Клинико-патогенетическое значение перекисного окисления липидов у больных лепрой при длительной химиотерапии
На правах рукописи
Апришкина Марина Сергеевна
Клинико-патогенетическое значение перекисного окисления липидов
у больных лепрой при длительной химиотерапии
14.00.11 – кожные и венерические болезни
14.00.46 – клиническая лабораторная диагностика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт по изучению лепры Росздрава»
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Рассказов Николай Иванович
кандидат медицинских наук Наумов Валентин Захарович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Кочергин Николай Георгиевич
доктор медицинских наук,
профессор Липова Елена Валерьевна
Ведущая организация:
Государственный институт усовершенствования врачей Министерства обороны РФ
Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.072.10 при Российском государственном медицинском университете (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета по адресу: 117997,
г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
Автореферат разослан 27 октября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
д.м.н., профессор Хамаганова Ирина Владимировна
Общая характеристика работы
Актуальность. Больные лепрой в низко эндемичных регионах, включая и Российскую Федерацию, - преимущественно лица пожилого возраста, организм которых на протяжении десятков лет был подвержен воздействию тяжелой хронической микобактериальной инфекции (Дуйко В.В., 2008). Кроме того, за плечами этих пациентов длительный опыт антибактериальной комбинированной химиотерапии. В этих условиях наиболее актуальной задачей системы противолепрозных мероприятий является применение нового комплекса медико-социальной реабилитации больных (Ющенко А.А., Дуйко В.В., 1999; Ющенко А.А. с соавт., 2002). Основным аспектом этого комплекса является предупреждение неблагоприятных последствий лепры, к которым, в частности, относятся структурные и функциональные нарушения в висцеральных органах, включая поражение печени. Это диктует необходимость углубления исследований метаболических процессов у больных с данным хроническим микобактериозом.
Одним из важных факторов, задействованных в патогенезе поражения печени, является перекисное окисление липидов. Функционирование биогенных радикал-генерирующих систем связано с электронно-транспортными цепями митохондрий и эндоплазматического ретикулума в клетках различных тканей (Ланкин В.З. с соавт., 2001), в том числе и в клетках-фагоцитах, реализующих свои эффекторные функции в ходе реакций воспаления (Зенков Н.К. с соавт., 2001). Известно, что данные эффекторы, помимо выполнения роли противоинфекционного барьера, способны захватывать и эффективно элиминировать из организма необратимо измененные молекулы эндогенных субстратов, утратившие в ходе формирования адаптивных реакций свое физиологическое значение и потенциально опасные для него. К таковым относятся гликолизированные, ацетилированные и окисленные липопротеиды, способные вызывать состояние клеточного липидоза со всеми вытекающими из этого последствиями (Yagi K.A.,1986; Steinbrecher U.P. et al.,1987; De Vries H.E. et al., 1999).
Показано, что в патогенезе лепрозного процесса существенную роль играют особенности обмена липопротеидов (Наумов В.З. с соавт., 2005; Цемба В.П., 2006). Определенное место в системе липидного метаболизма занимают апопротеин В - содержащие липопротеиды, в том числе их перекисно-модифицированные формы. Последние активно элиминируются из кровотока клетками ретикулоэндотелиальной системы посредством скавэнджер рецепторов и участвуют в трансформации макрофага в пенистую клетку при атерогенезе (De Vires et al., 1999). Особый интерес вызывает так называемый липопротеид (а) (Тихонов А.В. с соавт.,2003; Ежов М.В. с соавт., 2009; Morisset J.D. et al., 1987; Beisiegel, Greten, 1989; Yusuf S. et al., 2004; Carvalio 2007; Pietrzak A. et al., 2009), несущий два апобелка – Апо В и Апо (а), обогащенный как белком, так и холестерином и обеспечивающий внедрение их внутрь фагоцитирующей клетки (Kostner G.M.,1990), которая способна трансформироваться в пенистую (Beisiegel U., Greten H., 1989; Kostner G.M., 1992; Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999). Именно перегруженная липидами клетка Вирхова обеспечивает в последующем формирование лепроматозной тканевой гранулемы (Вишневецкий Ф.Е., 1976).
В связи с этим дискутируется вопрос о роли свободнорадикального и ферментативного окисления липидов в формировании самого лепрозного процесса (Bergel M., 1990; Abulafia J., Vignale R.A., 1999). Причиной специфических метаболических отклонений может быть как микобактериальная инвазия на фоне генетически обусловленной предрасположенности (Geluk A., Ottenhoff T.H., 2006;Cruz D. et al., 2008) так и оксидативный стресс, значение которого при лепре обсуждается в отдельных работах (Agnihotry N. et al., 1995; Reddy Y.N. 2003; Chhabra N. et al., 2008). Дискутируется также вопрос о значении антиоксидантного эффекта в терапевтическом действии сульфонов при лепре (Наумов В.З. с соавт., 2000; Tsutsumi S., Gidoh M., 1985).
Таким образом, изучение особенностей течения свободнорадикальных процессов и их роли в системе нарушения липидного метаболизма при лепре является актуальным. Его результаты необходимы для создания и внедрения в клинику новых тестов клинико-лабораторной диагностики, предназначенных для оптимальной оценки тяжести течения лепрозного процесса и его осложнений, а также указывают на возможные патогенетические механизмы заболевания и пути коррекции присущих ему метаболических нарушений.
Цель исследования. Разработка новых эффективных способов мониторинга метаболических и органных нарушений у больных лепрой при длительной химиотерапии на основе определения показателей свободнорадикального окисления липидов и оценки их клинико-патогенетической роли.
