Иммунные механизмы созревания шейки матки у женщин перед родами
На правах рукописи
ДОРОФЕЕВА НАТАЛИЯ КОНСТАНТИНОВНА
ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ «СОЗРЕВАНИЯ» ШЕЙКИ МАТКИ У ЖЕНЩИН ПЕРЕД РОДАМИ
14.00.01. – акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Иваново – 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Научные руководители –
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук,
профессор Посисеева Любовь Валентиновна;
доктор медицинских наук,
профессор Сотникова Наталья Юрьевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
(ГОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия Росздрава»)
Качалина Татьяна Симоновна
кандидат медицинских наук (ГОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия Росздрава»)
Керимкулова Надежда Вячеславовна
Ведущая организация – Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет»
Защита состоится « » декабря 2009г. в часов на заседании диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» по адресу: 153045, г.Иваново, ул.Победы, 20.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федеральном государственном учреждении «Ив НИИ МиД им. В.Н. Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Автореферат разослан « » ноября 2009г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук И.А.Панова
Актуальность проблемы
В современном практическом акушерстве проблема подготовки к родам остается чрезвычайно актуальной. В настоящее время отмечается выраженное снижение числа женщин, у которых беременность и роды протекают без осложнений (Айламазян Э.К., 2007). Биологическая готовность к родоразрешению- необходимое условие для нормального течения родов (Быковская Л.Н., 2003). Подготовленность женского организма к родам в значительной степени определяется состоянием шейки матки (Чернуха Е.А., 2005). «Зрелость» шейки матки достигается в результате сложного комплекса изменений в организме беременной, затрагивающих нейрогуморальную, эндокринную и иммунную системы как материнского организма, так и фетоплацентарного комплекса (Посисеева Л.В., 2006, Воскресенский С.Л., 2007).
В ряде работ было продемонстрировано, что фагоциты, инфильтрирующие ткань шейки матки и продуцируемые ими цитокины, а также другие биологически активные молекулы, непосредственно участвуют в ремоделировании тканей шейки матки (Timmons B.C., 2009). Однако данные об особенностях функционирования фагоцитарных клеток на системном уровне на разных этапах подготовки организма к родам практически отсутствуют. Остаются не изученными механизмы, определяющие выход циркулирующих фагоцитов из сосудистого русла в ткань и их взаимодействие с белками внеклеточного матрикса. Белкам из семейства матриксных металлопротеиназ (ММР), а также хемокинам отводится основная роль в осуществлении процесса «созревания» шейки матки на локальном уровне (Соболева Г.М., 2007; Trnblom S.A., 2005). Известно, что фагоциты являются одними из основных продуцентов ММР и хемокинов (Просекова Е.В., 2007; Пинегин Б.В., 2007). Однако в литературе отсутствуют данные о характере продукции фагоцитами протеолитических молекул и IL-8 на разных этапах подготовки организма к родам на системном уровне.
В настоящее время доказано, что TGF играет чрезвычайно важную роль в регуляции иммунологических взаимоотношений матери и плода на всем протяжении гестационного процесса (Thellin O., 2005). Ранее было показано, что к концу беременности происходит снижение продукции TGF, связанное с отсутствием необходимости на данном этапе иммуносупрессии (Сотникова Н.Ю., 2005). Однако в литературе отсутствуют данные о динамике сывороточного содержания TGF2 в процессе «созревания» шейки матки у женщин в конце гестации.
Таким образом, определение особенностей функционального состояния периферических фагоцитов и продукции цитокинов на разных этапах подготовки организма к родам позволит уточнить системные иммунные механизмы, определяющие «созревание» шейки матки, на основании которых можно будет разработать новые прогностические критерии готовности к родам, что имеет большое значение для практического акушерства.
Цель исследования:
Установить роль периферических фагоцитов и продуцируемых ими хемокинов и протеолитических ферментов, а также TGF2 в процессах подготовки шейки матки к родам у первобеременных женщин, на основании чего разработать новые прогностические критерии «созревания» шейки матки и характера течения родовой деятельности.
Задачи исследования:
1. Определить медико-биологические факторы риска, связанные с неэффективностью подготовки организма к родам у первобеременных женщин.
- 2. Установить особенности экспрессии CD49e и CD62L молекул и внутриклеточной продукции IL-8 нейтрофилами и моноцитами периферической крови первобеременных при различной степени «зрелости» шейки матки.
- 3. Определить уровень экспрессии мРНК IL-8, MMP-9 и TIMP-1 нейтрофилами периферической крови первобеременных при различной степени «зрелости» шейки матки.
