Нарушения системы th1 - и th2- цитокинов при параноидной шизофрении
На правах рукописи
Мельников Антон Павлович
нарушения системы Th1- и Th2-цитокинов при параноидной шизофрении
14.00.16 – патологическая физиология
14.00.18 – психиатрия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Томск – 2008
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, Рязанцева
профессор Наталья Владимировна
доктор медицинских наук Агарков
Александр Прокопьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Агафонов
профессор Владимир Иванович
доктор медицинских наук, Семке
профессор Аркадий Валентинович
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Росздрава»
Защита состоится «___» __________2008 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета
Автореферат разослан «___» __________ 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Суханова Г.А.
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. В течение длительного времени изучение биологических основ развития психических расстройств было сосредоточено в основном на выявлении структурно-функциональных особенностей мозговой ткани. Это позволило накопить многочисленные данные, указывающие на наличие нейроанатомических, нейрохимических, нейрофизиологических и нейроинтегративных нарушений при шизофрении и других психопатологических состояниях [Аганова Э.А., Уранова Н.А., 1990; Powchick P. et al., 1998; Тиганов А.С., 1999; Yao J.K. et al., 2000; Sperner-Unterweger B., 2005; Lang U.E. et al., 2007]. Вместе с тем в настоящее время основой стратегии поиска и идентификации биологических детерминант психических расстройств является изучение системных взаимоотношений. Стало ясно, что при шизофрении в патологический процесс вовлекается не только нервная система, на уровне которой разворачиваются структурно-функциональные нарушения. В последние годы особое внимание исследователей привлечено к состоянию иммунной системы при психических расстройствах [Ветлугина Т.П., 2000; Muller N., 2002; Семке В.Я. и соавт., 2003; Schwarz M.J., 2003; Андросова Л.В. и соавт., 2004; Коляскина Г.И. и соавт., 2004; Ветлугина Т.П. и соавт., 2006; Strous R.D., Shoenfeld Y., 2006].
К настоящему времени накоплено достаточное количество фактических данных относительно особенностей функционирования клеточного и гуморального звеньев иммунной системы при шизофрении. Новые перспективы исследований иммунного дисбаланса при шизофреническом процессе появились благодаря успехам фундаментальной иммунологии, в частности после открытия мессенджеров иммунных реакций – цитокинов [Ярилин А.А., 1997; Фрейдлин И.С., 1999; Ройт А. и соавт., 2000; Симбирцев А.С., 2004; Drzyzga L. et al., 2006]. Нарушения цитокиновой сети ведут к формированию дизрегуляции иммунной системы [Хаитов Р.М. и соавт., 2000; Владимирская Е.Б., 2002; Ebrinc С. et al., 2002; Zhang X.Y. et al., 2003].
Интерес к оценке состояния системы цитокинов у больных психическими расстройствами продиктован тем фактом, что интерлейкины включены в процессы взаимодействия нервной и иммунной систем: IL2 регулирует освобождение дофамина из нейронов полосатого тела [Lapchak P.A., 1992; Коляскина Г.И. и соавт., 2004]. Клетки мозговой ткани (нейроны и глия) имеют на своей плазматической мембране рецепторы для IL1, IL2 и IL6, а также могут сами продуцировать эти интерлейкины [Zalcman S., 1994]. В литературе встречаются сообщения, демонстрирующие противоречивость результатов исследования Th1- и Th2-цитокинов у больных шизофренией. Так, ряд исследователей сообщают, что содержание IL2, IL4 и TNF в сыворотке крови, полученной у больных параноидной шизофренией, не изменялось либо увеличивалось по сравнению с таковым у здоровых людей [Schwartz М., 2000; Cazzullo C.L. et al., 2001; Kaminska T. et al., 2001; Ebrinc С. et al., 2002]. Другие авторы представили данные о снижении продукции Th1- и Th2-цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови [Kowalski J. et al., 2000; Zhang X.Y. et al., 2002; Mahendran R., Chan Y.H., 2004; Avgustin B. et al., 2005]. При проведении этих исследований принимается во внимание и то обстоятельство, что для лечения больных используются антипсихотические средства – классические и атипичные нейролептики, которые способны модулировать иммунный ответ [Rapaport M.H. et al., 2001; Pae C.U. et al., 2006].
Несмотря на пристальное внимание исследователей к данной проблеме, до сих пор остаются нерешенными ряд вопросов: предшествуют ли изменения в иммунной системе, в частности – в цитокиновой сети, манифестации заболевания или являются следствием возникшего патологического процесса: осуществляют ли они защитную функцию или обладают «агрессивными» свойствами, способствуя возникновению психопатологии [Андросова Л.В. и соавт., 2004; Коляскина Г.И. и соавт., 2004; Ветлугина Т.П. и соавт., 2006].
Комплексное исследование продукции и рецепции иммунорегуляторных Th1- и Th2-цитокинов мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией представит возможность приблизиться к разрешению дискутабельного вопроса фундаментального характера о патогенезе иммунных нарушений при шизофреническом процессе, что в свою очередь позволит обосновать новые патогенетически оправданные способы диагностики и коррекции дизрегуляции иммунной системы при данной патологии.
Цель исследования: установить особенности продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови Th1- и Th2-цитокинов при параноидной шизофрении.
Предпринятое исследование было сосредоточено на решении следующих основных задач:
- Установить особенности продукции IL2, IL4 и TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией.