Задачи исследования:
- Проанализировать особенности клинического течения лепры у больных при длительной химиотерапии.
- Оценить содержание промежуточных продуктов перекисного окисления липидов в гептановых и изопропанольных экстрактах плазмы крови у больных лепрой.
- Проанализировать показатели уровня малонового диальдегида в липидах сыворотки крови больных лепрой.
- Изучить уровень липопротеида (а) в крови и содержание внутриклеточных липидов в циркулирующих лейкоцитах у больных лепрой.
- Исследовать особенности анализируемых показателей и их взаимоотношение в зависимости от характера течения лепрозного процесса под влиянием комплексной терапии.
Научно-практическая значимость исследования. Полученные результаты и разработанный на их основании критерий в виде коэффициента пероксидации могут быть использованы в качестве лабораторных показателей прогноза течения лепры и её осложнений, контроля за процессом химиотерапии и медицинской реабилитацией больных данным хроническим микобактериозом.
Сформулированы и внедрены в практику лепрологии новые методы лабораторной диагностики, позволяющие на их основе оптимизировать патогенетическое лечение больных лепрой.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Определение коэффициента пероксидации и внедрение данного показателя в комплекс клинического обследования больных лепрой способствует своевременному установлению диагноза хронического гепатита при этом заболевании.
2.При лепре существует достоверная обратная зависимость между интенсивностью ПОЛ, характеризующейся концентрацией первичных и вторичных продуктов пероксидации, и степенью окисленности липидов крови.
3. Концентрация внутриклеточных липидов в лейкоцитах периферической крови больных лепрой находится в прямой корреляционной зависимости от сывороточного уровня липопротеида (а).
4. Выявленные патогенетические механизмы поражения печени при лепре, связанные с активацией перекисного окисления липидов, указывают на обоснованность использования при данном микобактериозе в качестве «защиты» печени гепатопротекторов с антиоксидантными свойствами.
Апробация результатов работы
Научно–практическая конференция врачей–дерматовенерологов Астраханской области (Астрахань, 2006г.). Результаты исследования в процессе выполнения научной работы докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава», заседаниях общества дерматовенерологов 2004–2008 гг, всероссийских съездах дерматовенерологов и 17–го Международного конгресса по лепре, прошедшего в Индии (Хайдерабад) с 30 января по 4 февраля 2008 года (представлены в виде стендового доклада); международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию института и 85-летию противолепрозной службы России, прошедшей в Астрахани 16-17 октября 2008 года. Апробация диссертации состоялась на заседании ученого совета при НИИ по изучению лепры 30 июля 2009 г.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава», а также в клиническую практику противолепрозного кабинета Ростовского областного кожно - венерологического диспансера.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 8 научных работ в центральной печати.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Список литературы включает 225 источников, из них 88 отечественных и 137 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами, 4 рисунками.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось в отделе биохимии и иммуногенетики ФГУ «Научно-исследовательский институт по изучению лепры Росздрава».
Обследовано 50 больных лепрой. Основную часть (46 человек) составили больные многобактериальными формами лепры, среди которых лепроматозный тип (LL), погранично-лепроматозной (BL) и пограничный (ВВ) типы по классификации Ridley-Jopling (1962). Больных с недифференцированным типом лепры (РВ) было 4 человека. Все больные находились на стационарном лечении в клинике «НИИ по изучению лепры».
Для характеристики клинического статуса больных лепрой использовались следующие методы:
1. Сбор анамнеза заболевания.
2. Лабораторные методы исследования, в том числе УФ спектрофотометрия, цитохимический метод, турбидиметрия.
3. Статистическая обработка результатов велась с использованием пакета программ Microsoft Excel 2003.
При анализе историй болезни больных лепрой оценивали возраст и пол больных, клинический диагноз, продолжительность заболевания, количество рецидивов, неврологический статус (наличие полиневрита, амиотрофий, контрактур, мутиляций, трофических язв, остеомиелита), характер и длительность проводимого лечения, данные клинико-лабораторного и инструментального обследования больных (результаты ультразвуковой зонографии и скенирования печени). Обязательно регистрировалось наличие сопутствующих заболеваний со стороны сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и печени.
В ходе исследования больные были разделены на две группы. Первая группа– больные без гепатита; вторая группа – больные с гепатитом. Третью группу составил контроль (20 человек, того же возраста, не имеющих в анамнезе лепры и хронического гепатита).
С целью нивелирования сезонного фактора (физиологические ритмы) исследование проводилось только летом и осенью. Больные находились в приблизительно одинаковых условиях клинического режима, питания, медикаментозной химиотерапии. Возраст обследованных больных составил от 65 до 80 лет, из них женщин было 28, мужчин– 22.
Средняя продолжительность болезни у лиц, получавших комбинированную химиотерапию, составила 39,6±2,3 лет, а у больных, получавших монотерапию, – 40,3±1,4 лет. Количество рецидивов у обследованных больных от 2 до 7 за весь период болезни. На момент исследования комбинированную противолепрозную химиотерапию (дапсон 100 мг ежедневно+рифампицин 600 мг 1 раз в месяц) получали 10 больных, противорецидивную монотерапию (дапсон 100 мг ежедневно) получали 28 больных, у 12 человек был перерыв в специфическом лечении. Продолжительность лечения составила от 20 до 38 лет.