- 4. Установить закономерности изменения сывороточного содержания TGF2 у первобеременных женщин при различной степени «зрелости» шейки матки.
- 5. Разработать новые прогностические критерии «созревания» шейки матки у первобеременных женщин и характера течения родовой деятельности.
- Научная новизна исследования:
Впервые установлено, что процесс «созревания» шейки матки у первобеременных женщин при доношенной беременности сопровождается выраженными изменениями функционального состояния фагоцитов периферической крови, характеризующиеся усилением экспрессии интегриновых молекул CD62L на поверхности нейтрофилов и моноцитов и рецепторов к фибронектину периферическими нейтрофилами.
Показано, что подготовка организма к родам ассоциирована с изменением баланса активности протеолитических и антипротеолитических ферментов, продуцируемых периферическими нейтрофилами. При отсутствии готовности организма к родам в периферических нейтрофилах преобладает антипротеолитическая активность за счет низкого уровня синтеза ММР-9, тогда как у женщин со «зрелой» шейкой матки - доминирует протеолитическая активность за счет выраженного повышения экспрессии мРНК ММР-9.
Установлено, что в процессе «созревания» шейки матки происходит прогрессивное снижение содержания периферических нейтрофилов, экспрессирующих внутриклеточно IL-8.
Выявлено, что сывороточное содержание TGF2 снижается по мере развития готовности организма к родам и достигает минимальных значений у женщин со «зрелой» шейкой матки.
Показано, что у женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки уровень экспрессии интегриновых молекул на поверхности периферических фагоцитов связан с эффективностью медикаментозной подготовки организма к родам, а уровень экспрессии мРНК ММР-9 и IL-8- с патологическим прелиминарным периодом и нарушениями сократительной деятельности матки в родах.
Практическая значимость:
Разработан и предложен в клиническую практику новый способ прогнозирования «созревания» шейки матки в процессе подготовки организма к родам на основании определения относительного содержания CD49е позитивных нейтрофилов в периферической крови первобеременных женщин в 38-39 недель гестации (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 01.10.09).
Положения, выносимые на защиту:
Процесс «созревания» шейки матки у первобеременных женщин ассоциирован с изменением функционального состояния фагоцитарных клеток периферической крови, которое проявляется в прогрессивном усилении экспрессии интегриновых молекул CD62L на поверхности периферических фагоцитов, увеличении содержания нейтрофилов с рецепторами к фибронектину, повышении уровня экспрессии мРНК ММР-9 в периферических нейтрофилах при одновременном снижении сывороточного содержания TGF2 и количества циркулирующих нейтрофилов, продуцирующих внутриклеточно IL-8.
Эффективность медикаментозной подготовки организма к родам ассоциирована с изначально высокими уровнями СD49е+ и СD62L+ нейтрофилов и СD62L+ моноцитов, а также низким содержанием IL-8+ нейтрофилов в периферической крови первобеременных. Развитию аномалий родовой деятельности предшествуют низкие уровни экспрессии мРНК IL-8 и ММР-9 периферическими нейтрофилами.
Показатель относительного содержания CD49е позитивных нейтрофилов в периферической крови первобеременных женщин в 38-39 недель гестации служит прогностическим критерием «созревания» шейки матки в процессе подготовки организма к родам.
Внедрение результатов в практику:
Разработанный новый способ прогнозирования «созревания» шейки матки прошел предрегистрационное испытание в акушерской клинике Федеральном государственном учреждении «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи ».
Апробация работы: Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 75-летию со дня рождения основателя института, профессора, Заслуженного деятеля науки РФ, Заслуженного врача РФ Виктора Николаевича Городкова (Иваново, 2007) и конференции молодых ученых, посвященной памяти основателя института, профессора, Заслуженного деятеля науки РФ, Заслуженного врача РФ Виктора Николаевича Городкова (Иваново, 2009).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.
Личное участие автора: Автором самостоятельно производилось обследование беременных женщин перед родами, проводилось динамическое наблюдение за ними, а также прослежены исходы беременности у обследованных, проведена систематизация и статистическая обработка полученных результатов.
Структура и объем диссертации: Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 265 источников. Работа иллюстрирована 32 таблицами, 11 рисунками и 1 схемой.
Содержание работы
Материалы и методы исследования:
Обследовано 106 первобеременных женщин в сроке гестации 38- 40 недель, поступивших на дородовую госпитализацию в ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».