- Оценить состояние рецепторного аппарата к IL2, IL4 и TNF мононуклеарных лейкоцитов крови у больных параноидной шизофренией.
- Установить роль изменений апоптотической гибели иммунокомпетентных клеток крови в механизмах нарушения их цитокинопосредованной кооперации у больных параноидной шизофренией.
- Выявить клинико-имунологические параллели состояния системы Th1- и Th2-цитокинов (IL2, IL4 и TNF) и их рецепторов у больных параноидной шизофренией в зависимости от активности, характера и длительности течения патологического процесса, до и в процессе проведения психофармакокоррекции.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование способности мононуклеарных лейкоцитов крови продуцировать цитокины с провоспалительными (IL2, TNF) и противовоспалительными (IL4) эффектами и комплементарных им рецепторов у больных параноидной шизофренией в зависимости от активности, характера и длительности течения патологического процесса, до и в процессе психофармакокоррекции. Установлены увеличение базальной продукции мононуклеарными лейкоцитами крови IL2, снижение секреции IL4 у пациентов с параноидной шизофренией, нарушение презентации в интактной и митоген-стимулированных культурах мононуклеарных лейкоцитов крови мембрано-ассоциированных форм рецепторов к IL2 и IL4. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при обострении параноидной шизофрении имеют место повышение базальной продукции TNF и его растворимого рецептора; в период редукции психопатологической симптоматики (после проведения психофармакотерапии) нарушена продукция мембраносвязанной и растворимой форм рецептора к TNF на фоне снижения содержания TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови. Выявлено, что нарушение реализации апоптоза лимфоцитов при параноидной шизофрении (стимулирование апоптоза лимфоцитов при обострении заболевания, угнетение программированной гибели лимфоцитарных клеток у пациентов на фоне проведения психонейролептикотерапии) сопряжено с дисфункцией TNF-индуцированного пути регуляции программированной гибели лимфоцитов. Получены приоритетные данные, свидетельствующие, о том, что продукция и рецепция иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, TNF) в зависимости от типа течения параноидной шизофрении (непрерывное, эпизодическое течение) характеризуются однонаправленными, разной степени выраженности изменениями и не зависят от продолжительности заболевания.
Теоретическая и практическая значимость. Выявленные закономерности нарушения системы иммунорегуляторных Th1/Th2 цитокинов (IL2, IL4, TNF) и рецепторов к ним у больных параноидной шизофренией раскрывают новые патофизиологические аспекты шизофренического процесса. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки патогенетически обоснованных подходов к прогнозированию клинического течения шизофрении, а также способов предупреждения и коррекции дизрегуляции иммунной системы при шизофреническом процессе.
Положения, выносимые на защиту:
- У больных параноидной шизофренией имеет место дисбаланс продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови IL2, IL4 и TNF, характер и степень выраженности которого определяется активностью и особенностью течения шизофренического процесса.
- При параноидной шизофрении нарушена реализация программированной гибели лимфоцитов крови.
Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Развитие биопсихосоциального подхода в сфере охраны психического здоровья» (Томск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современные принципы терапии и реабилитации психически больных» (Москва, 2006), Межрегиональной научно-практической конференции «Вопросы охраны психического здоровья, обеспечения доступности и качества оказания психиатрической помощи» (Барнаул, 2007), II международной научной конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине» (Черногория, Бечичи, 2007), IV международной научной конференции «Современные медицинские технологии (диагностика, терапия, реабилитация и профилактика)» (Хорватия, Пула, 2007).
Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии (разделы «Патофизиология иммунной системы») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, внедрены в учебный процесс кафедры фундаментальных основ клинической медицины в разделы “Клиническая патофизиология реактивности организма”, “Молекулярные основы патологии”, кафедры психиатрии, наркологии и психотерапии ФПК и ППС в раздел “Шизофрения, шизотипические и бредовые расстройства”.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из которых 2 – в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 26 таблицами. Библиографический указатель включает 417 источников (94 отечественных и 323 иностранных).
Характеристика клинического материала и методы исследования
В настоящей работе приведены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 80 больных параноидной шизофренией мужского пола в возрасте от 19 до 53 лет (средний возраст составил 33±1 года), проводившегося на базе стационарных отделений Томской областной клинической психиатрической больницы (главный врач – Заслуженный врач РФ, д-р мед. наук А.П. Агарков).
Диагностическая оценка и клиническая верификация психических расстройств проводились в соответствии с Международной Классификацией Болезней 10-го пересмотра (МКБ-10). Комплексному исследованию функциональных свойств мононуклеарных лейкоцитов крови предшествовали катамнестический анализ каждого случая, а также оценка психического статуса пациентов. Критериями исключения из исследования являлись наличие инфекционных заболеваний, обострений хронических соматических, неврологических заболеваний, алкогольной и наркотической зависимости пациентов.
Диагноз был верифицирован в ходе настоящей и предыдущих госпитализаций в психиатрический стационар. Обязательной явилась процедура ретроспективного анализа динамики шизофренического процесса путем изучения архивных историй болезни, а также амбулаторных карт. При их детальном анализе оказалось, что у большинства больных заболевание начиналось в возрасте от 20 до 30 лет (в среднем - 23±1 года). Между тем среди обследованных душевнобольных встречались пациенты с манифестацией шизофрении как в 16 лет, так и в 34 года. Средняя давность заболевания, определявшаяся по данным психиатрического учета, оказалась равной 8,7±0,6 лет.