Дерматологические проявления лепрозного процесса у обследованных больных следующие:
У больных отмечалась пастозная, плотная, блестящая кожа, остаточные инфильтраты были от розовато-синюшного и буро-ржавого цвета. У части больных наблюдалось усиление функции сальных желез, потоотделение в пределах инфильтратов было снижено. Иногда отмечалось углубление естественных складок кожи и морщин, выбухание надбровных дуг, кожа носа, щек, губ, подбородка имела утолщенный рельеф. Также на лице отмечалось разрежение бровей, ресниц, пушковых волос. На тыльной поверхности кистей и стоп у некоторых пациентов отмечались подушкообразные отеки.
У обследованных пациентов отмечалось нарушение всех видов кожной чувствительности, сочетавшееся с вазомоторными, трофическими, секреторными расстройствами. Как следствие нарушения чувствительности, при объективном осмотре у некоторых больных отмечались ожоги и повреждения кожи в виде гематом, волдырей, ран на контактных поверхностях тела.
У части больных наблюдались нейротрофические язвы на подошвах стоп. У двух больных язвы были вторично инфицированы. Следствием трофических осложнений лепрозного процесса была инвалидизация больных лепрой.
У 26 обследованных выявлены нарушения со стороны органов желудочно-кишечнгого тракта. Среди них хронический гастрит- у 14 больных, хронический панкреатит- у 8 больных, хронический холецистит- у 12 больных. Сочетанная патология органов желудочно-кишечного тракта отмечалась у 20 больных. У 14 обследованных наблюдались признаки хронического гепатита.
Спектрофотометрическое определение продуктов перекисного окисления липидов проводили по методу И.А. Волчегорского (2000) в гептан-изопропанольных экстрактах плазмы периферической крови. Метод отражает относительный уровень изолированных двойных связей, а также первичных и вторичных продуктов ПОЛ.
Спектрофотометрия фаз липидного экстракта осуществлялась в кварцевых кюветах толщиной 1 см против соответствующего контроля на спектрофотометре Спекорд - М40 (Карл Цейс-Йена, Германия). Замеры проводили при трёх длинах волн ультрафиолетового спектра: 220, 232 и 278 нм. При этом поглощение при 220 нм соответствует нисходящему плечу максимума оптической плотности изолированных двойных связей, а значения экстинкций при 232 нм и 278 нм являются отражением содержания первичных и вторичных (соответственно) продуктов ПОЛ в липидном экстракте (Волчегорский И.А. с соавт., 1989).
Конечный результат спектрофотометрии выражали в единицах абсорбции на миллилитр плазмы крови (ЕА/мл).
Определение в сыворотке крови содержания липидов, чувствительных к перекисному окислению, осуществлялось с помощью метода Л.И. Андреевой с соавт. (1988). Для анализа использовали 0,3 мл свежей сыворотки крови без гемолиза. Расчет содержания продуктов проводили по величине оптической плотности с учетом коэффициента разведения и выражали в единицах оптической плотности (единицах абсорбции) на миллилитр сыворотки (ЕА/мл).
Определение в сыворотке крови концентрации липопротеида (а) производилось турбидиметрическим методом с использованием тест-наборов фирмы «Хьюман» (Германия) и программируемого фотометра «Хумалайзер 2000» того же производителя. Концентрация аналита выражалась в мг/дл.
Определение содержания липидов в лейкоцитах периферической крови
Забор крови из локтевой вены осуществляли в пробирку, содержащую гепарин из расчета 20 ЕД на миллилитр крови. Кровь перемешивали с 1% желатином в равных объёмах и осаждали 30 минут при 37С. Супернатант, содержащий лейкоциты, отбирали и трижды отмывали бесцветным раствором Хенкса без фенолового красного. После этого клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл того же раствора. Концентрацию клеточной суспензии доводили до 2 миллионов клеток на 1 мл среды RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки.
Клеточную суспензию культивировали в плоскодонных планшетах при 37С в атмосфере 5 % СО2. Перед окраской прилипшие ко дну лунок клетки отмывались раствором Хенкса без фенолового красного и покрывались фосфатным буфером.
Клетки окрашивались красителем нильским красным в соответствии с методикой Greenspan P. et al. (1985).
Измерение флюоресценции красителя, связанного с липидами, велось на приборе FL600 производства фирмы «Био-Тек Инструментс» (США). Результаты выражались в единицах флуоресценции (ЕФ).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате измерения содержания продуктов перекисного окисления липидов в гептановой фазе липидного экстракта было выявлено достоверное различие по их содержанию в изученных группах (таблица1).
Таблица 1
Показатели оптической плотности гептанового экстракта плазмы крови у больных лепрой
| Длина волны | Показатели оптической плотности (ЕА/мл) липидного экстракта в обследованных группах | |||||||
| Все больные M | m | Больные с гепатитом M | m | Больные без гепатита M | m | Контроль M | m | |
| 220 нм | 0,291 | ±0,0121 | 0,322 | ±0,024 | 0,277 | ±0,0133 | 1,350 | ±0,082 |
| 232 нм | 0,202 | ±0,009 | 0,210 | ±0,018 | 0,198 | ±0,011 | 1,115 | ±0,070 |
| 278 нм | 0,027 | ±0,001 | 0,029 | ±0,002 | 0,026 | ±0,011 | 0,136 | ±0,03 |
Примечание: M – средняя арифметическая; m – ошибка средней арифметической.
В то же время при количественном анализе содержания продуктов ПОЛ в изопропанольной фазе липидного экстракта выявлены существенные различия по данным показателям между исследованными группами больных (таблица 2).
Так, установлено, что хотя по среднему значению концентрации всех продуктов ПОЛ (изолированных двойных связей, диеновых конъюгатов и сопряженных кетодиенов– триенов) в изопропанольном экстракте плазмы крови обследованные больные лепрой (весь контингент) и контрольная группа существенно не различались, анализ этих показателей в группах больных с гепатитом и без такового выявил следующие особенности.