В зависимости от степени «зрелости» шейки матки (по шкале E.H.Bishop) обследованные женщины были разделены на 3 группы: первую группу составили 30 первобеременных со «зрелой» шейкой матки (9 – 13 баллов), вторую– 35 первобеременных женщин с «недостаточно зрелой» (6 – 8 баллов) и третью – 41 первобеременная, имевшая «незрелую» шейку матки (0 – 5 баллов).
Для уточнения особенностей исследуемых иммунологических показателей в конце гестационного периода и до начала физиологических процессов ремоделирования тканей шейки матки дополнительно было обследовано 16 первобеременных женщин в сроке гестации 36 недель, не отличавшихся по анамнезу и соматическому состоянию от женщин основных клинических групп наблюдения и не имевших признаков угрожающих преждевременных родов.
Иммунологическое обследование проводилось однократно при взятии женщины в исследование. Беременным, имевшим «незрелую» и «недостаточно зрелую» шейку матки проводилась комплексная подготовка организма к родам, включающая в себя ежедневные инъекции в течение 7-10 дней 3 мл 5% раствора аскорбиновой кислоты в/в, введение спазмолитиков (но-шпа 2,0 в/м, галидор 2,0 в/м, свечи «Бускопан» 1 свеча per rectum). Динамика «созревания» шейки матки во второй и третьей группах оценивалась при влагалищном исследовании 1 раз в 7 дней.
Наряду со сбором анамнестических сведений, акушерским и общеклиническим исследованиями проводилось наблюдение за состоянием плода с использованием ультразвукового сканирования и кардиотокографии.
Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь.
Иммунологические методы исследования:
- Выделение обогащенных популяций моноцитов и нейтрофилов из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (d=1,078, d=1,114) (Boyum A.,1968).
- Определение фенотипа и внутриклеточного синтеза цитокинов периферическими моноцитами и нейтрофилами с помощью моноклональных антител (мАТ) (CALTAG Laboratories, USA) методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, USA). В работе использованы следующие антитела: коньюгированные с FITC анти-CD62L, коньюгированные с РЕ анти-CD49e, анти- IL-8 антитела. При оценке внутриклеточной продукции IL-8 нейтрофилами и моноцитами предварительно проводили процедуру пермеабилиазации клеточной мембраны с использованием коммерческого набора FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, Burlingame, CA, USA).
- Определение экспрессии мРНК MMP-9, TIMP-1 и IL-8 нейтрофилами периферической крови методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в масштабе реального времени. на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO-RAD, USA). В работе использовали праймеры и зонды для IL-8 и 2-микроглобулина, синтезированные в лаборатории генной инженерии гематологического научного центра РАМН (г. Москва, зав. лабораторией Мисюрин А.В.).
-Содержание TGF2 в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном ридере Multiscan EX (Labsystems, Finland) с помощью коммерческой тест-системы (Bender MedSystems, Austria, Europe).
Статистическая обработка данных:
Статистическая обработка результатов проводилась на ПК Intel Pentium 4, функционирующем под управлением операционной системы Microsoft Windows XP, с использование программных компонентов пакета Microsoft Office 2003.
Результаты исследования и их обсуждение.
Возраст обследованных беременных колебался от 17 до 32 лет. Группы практически не отличались по среднему возрасту, характеру менструальной функции и началу половой жизни.
При оценке данных гинекологического анамнеза первобеременных женщин была выявлена высокая частота гинекологических заболеваний (83,3%, 80,0% и 78,0% по группам соответственно, р>0,05). В структуре гинекологической патологии наиболее часто встречались воспалительные процессы гениталий (73,3%, 51,43% и 61,0% соответственно по группам), эктопия шейки матки (50,0%, 54,3% и 36,6% в группах соответственно) (р>0,05 во всех случаях).
Соматически здоровых женщин было соответственно в группах: 16,7%, 37,1% и 34,1% (p>0,05). В третьей группе было больше обследованных, страдавших нейроциркуляторной дистонией по смешанному типу (9,8%), а также патологией щитовидной железы (17,1%) (р<0,05 в обоих случаях).По остальным нозологическим формам экстрагенитальной патологии клинические группы практически не различались между собой.
Анализ осложнений настоящей беременности выявил, что у 96,2% женщин всех групп беременность протекала с отклонениями. Достоверно чаще в третьей группе отмечался ранний гестоз (24,4%) и анемия третьего триместра (48,8%) по сравнению с первой группой (6,7%, р<0,05 и 20,0%, p<0,01). Угроза прерывания по трем триместрам беременности регистрировалась приблизительно одинаково во всех клинических группах.
