Обоснование применения высокотехнологичных изделий медицинского назначения из биодеградируемых полимеров в реконструктивной хирургии (экспериментально-клиническое исследование)

На правах рукописи

МАРКЕЛОВА НАДЕЖДА МИХАЙЛОВНА

ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ

ИЗ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ ПОЛИМЕРОВ

В РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ХИРУРГИИ

(экспериментально-клиническое исследование)

14.01.17 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

14.01.17 – хирургия

Красноярск - 2012

Работа выполнена на кафедре общей хирургии ГБОУ ВПО "Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедре медицинской биологии Сибирского федерального университета

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Винник Юрий Семенович

доктор биологических наук, профессор Шишацкая Екатерина Игоревна

Официальные оппоненты:

Евсеев Максим Александрович, доктор медицинских наук, профессор кафедры хирургии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Дыхно Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой онкологии и лучевой терапии с курсом ПО

Бондарь Владимир Станиславович, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией нанобиотехнологии и биолюминисценции Института биофизики Сибирского отделения Российской Академии наук

Ведущая организация:

ФГБУ «Институт хирургии им. А.В. Вишневского» Минздрава России

Защита диссертации состоится «___» __________ 2013 г. в ____часов на заседании диссертационного совета Д 208.037.02 при ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации (660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, 1, тел. 8 (391) 228-08-60).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан «______» ____________________ 2013 г.

Ученый секретарь

совета по защите докторских

и кандидатских диссертаций Д 208.037.02

кандидат медицинских наук, доцент Кочетова Л.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Развитие высоких медицинских технологий, направленных на повышение эффективности лечения и качества жизни населения, требует освоения новых препаратов и устройств высокой функциональности, включая конструирование систем, способных воспроизводить биологические функции органов и тканей (Sudeshetal., 2000; 2004; Biopolymers, 2002; Biotechnology of Biopolymers: From Synthesisto Patents, 2004; Biopolymers for Medicinal and Pharmaceutical Applications, 2005; Штильман, 2006; Хенч, Джонс, 2007; Биосовместимость, 2011).

Хирургия относится к тем медицинским наукам, которые испытывают наиболее острую потребность в новых высокотехнологичных средствах и технологиях. Прежде всего, эта потребность ощущается в реконструктивной хирургии, нуждающейся в функциональных материалах и изделиях нового поколения, таких, как шовный материал, эндопротезы, имплантаты, материалы для реконструкции дефектов поврежденных тканей. Улучшение результатов хирургических вмешательств в абдоминальной хирургии напрямую связано с внедрением новых материалов.

В мире выполняется более 20 млн. грыжесечений с частотой рецидивов 10–15 % (Федоров и др., 2000; Шляховский, Чекмазов, 2002). Для профилактики образования послеоперационных спаек разрабатываются новые методы с применением облегченных сетчатых эндопротезов типа «Vipro» и «Ultrapro» (за рубежом) и «Эсфил», «Унифлекс» (в РФ) (Klingeetal., 2002; Ярема, Магомедов, 2003; Суковатых и др., 2004; Дубова с савт., 2006; 2007; Суфияров, 2007). Применение эндопротезов из синтетических полимеров, главным образом, полипропилена, как показала клиническая практика, может сопровождаться эндопротез-ассоциированными осложнениями. Исследования, проводимые как в России, так и за рубежом, свидетельствуют о необходимости поиска новых материалов для повышения биосовместимости сетчатых эндопротезов.

В гепатохирургии, несмотря на значительный прогресс и внедрение большого количества высокотехнологичных диагностических и лечебных малоинвазивных методов, сохраняются ограничения, не позволяющие решить проблему лечения больных с механической желтухой. Большое значение имеют малоинвазивные эндобилиарные вмешательства, в частности, эндопротезирование желчевыводящих путей, при этом исход операции зачастую определяет выбор конструкции стента (Ferro et al., 1993; Harewood et al., 2002). Применяемые сегодня эндобилиарные стенты не лишены ряда недостатков. Поиск новых материалов для этих целей продолжается.

В хирургической практике в огромных количествах расходуется шовный материал. Поиск материалов для изготовления биосовместимых, механически прочных и биорезорбируемых шовных нитей является актуальной задачей материаловедения и хирургии (Воробьев, Бебуришвили, 2001; Воробьев, 2003; Сергеев с соавт., 2009 и др).

Реконструктивная хирургия испытывает большую потребность в биосовместимых материалах, необходимых для закрытия дефектов тканей, возникающих в результате травм или секвестрации. В настоящее время для реконструкции костных дефектов наиболее распространенными материалами являются искусственные и натуральные кальций-фосфатные соединения (гидроксилапатит, ди- и трифосфат кальция). Новым решением проблемы может стать создание гибридных материалов на основе гидроксиапатита и биосовместимых полимеров, способных к биодеградации (Mistry etal., 2007; Link etal., 2008).

Открытие и изучение полигидроксиалканоатов (ПГА) – биосовметимых и биоразрушаемых полимеров микробиологического происхождения, явилось значимым событием. Сфера применения ПГА потенциально широка, они могут включаться в восстановительную хирургию, клеточную и тканевую инженерию, трансплантологию, фармакологию и т.п. (Zhu et al., 2003; Liu et al., 2005, Yun et al., 2004; Balthasar et al., 2005; Nodaetal., 2005; Volova,2004; Hazer, Steinbuchel, 2007; Волова, Севастьянов, Шишацкая, 2006; Волова, Шишацкая, 2011). Исследование ПГА активно проводится, главным образом, за рубежом. В сфере коммерциализации ПГА - крупнейшие корпорации и компании: «Монсанто Ко», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter&Gambel», «BerlinPackagingCorp.», «Merk», выпускающие ПГА под марками Biopol®, MerelTM, TephaFLEXTM, DegraPol/btc®, NodaxTM.Среди изделий, допущенных к применению FDA (США) в самые последние годы - шовный материал, сетчатые эндопротезы, мембранные изделия, производимые фирмой «Tepha». Несмотря на проводимые активные исследования, результаты биомедицинских, в особенности, клинических исследований, представлены в доступной литературе крайне ограниченно.

Таким образом, многие ключевые вопросы, без решения которых невозможно практическое применение ПГА, остаются открытыми. Остаются не изученными последствия взаимодействия ПГА с тканями различной структуры; мало данных, полученных в клинических условиях.

Учитывая вышеизложенное, потребности практики, малая изученность ряда ключевых вопросов, необходимых для применения ПГА, в сочетании с уникальными научными заделами в области биотехнологии ПГА и научно-практической базой, созданной при взаимодействии научных учреждений Красноярского научного центра СО РАН и Сибирского федерального университета, включающей первое в РФ опытное производство полимеров этого класса и изделий из них, послужили основанием для выполнения этой работы и развертывания клинических исследований.

Цель работы – экспериментально-клиническое исследование эффективности применения изделий из ПГА, и разработка научной основы для внедрения в клиническую практику высокотехнологичных изделий нового поколения и повышения эффективности лечения хирургических заболеваний.

Задачи исследования:

1. Изучить физико-химические, физико-механические свойства серии пионерных высокотехнологичных хирургических изделий из ПГА (модифицированных сетчатых эндопротезов, полностью резорбируемых эндобилиарных стентов, шовных волокон, материала для реконструктивного остеогенеза).
2. Исследовать биологическую совместимость ПГА в культурах клеток и экспериментах на животных, длительность функционирования in vivoпри взаимодействии с различными тканями.
3. В эксперименте изучить морфогистохимические особенности взаимодействия с тканями передней брюшной стенки сетчатых эндопротезов, модифицированных покрытием из ПГА, ближайшие и отдаленные результаты грыжесечений с применением разработанных эндопротезов при грыжах передней брюшной стенки.
4. Исследовать состоятельность рассасывающихся моножильных нитей из ПГА для ушивания мышечно-фасциальных ран, формирования кишечных анастомозов в эксперименте на животных и оценить эффективность их применения для ушивания ран передней брюшной стенки.
5. Экспериментально обосновать целесообразность применения полностью резорбируемых трубчатых эндопротезов из ПГА для протезирования внепеченочных желчных путей; изучить клинические результаты использования стентов у больных с непроходимостью внепеченочных желчных протоков различной этиологии.
6. В доклинических экспериментах исследовать возможность использования ПГА в виде имплантатов и пломбировочного материала для реконструкции дефектов костной ткани, в т.ч. инфицированных Staphylococcus aureus; оценить эффективность применения ПГА для закрытия костных дефектов травматической и инфекционной этиологии в клинике.
7. Провести анализ результатов экспериментально-клинических исследований и эффективности использования изделий из ПГА; разработать практические рекомендации на их применение в реконструктивной хирургии.

Научная новизна исследования.

Изучены физико-химические, физико-механические свойства, закономерности биодеструкции и прочностные характеристики опытных образцов высокотехнологичных изделий медицинского назначения из сополимера 3ПГБ/3ПГВ с включением гидроксивалерата (3-ГВ) от 5 до 25 мол. %. (модифицированные эндопротезы для герниопластики, рассасывающийся моножильный шовный материал, эндобилиарные стенты, объемные полимерные матриксы) in vitro и in vivo.

Получены новые данные об эффективности клинического применения эндопротезов, модифицированных ПГА-покрытием. Оценено влияние их применения на частоту возникновения ранних и поздних эндопротез-ассоциированных осложнений.

Исследованы морфогистохимические особенности реакции тканей организма экспериментальных животных, в частности, макрофагальной и гигантоклеточной реакции, формирования соединительной ткани, активности локального ангиогенеза (экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)), возникающей на имплантацию различных изделий медицинского назначения из ПГА, разработанных в рамках данного исследования, в сравнении с их аналогами, применяемыми в клинике.

Экспериментально обоснована возможность использования рассасывающейся монофиламентной нити из ПГА для формирования различных видов кишечных анастомозов, произведена сравнительная оценка выраженности спаечного процесса в брюшной полости в зависимости от выбора шовного материала. Впервые в клинической практике использован шовный материал из ПГА для ушивания послеоперационных ран передней брюшной стенки.

Доказана принципиальная возможность применения эндобилиарных стентов на основе ПГА для протезирования внепеченочных желчных протоков и клиническая эффективность их применения у пациентов с различной этиологией механической желтухи.

Впервые на экспериментальной модели хронического остеомиелита доказана эффективность и возможность применения материала ПГА для замещения дефектов костных полостей. Проведены пилотные клинические испытания нового биодеградируемого материала у пациентов с осложненными переломами верхних и нижних конечностей, в том числе, страдающих хроническим остеомиелитом.

В результате пилотных клинических исследований изделий медицинского назначения нового поколения из биополимеров класса полигидроксиалканоатов – сетчатых эндопротезов, модифицированных покрытием из ПГА, рассасывающихся шовных нитей, эндобилиарных стентов и объемных матриксов из этого же материала – выявлены преимущества последних в сравнении с традиционно применяемыми изделиями в клинической практике, что позволило снизить число послеоперационных осложнений, улучшить результаты хирургического лечения и рекомендовать их к дальнейшему применению и изучению.

Практическая значимость работы.

Доказано, что физико-химические и физико-механические свойства высокотехнологичных изделий медицинского назначения на основе ПГА (модифицированные эндопротезы для герниопластики, рассасывающийся моножильный шовный материал, эндобилиарные стенты, объемные полимерные матриксы) соответствуют необходимым требованиям, предъявляемым к медицинским изделиям, и могут быть использованы в хирургической практике.

Экспериментально обоснован и внедрен в клиническую практику принцип хирургического лечения грыж передней брюшной стенки, основанный на использовании сетчатых эндопротезов, покрытых ПГА, позволяющий улучшить клинические результаты хирургического лечения больных, перенесших герниопластику (снижение частоты послеоперационных осложнений, сокращение сроков временной нетрудоспособности).

В эксперименте доказаны преимущества деградируемой мононити из ПГА при ушивании мышечно-фасциальных ран, выполнении различных видов межкишечных анастомозов, в частности, энтероэнтеро-, гастроэнтеро- и холецистоэнтероанастомозов.

Впервые в клинической практике рассасывающаяся мононить из ПГА использована для послойного ушивания ран передней брюшной стенки.

Предложен и внедрен в клинику способ лечения механической желтухи с различным уровнем окклюзии внепеченочных желчных протоков с помощью эндобилиарных стентов на основе ПГА и доказана его клиническая эффективность.

Впервые на экспериментальной модели остеомиелита подтверждены костнопластические свойства объемных биодеградируемых имплантатов. Обоснована и клинически доказана эффективность использования матриксов на основе ПГА для лечения больных осложненными переломами верхних и нижних конечностей, в том числе хроническим остеомиелитом, что позволило улучшить результаты хирургического лечения.

Внедрение результатов в практическое здравоохранение.

Предложенные высокотехнологичные изделия медицинского назначения (модифицированные эндопротезы для герниопластики, рассасывающийся моножильный шовный материал, эндобилиарные стенты, объемные полимерные матриксы) используются в работе хирургических отделений МБУЗ ГКБ№7, Дорожной больницы на ст. Красноярск.