Таблица 2
Показатели оптической плотности изопропанольного экстракта плазмы крови у больных лепрой
| Длина волны | Показатели оптической плотности (ЕА/мл) экстракта плазмы в обследованных группах | |||||||
| Все больные M | m | Больные с гепатитом M | m | Больные без гепатита M | m | Контроль M | m | |
| 220 нм | 2,270 | ±0,11 | 3,450** | ±0,15 | 1,950 | ±0,08 | 2,205 | ±0,14 |
| 232 нм | 1,140 | ±0,09 | 2,130** | ±0,12 | 0,800* | ±0,05 | 1,110 | ±0,12 |
| 278 нм | 0,315 | ±0,01 | 0,505** | ±0,02 | 0,250 | ±0,01 | 0,345 | ±0,03 |
Примечание: M – средняя арифметическая; m – ошибка средней арифметической; * - отличие от контроля статистически достоверно при P<0,05; ** - при P<0,01. В скобках – величина доли экстинкции по отношению к исходной (220 нм).
У больных лепрой с клинически диагностированным хроническим гепатитом показатели концентрации интермедиатов ПОЛ (изолированных двойных связей, диеновых и триеновых коньюгатов) были наиболее высокими по отношению к соответствующим контрольным показателям (P<0,01) и, что особенно ярко выражено, к их величинам у больных без осложнений со стороны печени (P<0,001). У последних наблюдались наиболее низкие концентрации интермедиатов ПОЛ. И хотя это снижение по отношению к контрольным показателям было статистически достоверно только в отношении диеновых коньюгатов (P<0,05), тенденции достаточно выражены.
Оптическая плотность изолированных связей (220 нм) отражает исходный уровень ненасыщенности липидов (Волчегорский И.А. с соавт., 1989), а значения экстинкций при 232нм и 278 нм представляют собою величины, характеризующие образование первичных и вторичных (соответственно) продуктов ПОЛ. Как следует из анализа отношения этих производных к исходным – 220 нм (таблица 3),
Таблица 3
Доли образования первичных и вторичных продуктов ПОЛ по отношению к показателям исходного окислительного потенциала
| Отношение экстинкций | Обследованная группа | |||
| Все больные | Больные с гепатитом | Больные без гепатита | Контроль | |
| 232нм/220нм | 50% | 62% | 41% | 50% |
| 278нм/220нм | 14% | 15% | 12% | 15% |
наиболее интенсивно процесс образования диеновых коньюгатов протекает у больных с нарушением функции печени – 62% от уровня исходной экстинкции (в объединённой группе больных, у больных без признаков гепатита и в контроле – 50%; 41% и 50% соответственно). В сочетании с высоким исходным уровнем изолированных двойных связей и относительно высокой концентрацией вторичных интермедиатов ПОЛ это свидетельствует об активации свободнорадикальных процессов в условиях хронического гепатита при лепре. Образование вторичных продуктов ПОЛ, судя по вычисленным соотношениям, протекает во всех обследованных группах приблизительно одинаково.
Таким образом, для больных с клинически диагностированным хроническим гепатитом характерно значительное повышение содержания продуктов ПОЛ по сравнению как с контрольными показателями, так и с больными без осложнений со стороны печени. У больных лепрой с клиническими проявлениями хронического гепатита исходный окислительный потенциал (содержание изолированных двойных связей) существенно выше, чем у остального контингента больных лепрой, находящихся в приблизительно одинаковых условиях клинического режима, питания и медикаментозной химиотерапии. У последних содержание изолированных двойных связей особенно низко, что на фоне столь же низкого содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ свидетельствует о значительном снижении интенсивности ПОЛ. Это, по нашему мнению, можно объяснить особенностями процесса химиотерапии при лепре, при которой основой лечения является дапсон, препарат, как известно, обладающий антиоксидантным действием (Tsutsumi S., Gidoh M., 1985). У больных с признаками печеночной недостаточности активация процессов свободнорадикального окисления, на наш взгляд, свидетельствует о заинтересованности этих процессов в патогенезе хронического гепатита при лепре. Указанное обстоятельство позволяет рассматривать показатели уровня интермедиатов ПОЛ как дополнительные диагностические клинико-лабортаторные критерии, подтверждающие наличие у больного лепрой патологического процесса в печени.
Таблица 4
Лабораторные критерии диагностики хронического гепатита при лепре
| Состояние печени обследованных больных | Показатель ПОЛ | |||
| Концентрация первичных продуктов ПОЛ (ЕА/мл) | Концентрация вторичных продуктов ПОЛ (ЕА/мл) | |||
| М | S | M | S | |
| Хронический гепатит | 2,130* | 0,460 | 0,505* | 0,090 |
| Без гепатита | 0,800 | 0,290 | 0,251 | 0,050 |
Примечание: ЕА – единица абсорбции; М – среднее арифметическое; S – среднее квадратическое отклонение; P – вероятность правильности нулевой гипотезы (Р<0.05).
Как следует из полученных результатов (таблица 4), среднее значение концентрации первичных продуктов ПОЛ у больных лепрой с клинически диагностированным хроническим гепатитом (2,130 ± 0,460 ЕА/мл) достоверно выше такового у лиц без поражения печени (0,800 ±0,290 ЕА/мл). Нижняя граница доверительного интервала (MS) в данном случае составила 1,670 ЕА/мл. В связи с этим значение концентрации первичных продуктов ПОЛ равные и выше 1,670 ЕА/мл с определенной долей вероятности указывают на нарушение функции печени.