С учетом характера течения, темпа прогредиентности и длительности шизофренического процесса, особенностей проведения психофармако-коррекции, а также ведущих продуктивных и негативных расстройств были выделены следующие группы больных шизофренией.
Обследование 46 пациентов проводилось на фоне клинически выраженного обострения шизофренического процесса непосредственно при госпитализации в психиатрический стационар до назначения психофармакокоррекции. Основными критериями включения больных в исследование являлись: наличие бредово-галлюцинаторной симптоматики; удовлетворительное соматическое состояние, подтвержденное впоследствии результатами лабораторного (общий анализ крови, общий анализ мочи) и инструментального (электрокардиография, рентгенография и др.) методов исследования; отсутствие сведений о применении психотропных лекарственных средств в течение 6 и более месяцев, предшествовавших госпитализации. Отсутствие поддерживающей терапии было обусловлено тем, что у пациентов либо отмечалась стойкая ремиссия заболевания длительностью более 6 месяцев, не требующая психофармакокоррекции, либо больные самостоятельно прекратили прием нейролептиков.
Клиническая картина была представлена острой параноидной симптоматикой с выраженной аффективной напряженностью, псевдогаллюцинациями, бредовыми идеями воздействия, отношения, преследования, явлениями психического автоматизма, актуальными болезненными переживаниями и др. Повторное обследование этих больных проводилось через 1,5-2 месяца при выписке из стационара в момент регресса психопатологической симптоматики в состоянии неполной терапевтической ремиссии, полученной в результате проведения традиционной психофармакокоррекции (аминазин, галоперидол, азалептин, трифтазин, амитриптилин и др.).
Отдельную категорию обследованных больных составили 34 пациента с параноидной шизофренией, у которых проведение нейролептической терапии не приводило к полной редукции продуктивной психопатологической симптоматики. Все пациенты получали психофармакотерапию, характеристики которой (спектр и дозировки препаратов, темпы наращивания, способы введения) отвечали современным принципам адекватности лечения. В зависимости от особенностей психического и сомато-неврологического статуса больных, особенностей их реагирования на препараты терапия своевременно корригировалась.
Непрерывное течение параноидной шизофрении (по МКБ-10 рубрика F20.00) было диагностировано у 33 больных, эпизодическое (по МКБ-10 рубрика F20.01-03) – у 47 пациентов.
В зависимости от длительности заболевания пациенты были разделены на три группы: заболевание с длительностью от 1-го до 5-ти лет было выявлено у 28 (35,0%) человек, от 5-ти до 10-ти лет - у 31 пациента (38,75%), более 10 лет – у 21 (26,25%) больного.
Контрольную группу составили 35 практически здоровых доноров мужского пола, не предъявлявших на момент обследования жалоб соматического и психического профиля, выполнявших полный объем профессиональных обязанностей и ведущих привычный образ жизни.
У пациентов с параноидной шизофренией и здоровых доноров проводили комплексное исследование концентрации цитокинов (IL2, IL4 и TNF) и растворимого рецептора TNF (sTNFR1) в супернатантах интактной, фитогемагглютинин (ФГА)- и липополисахарид (ЛПС)-стимулированных культур мононуклеарных лейкоцитов, количества лимфоцитов крови, презентирующих соответствующие мембраносвязанные рецепторы (IL2R, IL4R, TNFR1), а также вступивших в апоптоз (табл.).
Выделение мононуклеарных лейкоцитов крови осуществляли с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Для получения супернатантов выделенные мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в полной питательной среде, состоящей из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Для стимуляции секреторной способности мононуклеарных клеток в пробы вносили 10 мкг/мл ФГА или ЛПС (“Difco”, Германия). Определение содер-жания лимфоцитов в суспензии и их жизнеспособности проводили в счетной камере Горяева. Процедуру определения уровня IL2, IL4, растворимого рецептора TNF (sTNF-R1) в супернатантах интактной, ФГА- и ЛПС-стимулированных культур мононуклеарных лейкоцитов крови проводили с использованием метода иммуноферментного анализа по инструкции, предлага-емой производителем тест-систем («Procon», Россия; «Cytimmun», США).
Оценку количества лимфоцитов крови, презентирующих мембрано-связанные формы рецепторов к IL2, IL4 и TNF и вступивших в апоптоз, проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам и FITC-меченного аннексина V, соответственно [Van England et al., 1998]. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на лимфоцитах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 1).