Основные положения работы, выносимые на защиту:

Эндопротезы, модифицированные покрытием на основе ПГА, обладают преимуществами в сравнении с коммерческими аналогами, их использование позволяет предотвратить развитие спаечного процесса в брюшной полости и улучшить результаты хирургического лечения грыж передней брюшной стенки.

Мононить из ПГА обладает удовлетворительными физико-механическими и биологическим свойствами, высокой биосовместимостью, пригодна для ушивания кожных и мышечно-фасциальных ран, формирования межкишечных анастомозов разных типов.

Эндобилиарные стенты на основе ПГА пригодны для длительного функционирования при установке во внепеченочные желчные протоки, не вызывают местных патологических реакций, обладают хорошими каркасными свойствами.

Биодеградируемые объемные имплантаты и пломбировочный материал на основе ПГА обладают остеоиндуктивными свойствами и могут быть использованы в качестве костнозамещающего препарата для заполнения костных полостей, в том числе, в условиях гнойной инфекции.

Апробация работы.

Основные положения работы представлены: на Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука – третье тысячелетие», г. Красноярск, 2007 г.; на конференции молодых ученых им. акад. Б.С.Гракова «Актуальные вопросы медицины и новые технологии-2008», г. Красноярск, 2008 г.; на I Международной конференции "Современные технологии и возможности реконструктивно-восстановительной и эстетической хирургии", г. Москва, 2008 г.; на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной хирургии», посвященной 60-летию со дня рождения профессора Юрия Семеновича Винника, г. Красноярск, 2008 г.; на юбилейном заседании Красноярского краевого научно-практического общества хирургов, посвященного 100-летию со дня рождения проф. А.М. Дыхно, г. Красноярск, 2009 г.; на заседании Красноярского краевого научно-практического общества хирургов, г. Красноярск, 2009, 2010, 2011 гг.; международной конференции Fundamental and applied researches in medicine and biology, ОАЭ, Дубаи, 2008 г.; на IV Европейском конгрессе по биополимерам, Турция, Кушадасы, 2007 г., на XVII Российском съезде хирургов-гепатологов, г. Екатеринбург, 2009 г., на XI съезде хирургов Российской Федерации, Россия, г. Волгоград, 2011 г., на международном семинаре «Биотехнологии и окружающая среда», г. Красноярск, 2012 г., на IV съезде хирургов Сибири и Дальнего востока, Россия, г. Якутск, 2012 г., Всероссийском симпозиуме молодых ученых «Современные проблемы хирургии и хирургической онкологии», г. Москва, 2012 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 56 научных работ, опубликованных научных изданиях и журналах, в том числе 2 – в международной печати, 18 – в изданиях, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов ВАК РФ. В 2008 году издана монография «Хирургия грыж передней брюшной стенки». Получено 2 патента РФ на изобретение, 2 патента на полезную модель.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 380 страницах машинописи и состоит из введения, 7-ми глав собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы. В начале диссертации приводится список сокращений, используемых в работе. Библиография включает 285 источников, из них 130 – на русском и 155 – на иностранных языках. Текст иллюстрирован 58 рисунками и 68 таблицами.

Работа выполнена на базах кафедры общей хирургии Красноярского государственного медицинского университета имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, на базе I и II хирургических отделений МБУЗ ГКБ №7 и Дорожной больницы на ст. Красноярск совместно с Институтом биофизики СО РАН и Сибирским федеральным университетом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследованы экспериментальные образцы полигидроксиалканоатов (ПГА), полученные в лаборатории хемоавтотрофного биосинтеза Института биофизики Сибирского Отделения Российской академии Наук с использованием лабораторного автоматизированного комплекса BioFlo (New Brunswek, США), а также в условиях функционирующего опытного производства (Волова с соавт., 2006). Полимеры синтезированы бактериями Ralstonia eutropha B5786 (прежнее название Alcaligenes eutrophus B5786) в автотрофных стерильных условиях роста на минеральной солевой среде и газовом субстрате, содержащем смесь углекислоты, кислорода и водорода (СО2:О2:Н2=1:2:7 по объему). Для получения экспериментальных образцов полимерных изделий использованы полимерные растворы, суспензии, эмульсии, расплавы, порошки ПГА, находящиеся в различном фазовом состоянии, получено семейство экспериментальных изделий: 2-х мерные матриксы (гибкие плотные пленки, мембраны), 3-х мерные матриксы (губки, плотные и пористые объемные прессованные компакты), моножильные волокна, плотные трубчатые конструкции (стенты).

Исследования ПГА и разработанных полимерных изделий медицинского назначения проводили в соответствии с требованиями нормативной документации ИСО Р 10993 по оценке биологической безопасности медицинских материалов и изделий (Оценка биологического действия… ГОСТ Р ИСО 10 993), принятой в настоящее время в России, США и странах ЕС, а также используя принятые в России инструктивные материалы.

Исследование физико-химической, физико-механической и физико-биологической природы изучаемых изделий:

Соcтав полимеров определяли после метанолиза проб по метиловым эфирам жирных кислот (Brandle et al., 1990) на хроматомасс-спектрометре GCD plus (Hewlett Packard, США). Изучали молекулярную массу, температурные характеристики ПГА, рентгеноструктурный анализ и степень кристалличности, микроструктуру и физико-механические свойства (абсолютную и относительную разрывную нагрузку, относительное разрывное удлинение, модуль упругости при 1 % и 2 % удлинения).

Оценка биосовместимости разработанных объемных имплантатов проведена in vitro в культуре клеток, культивируемых при прямом контакте с экстрактами, полученными из полимерных имплантатов из ПГБ, ПГБ/ПГВ), а также из композитов ПГБ/ГАП. Тест на выявление потенциальной цитотоксичности разработанных имплантатов выполнен с использованием первичной культуры остеобластов, полученных из МСК костного мозга крыс. Жизнеспособность неадгезированных клеток оценивали по результатам окрашивания трипановым синим; количество прикрепленных клеток выявляли методом компьютерной морфометрии цифровых изображений при изучении 5 лунок для каждого образца.

Экспериментальный раздел работы выполнен в научно-исследовательской лаборатории кафедры общей хирургии в период с января 2007 года по апрель 2012 года. Проведение экспериментов одобрено Локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО КрасГМУ им. профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого.

Исследование эндопротезов, модифицированных ПГА-покрытием.

Для исследования особенностей реакции макрофагов на различные виды сетчатых эндопротезов, наиболее часто используемых при грыжесечениях, а также на эндопротезы, покрытые ПГА, проведен эксперимент, включающий наблюдение за 180 кроликами породы «Шиншилла». В 1 и 4 группах животным имплантировали полипропиленовый эндопротез «Эсфил» («Линтекс», Санкт-Петербург), во 2 и 5-й группах – облегченный комбинированный эндопротез «VIPRO II» («Ethicon», США). У животных 3 и 6 групп использовали полипропиленовый эндопротез «Эсфил» с покрытием из сополимера ПГБ/ПГВ Сформированный заранее лоскут эндопротеза размерами 5,0х5,0 см устанавливался в позицию «sublay» в 1, 2 и 3 группах животных, во внутрибрюшную позицию - у животных 4, 5 и 6 групп. Животных выводили из эксперимента с помощью передозировки наркоза через 30, 60 и 90 суток наблюдения. Во время проведения аутопсии оценивали: состояние эндопротеза (его положение, плотность сращения с тканями брюшной стенки), наличие и отсутствие спаечного процесса с органами брюшной полости (петли кишечника, пряди сальника). Степень выраженности спаечного процесса (СП) в брюшной полости оценивалась количественным способом – методом семантического дифференциала. Морфологическому исследованию подвергали фрагменты передней брюшной стенки кроликов в зоне стояния сетчатого имплантата. Микроскопическое исследование, и фотографирование приводилось с применением светового микроскопа Carl Zeiss Axiostar («Carl Zeiss», Германия) (объективы х4, х10, х40, х100 Oil; окуляры х10) с адаптированной цифровой фотокамерой Pentax Optio A30. Верификация макрофагов выполнялась посредством иммуногистохимического анализа с применением моноклональных антител к CD68 антигену макрофагов (клон: MAC 387; тип: мышиные анти-макрофагальные, неконьюгированные; кроссреактивные к человеку, крысам, кроликам; изотип: IgG1; специфичность: макрофаги; производитель: Abcam, США). Учитывалось позитивное внутрицитоплазматическое гранулярное окрашивание в клетках с морфологией макрофагов. Иммуногистохимическое окрашивание проводилось согласно прилагаемому протоколу с применением двухшаговой полимерной системы визуализации «EnVision+Dual Link System-HRP» Dako Cytomation. Срезы, наносились на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином фирмы Thermo Scientific «Polysine Slides» или Thermo Scientific «SUPERFROST Plus». Демаскировка антигенов выполнялась по высокотемпературной технологии с использованием ретривера «Retriever 2100» (PicsCell, Великобритания, 2006) в автоматическом режиме в цитратном буфере (pH 6,0) фирмы LabVision corp. Срезы докрашивались гематоксилином Майера (готовый раствор фирмы Dako Сytomation, США) для дальнейшего микроскопического исследования.

Каждое иммуногистохимическое исследование проводилось с постановкой положительного и отрицательного контроля для исключения вероятности получения ложнонегативных и ложнопозитивных результатов.

Моножильный шовный материал получен с использованием лабораторного мини-эктсрудера фирмы Brabender, Германия, по разработанной технологии (Т.Г.Волова с соавт., 2006).

Использованы образцы сополимера 3ПГБ/3ПГВ с включением гидроксивалерата (3-ГВ) от 5 до 25 мол.%. Биодеградацию образцов полимерных изделий из ПГА изучали in vivo, используя диффузионные камеры и при непосредственной имплантации нитей в мышечную ткань животных (использованы половозрелые крысы Вистар). Регистрировали физико-механические характеристики (абсолютную прочность, модуль Юнга) и морфологию нитей. Микроструктуру нитей изучали с использованием сканирующей электронной микроскопии на микроскопе «JEM-100C» с растровой приставкой EM-ASID-4 (Япония).

Изучение нитей ПГА для ушивания мышечно-фасциальных ран в эксперименте. Исследование проводилось на 90 кроликах породы «Шиншилла», содержавшихся в стандартных условиях вивария при естественном освещении со свободным доступом к пище и воде.

В зависимости от типа использованного шовного материала были сформированы 3 группы. В каждой из групп были выделены 3 подгруппы с различными сроками вывода животных из эксперимента – 30 дней, 120 дней и 180 дней. Верификация макрофагов проводилась аналогично методике, используемой при изучении препаратов передней брюшной стенки в зоне стояния эндопротезов. Для верификации сосудов применялось антитело в отношении CD31 (клон: [JC/70A] (ab9498); тип: мышиные анти-кроличьи, неконьюгированные; кроссреактивные к человеку; специфичность: связывается с 100 kDa гликопротеином, экспрессируемым эндотелиоцитами и тромбоцитами/мегакариоцитами; производитель: Abcam, США).

Для оценки активности процессов ангиогенеза в зоне наложенного на мышцу шовного материала исследовался уровень экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). Экспрессия VEGF оценивалась с помощью иммунофлюорисцентной реакции с антителами к VEGF (клон: [VG-1] (ab1316); тип: мышиные неконьюгированные; специфичность: связывается с изоформами -121, -165 и -189 фактора роста эндотелия сосудов; производитель: Abcam, США).

Изучение возможности использования шовного материала из ПГА для наложения межкишечных анастомозов. Эта часть экспериментальных исследований выполнена на 35 беспородных собаках обоего пола с массой тела от 13 до 22 кг. Распределение животных по группам эксперимента представлено в таблице 1.

Таблица 1.

Распределение животных по группам эксперимента

Номер группы	Характеристика группы	Количество особей
I группа	Энтероэнтероанастомоз «бок в бок» с использованием шовного материала Викрил	5
II группа	Гастроэнтероанастомоз с использованием шовного материала Викрил	6
III группа	Холецистоэнтероанастомоз с использованием шовного материала Викрил	5
IV группа	Энтероэнтероанастомоз «бок в бок» с использованием шовного материала ПГА	7
V группа	Гастроэнтероанастомоз с использованием шовного материала ПГА	6
VI группа	Холецистоэнтероанастомоз с использованием шовного материала ПГА	6
Всего		35

Животные были оперированы в экспериментальной лаборатории при комнатной температуре в стерильных условиях под калипсол-дроперидоловым наркозом. В ходе эксперимента до операции, на 7-е, 30-е, 60-е и 100-е сутки производили развернутый биохимический анализ крови Показателем состояния неспецифического звена иммунитета животных служила фагоцитарная активность лимфоцитов. Наблюдение за животным осуществляли в течение 100 суток. Морфологические методы исследования тканей включали данные аутопсии, макроскопическое описание и морфологическую характеристику препаратов тканей.

Экспериментальное изучение эндобилиарных стентов.

В эксперименте на 20 беспородных собаках изучены свойства эндобилиарных стентов, изготовленных из ПГА. После выполнения верхнесрединной лапаротомии верифицировался холедох, производилась холедохотомия. В 1 группе (позитивный контроль) животным был имплантирован силиконовый стент в супрадуоденальную часть холедоха. Во 2 группе стент из ПГА был имплантирован аналогично и фиксировался нитью ПГА. В ходе эксперимента до операции, на 7-е, 30-е, 60-е и 100-е сутки производили общий и биохимический анализы крови, определяли фагоцитарную активность лимфоцитов.