В группе больных, не имевших поражения печени, среднее значение содержания первичных продуктов ПОЛ составило 0,800ЕА/мл ± 0,290. Верхняя граница доверительного интервала при этом (M+S) соответствовала 1,090ЕА/мл, что находится существенно ниже принятой нами диагностической границы для гепатита. Таким образом, достоверное различие по данному показателю между больными лепрой с наличием гепатита и больными без такового, исключающее пересечение доверительных интервалов исследуемых показателей, позволяет использовать указанный метод с диагностической целью.
Среднее содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов в крови больных с наличием хронического гепатита составило 0,505 ± 0,090 ЕА/мл. Нижняя граница доверительного интервала в данном случае 0,415ЕА/мл. Эта величина принята за статистическую границу, выше которой у больного лепрой также диагностируется наличие хронического гепатита по вторичным продуктам ПОЛ. В группе больных без поражения печени содержание вторичных продуктов ПОЛ составило 0,251 ± 0,050 ЕА/мл. Верхняя граница доверительного интервала в данном случае 0,301 ЕА/мл. Существенное различие величин концентрации вторичных продуктов пероксидации липидов позволяет использовать эти показатели (по вторичным продуктам ПОЛ) для диагностики хронического гепатита у больных лепрой.
Окисление липидов сыворотки крови больных лепрой в присутствии Fе2+
Интенсификация пероксидации липидов может сопровождаться снижением окислительного потенциала липидов крови, так как использование окисляемого субстрата рано или поздно должно привести к истощению потенциала его окисляемости. Чтобы проверить это предположение, мы провели исследование окисления липидов крови в присутствии ионов двухвалентного железа по содержанию малонового диальдегида в тесте с тиобарбитуровой кислотой.
Результаты анализа полученных данных представлены в таблице 5.
Таблица 5
Показатели концентрации малонового диальдегида в сыворотке крови больных лепрой в присутствии ионов двухвалентного железа
| Обследованная группа | М±m | Р по отношению к контролю |
| Все больные | 1,47±0,11 | >0,05 |
| Больные с гепатитом | 0,80±0,09 | <0,05 |
| Больные без гепатита | 1,70±0,08 | >0,05 |
| Контроль | 1,72±0,19 |
Примечание: М – средняя величина концентрации МДА; m – средняя статистическая ошибка; P – вероятность правильности нулевой гипотезы.
Из представленных выше результатов статистического анализа следует, что у больных лепрой с проявлениями хронического гепатита наблюдается значительное снижение уровня окисляемости липидов крови в использованной нами модели «in vitro». Это различие достоверно при сравнении как с контрольными показателями, так и с показателями у больных без проявлений патологии печени, что подтверждает правильность выдвинутой нами гипотезы о взаимосвязи процессов пероксидации циркулирующих липидов «in situ» и состоянием их окисляемости.
Более того, проведенный анализ линейной корреляции между индивидуальными величинами концентрации первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов с уровнем МДА, определявшимся в использованной нами аналитической системе с Fe2+, показал наличие выраженной статистически достоверной обратной связи между указанными показателями (Рис.1; Рис.2). Величины коэффициентов линейной корреляции составили -0,590 и -0,658 соответственно ( Р<0,05).
Рис. 1
Рис. 2
Достоверные различия между больными с проявлениями гепатита и без такового по уровню первичных и вторичных продуктов ПОЛ, а также по степени окисляемости липидов указывают на правомерность применения любого из этих показателей, характеризующих состояние ПОЛ у больных лепрой, с целью диагностики хронического гепатита. Однако для упрощения решения этой задачи мы решили воспользоваться интегральным показателем, отражающим их соотношение.
Коэффициент пероксидации как показатель выраженности свободнорадикального окисления липидов у больных лепрой
Исходя из факта наличия выраженной обратной зависимости между уровнем вторичных продуктов пероксидации липидов и их окисляемостью «in vitro», мы предлагаем использовать коэффициент, условно обозначаемый нами как коэффициент пероксидации (КП), и представляющий собою отношение концентрации продуктов ПОЛ, определенных в крови спектрофотометрическим методом, к уровню МДА в аналитической системе с применением в качестве индуктора окисления ионов двухвалентного железа. Так как обе соотносимые величины при этом выражаются в единицах абсорбции на мл крови (ЕА/мл), сам коэффициент пероксидации выражается в относительных единицах.
В таблице 6 мы приводим значения этих коэффициентов у больных лепрой с гепатитом и у больных без гепатита.
Таблица 6
Показатели величины коэффициента пероксидации липидов у больных лепрой в зависимости от наличия осложнений со стороны печени
| Обследованная группа | Е232/ МДА M ± S | Е278/МДА M ± S |
| Больные без гепатита | 0,520 ± 0,66* | 0,178±0,084** |
| Больные с гепатитом | 2,251± 0,52 | 0,730±0,300 |
Примечание: М – среднее арифметическое; S – среднее квадратическое отклонение; N – число обследованных; * – различие достоверно при Р<0,05; ** – различие достоверно при Р<0,01.
Хотя статистическое различие между группами по величине КП, рассчитанного по первичным продуктам пероксидации (232нм), достоверно, использование его в качестве диагностического критерия мы нашли мало приемлемым из-за существенного статистического разброса данного показателя. Величина же КП, рассчитанная в отношении вторичных продуктов ПОЛ, вполне соответствует предполагаемым нами критериям. Так, нижняя граница доверительного интервала распределения величин КП для больных с проявлениями хронического гепатита в данном случае составляет 0,430. Она значительно выше верхней границы доверительного интервала распределения величин КП в группе больных с неосложненным течением лепрозного процесса, величина которой в данном случае составила всего 0,264. Таким образом, величина 0,430 принимается в качестве числового значения КП, выше которого у больного диагностируется хронический персистирующий гепатит. Таким образом, в ходе исследования нами установлено значение нормы величины КП=0,430 для больных лепрой.