Таблица
Распределение обследованных лиц по клиническим группам в соответствии с использованными методами исследования
| Методы исследования | Характеристика обследованных | ||||||||
| Здоро-вые доноры | Больные параноидной шизофренией | ||||||||
| Активность шизофреничес- кого процесса | Резистент-ные к психо-фармако-терапии | Характер течения шизофрении | Длительность течения шизофрении | ||||||
| обост-рение | редук-ция | ||||||||
| непрерыв- ный | эпизоди-ческий | от 1 до 5 лет | от 5 до 10 лет | более 10 лет | |||||
| Определение содержания цитокинов (IL2, IL4 и TNF) в супернатантах интактных, ФГА- и ЛПС-стимулированных мононуклеарных лейкоцитов крови с использованием иммуноферментного анализа | 21 | 45 | 37 | 21 | 20 | 17 | 15 | 24 | 21 |
| Оценка количества интактных, ФГА- и ЛПС-стимулированных лимфоцитов крови, презентирующих цитокиновые рецепторы (IL2R, IL4R, TNFRI), методом лазерной проточной цитометрии | 20 | 31 | 30 | 19 | 16 | 14 | 11 | 23 | 16 |
| Определение содержания растворимого рецептора TNF в супернатантах моно-нуклеарных лейкоцитов крови с использованием иммуноферментного анализа | 19 | 28 | 27 | 20 | 15 | 12 | 10 | 21 | 17 |
| Цитофлуориметрическая оценка спонтанного и активационного апоптоза общей популяции лимфоцитов крови в аннексиновом тесте | 12 | 21 | 21 | 15 | 11 | 10 | 9 | 15 | 12 |
Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Колмагорова-Смирнова. Проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента, критериев Манна-
Рис. 1. Гистограмма распределения лимфоцитов по интенсивности флуоресценции в FL1-канале (оценка содержания TNFR1+-клеток, меченных FITC, в гейте лимфоцитарных клеток):
а – принцип автоматического выделения гейта лимфоцитов по показателям малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеивания;
б – одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте лимфоцитарных клеток по FL1-каналу (слева от оси – несветящиеся клетки, справа - FITC-положительные лимфоциты)
Уитни и Вилкоксона. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследованными показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) [Лакин Г.Ф., 1980; Бронштейн И.Н., 1986; Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001].
Результаты исследования и их обсуждение
Существенная распространенность шизофрении в структуре психических расстройств, исключительный полиморфизм клинической картины, сложность механизмов развития патологического процесса обуславливают интерес к исследованию биологических аспектов этого заболевания. Актуальным направлением становится исследование состояния иммунной системы при психических расстройствах [Морковкин В.М., Картелишев А.В., 1988; Языков К.С., 2000; Коляскина Г.И. и соавт., 2004; Ветлугина Т.П. и соавт., 2006; Strous R.D., Shoenfeld Y., 2006].
Одним из основных аспектов характеристики иммунного ответа является состояние межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток крови. Для полного анализа функционального статуса последних при каком-либо патологическом процессе необходима комплексная оценка системы цитокинов, поскольку характер иммунного ответа во многом обусловливается особенностями продукции и рецепции регуляторных цитокинов, являющихся важнейшими медиаторами межклеточного взаимодействия [Kurushita N. et al., 1997; Хаитов Р.М. и соавт., 2000; Черешнев В.А., Гусев Е.Ю., 2001; Ярилин А.А., 2001; Cazzullo C.L. et al., 2002; Ebrinc С. et al., 2002; Zhang X.Y. et al., 2003; Симбирцев А.С., 2004].
В связи с этим наше исследование было направлено на получение новых знаний фундаментального характера об особенностях функционирования системы иммунорегуляторных Th1- и Th2-цитокинов при параноидной шизофрении.
При этом мы руководствовались концепцией, что продуцируемые соответственно Th1- и Th2-лимфоцитами, оказывают взаимное влияние [Ярилин А.А., 1997; Симбирцев А.С., 1998; Петров Р.В., Хаитов Р.М., 2001; Фрейдлин И.С., 2001; Walker D. et al., 2002; Кадагидзе З.Г., 2003; King N.J. et al., 2003].
В ходе настоящего исследования было установлено, что у больных параноидной шизофренией, обследованных как в период обострения заболевания (до проведения психофармакотерапии), так при редукции психопатологической симптоматики (после проведения психофармакотерапии), а также у пациентов, резистентных к проведению нейролептикотерапии, в супернатантах интактных культур мононуклеарных лейкоцитов содержание IL2 увеличивалось относительно аналогичного показателя у здоровых доноров (рис. 2, А). Данный факт демонстрирует повышение потенциала иммунокомпетентных клеток синтезировать данный провоспалительный цитокин. Однако при оценке ФГА- и ЛПС-стимулированных in vitro культур мононуклеаров, полученных у больных параноидной шизофренией, мы выявляли иные результаты: у пациентов, обследованных в острый период и при редукции психопатологической симптоматики, содержание IL2 оказалось сниженным по сравнению с подобным у здоровых людей, однако, у больных шизофренией, резистентной к психофармакотерапии, концентрация изученного цитокина определялась на уровне контрольных значений. В свете данного
Рис. 2. Содержание цитокинов (IL2, IL4, TNF) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (А) и количество лимфоцитов крови, несущих комплементарные мембранассоциированные рецепторы (Б), у больных параноидной шизофренией: 1 – у здоровых доноров, 2 - у больных параноидной шизофренией в период обострения (до проведения психофармакотерапии), 3 – у больных параноидной шизофренией в период редукции психопатологической симптоматики (после проведения психофармакотерапии), 4 - у больных параноидной шизофренией, резистентной к психофармакотерапии; I – в интактных культурах клеток, II – ФГА-стимулированных культурах клеток, III – в ЛПС-стимулированных культурах клеток
положения, на наш взгляд, возможно констатировать факт напряжения функционирования Т-клеточного звена иммунитета. Соответствующие изменения могут, во-первых, способствовать некоторой активации Th1-пути иммунного ответа, во-вторых, учитывая активационную роль IL2 в усилении пролиферации активированных В-клеток в присутствии IL4, являться причиной изменения реактивности антителопродуцирующей компоненты иммунитета.