Морфологические методы исследования тканей включали макроскопическое описание (результаты аутопсии) и морфометрическую характеристику препаратов тканей (ткань стенки холедоха в зоне установки стента, печень, ДПК).

Экспериментальное обоснование применения имплантатов ПГА для замещения костных дефектов, в том числе на модели экспериментального остеомиелита.

Исследование возможного общетоксического действия имплантатов из ПГБ и композита ПГБ/ГАП выполнено в эксперименте на белых мышах линии BALB/c, которые были разбиты на 5 групп (по 8 животных в каждой группе): 1 группа – интактный контроль, и 4 - экспериментальные группы, которым подкожно имплантировали матриксы разных типов (из ПГБ, композита ПГБ/ГАП с различным соотношением компонентов). Подкожную имплантацию матриксов животным проводили в стерильных условиях.

Оценка остеогенного потенциала полимерных (ПГБ) и композитных (ПГБ/ГАП) имплантатов

Для определения остеоиндуктивных свойств ПГА проведен эксперимент на крысах «Вистар» с модельными дефектами костной ткани (тест сегментарной остеотомии). Животные были разделены на 4 группы (по 12 в каждой группе): две экспериментальные (имплантаты на основе ПГБ и композита ПГБ/ГАП), группа сравнения (имплантаты из коммерческого материала), контрольная группа (без имплантата, заживление дефекта – под кровяным сгустком).

Исследовали имплантаты трех типов: изготовленные из ПГБ, композита полигидроксибутират/гидроксиапатит (ПГА/ГАП) с содержанием ГАП 20 % (фирмы ЗАО НПО Полистом®, Москва. В качестве материала сравнения был взят препарат ксенокости «Bio-OSS®» (фирмы "Geistlich", Швейцария).

В эксперименте анализировали общее состояние животных, опороспособность оперированной конечности, состояние тканей в месте операции. В сроки 14 суток, 1 и 3 месяца после операции животных выводили из эксперимента. Состояние новообразованной костной ткани в местах экспериментальных дефектов оценивали по результатам замеров плотности костной ткани с использованием компьютерной рентгенографии (установка «Kodak Trophy IRIX-70»). Морфологические исследования выполнены общепринятыми методами. Определение остаточного содержания материала имплантатов в месте дефекта проводили модифицированным морфометрическим методом В.П. Яценко (1986).

Изучение эффективности применения имплантатов ПГА в лечении экспериментального остеомиелита.

Хронический остеомиелит моделирован у 60 кроликов-самцов породы «Шиншилла» 4-5 месячного возраста (таб. 2).

Таблица 2.

Характеристика экспериментальных групп животных

Номер группы	Характеристика группы	Кол-во животных
1 группа - сравнения	Модель хронического остеомиелита, пластика полости аутокостью	20
2 группа - исследуемая	Модель хронического остеомиелита, пластика остеомиелитического дефекта пломбировочным материалом из ПГА	20
3 группа - исследуемая	Модель хронического остеомиелита, пластика остеомиелитического дефекта пломбировочным материалом из ПГА в комбинации с препаратом Тиенам	20

Исследованы экспериментальные объемные имплантаты, изготовленные из непосредственно из ПГА, в виде пломбировочного материала, представляющего собой порошок ПГА и смесь ПГА с тиенамом.

Костный дефект в первой исследуемой группе заполняли плломбировочным порошком из ПГА, второй – имплантатом, на основе ПГА и антибактериального препарата группы карбапенемов (тиенам) в сочетании 10:1, в группе сравнения – костным аутотрасплантантом.

Под калипсол-дроперидоловым наркозом в области передней поверхности метадиафиза бедра выполняли остеотомию на протяжении 0,5 см, ограниченную отслойку надкостницы, вскрывали костномозговой канал; удаляли костный мозг. В образованный дефект имплантировали марлевую турунду с культурой золотистого стафилококка – 109 микробных тел Staphylococcus aureus. Модель экспериментального остеомиелита формировали в течение 1 месяца; воспроизводимость модели - 100%.; процесс был первично-хроническим.

Далее производили пластику костных дефектов. После удаления всех нежизнеспособных тканей, полость промывали раствором антисептиков (пливасепт, октенисепт). Далее костную полость полностью заполняли костнопластическими материалами: деминерализованный костный аутотрансплантат, взятый из гребня подвздошной кости (контрольная группа) и экспериментальные материалы: имплантаты из ПГБ и имплантаты ПГБ с антибактериальным препаратом Тиенам в соотношении 10:1 (экспериментальные группы).

Рентгенологическое исследование оперированных конечностей животных выполняли на рентгенологическом аппарате РУМ-20 в режиме 44 mA 0.1 kB с экспозицией в 1 сек. Проводили сравнительный анализ рентгенографических данных на 30-е, 90-е сутки после пластики костной полости. Оценивали размеры костного дефекта, его форму, однородность структуры регенерата, состояние надкостницы, кортикальной пластины и костномозгового канала.

Выведение животных из эксперимента и забор материала осуществлялся на 30-е, 60-е, 90-е сутки наблюдения. На аутопсии оценивали состояние окружающих мягких тканей, состояние надкостницы, кортикального слоя и костномозгового канала. Из области дефекта производили бактериологический посев на среду Чистовича (желточно-солевой агар). Результаты оценивали на 2-4 сутки.

Клиническая часть работы

Исследование модифицированных эндопротезов с ПГА-покрытием для хирургического лечения больных с грыжами передней брюшной стенки (паховые, послеоперационные вентральные) включало результаты наблюдений за 112-ю пациентами, оперированными по по разным методикам с применением сетчатых эндопротезов. В зависимости от вида используемого эндопротеза было выделено 2 подгруппы пациентов: в первой подгруппе проведено сравнение эндопротезов, покрытых ПГА, с полипропиленовым эндопротезом «Эсфил» («Линтекс», г. Санкт-Петербург), во второй – с облегченным эндопротезом «VIPRO II» («Ethicon», США), состоящим из полипропилена и резорбируемого сополимера лактида и гликолида.

Клинические группы были сопоставимы по возрасту, длительности грыженосительства, типу грыжи согласно классификации Nyhus, Rat.

До операции всем больным проводилось ультразвуковое исследование паховой области. На аппарате Aloka SSD-4000 ProSound («ALOKA», Япония), с использованием линейного датчика с частотой сканирования 7,5 МГц. Использовали В-режим и режим цветного доплеровского картирования.

Для оценки результатов оперативного лечения в динамике больным предлагали повторные смотры через 30, 180 и 360 суток после вмешательства. В эти сроки, помимо повторного УЗ-исследования, уделяли внимание выраженности, характеру и длительности болевого синдрома, присутствию неприятных ощущений в области имплантации эндопротеза.

Для оценки эффективности использования нитей ПГА в клинике использовали результаты ушивания послеоперационных ран 31-го пациента после операций на передней брюшной стенке (мини-инвазивная холецистэктомия, грыжесечение, аппендэктомия). При этом раны ушивали с помощью внутреннего погружного косметического шва по Холстеду. С целью сравнения использовали синтетический рассасывающийся шовный материал Капрофил. Наблюдение за пациентами осуществляли в стационаре на протяжении 9 суток, а затем амбулаторно в течение 3-х месяцев.

Клиническое изучение эффективности резорбируемых эндопротезов включало результаты наблюдений 32-х пациентов с механической желтухой, из них 13 - опухолевого генеза и 19 пациентов - с рубцовыми стриктурами холедоха (таб. 3). Больные были сопоставимы по тяжести, полу, возрасту, длительности и причине возникновения синдрома механической желтухи.

Таблица 3.

Распределение больных по причине возникновения механической желтухи

Причина возникновения желтухи	Группа сравнения	Исследуемая группа
Рак головки pancreas, дистальный блок холедоха	2 (11,0%)	2 (26,7%)
Cancer гепатикохоледоха, опухоль Клатскина	2 (14,0%)	5 (13,3%)
Рак желчного пузыря	2 (11,0%)	-
ЖКБ, холецистохолангиолитиаз, холангит, рубцовая стриктура холедоха	10 (64%)	9 (60%)

Объем оперативного вмешательства определялся причиной синдрома механической желтухи и уровнем окклюзии ВЖП. У пациентов исследуемой группы с дистальным блоком холедоха (рак головки pancreas) в 2-х случаях стентирование выполнить не удалось, в этих случаях после билиодигестивного анастомоза было выполнено каркасное стентирование зоны анастомоза для профилактики рестенозирования и несостоятельности анастомоза. При опухолевом блоке гепатикохоледоха удалось бужировать стриктуру и имплантировать стент без наложения билиодигестивного анастомоза. Такой вариант стентирования позволил минимизировать объем вмешательства и восстановить проходимость гепатикохоледоха (таб. 4).

Таблица 4.

Распределение больных с механической желтухой по группам исследования

№ группы	Характеристика группы	Количество больных
Группа сравнения	Механическая желтуха, традиционные методы декомпрессии ВЖП (ЭПСТ, холедохотомия, дренироваие холедоха, билиодигестивный анастомоз)	17
Исследуемая группа	Механическая желтуха, эндобилиарное стентирование с использованием стентов из ПГА, каркасное стентирование билиодигестивного анастомоза	15
	ВСЕГО	32

Для непротяженной низкой стриктуры рубцового генеза мы разработали оригинальный способ стентирования холедоха. После обработки операционного поля из малоинвазивного доступа с помощью набора инструментов «Мини-ассистент», г. Екатеринбург, выполняли холедохотомию (холецистэктомия – по показаниям). Предварительно для уточнения уровня блока холедоха выполняли ретроградную панкреатохолангиографию. Далее модифицированным зондом Фогарти с усиленной манжетой производили баллонную дилятацию стриктуры, затем по зонду проводили стент до упора. Затем для контроля проходимости холедоха выполняли интраоперационную холангиографию. Далее контроль проходимости холедоха осуществляли через 2-3 недели по показаниям эндоскопически (использовали дуоденоскоп фирмы Olimpus). У всех больных в течение 38 суток определяли общие и биохимические параметры крови, Мониторинг содержания общего билирубина проводили через 3, 7, 10, 14, 28, 38 суток наблюдения.

Для оценки эффективности материала ПГА для закрытия костных дефектов исследованы результаты лечения 33-х больных с переломами верхних и нижних конечностей, в том числе осложненных хроническим остеомиелитом, находившихся на лечении в II хирургическом и травматологическом отделениях МБУЗ ГКБ№7 с 2008 по 2012 гг.

Для пластики дефектов костной ткани использовали гранулированный порошок из ПГА с добавлением антибактериального препарата Тиенам при закрытии первично и вторично инфицированных дефектов в соотношении 1:10, и пресс-формы для замещения дефектов при импрессионных и оскольчатых переломах костей верхних и нижних конечностей.

Все больные были оперированы. Пациенты разделены на 3 группы. Первую группу составили 13 больных с дефектами костной ткани в области переломов, в том числе страдающих посттравматическим остеомиелитом, которым после некрсеквестрэктомии в пределах здоровых тканей была выполнена традиционная костная пластика - закрытие дефекта аутокостью, дренирование. Во вторую группу были включены 11 пациентов, которым для пластики дефекта был использован материал коллапан, в третью – 9 больных, которым была выполнена комбинированная пластика дефекта костной ткани – дефект заполнялся материалом ПГА, после чего с помощью ультратонких пленок выполнялась пластика надкостничного дефекта. С целью фиксации дополнительно по показаниям применяли титановые пластины (рис. 1).

а б

в

Рис. 1. Этапы пластики остеомиелитического дефекта верхней трети голени: а – некрсеквестрэктомия, б - ипмлантация гранулированного материала ПГА в полость дефекта, в - фиксация с помощью титановой пластины.

Контроль эффективности осуществляли рентгенологически (до вмешательства, через 30 и 90 суток после вмешательства), с учетом клинических и лабораторных показателей (сроки заживления, восстановления опорной функции конечности, временной нетрудоспособности и пребывания в стационаре, длительность антибактериальной терапии).

По локализации поражения больные распределялись следующим образом: бедренная кость - 14 пациентов, кости голени - 8 (30,4%), плечевая кость - 7 (10,9%), пяточная кость и коленный сустав - 6 (2,2%). Посттравматический остеомиелит диагностирован у 24 больного, послеоперационный - у 7 (28,3%), огнестрельный – у 2-х.

Статистическая обработка клинического материала.

Статистическая обработка полученных в исследовании данных проводилась на персональном компьютере в статистическом пакете Statistica v.8.0 (StatSoft, США).

Проводилось вычисление всех необходимых параметров описательной статистики (средних, ошибок средних, среднеквадратических отклонений, дисперсий, медиан, интерквартильных интервалов и т.д.), а также анализ соответствия вида распределения качественных признаков нормальному закону с применением критерия Шапиро-Уилка.

При сравнении групп по количественному нормально распределенному признаку использовали t-критерии Стьюдента для связанных и несвязанных выборок, в остальных случаях использовали непараметрические методы – критерии Манна-Уитни (Z), Вилкоксона, угловое преобразование Фишера (*), 2.

