миелопероксидазы высокий показатель спонтанного НСТ-теста, отражающий интенсификацию процессов свободно-радикального окисления, свидетельствует о дисбалансе в системе «свободно-радикальное окисление – антиоксидантная защита». Обращает на себя внимание тот факт, что этот дисбаланс наиболее выражен в группе больных с клинически выраженными распространенными формами профаллергодерматозов.

При изучении биоэнергетических процессах выявлено повышение активности ферментов – дегидрогеназ сукцината и а-глицерофосфата – в группе 1 до 17,24±0,62 ед. и 14,73±0,61 ед., в группе 2 до 19,29±1,31 ед. и 16,98±1,66 ед. соответственно при 14,7±1,7 ед. и 10,6±0,7 ед. в контроле (P<0,05).Увеличение активности энергетических ферментов носило однонаправленный характер, наибольшее их увеличение наблюдалось в группе больных с клинически выраженными распространенными формами профаллергодерматозов. Следует отметить, что в группе обследованных лиц, подвергавшихся воздействию электромагнитных полей радиочастот был повышен только один из энергетических ферментов: а-ГФДГ до 17,13±0,56 ед.

Выявленная высокая активность щелочной фосфатазы - в группе больных профаллергодерматозами до 65,64±3,51 ед.акт. в группе 1 и до 55,7±10,09 во 2 группе при 44,7±1,7 ед.акт. в контроле (P<0,05) свидетельствует о выраженности воспалительного процесса у обследованных больных. Повышенная активность кислой фосфатазы до 74,15±1,7 % в группе 1 и до 78,8± 3,61% в группе 2 при 35,1±1,2 % (P<0,05) наряду с эозинофилией являются отражением сенсибилизации и указывают на аллергический характер воспалительной реакции у больных профаллергодерматозам. При этом обращает на себя внимание, что в группе больных с локализованными формами преобладает воспалительный компонент, а в группе больных с распространенными клинически выраженными формами – аллергический.

Таблица 6.

Цитохимические показатели функционального состояния нейтрофилов у больных обследуемых групп (M±m).

Группы	НСТ-тест, спонтанный, ед. акт.	КФ, %	МП, ед. акт.	ЩФ, ед. акт.	СДГ, ед. акт	а-ГФДГ, ед. акт.
1.Больные с локализованными формами ПАД (n=52)	14,26±1,15*	74,15±1,7*	1,92±0,5*	65,64±3,51*	17,24±0,62*	14,73±0,61*
2.Больные с распространенными формами ПАД (n=20)	16,6 ±3,46* **	78,8± 3,61*	1,63±0,07* **	55,7±10,09*	19,29±1,31* **	16,98±1,66* **
3.Лица, подвергавшиеся воздействию ЭМП РЧ (n=35)	16,05±1,37*	-	1,83±0,09*	-	14,0±0,32	17,13±0,56*
4.Контроль (n=20)	5,7±0,64	35,1±1,2	2,03±0,04	44,7 ±1,7	14,7±1,7	10,6±0,7

* достоверные отличия от группы контроля при P<0,05

** достоверные отличия от группы 1 при P<0,05

По результатам проведенного исследования, в соответствии в общепринятыми методами математической статистики с учетом величины среднего квадратичного отклонения, предложены объективные критерии повреждающего действия на организм работников физических и химических факторов (кол-во Ag-ЯОР в клетке - К1 >2,8; а-ГФДГ > 14,03 е.а; НСТспон. > 10 е.а.); критерии оценки тяжести клинических проявлений профаллергодерматозов (активность рибосомных генов - К1 >4,0; а-ГФДГ > 16,00 е.а.; СДГ > 17,00 е.а.; НСТспон. > 15 е.а.).

Таким образом, комплексное исследование нуклеолярного аппарата и ферментных систем лейкоцитов крови раскрывает, на уровне субклеточных структур, функциональное состояние клеток, участвующих в формировании ответной реакции организма на действие вредных факторов физической и химической природы, формировании воспалительных и токсико-аллергических реакций в патогенезе профессиональных аллергодерматозов и расширяет наши представления о механизмах повреждающего действия ЭМП радиочастот и металлов-аллергенов. Предложены критерии диагностики воздействия вредных физических и химических факторов и критерии оценки тяжести клинических проявлений профаллеродерматозов.