Численность иммунокомпетентных клеток, несущих на своей поверхности рецепторы к тому или иному цитокину, также оказывает влияние на изменение выраженности действия цитокина [Hibbert L., Johnston J.A., 2001; Walker D. et al., 2002; Plevy S., 2003]. С целью получения комплексного представления о состоянии системы IL2 нами была проведена оценка относительного количества IL2R-позитивных лимфоцитов у здоровых людей и больных параноидной шизофренией.
На наш взгляд, интересным представляется выявленный нами у больных параноидной шизофренией факт снижения, по сравнению с аналогичным показателем у здоровых людей, содержания IL2R-несущих лимфоцитов крови (рис. 2, Б). В ФГА- и ЛПС-стимулированных культурах лейкоцитов также отмечалась общая тенденция к угнетению экспрессии изученного рецептора у больных параноидной шизофренией (рис. 2, Б). Таким образом, нами был обнаружен факт дисбаланса (разнонаправленного изменения) цитокин-продуцирующей и рецепторэкспрессирующей функции лимфоцитов крови у больных параноидной шизофренией как в период обострения заболевания, так и при редукции психопатологической симптоматики. При этом в ходе проведения корреляционного анализа были выявлены отрицательные функциональные связи между концентрацией в супернатантах интактных культур мононуклеарных клеток крови IL2 и количеством IL2R-позитивных лимфоцитов у больных параноидной шизофренией (r=-0,73, p<0,05).
Для интерпретации полученных фактических данных нам представилось целесообразным проследить другие клинико-иммунологические закономер-ности.
Нами был проведен анализ продукции и рецепции IL2 эффекторными клетками крови в зависимости от типа течения заболевания. В результате установлено, что наиболее выраженные изменения продукции IL2 и его рецепции были обнаружены при непрерывном течении шизофренического процесса (рис. 3 А, Б). С целью выявления влияния продолжительности течения шизофренического процесса на изменение продукции и рецепции цитокинов нами был исследован цитокиновый статус у больных параноидной
Рис. 3. Содержание цитокинов (IL2, IL4, TNF) в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (А) и количество лимфоцитов крови, несущих комплементарные мембранассоциированные рецепторы (Б), у больных параноидной шизофренией в зависимости от типа течения заболевания: 1 – у здоровых доноров, 2 - больные шизофренией с непрерывным типом течения, 3 - больные шизофренией с эпизодическим типом течения; I – в интактных культурах клеток, II – ФГА-стимулированных культурах клеток, III – в ЛПС-стимулированных культурах клеток
шизофренией с различной длительностью заболевания (до 5 лет, от 5 до 10 лет, более 10 лет), не выявивший, однако, каких-либо статистически значимых различий (p>0,05).
IL4, обладая выраженными контрвоспалительными свойствами, стимулирует преимущественно гуморальное звено иммунитета, способствуя дифференцировке по Th2 пути иммунного ответа, ингибирует продукцию провоспалительных Th1-цитокинов [Paul W.E., 1991; Лукина Е.А., 1998; Paludan S.R., 1998; Ройт А. и соавт., 2000; Фрейдлин И.С., 2001; Хаитов Р.М., 2001; Lin S.-J. et al., 2003].
По данным проведенного нами исследования, было установлено снижение базальной, ФГА- и ЛПС-стимулированной продукции IL4 мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией как в период обострения заболевания, так и на фоне проведения психофармакотерапии (рис. 2, А). В качестве одного из возможных механизмов угнетения продукции IL4 мононуклеарными лейкоцитами крови можно предполагать изменение (увеличение) IL2-секреторного потенциала интактных клеток у больных, страдающих параноидной шизофренией [Cazzullo C.L. et al., 2002; Ebrinc С. et al., 2002]. Проведенное нами исследование количества IL4R-положительных лимфоцитов крови у больных параноидной шизофренией выявило тенденцию соответствия доли IL4R-несущих клеток у пациентов с параноидной шизофренией аналогичному показателю у здоровых доноров (рис. 2, Б).
В результате анализа изменения продукции и рецепции IL4 эффекторными клетками крови в зависимости от типа течения заболевания установлено наиболее значимое угнетение продукции цитокина у пациентов с непрерывным течением шизофренического процесса (рис. 3). Следует отметить, что исследование продукции и рецепции IL4 мононуклеарными лейкоцитами крови в зависимости от продолжительности течения шизофренического процесса (до 5 лет, от 5 до 10 лет, более 10 лет) не выявило статистически значимых различий между средними значениями изученных показателей.
Особую роль в регуляции иммунного гомеостаза играет TNF. Согласно данным литературы, TNF не только является одним из основных провоспалительных цитокинов, осуществляющих реализацию неспецифического иммунного ответа, но и выступает в качестве индуктора, стимулирующего дифференцировку Th0 в Th1, тем самым, модулируя направление специфического иммунного ответа в сторону преобладания клеточного звена резистентности [Takizawa Т., 1993; Кашкин К.П., 1998; Логинов А.С., 2001; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004]. Сведения о продукции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с параноидной шизофренией весьма противоречивы [Schattner A. et al., 1996; Naudin J. et al., 1997; Haack М. et al., 1999; Hinze-Selch D. et al., 2000; Erbagci A.B. et al., 2001; Kaminska T. et al., 2001; Kowalski J. et al., 2001; Kudoh А. et al., 2001; Theodoropoulou С. et al., 2001; Paterson G.J. et al., 2006; Sacchetti E. et al., 2007].