Для анализа взаимосвязи двух признаков проводили в случае нормального распределения качественных признаков корреляционный анализ по Пирсону, во всех остальных случаях использовали критерий 2, или проводили корреляционный анализ по Спирмену.

Данные в тексте в зависимости от типа представлены в виде M±SD, Me (LQ; UQ), % (n/N), средние величины округлены до разрядности на один знак точнее исходных данных. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

Работа выполнена в рамках программно-комплексного исследования университета «Применение биополимеров нового класса - полиоксиалканоатов - в хирургии» (№ гос. регистрации 01200807478) и в рамках серии грантов и проектов: грант Президента РФ МК-6025.2008.7; «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности» (Проект Разработка и внедрение в хирургическую практику высокотехнологичных изделий из материала нового поколения «Биопластотан», 2010 г.); Программа Президиума РАН «Фундаментальные науки-медицине» (проект № 21-12 «Исследование резорбируемых полиэфиров для внедрения в медицинскую практику нового класса биосовместимых материалов и конструкций из них»); Мега-грант «Биотехнология новых биоматериалов» (Договор № 11.G34.31.0013) Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских учреждениях высшего профессионального образования (Постановление правительства РФ « 219 от 9 апреля 2010 г.).

Результаты исследований.

Характеристика экспериментальных изделий медицинского назначения из полигидроксиалканоатов – результаты экспериментальных исследований

Свойства пленочных мембран из растворов ПГА

По изученным характеристикам поверхность ПГА-матриксов – гидрофобна и аналогична свойствам поверхности матриксов из синтетических полимеров (полиэтилентерефталата, полиметиметакрилата, поливинилхлорида и полиэтилена).

Физико-механические свойства пленок из различных сополимеров представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Физико-механические свойства наливных пленок различного состава и толщины

Состав образца мол.%	Толщина, мм	Модуль упругости, МПа	Прочность при разрыве, МПа	Удлинение при разрыве, %
П3ГБ (100%)	0,04	1009,40±126,42	22,56±1,75	29,4
П3ГБ/3ГВ (93.5/6.5)	0,035	1474,61±161,51	33,13±2,57	35,7
П3ГБ/3ГВ (89,5/10,5)	0,04	827,44±150,99	24,61±0,84	51,6
П3ГБ/3ГВ (80/20)	0,04	424,10±36,38	13,06±1,61	47,34
П3ГБ/3ГВ (67/33)	0,04	268,22±45,37	12,37±2,76	98,21
П3ГБ	0,030	1340,24±173,36	18,93±1,12	9,2
П3ГБ	0,070	1193,83±58,30	23,23±0,61	29,14
П3ГБ	0,115	1061,65±71,67	21,07±0,84	50,92

Очень важное свойство изделий из ПГА – возможность моделирования их свойств, в частности, нагружать их препаратами различного действия. Для сравнительного исследования динамики высвобождения препаратов из пленок были получены образцы с депонированным гентамицином и мовалисом (мелоксикам). Включение препаратов составило по 1%. На рисунке 2 представлены кривые выхода этих препаратов в среду (фосфатный буфер). Доля высвободившихся препаратов в первые сутки составила 2,09±0,39% и 0,01±0,009% от включенного в матрикс для мовалиса и гентамицина соответственно. Далее, в течение последующих 5 суток (120 ч) отток мовалиса резко увеличился и достиг 6,82±0,45% от включенного в матрикс. Начиная с 6-х суток (144 ч) и до конца эксперимента наблюдали постепенное снижение оттока препарата, которое составило 0,0042±0,00035% в сутки. В случае с гентамицином наблюдали более продолжительную фазу увеличения концентрации антибиотика в среде, которая длилась в течение 8 суток (192 ч). За 8 суток от начала эксперимента выход гентамицина составил 6,41±0,48% от включенного в матрикс. В целом, выход мовалиса из 3ПГБ пленок был достоверно выше и составил 8,45±0,3% по сравнению с гентамицином - 7,49±0,4%.

Рисунок 2. Динамика выхода различных антибиотиков из 3ПГБ пленок при 1% содержании в матриксе (Мв гентамицина – 478 Да; Мв мовалиса (мелоксикам) – 351 Да).

Биосовместимость 2D матриксов, изготовленных из полимеров различного химического состава изучена в культуре клеток in vitro. Результаты подсчета клеток с использованием флуоресцентных зондов на ДНК (DAPI) и цитоплазму (FITS) дали следующие результаты. Спустя 24 ч после засева пленок фибробластами NIH 3Т3, их количество в контроле (полистирол) и полимолочная кислота (ПМК) было достоверно ниже, чем на мембранах из ПГА; это отставание сохранялось на протяжении 4 суток. Однако к концу наблюдения количество клеток на полистироле было сопоставимо с экспериментальными пленками из ПГА, но достоверно меньшее количество клеток на полилактиде сохранилось. На матриксах ПГА получены следующие результаты: через 4 суток количество клеток на пленках из П3ГБ составило n=154±13,4; на П3ГБ/3ГВ (13 мол. %) соответственно n=180±13,9; при этом статистически значимых различий между П3ГБ и сополимерными мембранами всех типов не выявлено. В конце наблюдения (7 суток после засева) количество клеток было достоверно самым низким – n=300±14,6 клеток/поле на ПМК. На пленках из ПГА количество клеток было близким и составило (клеток/поле) n=440±27,4 на П3ГБ; (близко к контролю); n=423±32,6 – на П3ГБ/3ГВ-13.

Жизнеспособность клеток, культивируемых на образцах из ультратонких волокон, оцениваемая в МТТ-тесте, представлена на рис. 3. По этому показателю влияния диаметра волокон и толщины образца на физиологическую активность культивируемых фибробластов не выявлено; через 24 ч после засева количество клеток во всех вариантах было близким и составило от 1.52 до 1.95103 клеток/мл; через 3- е суток - от 6,55 до 8,02103 клеток/мл. Несмотря на то, что отмечена некоторая тенденция снижения количества жизнеспособных клеток с увеличением диаметра волокон, зарегистрированные отличия не достоверны.

Рисунок 3. Жизнеспособность клеток на нетканых мембранах, полученных методом электростатического формования из П3ГБ, с разным диаметром волокон (в зависимости от концентрации исходного раствора) (контроль-полистирол).

Таким образом, полученные из П3ГБ с применением метода электростатического формования ультратонкие пленки разного диаметра и сформированные из них образцы нетканого полотна, отличающиеся физико-механическими характеристиками, обладают высокой адгезионной способностью по отношению к клеткам фибробластического ряда и поддерживают рост клеток аналогично контролю.

Результаты экспериментальных исследований модифицированных эндопротезов.

Изучение физико-механических характеристик модифицированных эндопротезов показало, что полимерное покрытие не ухудшало структуры поверхности и не влияло отрицательно на прочностные свойства сеток (таблица 6)

Таблица 6.

Физико-механические характеристики сетчатых эндопротезов

Характеристика образца	Толщина образца, мм	Е, МПа	, МПа	, %
Непокрытые сетчатые эндопротезы	0,05	11,36±0,54	7,45 ±1,57	141,7± 8,6
Покрытые сетчатые эндопротезы	0,05	11,42±1,67	7,36±2,42	134,3±3,1

Во все сроки эксперимента на образцах с покрытием обоими типами ПГА количество жизнеспособных клеток было достоверно выше по сравнению с исходным эндопротезом без покрытия на 25-30 %.

Таким образом, покрытия для сетчатых хирургических эндопротезов из ПГА благоприятны для адгезии клеток на их поверхности и увеличивают их пролиферативный потенциал.

В ходе исследования было выявлено, что макрофагальная реакция на протяжении всего периода наблюдения была достоверно менее выражена и носила локальный характер в 3-й и 6-й группах животных, в которых применялись эндопротезы с покрытием на основе ПГА. В 1-й и 4-й группах животных (без покрытия ПГА), макрофагальная реакция была более выраженной и распространенной на всех сроках эксперимента, за исключением животных группы 1, которым протез устанавливался в позицию «sublay». Кроме того, в группах 3 и 6, в отличие от других групп исследования, в области установки эндопротезов с покрытием на основе ПГА не было выявлено формирования гранулем. То же самое можно сказать по поводу гигантоклеточной реакции – в препаратах, полученных от животных группы 3, гигантских клеток не обнаружено, а у животных 6 группы, у которых эндопротез устанавливался во внутрибрюшную позицию, они были единичными на ранних сроках, и только в половине случаев встречались у животных, выводимых из эксперимента на 60-е и 90-е сутки наблюдения. Необходимо отметить, что наиболее выраженная гранулематозная и гигантоклеточная реакция наблюдалась у животных 2 и 4 групп при применении комбинированных полипропиленовых эндопротезов, содержащих волокна из сополимера лактида и гликолида.

Процесс образования фиброзной капсулы вокруг волокон эндопротеза протекал быстрее в случае применения протезов с ПГА-покрытием. Удельный объем грубоволокнистой оформленной соединительной ткани в области установки эндопротеза был в среднем на 10% выше уже на втором месяце эксперимента у животных 3 и 6 групп в сравнении с остальными группами. При этом степень вовлеченности окружающих тканей была статистически значимо меньшей, чем у животных, которым были установлены протезы без ПГА-покрытия. Особенно выражены эти различия были в группах животных 1, 2 и 3 при расположении протезов в позиции «sublay».

При использовании протезов с ПГА-покрытием распространенность фиброза была ограничена зоной установки эндопротеза. Причем сохранность мышечного слоя, т.е. отсутствие явлений фиброзирования окружающей мышечной ткани позволяет говорить о сохранности функциональной активности мускулатуры в зоне установки эндопротеза.

При выполнении секционного исследования в случае интраабдоминального расположения протезов наблюдались статистически значимые различия между 6 группой животных, в которой спаечный процесс был обнаружен только у 7,5% особей, и группами 4 и 5, в которых практически у всех животных (100% и 97,5% соотв.) имел место спаечный процесс различной степени выраженности.

Выявленные морфологические изменения свидетельствуют о том, что применение сетчатых эндопротезов, покрытых ПГА, позволяет достичь более скорого укрепления передней брюшной стенки при меньшем воспалительном ответе.

Характеристика шовных волокон, полученных из ПГА.

Внешний вид экспериментальных монофиламентных шовных волокон из ПГА представлен на рис. 3.

Рисунок 4. Внешний вид монофиламентных ориентированных волокон, полученных экструзией из расплава 3-ПГБ/3-ПГВ: диаметр 0.1 мм; а- натуральные размеры; б – увеличение в 4 раза.

Полученные волокна имели практически круглое сечение. Средняя площадь сечения - 0.0344 мм2..Результаты исследования механо-физических свойств волокон, включающие в качестве показателей абсолютную разрывную нагрузку, прочность при разрыве, относительное разрывное удлинение и модуль упругости, представлены в таблице 7.

Прочность волокон в узле, оцениваемая по отношению к разрывной прочности, составила 60-70 %. В целом, можно констатировать, что полученные волокна обладают удовлетворительными показателями прочности. Это позволили начать их медико-биологические исследования. Результаты изучения влияния стерилизации на свойства моножильных шовных нитей показали, что оба метода стерилизации практически не влияли на прочностные свойства нитей, изготовленных из 3ПГБ/3ГВ.

Таблица 7.

Характеристики экспериментальных образцов ПГА-нитей (М*±м)

Показатель	Тип ПГА 3-ПГБ/3-ПГВ
Абсолютная разрывная нагрузка (Fр), Н	9.26±0.19
Прочность при разрыве, МПа	340±27
Относительное разрывное удлинение, %	27.30 ±1.74
Модуль упругости, ГПа	3.35

*-среднее из 10 измерений

Данными исследованиями установлена возможность применения для стерилизации волокон, изготовленных из ПГА, общепринятых методов стерилизации и показано, что их прочностные свойства не ухудшаются в процессе термообработки, а также после -облучения.

Результаты сравнительного изучения биодеградации in vivo монофиламентнтных нитей из ПГА и коммерческого шовного материала свидетельствовали о том, что потеря прочности викрила на 50 % от исходной величины зафиксирована уже через 12 суток; максона – через 28 суток. Полная потеря прочности этих волокон произошла, соответственно, для викрила и максона через 60 и 80 суток.

Мы проанализировали особенности взаимодействия нитей ПГА с помощью иммуноморфогистохимических методов и сравнили результаты их использования с викрилом и капрофилом. Подводя итоги в отношении группы животных, у которых в качестве шовного материала использовался «Викрил», можно сказать следующее. На ранних сроках преобладала воспалительная инфильтрация макрофагами с формированием обширных некрозов. На более поздних сроках наблюдения одновременно с процессами резорбции шовного материала верифицированы репаративные процессы, характеризующиеся перифокальным фиброзированием. Сосудистые реакции проявлялись функциональными изменениями, такими как полнокровие в сосудах капиллярного и венулярного типа. При этом число сосудов в различные сроки оставалось относительно постоянным. Выявлена тенденция к увеличению удельного объема сосудов на 120 сутки эксперимента с последующим снижением данного показателя. Изменения плотности васкуляризации ткани в зоне операционного вмешательства вероятно находится как под влиянием VEGF, образуемого интерстициально расположенными фибробластоподобными клетками, так и под влиянием иных факторов, ассоциированных с макрофагами. Однако, это не исключает опосредованное влияние макрофагов на процессы ангиогенеза. На 180-е сутки эксперимента зафиксировано полное замещение воспалительно-некротического инфильтрата хорошо выраженной фиброзной тканью с резорбцией шовного материала.