ВЫВОДЫ:

1. Характер изменений морфологии нуклеолярного аппарата по параметрам активности рибосомных генов в сочетании с изменением биохимических процессов цитоплазматических структурах лейкоцитов крови - однонаправленный как у больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов, так и у лиц подвергавшихся воздействию электромагнитных полей радиочастот, только разной степени выраженности.
2. Изменения рибосомного хроматина ядра лимфоцитов крови, выявляемые методом реакции с нитратом серебра проявляются в виде гранул различного размера.
3. Результаты изучения нуклеолярного аппарата при профаллергодерматозах от металлов-аллергенов показали более высокую активность рибосомного хроматина по сравнению с измененным уровнем транскрипционной активности рибосомных генов у лиц, подвергавшихся воздействию ЭМП радиочастот.
4. Наиболее высокая активность рибосомных генов наблюдалась у больных с распространенными формами профаллергодерматозов с выраженными клиническими проявлениями поражения кожи.
5. Использованный в работе метод компьютерного анализа клеточного изображения, позволяющий изучить морфологическую характеристику ядра и цитоплазмы, морфометрических параметров, расширяет возможности в изучении тонких структур генетического материала и является перспективным в клинике профессиональных заболеваний при анализе степени воздействия факторов окружающей среды.
6. Представленный в работе методический комплекс, характеризующий клетки на уровне генетического аппарата и функции цитоплазматических структур и предложенные диагностические критерии, могут быть внедрены в практику предварительных и периодических медицинский осмотров для оценки повреждающего действия на организм вредных производственных факторов, для ранней диагностики и оценки тяжести заболевания при обследовании больных профаллергодерматозами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стаценко Ю.В. Определение активности рибосомных генов лимфоцитов крови у лиц, подвергавшихся профессиональному воздействию металлов-сенсибилизаторов и электромагнитных полей СВЧ. //Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». – Суздаль, 2005. – С. 402.
2. Иванова Л.А., Рубцова Н.Б., Горизонтова М.Н., Стаценко Ю.В., Ткач А.В. Иммуногематологические и цитогенетические эффекты при воздействии электромагнитных полей СВЧ у профессиональных пользователей ПЭВМ а аппаратами сотовой связи. IV Всероссийский конгресс «Профессия и здоровье»: Сб. тезисов. – М., 2005. – С. 79.
3. Стаценко Ю.В., Иванова Л.А., Измерова Н.И. Морфологические особенности хроматина лимфоцитов крови при профессиональном воздействии металлов-сенсибилизаторов и электромагнитных полей СВЧ. IV Всероссийский конгресс «Профессия и здоровье»: Сб. тезисов. – М., 2005. – С. 590.
4. Ткач А.В., Иванова Л.А., Измерова Н.И., Стаценко Ю.В. Современные представления о клеточных механизмах патогенеза профессиональных аллергических контактных дерматитов. (Обзор литературы). // Медицина труда и промышленная экология. – 2006. - №7.- С. 23-27.
5. Измерова Н.И., Иванова Л.А., Чикин В.В., Поповкина С.В., Богачева Н.А., Ткач А.В., Стаценко Ю.В. Современные особенности развития и проявлений профессиональных аллергодерматозов. // Актуальные проблемы «Медицины труда». Сборник трудов института. Под редакцией академика РАМН Н.Ф. Измерова. М., 2006. – С. 377-390.
6. Иванова Л.А., Измерова Н.И., Ткач А.В., Стаценко Ю.В., Рубцова Н.Б., Плюхин А.Е. Новые клеточные технологии в клинике основных форм профессиональных заболеваний (патогенез, диагностика, лечение, профилактика). // Актуальные проблемы «Медицины труда». Сборник трудов института. Под редакцией академика РАМН Н.Ф. Измерова. М., 2006. – С. 479-491.
7. Stacenko J.V., Petinati Ia.A., Ivanova L.A. Izmerova N.I., Pogorelov V.M. The transcripthion ribosomal RNA genes in lymphocytes of industrial workers: effect of metals and HF radiation. // 9th Congress of the European Hematology Association. Switzerland, 2004. – P. 243.
8. Tkach A., Ivanova L, Stacenco J. Peripheral blood lymphocytes apoptosis in occupational contact dermatitis. // 28-th International Congress on Occupational Health. Milan, Italy, 2006. – P.573.