Анализ продукции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с параноидной шизофренией выявил следующую динамику: увеличение содержания TNF в супернатантах интактных и снижение в супернатантах стимулированных культур мононуклеарных лейкоцитов у больных параноидной шизофренией в период обострения заболевания до начала применения специфической нейролептикотерапии по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров; снижение продукции TNF у пациентов в процессе применения нейролептикотерапии как при редукции психопатологической симптоматики, так и у больных параноидной шизофренией, резистентной к психофармакотерапии в интактных, ФГА- и ЛПС-стимулированных in vitro культурах клеток (рис. 2, А).
Угнетение продукции TNF мононуклеарами может быть связано с глубокой дизрегуляцией иммунного ответа, как вследствие развития заболевания, так и являться результатом действия нейролептикотерапии. С другой стороны, учитывая провоспалительный эффект цитокина, снижение секреции мононуклеарами можно рассматривать как компенсаторный механизм, который помогает избежать аутоиммунной агрессии и чрезмерного повреждения собственных тканей организма [Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004].
Проведенная нами с помощью проточной цитофлуориметрии оценка рецептор-презентирующих лимфоцитарных клеток крови показала, что количество TNFR1-несущих лимфоцитов у больных параноидной шизофренией, обследованных в период обострения заболевания, и у пациентов, резистентных к специфической нейролептикотерапии, соответствовало таковому у здоровых людей (рис. 2, Б). У больных параноидной шизофренией, обследованных в период редукции психопатологической симптоматики на фоне проведения психофармакотерапии, количество лимфоцитарных клеток, презентирующих мембранассоциированный рецептор к TNF, снижалось (рис. 2, Б).
Рассматривая значение рецепторов в реализации биологической функции TNF, необходимо отметить роль их растворимых форм (sTNFR). Нами было выявлено увеличение содержания в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов растворимой формы TNFR1 у всех пациентов с параноидной шизофренией (p<0,05). При этом у больных параноидной шизофренией, получавших психофармакотерапию, был установлен факт отрицательной функциональной связи между продукцией TNF мононуклеарами и содержанием sTNFR1 в супернатантах культур лейкоцитов (r=-0,67, p<0,05, r=-0,74, p<0,05 и r=-0,72, p<0,05, соответственно).
Таким образом, изменения продукции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией в период редукции симптоматики имели противоположный (по сравнению с таковым у больных в период обострения) характер и выражалось значительным снижением содержания исследуемого цитокина в супернатантах культур клеток. При этом состояние рецепторного аппарата (sTNFR1 и TNFR1) у больных в период редукции психопатологической симптоматики соответствовало таковому у пациентов в период обострения заболевания.
Результаты исследования изменения продукции и рецепции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией в зависимости от особенностей течения заболевания обозначили тенденцию к наиболее выраженному изменению секреции цитокина у пациентов с непрерывным течением шизофренического процесса, однако, не позволили констатировать таковую при оценке количества клеток, несущих мембранассоциированный рецептор, и содержания растворимой формы рецептора (рис. 3 А, Б).
При анализе влияния продолжительности течения шизофренического процесса на изменение продукции и рецепции TNF у больных параноидной шизофренией с различной длительностью заболевания (до 5 лет, от 5 до 10 лет, более 10 лет) был выявлен факт нормализации изученного показателя при одновременном снижении количества лимфоцитов, несущих комплементарный мембраносвязанный рецептор, у больных параноидной шизофренией с длительностью течения заболевания от 5 до 10 лет, при том, что у больных с длительностью шизофренического процесса до 5 лет и более 10 лет было обнаружено снижение синтеза TNF мононуклеарами крови.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о выраженном дисбалансе продукции и рецепции Th1- и Th2-цитокинов у больных параноидной шизофренией. Выявленные изменения, с одной стороны, являются следствием нарушения иммунологического равновесия, обеспечивающего полноценное функционирование макроорганизма. С другой стороны, указанные изменения сами могут выступать в качестве причины дизрегуляции иммунной системы посредством модуляции функциональной активности лимфоцитов. По существующим представлениям, продукция цитокинов определяется стимулирующими воздействиями, запрограммирована на генном уровне [Фрейдлин И.С., 2001; Кетлинский С.А., 2002; Plevy S., 2003; Schmidt C. et al., 2003; Celec P., 2004].
Одним из фундаментальных механизмов, регулирующих иммунный ответ в норме и при патологии, является апоптоз иммунокомпетентных клеток. В связи с этим мы сочли целесообразным проведение изучения реализации танатогенной программы лимфоцитов у пациентов с параноидной шизофренией.
При исследовании выраженности апоптоза лимфоцитов у больных параноидной шизофренией в период обострения заболевания отмечалось достоверное (р<0,05) увеличение количества аннексин-положительных лимфоцитов в интактной культуре клеток.
У пациентов с параноидной шизофренией в период редукции психопатологической симптоматики (после проведения психофармакотерапии) и у больных параноидной шизофренией, резистентной к психофармакотерапии, установлено статистически значимое (р<0,05) снижение относительного числа лимфоцитов, находящихся на ранних стадиях апоптотической гибели, по сравнению с соответствующими параметрами у лиц контрольной группы.
Оценка апоптоза лимфоцитов у больных параноидной шизофренией, разделенных на группы в зависимости от типа течения заболевания, показала, что средние значения, характеризующие уровень активационного апоптоза лимфоцитарных клеток, достоверно снижались (р<0,05 во всех случаях) относительно аналогичных показателей у здоровых доноров в культуре митоген-стимулированных клеток.