Итоги оценки внутригрупповых изменений при использовании шовного материала «Капрофил» в эксперименте позволяют высказаться в пользу стереотипности изменений, возникающих в области нахождения шовного материала. Преобладающим типом реакций на 30-120 сутки эксперимента являлись альтеративно-воспалительные процессы, сменяющиеся в последующем на процесс репарации с нарастанием фибротических реакций. Вероятным отражением активной выработки VEGF на 120 сутки эксперимента явилось усиление васкуляризации зоны повреждения, с последующим снижением количества сосудов, что, вероятно, объяснимо нарастающим фиброзированием.

Принципиально отличающиеся результаты были получены при изучении изменений типа «нить-ткань» у животных, раны которых были ушиты с использованием ПГА-нити.

Изменения, возникающие на ранних сроках эксперимента, характеризовались минимальной макрофагально-гистиоцитарной инфильтрацией с формированием в ряде случаев хорошо выраженной гигантоклеточной реакции иммунитета. При этом уже на 120 сутки в результате биодеградации и вероятно макрофагальной резорбции материала без формирования обширных гнойно-некротических очагов происходила частичная резорбция шовного материала. В участках, ранее содержавших шовные элементы формировалась зона разрастающейся фибро-ретикулярной ткани с минимальной лимфо-гистиоцитарной инфильтрацией без признаков диффузного коллагенообразования. В этой связи можно говорить о преобладании на протяжении всего срока эксперимента процессов репарации над процессами альтерации.

В целом, применение в эксперименте ПГА-нитей сопровождалось на ранних сроках (30 суток) активацией макрофагального звена иммунитета с нарастанием количества CD68+ макрофагов, а также появлением в воспалительном инфильтрате гигантских многоядерных клеток типа инородных тел. При этом во всех случаях такая инфильтрация носила очаговый характер и не распространялась на окружающие ткани, что подтверждают данные морфометрического анализа. Важно отметить, что подобная тенденция прослеживалась и при морфологическом изучении тканей передней брюшной стенки в месте контакта с модифицированными ПГА-покрытием эндопротезами.

Формирующаяся фиброретикулярная капсула в окружении шовного материала достигала своего максимума к 120 суткам и в последующем оставалась практически в неизменном виде. Столь минимальные изменения в окружении материала, вероятно, связаны не только с антигенными свойствами материала, но и с особенностями биодеградации. Сохраняющийся до 30 суток эксперимента материал частично подвергался биодеградации на 180 сутки эксперимента, что снижало антигенную нагрузку и не приводило к нарастанию воспалительной макрофагальной реакции и предупреждало интенсивность перифокальных фибротических реакций. При проведении корреляционного анализа была выявлена выраженная положительная корреляционная связь между уровнем экспрессии VEGF и удельным объемом CD31+ эндотелиоцитов в течение всего эксперимента. При этом нарастание числа CD68+ клеток в исследуемом субстрате сопровождалось снижением экспрессии VEGF и удельного объема CD31+ клеток. Такие показатели могут указывать на отсутствие прямой заинтересованности CD68+ клеток в продукции VEGF, а с другой стороны, могут указывать на их опосредованное влияние на ангиогенез.

Межгрупповое сопоставление уровня экспрессии VEGF позволяет говорить о большем уровне экспрессии этого ростового фактора на всех сроках эксперимента при использовании ПГА-нитей в сравнении с другими биодеградируемыми материалами.

Такое подробное гистоморфологическое исследование позволило сформировать представления об особенностях взаимодействия изучаемого шовного материала и расширить диапазон его применения.

Более показательно с клинической точки зрения выгодные свойства ПГА-нитей были продемонстрированы в разделе, где была изучена возможность их использования для формирования разных видов межкишечных анастомозов.

Несмотря на малую выборку в экспериментальных группах, мы получили достоверно положительные результаты. Формировали 3 вида анастомозов: энтероэнтеро-, гастроэнтеро- и холецистоэнтероанастомозы. Учитывая современные тенденции в хирургии кишечника и предпочтения ведущих хирургических школ, нами выбран однорядный узловой серозо-мышечный шов. В качестве сравнения был использован викрил.

Нити ПГА оказались не только пригодны для наложения межкишечных соустий, но и зарекомендовали себя лучше, чем нити из полилактида.

Результаты комплексной оценки выраженности спаечного процесса в брюшной полости достоверно подтвердили эффективность использования предлагаемого моножильного шовного материала. В группах, где был применен викрил, спаечный процесс был более выражен, что способствовало развитию такого осложнения как острая спаечная кишечная непроходимость, что в одном случае привело к летальному исходу.

Сравнительный анализ показателей периферической крови в динамике не выявил каких-либо существенных отличий между исследуемыми группами оперированных животных, однако статистически значимые различия по ряду параметров все-таки были выявлены. Операционная травма, воспалительные изменения в стенке кишки после наложения анастомозов, и развившиеся осложнения в группах, где использовался викрил, отразились на динамике уровня лейкоцитов, СОЭ, активности амилазы и трансаминаз на протяжении всего периода наблюдения. У животных 1, 4 и 6 групп эти показатели к 100-м суткам соответствовали нормальным значениям.

Показатели неспецифического иммунитета оперированных животных в 1 и 2 группах по сравнению с нормальными значениями были умеренно снижены, что, по нашему мнению, может быть причиной длительной антигенной нагрузки и хронического системного воспаления. В остальных группах статистически значимых различий изучаемых параметров неспецифической защиты у животных исследуемых групп мы не наблюдали.

Для конструирования трубчатых полностью биоразрушаемых эндобилиарных стентов были использованы растворы ПГА. Технология получения стентов отработана с применением двух различных методов. В первом варианте были взяты растворы ПГА в дихлорметане, которые наносили послойно на поверхность стеклянной трубчатой матрицы. После испарения растворителя сформированную полимерную трубочку снимали с матрицы. В результате исследований получена серия трубчатых стентов, гладкие и со складчатой поверхностью (рис. 5).

Рисунок 5. Прототипы полностью резорбируемых эндопротезов трубчатой формы, изготовленные из ПГА

Получены модели трубчатых эндопротезов различного диаметра, от 3,0 мм до 10,0 мм, длиной 50-80 мм; толщина стенок составила от 0,08 мм до 0,1 мм. Эти стенты были недостаточно эластичными, и их длина не превышала 8 см. Это ограничивало применение эндорпотезов.

Второй вариант базировался на использовании метода электростатического формования (ЭФС) полимерного раствора ПГА с использованием установки Nanon. Стенты, полученные методом ЭСФ, имели по сравнению с полученными первым методом более высокие прочностные характеристики при возможности варьирования размерами (длина и диаметр трубки) (таблица 8). Прежде всего, метод обеспечил получение эндопротезов большей длины. Стенты имели более высокие прочностные характеристики и были более эластичными.

Таблица 8.

Физико-механические характеристики стентов, полученных из ПГА методом ЭСФ

Длина, см	Ширина, мм	Толщина стенок, мм	Е, МПа	, МПа	, %
30 – 250	Диаметр 5-15 мм	0.05-0.09	1439.6±249.0	35–65	6–11

В результате имплантации стентов in vivo получены следующие результаты. После выведения животных 2 группы из эксперимента, у которых были установлены стенты из ПГА, на аутопсии выпота, спаечных, рубцовых изменений в свободной брюшной полости и подпеченочном пространстве выявлено не было. Холедох в месте установки стента имел обычный вид; расширения, воспалительной реакции, рубцового процесса не визуализировалось. Все имплантированные стенты находились там, где были изначально установлены, ни в одном случае миграции стента не отмечено.

Просвет холедоха в месте установления стента у всех животных был сохранен, имел обычные размеры (0,4-0,5 мм), деформаций, стриктур, рубцовых и воспалительных изменений в зоне имплантирования стентов не отмечено. При извлечении стентов зафиксировано неплотное сращение со слизистой холедоха, при незначительном усилии последние были легко извлечены из просвета холедоха. Стенты сохраняли первичные физические свойства, не были подвержены процессам кальцификации, не отмечено сужения просвета стентов, диаметр их составил 3,5±0,1 мм. Дефектов вследствие биодеградации не обнаружено, имело место лишь уменьшение толщины стенки стента, в среднем она составила 0,05-0,08 мм. Участков сужения просвета стентов не зафиксировано.

Результаты исследования общеклинических и биохимических показателей крови животных показали, что они находились в пределах физиологической нормы. Незначительное повышение количества лейкоцитов (от 10 до 12*109/л) и уровня СОЭ (до 10-15 мм/ч) отмечены на 7 сутки после оперативного вмешательства во всех группах у оперированных животных относительно контроля. У животных 1 исследуемой группы к концу периода наблюдения сохранялось умеренное повышение СОЭ (до 10,1±3,3 мм/ч). Сдвигов в лейкоцитарной формуле крови экспериментальных животных во все сроки наблюдения также не выявлено.

Анализ результатов определения мочевины, общего белка в сыворотке крови животных свидетельствовал об отсутствии негативного влияния имплантированных полимерных изделий на показатели азотистого обмена и функцию почек животных. Достоверных различий между группой сравнения и исследуемыми группами среди показателей, характеризующих функцию поджелудочной железы (амилаза крови), также выявлено не было. У животных 1 группы с 30-х суток отмечено умеренное повышение уровня общего билирубина, которое было обусловлено нарушением оттока желчи вследствие миграции и сужения просвета силиконовых стентов.

Определение показателей функции печени не выявило патологических отклонений в экспериментальной группе животных. Зарегистрированное в течение первого периода наблюдений умеренное повышение активности АЛТ было обусловлено операционной травмой и токсическим действием препаратов для наркоза.

Результаты определения степени влияния имплантированных полимерных стентов на показатели неспецифического иммунитета животных исследуемых групп характеризовались умеренным повышением активности, о чем свидетельствует незначительное увеличение уровня фагоцитоза и стимулированной хемилюминесценции. Однако, снижения, угнетения фагоцитарной активности не отмечено, что свидетельствует об отсутствии длительной антигенной нагрузки и феномена «иммунологического паралича».

При морфологическом исследовании не выявлено данных, свидетельствующих о том, что стенты из ПГА вызывают патологических реакций тканей желчевыводящих путей. Ткань стенки холедоха в месте стояния стента соответствовала физиологической норме, без признаков атрофии, фиброза и воспаления.

Экспериментальные исследования костнозамещающих имплантатов на основе ПГА

Использование методов прямого холодного прессования позволяет получать из высокомолекулярных соединений объемные изделия различных размеров и геометрии.

Для замещения дефектов костной ткани сконструирована серия объемных имплантатов из ПГБ, сополимеров ПГБ/ПГВ и композита ПГА/ГАП различных размеров и формы.

Серия объемных форм, полученных из гомополимера П3ГБ и сополимера 3ГБ/3ГВ с различным включением 3-гидрксивалерата, имела сходные характеристики, как по структуре поверхности, так и по плотности матрикса и величине влагопоглощения.

Плотность образцов с увеличением содержания ГАП несколько возрастала. Наполнение полимера гидроксилапатитом значительно влияло на гидрофильность полимерных конструкций, которая увеличивалась с ростом содержания в композите ГАП. Влагопоглощение у образца с самым низким (10 %) содержанием ГАП составило 2,3 %, а 18,9 % у образца, в котором соотношение ПГБ:ГАП было равным 50:50. Таким образом, варьируя соотношение составляющих в композите ПГБ/ГАП, можно получать биоматериал различной степени гидрофильности.

Полученные изделия обладали достаточно высокой механической прочностью и имели следующие физико-механические показатели: абсолютная прочность - на уровне 30-40 МПа, модуль Юнга 1-3 - 4-6 ГПа. Образцы, изготовленные из менее кристалличного сополимера ПГБ/ПГВ, имели более высокую механическую прочность по сравнению с изделиями из высококристалличного ПГБ. Полученные объемные матриксы возможно обрабатывать с целью придания специфической формы.

Внешний вид полученных пористых матриксов показан на рис. 6. Композитные матриксы ПГБ/ГАП имели более высокие показатели суммарной пористости (от 0,76 ± 0,12 до 0,89 ± 0,20) по сравнению с матриксами из чистого ПГА (0,65 ± 0,12).

Рисунок 6. Пористые матриксы, полученные из композитов ПГБ/ГАП с различным соотношением компонентов: ПГБ/ГАП= 80:10 (а), 80:20 (б).