Достоверность различий данного показателя с таковым у больных с нормальной функцией печени позволяет использовать величину коэффициента пероксидации в качестве дополнительного лабораторно-диагностического критерия для установления и уточнения диагноза хронического гепатита при лепре.
Кроме того, информативность предлагаемого критерия лабораторной диагностики хронического гепатита, полученного на основе анализа концентрации вторичных продуктов ПОЛ, окисляемости липидов крови в присутствии ионов двухвалентного железа в форме интегрального показателя, представляющего собою коэффициент пероксидации, проливает свет и на сущность патогенетических механизмов поражения печеночной ткани у больных лепрой. Это может служить объективным основанием для индивидуально-обоснованной коррекции окислительного потенциала у данного контингента больных с помощью антиоксидантных и гепатотропных медикаментозных средств.
Для лепры характерен вторичный иммунодефицит (Маркова Т.П., 2008) в перечне средств иммунореабилитации, при которых терапия антиоксидантами занимает не последнее место (Нестерова И.В., 2008). А это в каждом конкретном случае требует адекватной оценки оксидантного статуса организма. Продукты перекисного окисления липидов способны активировать звездчатые клетки печени и стимулировать хемотаксис нейтрофильных гранулоцитов. Это может вести к стимуляции выработки клетками цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF–), интерлейкина–6 (ИЛ–6), интерлейкина–8 (ИЛ–8), а также простагландинов. Этому способствует липидоз, наблюдающийся при лепре в клетках Купфера, что усугубляет прогрессирующее поражение печени. Бесконтрольность и пролонгированностъ выработки цитокинов и простагландинов при гепатите приводит к продолжительному острофазному воспалительному ответу со стимуляцией выработки амилоидных пептидов, угнетению синтеза белка гепатоцитами, ингибированию глюконеогенеза, нарушению митохондриального дыхания и индукции гепатоцеллюлярного апоптоза. Фиброз печени является клиническим проявлением стимуляции фиброгенеза и избыточного отложения протеинов внеклеточного матрикса, особенно в пожилом возрасте. Ранее В.З. Наумовым с соавт. (2001) показано, что у больных лепрой с гепатитом повышена активность монооксигеназной системы, которая, как известно, играет ключевую роль в биотрансформации ксенобиотиков. Индукция отдельных ферментов цитохрома Р–450 может провоцировать наработку повышенного количества цитотоксичных вторичных радикалов, в том числе из эндогенных субстратов и ксенобиотиков, включающих лекарственные препараты. Поэтому на первый взгляд не причиняющая больному особых беспокойств жировая дистрофия печени является основой для формирования более тяжелой патологии. При наличии отягощающих факторов, таких как длительный прием лекарственных препаратов, возможно формирование декомпенсированного цирроза печени.
Следует отметить, что информативность традиционных лабораторных показателей в большинстве рассматриваемых случаев была ограниченной. Так, уровень трансфераз был незначительно повышен у трети больных. В целом это подтверждает трудность клинической лабораторной диагностики гепатитов у больных лепрой и диктует необходимость расширения поиска новых лабораторных критериев оценки состояния печеночной ткани. Затруднения в выборе лабораторных критериев диагностики хронических гепатитов обусловлено также пожилым возрастом больных лепрой, длительностью заболевания и соответственно длительностью противолепрозного лечения. Хронические заболевания печени в гериатрической практике часто протекают бессимптомно. Определить у больного пожилого возраста специфичные жалобы, характерные для поражения печени, сложно по двум причинам. Во-первых, печень относиться к органам, не отличающимся обилием симптоматики, и редко, особенно при хроническом поражении, манифестирует клинические и лабораторные признаки, указывающие непосредственно на ее поражение (Шулутко Б.И., 1994). Во-вторых, у пожилых больных имеется много сопутствующих заболеваний, существенно ухудшающих течение болезни и обусловливающих полиморбидность симптоматики.
Полученные нами сведения о высоком содержании вторичных продуктов перекисного окисления липидов у больных лепрой, имеющих проявления лепрозного персистирующего гепатита, подтверждают данные V.N. Reddy et al. (2003) и N. Chhabra et al. (2008), свидетельствующие о наличии признаков оксидативного стресса у больных лепроматозной лепрой и о недостаточности антиоксидантных механизмов в условии данной патологии.
В пожилом возрасте оксидативному повреждению органов и тканей отводится важная роль, так как в условиях гипоксии тканей избыточно образующиеся активные формы кислорода воздействуют на аминокислоты, нарушая функции тех биологических образований, в структуру которых они входят (Владимиров Ю.А.,1998, Зборовская И.А., Банникова М.В. 1995). Следствием является инактивация ферментов, денатурация белков и нарушение их синтеза, повреждение гликопротеидов, металлопротеинов. Гибель печеночных клеток в условиях гипоксии стимулирует образование коллагена и узлов патологической регенерации на месте некротизированных гепатоцитов.