В рассматриваемом аспекте проблемы логично предположить, что выявленный в результате исследования выраженный дисбаланс продукции и экспрессии рецепторов цитокинов с про- (IL2, TNF) и противоспалительной (IL4) функциями в условиях длительного течения заболевания вносит существенный вклад в изменение апоптотической реактивности лимфоцитарных клеток крови. Более того, известно, что клетки, подвергающиеся активационному (индуцированному) апоптозу, способны сами секретировать цитокины, способствуя, таким образом, изменению их профиля [Chen W.J. et al., 2001; Попов Л.С., 2004]. Кроме того, выявленное снижение продукции мононуклеарами IL4, вероятно, приводит к предотвращению гибели лимфоцитов [Талалаев В.Ю. и соавт., 2001].
Дискуссионным остается вопрос о том, являются ли выявленные нами изменения продукции и рецепции цитокинов следствием развития шизофренического процесса или результатом влияния психофармакотерапии, поскольку известно, что нейролептические средства обладают иммуномодулирующей активностью [Pae C.U. et al., 2006]. По данным литературы известно, что нейролептические препараты воздействуют in vitro на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами у животных [Bertini R. et al., 1993; Tarazona R. et al., 1995]. Действие нейролептиков на продукцию и рецепцию цитокинов мононуклеарами крови имеет важное значение для терапии по следующим причинам. Во-первых, фармакотерапия может влиять на функционирование иммунной системы при шизофрении; во-вторых, распознание вызванных лекарствами изменений секреции цитокинов может помочь в понимании побочных эффектов, вызванных нейролептико-опосредованной дизрегуляцией иммунной системы (например, клозапин-индуцированная лихорадка, агранулоцитоз) [Pollmacher T. et al., 1996]; в-третьих, цитокины могут опосредовать действия нейролептиков на ЦНС [Pollmacher T. et al., 1995; Pae C.U., 2006].
Выявленные нами изменения (при обследовании пациентов в период обострения шизофренического процесса до назначения психофармакотерапии) подтверждают гипотезу о том, что иммунологические дисфункции могут вносить вклад в патогенез такого мультифакториального заболевания как параноидная шизофрения. Для того, чтобы исключить влияние фармакологических препаратов на достоверность полученных результатов и оценить истинную динамику, направленность и степень выраженности продукции и рецепции основных иммунорегуляторных цитокинов нами были проведены исследования цитокинпродуцирующей и рецепторэкспрессирующей способности иммунокомпетентных клеток крови у больных шизофренией в остром периоде заболевания, а также у тех же больных в период редукции психопатологической симптоматики вследствие проведения специфической психофармакотерапиии и у больных параноидной шизофренией, резистентной к нейролептикотерапии.
Учитывая данные литературы и тот факт, что в проведенных нами исследованиях содержание IL2 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов у больных параноидной шизофренией, получавших нейролептикотерапию (в основном, галоперидол, аминазин и др.), достоверно превышало аналогичный показатель у тех же пациентов в период обострения заболевания, можно говорить о том, что повышенная продукция IL2 мононуклеарными лейкоцитами крови у больных параноидной шизофренией, по всей видимости, является именно результатом дисфункции иммунной системы при развитии шизофренического процесса, а не побочным эффектом специфических препаратов.
Проведенные нами исследования установили также снижение числа IL2R-несущих лимфоцитов как у проходивших нейролептикотерапию, так и у нелеченых больных параноидной шизофренией. Это позволило высказать предположение о том, что изменение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецептор для IL2, является результатом действия шизофренического процесса, а не влияния нейролептикотерапии. Однако для окончательных заключений требуются дальнейшие экспериментальные исследования.
Данные о влиянии специфической психофармакотерапии на систему продукции и рецепции TNF у больных параноидной шизофренией немногочисленны и достаточно противоречивы [Pollmacher T. et al., 1996; Kowalski J. et al. 2001; Pae C.U., 2006]. В проведенных нами исследованиях было установлено, что у пациентов с параноидной шизофренией содержание TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов увеличивалось в период обострения заболевания и угнеталось у пациентов, получавших нейролептикотерапию вне зависимости от наличия или отсутствия эффекта от нейролептикотерапии. Таким образом, нельзя однозначно сказать, является ли снижение ниже контрольных значений продукции TNF у пациентов, проходивших психофармакотерапию, по сравнению с аналогичным показателем в остром периоде, результатом купирования специфической психопатологической симптоматики, либо влияния нейролептикотерапии. Можно лишь предположить, что поскольку у пациентов с редукцией психопатологической симптоматики выявлялось максимальное угнетение продукции TNF (по сравнению с больными, как в острый период заболевания, так и пациентами, резистентными к нейролептикотерапии), а также, учитывая провоспалительную роль этого цитокина, именно шизофренический процесс оказывает первостепенное влияние на продукцию TNF.
Таким образом, антипсихотические средства могут, по крайней мере, частично, модулировать цитокинпродуцирующую функцию иммунокомпетентных клеток при шизофрении. Однако для вскрытия молекулярных механизмов влияния нейролептиков на продукцию и рецепцию цитокинов мононуклеарными клетками требуются дополнительные экспериментальные исследования in vitro.