Результаты культивирования клеток in vitro в тесте с MТT представлены на рис. 7, из которого следует, что количество пролиферирующих остеобластов было больше на всех образцах композита П3ГБ/ГАП по сравнению с полимерным матриксом из П3ГБ, не содержащем ГАП. Наибольший прирост клеток зафиксирован на матриксах из композита П3ГБ/ГАП с содержанием гидроксиапатита 10 и 20 %, соответственно, 240 106 и 260 106. При более высоком содержании ГАП в композите (30% по массе) плотность клеток была ниже, однако достовернее выше, чем на полимерном матриксе. Это можно объяснить тем, что более гидрофильная поверхность композитных матриксов способствовала более активной прикрепляемости клеток, в результате этого исходная концентрация прикрепленных клеток на П3ГБ/ГАП была выше, чем на матриксе из ПГБ.

Рисунок 7. Прирост метаболически активных остеобластов крысы в тесте МТТ (A) и активность щелочной фосфатазы (Б) in vitro на 10-й день культивирования на композитных матриксах П3ГБ/ГАП с содержанием гидроксиапатита 10, 20 и 30 % w/w (2,3 и 4, соответственно) по сравнению с матриксом из П3ГБ (1).

Таким образом, 3D матриксы из ПГА не оказывают негативного влияния на жизнеспособность клеток остеобластического ряда и обеспечивают нормальную пролиферацию.

В экспериментах на лабораторных животных на модели сегментарной остеотомии доказано, что собственно полигидроксибутират (ПГБ) и в сочетании с гидроксилапатитом обладает выраженными остеопластическими свойствами, медленно деградирует in vivo, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза.

Оценка остеогенного потенциала полимерных (ПГБ) и композитных (ПГБ/ГАП) имплантатов.

Все животные удовлетворительно перенесли оперативное вмешательство; видимых осложнений в послеоперационном периоде не наблюдали. Через 7-8 дней движения оперированной конечности восстанавливались в полном объеме. В группе сравнения у одного животного полная опороспособность была зарегистрирована на 5 суток позднее, чем у остальных. Это подтверждено рентгенологически. Регенерация костного дефекта с образованием более плотной костной ткани через 3 месяца достоверно выше была после применения имплантатов из ПГА по сравнению с процессом репаративного остеогенеза, протекающего под сгустком крови без имплантата.

Через 3 месяца в препаратах были видны отдельные мелкие фрагменты разрушающегося полимера которые не включились в состав остеогенной ткани и находились отдельно от неё в виде кластеров.

Площадь, занимаемая фрагментами полимера, составила не более 25% от исходной. Присутствие полимерного материала в эти сроки свидетельствует о низких скоростях его резорбции. Через месяц объем остеогенной ткани заметно увеличился, но расположение костных пластин было хаотичным; система остеонов выражена в меньшей степени, чем при использовании ПГБ.

При использовании имплантата из остеозамещающего материала «Bio-OSS®» регенерация костного дефекта протекала на фоне более активной резорбции матриксов в сравнении с матриксами на основе ПГБ.

Восстановление костного дефекта в контроле, без имплантата («под свертком крови»), протекало по обычной схеме реконструкции. Через 14 суток в препарате отмечены признаки непрямого (энхондрального) остеогенеза. Через месяц зафиксирована менее зрелая по сравнению с экспериментальными группами животных компактная кость с гаверсовыми системами и линиями цементации. Активность остеогенных клеток и остеобластов при этом невелика; остеокластический феномен отсутствовал. На сроке три месяца препарат был представлен компактной костью, костно-мозговой канал широкий, заполнен кроветворными клетками.

Проведенные исследования собственно полигидроксибутирата (наиболее распространенный и изученный представитель семейства ПГА), а также сочетание этого биополимера с гидроксилапатитом показали, что этот тип биоматериала обладает остеопластическими свойствами и обеспечивает нормальное течение репаративного остеогенеза.

Исследование эффективности ПГА для реконструкции костных дефектов на модели хронического остеомиелита.

В раннем послеоперационном периоде (до 3 суток) животные оставались вялыми, мало двигались, щадили оперированную конечность. Аппетит и двигательная активность кроликов восстанавливалась к 3-5 суткам, однако отсутствовала опора на больную конечность. На 5-12 сутки после операции у 19 животных выявлен отек мягких тканей в области операции, у 12 – локальная гиперемия кожи.

Результаты сравнительного анализа клинической картины животных исследуемых групп показали следующее. В среднем на 16,5±3,2 сутки отек и гиперемия купировались. Опора на конечность появлялась на 6,22±1,72 сутки после операции. Операционные раны заживали в среднем на 11±1,32 сутки. Летальных случаев в послеоперационном периоде не наблюдали. В экспериментальных группах заживление операционной кожной  раны произошло в среднем через 7,4±0,9 суток; купирование отека и гиперемии мягких тканей - через 8,75±0,96 суток; в группе сравнения, соответственно, на 9,9±1,7 и 11,7±1,8 суток. Восстановление опороспособности оперированной конечности у экспериментальных животных получено на 4,28±0,9 сутки; в группе сравнения – на 5,56±1,2 сутки.

Анализ рентгенографических данных оперированных конечностей животных (рис. 8) выявил следующее: на 30-е сутки после применения для пластики дефекта с использованием ПГА и ПГА/тиенам в проекции костного дефекта определялись участки просветления округлой формы с четкими границами, с облачковидным затемнением в центре. На 90 сутки у животных первой и второй исследуемых групп рентгенологически подтверждалось восстановление анатомической структуры кости. В группе сравнения в эти сроки сохранялась неоднородность структуры регенерата и утолщение надкостницы.

При исследовании микробного профиля первой группы на 30 и на 90 сутки высевались ассоциации микробов преимущественно в 48,2% Staphilococcus aureus, в 51,8% ассоциации грамм + и - анаэробных микроорганизмов, E. сoli. Во второй группе животных на 30 сутки высевались ассоциации микробов преимущественно в 44,1% Staphilococcus aureus, в 55,9 % ассоциации грамм + и - анаэробных микроорганизмов, E. Coli, на 90 сутки бактериоскопические исследования были отрицательными. В третьей группе животных на 30–е и 90 - сутки при бактериоскопическом исследовании микробы не высевались.

Рисунок 8. Рентгенографические снимки оперированных конечностей животных на 30-е и 90-е сутки послеоперационного периода: 1-костный аутотрансплантант; 2-ПГА; 3-ПГА/тиенам. РУМ-20, 44 mA 0,1 kB, экспозиция 1 с.

При гистологическом исследовании препаратов экспериментальной группы с ПГБ и ПГБ/тиенам на 15-е сутки, дефект в центре был заполнен грубоволокнистой соединительной тканью с выраженной перифокальной пролиферацией капиллярного типа сосудов, очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрацией (рис. 9).

Рисунок 9. Гистологический срез костной ткани в области повреждения на 30, 90-е сутки (1 - формирующаяся костная балка, 2 - лизированная костная балка, 3 - костный мозг, 4 - дефект костной ткани, 5 -лейкоцитарная инфильтрация).

Преимущественно вокруг новообразованных сосудов отмечены очаги примитивного остеогенеза с формированием остеоидноподобных масс, а также костных балок с нарушенной архитектоникой, хаотичным расположением остеоцитов. Зона остеогенеза характеризовалась выраженной базофилией клеток и остеомукоида развивающейся костной ткани.

В группе сравнения в эти сроки дефект был заполнен рыхлой соединительной тканью с участками грануляционной и фибро-ретикулярной ткани и остатками детрита. Отмечена выраженная лейкоцитарная инфильтрация регенерата, гиперемия кровеносных сосудов со стазом форменных элементов крови, периваскулярный отек, сосудистая сеть была слабо выражена.

В экспериментальных группах на 30-е сутки дефект уменьшался в размерах, был заполнен грубо-волокнистой фиброзной, костной и хрящевой тканью. Вокруг сосудов вновь образующихся остеонов концентрически наслаивалось межклеточное вещество, формировались костные пластинки. По периферии дефекта, костная ткань была более зрелая, остеонно-балочного строения, расположение остеонов - нерегулярное, гаверсовы каналы различной ширины, полнокровны, периваскулярный отек отсутствовал. В контрольной группе дефект по периферии был заполнен незрелой костной тканью, в центре представлен грубо-волокнистой рубцовой и хрящевой тканью. Васкуляризация регенерата и окружающей костной ткани - слабая. Надкостница утолщена, инфильтрирована клетками макрофагального ряда.

При гистологическом исследовании на 60-е сутки микроскопически дефект в экспериментальной группе ПГБ/тиенам представлен сетью переплетающихся костных перекладин различной степени зрелости. Наблюдали явления активной перестройки грубоволокнистой костной ткани в пластинчатую кость. В группе сравнения наблюдали снижение темпов регенерации. В центре дефекта сохранялись прослойки плотной неоформленной соединительной ткани с чрезмерным отложением коллагеновых волокон, что вероятно создавало механический барьер на пути роста хрящевой и костной ткани. На границе рубцовой и костной ткани располагались очаги активно пролиферирующего хряща.

На 90-е сутки во всех препаратах экспериментальных групп имелись признаки, указывающие на полное восстановление целостности костной структуры. Надкостница была полностью моделированной, состояла из наружного и внутреннего слоев. Костная ткань - различной степени зрелости, пластинчатого строения, расположение остеонов нерегулярное, увеличивалось количество зрелых фиброцитов и остеоцитов. Межуточное вещество становилось оптически более плотным и гомогенным. Микроскопически в препаратах дефект заполнялся достаточно зрелой костной тканью, местами с прослойками хрящевой ткани. Преобладала плотная костная ткань с малочисленными остеонами, межклеточное вещество, менее гомогенное и рыхлое. Клетки представлены в основном зрелыми фибробластами и остеоцитами, не наблюдалось базофилии клеток и межклеточного вещества. Кортикальная пластинка сужена, костная ткань более зрелая, клетки малочисленны, в межбалочных пространствах сосуды синусоидного типа, костномозговой канал либо резко сужен, либо закрыт замыкательной пластинкой.

Таким образом, в ходе эксперимента установлено, что при использовании для пластики костного дефекта, осложненного хроническим остеомиелитом имплантатом ПГБ/тиенам, купирование воспалительного процесса, реконструкция костных дефектов и восстановление функциональных свойств оперированных конечностей происходило значительно эффективнее, чем в контрольной группе животных (использован материал аллокости). Морфогенез репаративных процессов в экспериментальных полостях бедренных костей кроликов после пластики ПГА характеризовался восстановлением анатомической и функциональной целостности костей к 60 суткам. При замещении костной полости деминерализованным костным аутотрансплантантом восстановления костной структуры не происходило.

Клинические результаты пилотных исследований изделий медицинского назначения на основе ПГА.

Клинические испытания сетчатых эндопротезов, модифицированных ПГА-покрытием. В описанных исследуемых группах применялись эндопротезы, модифицированные покрытием на основе ПГА, и моножильный шовный материал из этого же полимера.

В послеоперационном периоде в исследуемых группах были получены более низкие показатели ранних послеоперационных осложнений. Такие осложнения как серома чаще обнаруживались при выполнении УЗИ, а число случаев, требующих пункционного разрешения, было значительно меньше и статистически значимо не различалось в указанных группах. При осмотре больных в отдаленные сроки после оперативного вмешательства (через 6 и 12 месяцев) было выявлено следующее: у пациентов групп клинического сравнения, в отношении которых применялись эндопротезы без ПГА-покрытия, частота эндопротез-ассоциированных осложнений была выше, чем у пациентов исследуемых групп, которым во время операции устанавливали эндопротезы с покрытием на основе ПГА. В целом, эндопротез-ассоциированные осложнения в 2,5 раза реже выявлялись у пациентов исследуемых групп, чем в группах сравнения.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что применение сетчатых эндопротезов с покрытием на основе ПГА и одноименного шовного материала позволяет добиться уменьшения сроков госпитализации и временной нетрудоспособности пациентов, снизить частоту возникновения эндопротез-ассоциированных осложнений в отдаленном периоде.

Результаты клинических исследований применения нитей из ПГА

Согласно заранее разработанному протоколу проведения ограниченных клинических испытаний, в исследование включен 31 пациент, которым были выполнены неосложненные оперативные вмешательства на брюшной полости (аппендэктомия по поводу катарального аппендицита, миниинвазивная холецистэктомия по поводу хронического калькулезного холецистита, грыжесечение по поводу паховых грыж в плановом порядке).

У пациентов 1 группы сравнения, которым был наложен погружной косметический шов по Холстеду с использованием шовного материала Капрофил, в 4-х случаях в разные сроки (от 12 до 25 суток) были отмечены явления воспаления, что потребовало удаления шовного материала, дополнительного назначения антибактериальных препаратов, при этом не был достигнут желаемый косметический эффект, учитывая локализацию послеоперационного рубца на передней брюшной стенке и склонностью рубца к «растягиванию».

У больных 2 группы применение ПГА-нитей обеспечило длительное сопоставление тканей передней брюшной стенки, что послужило основой для формирования крепкого рубца, при этом был достигнут максимальный косметический эффект. Длительное удержание краев раны передней брюшной стенки при отсутствии выраженной реакции на шовный материал и местного воспаления обеспечило образование тонкого крепкого послеоперационного рубца и предотвратило его растяжение, что обычно характерно для рубцов на передней брюшной стенке.

Результаты клинического применения эндобилиарных стентов на основе ПГА

Нами проанализированы результаты оперативного лечения 32 пациентов с механической желтухой различной этиологии. Сроки наблюдения ограничивались пребыванием пациентов в стационаре, что не позволило проанализировать отдаленные результаты лечения.