Проявлением диффузных изменений паренхимы печени, обнаруживаемых у больных лепрой пожилого возраста, является жировая инфильтрация (Вишневецкий Ф.Е., Логинов В.К., 1968). Интенсификации процесса может способствовать не только лепрозный процесс, но и дегенеративные болезни или болезни пожилого возраста, а также заболевания, сопровождавшиеся нарушением свободнорадикального окисления и обмена липидов и липопротеидов, к которым, в частности, относится сахарный диабет (Цемба В.П., 2006), воспалительные заболевания желудка, кишечника, поджелудочной железы (Заднепровская Е.А., 2005). Избыточное отложение липидов в клетках печени является следствием нарушения синтеза и утилизации свободных жирных кислот, снижения скорости их -окисления в митохондриях. Нарушения белкового обмена, связанные с возрастным ослаблением синтеза белка и уменьшением его метаболизма, усугубляют нарушения липидного обмена (Бобырев В.Н., 1989). При этом снижается скорость выведения из гепатоцитов триглицеридов.
Одним из вероятных претендентов на ведущее звено в цепи событий, приводящих к липидозу, является ПОЛ. Этот процесс в организме происходит на разделе фаз водная среда – липид, при этом практически вся масса циркулирующих жирных кислот, основных субстратов окисления, сосредоточена в составе липопротеидов. На границе этого раздела находятся погруженные в гидратированную среду полярные головки фосфолипидов, этих базовых структурных липидов, образующих мицеллярные поверхности как клеточных мембран, так и внешних слоёв липопротеидов. Неполярные липиды формируют гидрофобное ядро липопротеидов, полярные же – их поверхностный монослой (Титов В.Н., 1997). Возможно, это обстоятельство предопределило выявленное нами диагностическое значение ПОЛ жирных кислот, связанных с фосфолипидами, содержащимися именно в изопропанольной фазе экстракта. Известно, что наиболее окисляемыми являются апо-В содержащие липопротеиды, из которых наименее изученным является липопротеид (а).
Известно также, что основным источником активных кислородных радикалов в организме являются фагоцитирующие клетки ретикулоэндотелиальной системы. Они же, в силу своего предназначения, очищают организм от различного рода «биологического мусора», к коему относятся как собственные видоизменённые клетки, так и внеклеточные структуры, такие, к примеру, как чужеродные объекты в виде различного рода бактерий, токсинов и метаболитов (Goris R. J. A., 1989; Nathan C., Shiloh M.U., 2000). К ним относятся и окисленные липиды, избыток которых чреват для организма неблагоприятными последствиями.
Известно, что эти липиды транспортируются в составе липопротеидов, к которым, в частности, принадлежит липопротеид (а), роли которого в процессах развития клеточного липидоза в настоящее время отводится особое внимание (de Rijke Y.B. et al., 1992).
Сопоставив эти факты, мы предприняли попытку выявить наличие подобных механизмов при лепре.
Соотношение уровня липидов в лейкоцитах с содержанием
липопротеида (а) и продуктов ПОЛ в крови больных лепрой
В таблице 7 приведены результаты измерения содержания липидов в лейкоцитах периферической крови и липопротеида (а) в сыворотке крови
обследованных больных лепрой.
Таблица 7
Концентрация внутриклеточных липидов в циркулирующих лейкоцитах и липопротеида (а) в крови у больных лепрой
| Обследованная группа больных | Концентрация внутриклеточных липидов (ЕФ на 100000 клеток) | Концентрация липопротеида (а) в крови (мг/дл) |
| Больные с наличием признаков хронического гепатита | 34856,5 (24195 - 50972) | 45,7 (18,3 -71,1) |
| Больные без осложнений со стороны печени | 39805,0 (26322 – 55594) | 30,0 (21,8 -65,4) |
Примечание: приведены медианы и межквартильные интервалы; ЕФ – единицы флуоресценции.
Как следует из приведенной таблицы, содержание липидных включений в фагоцитирующих клетках больных с признаками хронического гепатита достоверно не отличается от аналогичного показателя у больных, не имеющих осложнений со стороны печени. Различие по концентрации липопротеида (а) между теми же группами также статистически недостоверно.
В то же время проведенный нами корреляционный анализ между показателями концентрации внутриклеточных липидов и уровнем липопротеида (а) показал наличие высоко достоверной положительной корреляции между этими параметрами (Рис 3). Линейный коэффициент корреляции в данном случае был довольно высок и составил +0,845, что указывает на сильную (P<0,01) степень зависимости содержания внутриклеточных липидов в фагоцитирующих клетках от концентрации липопротеида (а) в окружающей их плазме крови.
Рис.3
Кроме того, нами отмечена отрицательная корреляция между содержанием вторичных продуктов ПОЛ гептановой фазы липидного экстракта плазмы крови (резервные липиды/ триглицериды) с теми же внутриклеточными липидными субстанциями лейкоцитов, идентифицированными с помощью нильского красного (Рис.4).
Рис.4
Корреляция между содержанием липидов в лейкоцитах и концентрацией вторичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фазе липидного экстракта была менее выражена и статистически недостоверна (R = - 0,271; P>0,05), хотя знак коэффициента корреляции также указывает на отрицательную тенденцию связи.
Таким образом, мы констатируем, что фагоцитирующие клетки больных лепрой активнее поглощают липиды при высоких уровнях в крови липопротеида (а). Очевидно, что условия для этого создаются особым метаболическим статусом этих клеток, который может быть обусловлен спецификой окружающей межклеточной среды или свойствами самих клеток, скомпрометированных контактом с антигенами M. leprae.