В итоге, на основании результатов, полученных нами при исследовании цитокинопосредованной межклеточной кооперации эффекторных иммунокомпетентных клеток крови, были получены данные, свидетельствующие о дисбалансе продукции Th1/Th2 цитокинов с про- (IL2, TNF) и противовоспалительным функциями (IL4) и количества лимфоцитов, презентирующих комплиментарные им рецепторы, нарушении реализации апоптоза лимфоцитов крови у пациентов с параноидной шизофренией. Полученные фактические данные, по нашему мнению, во многом подтверждают представления о функционально значимых взаимодействиях иммунной и нервной систем, реализация которых во многом опосредуется цитокиновыми молекулами.
Учитывая важную роль системы цитокинов в межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток, очевидно, что дальнейшее углубленное изучение молекулярных механизмов нарушения функционирования системы цитокинов позволит расширить фундаментальные знания о нарушении системы иммунитета при шизофрении и получить возможность для поиска современных технологий коррекции шизофренического процесса.
ВЫВОДЫ
- При параноидной шизофрении имеет место нарушение системы Th1- и Th2-цитокинов и их рецепторов, характер и степень выраженности которых определяется активностью и особенностью течения шизофренического процесса.
- Дисбаланс продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови IL2 у пациентов с параноидной шизофренией характеризуется увеличением конституциональной и угнетением ФГА-, ЛПС-индуцированной секреции цитокина, снижением количества лимфоцитов, презентирующих рецептор к IL2.
- Параноидная шизофрения сопровождается угнетением продукции IL4 мононуклеарными лейкоцитами крови и снижением количества IL4-рецепторнесущих лимфоцитов.
- Закономерности нарушения системы TNF и его рецепторов при шизофреническом процессе определяются активностью заболевания: при обострении заболевания возрастает конституциональная секреция мононуклеарными лейкоцитами крови TNF и его растворимого рецептора; период редукции психопатологической симптоматики (после проведения психофармакотерапии) характеризуется угнетением секреции TNF, дисбалансом продукции мембраносвязанной и растворимой форм TNF-рецептора лимфоцитами крови.
- У больных параноидной шизофренией при обострении заболевания увеличивается численность лимфоцитов, подвергшихся спонтанному апоптозу; на фоне проведения нейролептикотерапии программированная гибель лимфоцитов угнетается.
- Дизрегуляция системы Th1- и Th2-цитокинов у больных параноидной шизофренией с непрерывным и эпизодическим типом течения шизофренического процесса характеризуется однонаправленными, но разной степени выраженности изменениями продукции и рецепции IL2, IL4 и TNF.
- Продукция и рецепция мононуклеарными лейкоцитами крови IL2, IL4 и TNF у больных параноидной шизофренией не зависят от длительности заболевания.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Уровень продукции интерлейкина 2 и его мембранного рецептора у больных параноидной шизофренией / А.П. Мельников, Н.А. Корнетов, Н.В. Рязанцева и др. // Развитие биопсихосоциального подхода в сфере охраны психического здоровья. Сборник научных трудов, выпуск 1. - Томск. - 2005. - С.121-123.
- Изменение продукции цитокинов при шизофрении / Н.В. Рязанцева, А.П. Мельников, А.П. Зима и др. // Материалы Российской конференции «Современные принципы терапии и реабилитации психически больных», Москва, 11-13 октября 2006 г. - Москва. - 2006. - С. 413-414.
- Апоптотическая гибель лимфоцитов у больных параноидной шизофренией / А.П. Мельников, Н.В. Рязанцева, А.П. Агарков и др. // Материалы Российской конференции «Современные принципы терапии и реабилитации психически больных», Москва, 11-13 октября 2006 г. - Москва. - 2006. - С. 409.
- Дисбаланс иммунорегуляторных Th1/Th2 цитокинов у больных параноидной шизофренией / А.П. Мельников, Н.В. Рязанцева, А.П. Агарков и др. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Вопросы охраны психического здоровья, обеспечения доступности и качества оказания психиатрической помощи», Барнаул, 29-30 мая 2007г. - Барнаул. - 2007. - С. 277-280.
- Дисбаланс Th1/Th2 цитокинов у больных параноидной шизофренией / Н.В. Рязанцева, А.П. Мельников, А.П. Агарков и др. // Материалы II научной международной конференции «Фундаментальные исследования в биологии и медицине», Черногория (Бечичи), 8-15 июня 2007г. - Бечичи. - 2007. - С. 62-63.
- Апоптоз лимфоцитов у больных параноидной шизофренией / Н.В. Рязанцева, А.П. Мельников, А.П. Агарков и др. // Материалы IV научной международной конференции «Современные медицинские технологии (диагностика, терапия, реабилитация и профилактика)», Хорватия (Пула), 7-14 июля 2007г. - Пула. - 2007. - С. 56.
- Состояние TNF-опосредованного пути регуляции апоптоза лимфоцитов у больных параноидной шизофренией / А.П. Мельников, А.П. Агарков, Н.В. Рязанцева и др. // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. - 2007. - №2. - С. 136-137.
- Нарушение продукции и рецепции фактора некроза опухолей альфа у больных параноидной шизофренией / А.П. Мельников, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Бюллетень СО РАМН. – 2007. - №6. – С. 37-43.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
IL - интерлейкин
ILR - семейство рецепторов для интерлейкина
TNF - фактор некроза опухолей
TNFR– семейство рецепторов для фактора некроза опухолей
sTNFR – растворимый рецептор для фактора некроза опухолей
Тh – лимфоцит Т-хелпер