Однако, первые положительные результаты использования эндобилиарных стентов подтвердили перспективность дальнейшего изучения и внедрения этих изделий медицинского назначения из ПГА в хирургическую практику. Мы сочли возможным сравнить стриктуры как онкологической, так и рубцово-воспалительной этиологии, ориентируясь, в основном, на уровень окклюзии ВЖП.

Учитывая невозможность эндоскопической установки стентов из ПГА, необходимо отметить, что интраоперационная имплантация их наиболее обоснована при наличии опухолей гепатикохоледоха, в случаях успешного бужирования опухолевой стриктуры (в исследование включено 5 пациентов с опухолью Клатскина). Интраоперационная установка стентов ПГА также целесообразна при непротяженных высоких рубцовых стриктурах холедоха.

В исследуемой группе больных отмечено более быстрое восстановление биохимических показателей, купирование синдрома гипербилирубинемии, проявлений эндогенной интоксикации и печеночной недостаточности. Это отразилось на клинических результатах лечения этой тяжелой категории больных – нам удалось избежать ранних осложнений и снизить процент летальности. Несомненно, это связано с минимизацией операционной травмы, возможностью воздержаться от выполнения билиодигестивных анастомозов, и с уникальными свойствами изучаемого материала.

Результаты клинического изучения костнозамещающих имплантатов на основе ПГА

В первой группе пациентов, где была выполнена пластика аутокостью, в 50,3% (6 пациентов) случаев за время наблюдения возник рецидив заболевания, при этом рентгенологически полного заполнения дефекта не произошло. После выполнения радикальной некрсеквестрэктомии только у 3-х пациентов (23,1%) рана зажила первичным натяжением.

Во второй группе, где для пластики дефекта был использован биокомпозиционный материал на основе гидроксиапатита с добавлением коллагена и антисептика - коллапан, у 54,5% больных операционная рана зажила первичным натяжением, у 45,5% - вторичным. К концу периода наблюдения (90 суток) после операции рентгенологически отмечалось постепенное заполнение остеомиелитических полостей костной тканью. При этом процент рецидива заболевания был существенно ниже, чем в группе сравнения и составил 36,6%.

Причиной рецидива в 2 случаях было наличие обширных постостеомиелитических полостей, не полностью замещенных коллапаном после секвестрнекрэктомии, в 2 случаях — развитие некроза кожных покровов над патологическим очагом и обнажение области операции.

Наиболее благоприятные результаты были получены в третьей группе, где для закрытия дефекта полости был применен пломбировочный материал на основе ПГА в комбинации с антибактериальным препаратом тиенамом. В этой группе зафиксирован минимальный процент рецидива заболевания – 11,1%, в 78% случаев раны заживали первичным натяжением. При этом рентгенологически закрытие дефектов происходило в более короткие сроки, и к концу периода наблюдения в 77,7% случаев произошло закрытие дефекта более чем на 50% от исходного.

Выводы:

1. Изучение физико-химических, физико-механических, биологических свойств серии пионерных высокотехнологичных хирургических изделий из ПГА (модифицированных сетчатых эндопротезов, полностью резорбируемых эндобилиарных стентов, шовных волокон, материала для реконструктивного остеогенеза) показало, что они устойчивы к воздействию внутренней среды организма и пригодны для функционирования в течение одного года, убыль массы полимерных изделий и их физико-механических характеристик (модуль Юнга, абсолютная прочность, разрывная способность) происходит постепенно, без резкого снижения прочности, пропорционально скорости формирования тканей.
2. Хирургические изделия из ПГА в культурах клеток in vitro и в экспериментах на лабораторных животных доказали высокую биологическую совместимость; время биорезорбции in vivo зависит от формы изделия, места имплантации и типа окружающих тканей.
3. Применение сетчатых эндопротезов, модифицированных покрытием из ПГА, позволяет достичь более быстрого укрепления передней брюшной стенки при умеренно выраженной макрофагальной реакции тканей. Использование модифицированных сетчатых эндопротезов предупреждает развитие выраженного спаечного процесса в брюшной полости при установке эндопротеза во внутрибрюшную позицию, снижает частоту возникновения эндопротез-ассоциированных осложнений и рецидивов в отдаленном периоде, позволяет улучшить результаты хирургического лечения пациентов с грыжами передней брюшной стенки.
4. При ушивании экспериментальных мышечно-фасциальных ран мононитью из ПГА формируется зона разрастающейся фиброретикулярной ткани с минимальной лимфогистиоцитарной инфильтрацией без признаков диффузного коллагенообразования, с высокой активностью экспрессии VEGF. Биодеградируемая мононить на основе ПГА обладает высокой биосовместимостью, удовлетворительными физико-механическими свойствами, медленно деградирует и может быть использована в качестве хирургического шовного материала для ушивания кожных, мышечно-фасциальных ран и формирования межкишечных анастомозов.
5. Эндобилиарные стенты на основе ПГА сохраняют свои физико-химические свойства при длительном нахождении во внепеченочных желчных протоках, не мигрируют, не способствуют отложению желчи, сохраняют просвет, поэтому пригодны для применения в качестве протезирующих конструкций с целью восстановления проходимости билиарного тракта. Использование эндобилиарных стентов для лечения больных с механической желтухой различной этиологии позволяет сократить время оперативного вмешательства, в более короткие сроки купировать гипербилирубинемию и повысить качество жизни.
6. Биодеградируемые объемные имплантаты и пломбировочный материал на основе ПГА обладают выраженными остеопластическими свойствами, медленно деградируют in vivo, обеспечивая нормальное протекание репаративного остеогенеза в условиях хронического воспаления. Применение материала ПГА для заполнения дефекта костной ткани после выполнения некрсеквестрэктомии при хроническом остеомиелите способствует купированию гнойного процесса, более быстрому замещению дефекта костью, позволяет на 32 % сократить количество рецидивов и на 10,2 % сократить сроки временной нетрудоспособности пациентов.
7. Итогом проведенных экспериментально-клинических исследований пионерных изделий медицинского назначения на основе биодеградируемого полимерного материала – ПГА, стали первые положительные результаты применения последних в клинике, что позволяет рекомендовать их для дальнейшего изучения и более широкого внедрения в хирургическую практику. Полученные новые знания могут лечь в основу последующих исследований и расширения спектра высокотехнологичных изделий медицинского назначения из ПГА.

Практические рекомендации:

1. Положительные результаты экспериментальных доклинических исследований (последние проведены in vitro, на крысах линии Vistar, беспородных собаках, кроликах породы «Шиншилла») изделий медицинского назначения из биополимеров нового класса – полигидроксиалканоатов - позволили обосновать возможность применения этих изделий в клинической практике.
2. С целью уменьшения частоты эндопротез-ассоциированных осложнений рекомендуется применение разработанных эндопротезов с ПГА покрытием при проведении протезирующих грыжесечений, особенно при выполнении операции Лихтенштейна у мужчин зрелого возраста, а также при выполнении операций, предложенных Nyhus, Stoppa, Wantz и лапароскопических вмешательств.
3. Длительные сроки биодеградации нитей ПГА (до 180 суток), сохранение ими прочностных свойств, при минимальной местной воспалительной реакции тканей, положительные результаты ограниченных клинических испытаний, свидетельствуют о возможности использования их в качестве рассасывающегося хирургического шовного материала, в том числе, в реконструктивно-восстановительной и пластической хирургии.
4. Сконструированные на основе ПГА методом электростатического формования резорбируемые эндобилиарные стенты можно рекомендовать для установки во внепеченочные желчные протоки при высоких опухолевых стриктурах гепатикохоледоха и рубцовых стриктурах внепеченочных желчных протоков, что позволяет отказаться от выполнения билиодигестивных анастомозов.
5. Костнозамещающие конструкции на основе полигидгоксиалканоатов различной формы и активного компонента (антибактериальный препарат) и композиты с полигидроксиапатитом обладают остеоиндуктивными и остеопластическими свойствами, могут быть рекомендованы как для замещения дефектов костной ткани при их повреждении, так и в случае их инфекционного поражения при хроническом остеомиелите. Наиболее эффективно использование композита ПГБ/ГА, объемных матриксов ПГА, и имплантатов, нагруженных антибактериальным препаратом Тиенам.
6. Указанные изделия могут быть рекомендованы для проведения расширенных клинических испытаний, и широкого применения в клинике после регистрации в Росздравнадзоре и получения положительных результатов внешней экспертизы.

Публикации:

1. Markelova, N.M. Experimental justification of using endobiliary stents made of bioresorbable polyhydroxyalkanoates / Yu.S. Vinnik, E.I. Shishatskaya, /N.M. Markelova, at all // 4th European Symposium on Biopolymers ESBP. – Turkey, Kusadasi, 2-4 October 2007. – P. 56.
2. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование использования эндобилиарных стентов из биорезорбируемых полигидроксиалканоатов / Ю.С.Винник, Т.Г. Волова, Н.М. Маркелова, и др. // Сб. материалов краевой науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы гнойно-септической хирургии и проблемы клинической медицины».- Красноярск.- 2007. – С. 51-56
3. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование использования эндобилиарных стентов из биорезорбируемых полигидроксиалканоатов / Е. И. Шишацкая, М. Н. Кузнецов, Н. М. Маркелова, и др. // Молодежь и наука – третье тысячелетие: сб. тр. всерос. науч. конф. – Красноярск, 2007. – С. 410-416.
4. Маркелова, Н.М. Эндобилиарное стентирование применением стентов из биополимеров нового класса Е. И. Шишацкая, И. И. Белецкий, / Н. М. Маркелова, и др. // сб. науч. статей студентов и молодых ученых, посвящ. памяти проф. В.К. Сологуба - Красноярск, 2007. – С. 222-230.
5. Markelova, N.M. In vivo justification of endobiliary stents made of polyhydroxyalkanoates / Yu.S. Vinnik, E.I. Shishatskaya, N.M. Markelova at all // Macromol. Symp. - 2008. - V. 269 - С.82-91.
6. Маркелова, Н.М. К вопросу применения нового биосовместимого биополимера в качестве шовного материала Ю.С. Винник, Т.Г. Волова, / Н.М. Маркелова, и др. // Актуальные вопросы современной хирургии: матер. науч.-практ. конф. - Москва-Красноярск, 2008. - С.107-109.
7. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование применения биодеградируемого шовного материала на основе линейного полиэфира 3-гидроксимасляной кислоты / Н. М. Маркелова, Е. И. Шишацкая, Т. Г. Волова, др. // Актуальные вопросы хирургии: сб. статей краев. науч.-практ. конф. посвящ. памяти академика Б.С. Гракова – Красноярск, 2008. – С. 144-147.
8. Маркелова, Н.М. К вопросу применения нового биосовместимого биополимера в качестве шовного материала / Н.М. Маркелова, Ю. С. Винник, Т. Г. Волова, и др. // Актуальные вопросы современной хирургии: матер. науч.-практ. конф. – М., 2008. – С. 107-109.
9. Маркелова, Н.М. Первые результаты применения биодеградируемого шовного материала на основе линейного полиэфира 3-гидроксимасляной кислоты / Н. М. Маркелова, Е. И. Шишацкая, Т. Г. Волова, Е. С. и др. // Успехи современного естествознания. – 2008. - №9. – С. 106-109.
10. Маркелова, Н.М. Новый способ дренирования общего желчного протока в эксперименте / Е. И. Шишацкая, Т. Г. Волова, Ю. С. Винник, и др. // Здоровье и образование в XXI: науч. тр. IX междунар. конгресса. – 2008. – С. 479-480.
11. Маркелова, Н.М. Формирование кишечного анастамоза с помощью нового рассасывающегося шовного материала на основе линейного полиэфира 3-гидроксимасляной кислоты в эксперименте / Е. И. Шишацкая, Н. М. Маркелова, Ю. С. Винник, Е. С. Гавриленко и др. // Здоровье и образование в XXI: науч. тр. IX междунар. конгресса. – 2008. – С. 481-482.
12. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование использования эндобилиарных стентов из биорезорбируемых полигидроксиалканоатов / Т.Г..Волова, Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова, и др. // Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии: сб. науч. трудов научно-практической конференции.- Железногорск, Диамант. - 2008. - С. - 57-59.
13. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование нового способа эндобилиарного стентирования / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, Т.Г. Волова, и др. // «Актуальные вопросы современной хирургии»: сб. мат. науч.-практ. конф., посвящ. 60-летию проф. Ю.С.Винника.- Красноярск. - 2008. - С. 308-314.
14. Маркелова, Н.М. К вопросу о лечении проходимости внепеченочных желчных протоков / // Н.М. Маркелова, Е.С. Черепанова, М.Н. Кузнецов и др. // Актуальные вопросы медицины и новые технологии: сб. науч. тр. конф. молодых ученых и специалистов, посвящ. им. акад. Б.С.Гракова. – Красноярск.- 2009.- С.146-150.
15. Маркелова, Н.М. Изучение биологических свойств пленчатых эндопротезов на основе полиоксиалканоатов в эксперименте / Н.М. Маркелова, Е.И. Шишацкая, А.В. Яковлев, и др. // Актуальные вопросы медицины и новые технологии – 2009: сб. науч. тр. конф. молодых ученых и специалистов, посвящ. им. акад. Б.С. Гракова. – Красноярск, 2009. – С. 278-283.
16. Маркелова, Н.М. Новый способ эндобилиарного стентирования / Т.Г. Волова, Е.И. Шишацкая, Н.М. Маркелова, И.И. Белецкий // Анналы хирургической гепатологии. - 2009. - № - 5. - С. 204-205.
17. Маркелова, Н.М. Применение материалов с памятью формы в хирургии больших и гигантских грыж передней брюшной стенки / Ю.С. Винник, А.А. Радкевич, Н.М. Маркелова, и др. // Сиб. мед. обозрение.-2009. - №3. - С.104-106.
18. Маркелова, Н.М.,. Экспериментальное обоснование применения биодеградируемых полимеров в лечении хронического остеомиелита / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, А.А. Шагеев // Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине: тезисы докладов X Международного конгресса. – Москва.- 2009.- С. - 934-935.
19. Маркелова, Н.М. Хронический остеомиелит: диагностика, лечение, профилактика / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, А.А. Шагеев // Сиб. мед. обозрение. - 2009. - №6.- С.12-15.
20. Маркелова, Н.М. Лечение паховых грыж с использованием полипропиленовых сетчатых эндопротезов и эндопротезов с покрытием на основе полигидроксиалканоатов / А.В. Яковлев, Н.М. Маркелова, Е.И. Шишацкая и др. // Сиб. мед. обозрение. – 2010. – №2.– С. 76-80.
21. Маркелова, Н. М., Первые результаты применения биодеградируемого шовного материала на основе линейного полиэфира 3-гидроксимасляной кислоты / Н.М. Маркелова, Е. И. Шишацкая, М. Н. Кузнецов, Е. С. Гавриленко // Актуальные вопросы медицины и новые технологии – 2009 им. акад. Б.С. Гракова: сб. тр. конф. – Красноярск, 2009. – С. 269-277.
22. Маркелова, Н.М. Первые результаты применения биодеградируемого шовного материала на основе линейного полиэфира 3-гидроксимасляной кислоты / Н. М. Маркелова, Е. И. Шишацкая, Т. Г. Волова, и др. // Медицинский Академический Журнал - 2010. – Т. 10, № 5. – С. 116.
23. Маркелова, Н.М. Результаты применения биодеградируемого шовного материала полигидроксибутирата / Е. И. Шишацкая, Т. Г. Волова, Н. М. Маркелова, и др. // Медицинский Академический Журнал - 2010. – Т. 10, № 5. – С. 116 -117.
24. Маркелова, Н.М. Опыт применения эндобилиарных стентов из биорезорбируемых биополимеров в эксперименте / Ю. С. Винник, Е. И. Шишацкая, Н. М. Маркелова, и др. // Актуальные вопросы диагностики и лечения распространенного перитонита и перфоративной язвы желудка и двенадцатиперстной кишки: конф. хирургов Юга России, посвящен. 95-летию каф. общей хирургии РостГМУ и 70-летию заслуженного деятеля науки РФ, проф. Чернова В. Н. – Ростов на Дону, 2011. – С. 175.
25. Маркелова, Н.М. Обоснование использования эндобилиарных стентов из биорезорбируемых полигидроксиалканоатов в эксперименте / Ю. С. Винник, Т. Г. Волова, Н. М. Маркелова, Е. С. Гавриленко и др. // XI Съезд хирургов Российской Федерации: сб. матер. конф. – Волгоград, 2011. – С. 72-73.
26. Маркелова, Н.М. Опыт применения биодеградируемого шовного материала в абдоминальной хирургии / Н. М. Маркелова, Ю. С. Винник, Е. С. Василеня и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: междунар. науч. семинар с молодежной школой – Красноярск, 2011. – С. 59-60.
27. Маркелова, Н.М. Изучение возможности использования шовного материала из ПГА для наложения межкишечных анастомозов / Н.М. Маркелова, Е.И. Шишацкая, Ю.С. Винник, и др. // «Актуальные вопросы неотложной и восстановительной хирургии»: сб. науч. практ. раб., посвящ 80-летию проф. М.И. Гульмана, Красноярск Версо: - 2011. - С.66-68.
28. Маркелова, Н.М. Изучение местной реакции макрофагов на различные виды сетчатых эндопротезов в эксперименте / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, Е.И. Шишацкаяи др. // Материалы XI съезда хирургов Российской Федерации.- Волгоград, ВолГМУ. – 2011.- С -.74.
29. Маркелова, Н.М., Винник, Ю.С., Соляников, А.С. К вопросу о профилактике несостоятельности межкишечных соустий / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, А.С. Соляников // Актуальные вопросы неотложной и восстановительной хирургии: сб.к науч.практ. раб. посвящ. 80-летию проф. М.И.Гульмана.- Красноярск, Версо. - 2011. - С.73-74.
30. Маркелова, Н.М. Мембранная повязка / В.С. Тюрюмин, Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник // Сиб. мед. обозрение. -2011.-№1. - С. 48-49.
31. Маркелова, Н.М. Мембранная повязка / В.С. Тюрюмин, Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова, С.А. Баранов // Актуальные вопросы неотложной и восстановительной хирургии: сб. науч.-практ. раб., посвящ. 80-летию проф. М.И. Гульмана. – Красноярск: Версо. – 2011.- С.320-322.
32. Маркелова, Н.М. Оперативное лечение грыж передней брюшной стенки. Ю.С. Винник, С.И. Петрушко Н.М. Маркелова, и др. Том 1 (Паховые и бедренные грыжи) // Красноярск. - 2011. - 260 с.
33. Маркелова, Н.М. Особенности реакции макрофагов на различные виды сетчатых эндопротезов, применяемых в герниопластике / Н.М., Маркелова, Ю.С. Винник, Е.И. Шишацкая, и др. // Актуальные вопросы диагностики и лечения распространенного перитонита и перфоративной язвы желудка и двенадцатиперстной кишки: сб. мат. конф. хирургов Юга России, посвященной 95-летию кафедры общей хирургии РостГМУ. - Ростов-на-Дону, РостГМУ. - 2011. - С.173-174.
34. Маркелова, Н.М. Сравнительная характеристика биополимеров нового класса для закрытия костных дефектов в эксперименте / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, Шишацкая Е.И., и др. // Актуальные вопросы неотложной и восстановительной хирургии: сб. науч.- практ. раб., посвящ. 80-летию проф. М.И. Гульмана,. – Красноярск: Версо. - 2011. - С.69-71.
35. Маркелова, Н.М. Актуальные проблемы печеночной недостаточности при механической желтухе: лечение / М.И.Гульман, Ю.С.Винник, Н.М. Маркелова, и др. // Московский хирургический журнал (сообщение 2).- 2012 - С.58-62. [http://www.mossj.ru/]
36. Маркелова, Н.М. Опыт применения кишечного шва в абдоминальной хирургии и проблемы выбора шовного материала / Е.И. Шишацкая, Н.М. Маркелова, Е.С. Василеня // Мат. VII Всерос. конф. общих хирургов с международным участием совместно с Пленумом проблемных комиссий Неотложная хирургия и Инфекция в хирургии Межведомственного научного совета по хирургии РАМН. - Красноярск: Версо.- 2012. - С.848-850.
37. Маркелова, Н.М. Особенности макрофагальной реакции на различные виды сетчатых эндопротезов, используемых при герниопластике в эксперименте Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, А.А. Шагеев, и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: сб. статей междунар. науч. семинара с молодежной школой. – Красноярск: ООО РПБ Амальгама. - 2012. - С.75-78.
38. Маркелова, Н.М. Оценка процессов ангиогенеза при использовании различных рассасывающихся хирургических нитей для ушивания мышечно-фасциальных ран / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, А.А. Шагеев, и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: сб. статей междунар. науч. семинара с молодежной школой. – Красноярск: ООО РПБ Амальгама. - 2012. - С.70-73.
39. Маркелова, Н.М. Применение полигидроксиалканоатов для лечения хронического остеомиелита в эксперименте / Ю.С.Винник, Н.М. Маркелова, А.А. Шагеев, и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: сб. статей междунар. науч. семинара с молодежной школой. – Красноярск: ООО РПБ Амальгама. - 2012. - С.78-80.
40. Маркелова, Н.М. Результаты применения биодеградируемого шовного материала на основе полигидроксиалканоатов для выполнения кишечных анастомозов / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, Е.С. Черепанова и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: сб. статей междунар. науч. семинара с молодежной школой. – Красноярск: ООО РПБ Амальгама. - 2012. - С.73-75.
41. Маркелова, Н.М. Экспериментальное обоснование использования эндобилиарных стентов из биорезорбируемых полигидроксиалканоатов. / Н.М. Маркелова, Ю.С. Винник, Е.С. Черепанова, и др. // Биотехнология новых материалов и окружающая среда: сб. статей междунар. науч. семинара с молодежной школой. – Красноярск: ООО РПБ Амальгама. - 2012. - С.68-70.
42. Маркелова, Н.М. Эндобилиарное стентирование в эксперименте с использованием биодеградируемых полимеров / Е.И. Шишацкая, Т.Г..Волова, Н.М. Маркелова, и др. // Неотложная хирургия и Инфекция в хирургии Межведомственного научного совета по хирургии РАМН: матер. VII Всерос. конф. общих хирургов с международным участием совместно с Пленумом проблемных комиссий. – Красноярск: Версо. - 2012. - С.845-846.
43. Маркелова, Н.М. Характеристики ультратонких волокон, полученных методом электростатического формования из поли-3-гидроксибутирата / Е.И. Шишацкая, Д.Б., Гончаров, Н.М. Маркелова, и др. // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. – 2012. – Т. 5., № 4. – С. 417-427
44. Маркелова, Н.М. Первые результаты и перспективы клинического применения биополимеров нового класса в хирургии / Ю.С. Винник, С.В. Миллер, Н.М. Маркелова, и др. // Журнал Сибирского федерального университета. Биология. - 2012. - Т. 5., №4. – С. 387-404.
45. Маркелова, Н.М. Влияние различных эндопротезов на состояние яичкового кровотока у пациентов, оперированных по поводу паховых грыж / Ю.С. Винник, Т.Г. Волова, Н.М. Маркелова, и др. // Креативная хирургия и онкология. – 2012. - N4. - С.4-7.
46. Маркелова, Н.М. Исследование остеопластических свойств резорбируемого поли-3-гидроксибутирата in-vivo на моделях сегментарной остеотомии / Е.И. Шишацкая, Ю.С. Винник, Н.М. Маркелова, и др. // Креативная хирургия и онкология. - 2012. - N4. - С.16-18.
47. Маркелова, Н.М. Профилактика раневых осложнений у больных с послеоперационными вентральными грыжами / С.И. Петрушко, Ю.А. Назарьянц, Н.М. Маркелова, и др. // Креативная хирургия и онкология. - 2012. - N4. - С. 22-23
48. Маркелова, Н.М. Экспериментальное исследование деградируемых биополимеров нового класса для пластики костных дефектов и остеомиелитических полостей / Е.И. Шишацкая, Ю.С.Винник, Н.М. Маркелова, и др. // Московский хирургический журнал. - 2012. - №6. - С. 22-31.
49. Маркелова, Н.М. Резорбируемые эндопротезы для эндобилиарного протезирования / Н.М. Маркелова // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 1; URL: http://www.science-education.ru/107-8219
50. Маркелова, Н.М. Исследование остеопластических свойств резорбируемого поли-3-гидроксибутирата in vivo на моделях хронического остеомиелита / E.И. Шишацкая, Ю.С., Винник, Н.М. Маркелова, др. // Врач-аспирант. – 2013. - №1.1 (56). – С. 127-133
51. Маркелова, Н.М. Применение биодеградируемых полимеров для замещения костных полостей при хроническом остеомиелите / Ю.С. Винник, Е.И. Шишацкая, Н.М. Маркелова, и др. // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. – 2013. – Т. 6, №1. – С. 31-37
52. Маркелова, Н.М. Исследование биорезорбируемых эндобилиарных стентов в эксперименте / Н.М. Маркелова // Московский хирургический журнал. - 2013. - №1. - С. 25-30.

Патенты:

1. Волова Т.Г., Тюрюмин В.С., Винник Ю.С., Маркелова Н.М., Шишацкая Е.И., Белецкий И.И., Черепанова Е.С. Эндобилиарный стент // Патент РФ на полезную модель № 20091373 35/ 22(052800) от 08.10.2009
2. Яковлев А.В., Винник Ю.С., Маркелова Н.М., Волова Т.Г., Шишацкая Е.И. Способ лечения паховых грыж // Патент на изобретение РФ №2427326 от 27.08.2011
3. Тюрюмин В.С., Винник Ю.С., Маркелова Н.М., Перьянова О.В., Шишацкая Е.И. Способ трансмембранного диализа гнойных ран // Патент РФ на изобретение №2433839 от 20.11.2011
4. Тюрюмин В.С., Винник Ю.С., Маркелова Н.М., Баранов С.А. Мембранная повязка // Патент РФ на полезную модель №101925 от 10.02.2011