S. Kaur et al. (1974) и J.C. Gupta et al. (1975) указывают, что печень является тем уникальным органом, где специфические для лепры изменения клеток ретикулоэндотелиальной системы сохраняются долгое время, по крайней мере, у части больных, имеющих, по-видимому, особые метаболические предпосылки для создания такого рода ситуации. На наш взгляд, в первую очередь это связано с особым оксидантным статусом индивидуумов, что проявляется в высокой активности у них свободнорадикальных процессов. Высокая окисляемость фосфолипидов создает условия для нестабильности мембранных структур клеток и повышению их проницаемости для липид-переносящих белков, проникающих в клетки через скавенджер рецепторы, минуя специальные рецепторные структуры. Эти предположения укладываются в представления об усилении перекисного повреждения не только липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), но и липопротеидов (а), которые крупны и более плотны, чем ЛПНП.
Кроме того, известно, что ЛП(а) образуется исключительно в печени. Последнее обстоятельство, возможно, является решающим в том, что липофагоцитоз циркулирующих лейкоцитов у больных лепрой напрямую связан с уровнем ЛП (а) в циркуляции.
Таким образом, исходя из полученных нами в данном исследовании сведений, заключаем, что в случае развития признаков поражения печени у больного лепрой наблюдаются признаки оксидативного стресса, что проявляется в повышении в циркуляции продуктов перекисного окисления липидов и снижении остаточной окисляемости липидов. При этом могут создаваться благоприятные условия для нарастания процесса липофагоцитоза циркулирующими фагоцитирующими клетками. Полученные в данном исследовании результаты, являясь приоритетными, раскрывают новые, неизвестные ранее, механизмы патогенеза лепрозного процесса как системного липидоза микобактериальной этиологии.
ВЫВОДЫ
1. Состояние процессов перекисного окисления липидов при лепре определяется наличием длительно текущего хронического микобактериоза, вызванного M.leprae, последствиями многолетней химиотерапии и степенью поражения тканей и органов организма больного, в частности, печени.
2. Для хронического гепатита при лепре характерно увеличение концентрации в крови продуктов перекисного окисления липидов в изопропанольной фазе липидного экстракта плазмы крови, содержащей в своем составе в основном структурные фосфолипиды, что свидетельствует об особой роли липидов этого класса в патогенезе лепрозного процесса.
3. Степень окисляемости липидов плазмы крови определяется исходным состоянием перекисного окисления липидов в организме больного «in situ». По соотношению интенсивности свободнорадикальных процессов в организме больного лепрой и уровня окисляемости липидов крови в модельной системе «in vitro» можно судить о степени компенсированности гепатита у больных лепрой.
4. Выявленные особенности перекисного окисления липидов у больных лепрой с наличием клинических признаков печеночной патологии полностью обосновывают обязательное включение актиоксидантов и мембранопротекторных медикаментозных средств в арсенал патогенетической терапии больных лепрой.
5. Уровень содержания липидов в лейкоцитах периферической крови больных лепрой находится в прямой корреляционной зависимости от концентрации в крови липопротеида (а), что указывает на патогенетическую роль данного липопротеида в процессах внутриклеточного липидного транспорта при лепре.
Практические рекомендации
- Рекомендуется исследование коэффициента пероксидации с целью оценки состояния процессов перекисного окисления липидов в организме больных лепрой.
- Введение в практику данного лабораторно-диагностического критерия позволит своевременно корректировать нарушение функции печени применением антиоксидантных и гепатопротекторных средств.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Наумов В.З., Апришкина М.С.. Уровень липопротеида(а) и содержание липидов в лейкоцитах периферической крови больных лепрой // IX Всерос. съезд дерматовенерологов: Тез. докл.– М., 2005.–Т. 1.– С.81–82.
2. Наумов В.З., Апришкина М.С., Ющенко А.А.. Свободнорадикальное окисление и содержание липидов в лейкоцитах при лепре // Терапия социально значимых заболеваний в дерматовенерологии. Новые лекарственные препараты и средства в дерматологии и косметологии: V науч.-практ.конф. Сб.тез.– М., 2005.– С.103–104.
3. Наумов В.З., Апришкина М.С. Cвязь между свободнорадикальными процессами в организме и окисляемостью липидов периферической крови больных лепрой // X Всерос. конф. дерматовенерологов «Организация оказания дерматологической помощи в современных условиях»: Тез. науч.работ.– М., 2006.–– С.48-48.
4. Наумов В.З., Апришкина М.С., Цемба В.П. Патогенетическое значение процессов перекисного окисления липидов у больных лепроматозным типом лепры на отдаленных стадиях химиотерапии // IX Всерос. конф. дерматовенерологов: Тез. науч. работ.– Екатеринбург, 2006.– С.16-16.
5. Naumov V.Z., Tsemba V.P., Aprishkina M.S., Naumov A.V., Vdovina L.N., Mesnyankina O.A. Pathogenetic factors of liver damage and their correction in treated leprosy patients // 17th.Int.Lepr. Congress: Abstraets.– Hyderabad, India, 2008.– P.189–189.
6. Наумов В.З., Апришкина М.С., Цемба В.П. Значение липопротеидов в обеспечении внутриклеточного транспорта липидов при лепре // Междунар. науч-практ. конф., посвящ. 60-летию ин-та и 85-летию противолепрозной службы в России–Астрахань, 2008.– С.83-86.
7. Наумов В.З., Апришкина М.С., Рассказов Н.И. Состояние перекисного окисления липидов как критерий оценки функции печени у больных лепрой // «Иммунопатология, аллергология, инфектология».– 2009, №3.– С. 76-81.
8. Наумов В.З., Апришкина М.С., Цемба В.П., Рассказов Н.И. Клиническое значение оценки продуктов перекисного окисления липидов в процессе реабилитации больных лепрой // «Вестник Последипломного Медицинского Образования».– 2009, №. – С.