С целью уточнения иммунных механизмов, участвующих в подготовке организма к родам, было проведено исследование характера экспрессии интегриновых молекул CD49e и CD62L на поверхности периферических моноцитов и нейтрофилов в конце гестации. Анализ полученных данных показал, что процесс «созревания» шейки матки сопровождался динамическим повышением экспрессии CD49e и CD62L молекул на поверхности нейтрофилов, а также CD62L на поверхности моноцитов периферической крови беременных женщин. Так, в группе женщин со «зрелой» шейкой матки уровень CD49e+ нейтрофилов в периферической крови составил 49,93±2,81%, достоверно ниже данный показатель был в группе женщин с «недостаточно зрелой» шейкой матки (41,32±2,35%, р<0,02) и с «незрелой» шейкой матки (32,48±1,91%, р<0,01 по сравнению с группой с «недостаточно зрелой» шейкой матки и р<0,001 по сравнению с женщинами со «зрелой» шейкой матки). Минимальные значения CD49e+ нейтрофилов были в дополнительно обследованной группе беременных в 36 недель гестации:23,17±1,89 (р<0,001 по сравнению со всеми группами). Относительное содержание CD62L+ нейтрофилов в трех основных клинических группах имело аналогичную тенденцию: 74,03±5,55%- в группе со «зрелой» шейкой матки, 66,92±2,43%- в группе с «недостаточно зрелой» шейкой матки, 39,94 ± 7,30%- в группе с «незрелой» шейкой матки (р<0,01 по сравнению с группами со «зрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки) и 34,10± 4,05%- в 36 недель гестации (р<0,001 по сравнению с группами со «зрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки). Экспрессия CD62L молекул на поверхности периферических моноцитов, также увеличивалась в процессе подготовки организма к родам и составила соответственно по группам: 69,67±2,52%, 63,50±2,81%, 48,21±4,66% (p<0,01по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки и p<0,02 по сравнению с группой с «недостаточно зрелой» шейкой матки) и 37,51 ± 5,09% (р<0,001по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки и р<0,01 по сравнению с группой с «недостаточно зрелой» шейкой матки).
Известно, что молекулы CD62L определяют взаимодействие клеток с эндотелиоцитами, регулируя процессы выхода клеток из сосудистого русла в ткань (Laudanna C., 2006). По-видимому, увеличение экспрессии CD62L молекул на поверхности нейтрофилов и моноцитов периферической крови у женщин в конце гестации является одним из механизмов, определяющих усиленную миграцию нейтрофилов и моноцитов в ткань шейки матки непосредственно перед развязыванием родовой деятельности.
Молекулы CD49e являются рецепторами к фибронектину, одному из основных компонентов внеклеточного матрикса тканей шейки матки, деструкция которого непосредственно обуславливает «созревание» шейки матки (Bowen J.A., 2000). Выявленное нами увеличение экспрессии CD49e молекул на поверхности периферических нейтрофилов, по-видимому, можно рассматривать как один из пусковых этапов тканевого ремоделирования шейки матки.
Учитывая выявленные нами значительные изменения в экспрессии функциональных молекул на поверхности периферических нейтрофилов в процессе «созревания» шейки матки, мы оценили также характер экспрессии нейтрофилами периферической крови мРНК матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и ее тканевого ингибитора-1 (TIMP-1) у женщин с различной степенью готовности организма к родам. Было установлено, что в процессе «созревания» шейки матки перед родами происходит постепенное повышение экспрессии гена ММР-9 периферическими нейтрофилами. Так, в группе женщин со «зрелой» шейкой матки данный показатель был максимальным (35,86±9,26х104 копий пар/мкл), группе с «недостаточно зрелой» шейкой матки он был достоверно ниже (10,75±6,15х104 копий пар/мкл, р<0,05 по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки), у женщин с «незрелой» шейкой матки этот показатель составил 2,48±0,92х104 копий пар/мкл (p<0,01 по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки). Следует отметить, что у женщин в 36 недель гестации уровень экспрессии гена ММР-9 периферическими нейтрофилами был минимальным, ниже предела детектируемых значений (р<0,01 по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки).
Динамика экспрессии тканевого ингибитора ММР-9 – TIMP-1 была иной и характеризовалась снижением уровня экспрессии этого гена на начальных этапах «созревания» шейки матки (12,83±6,22х103 копий пар/мкл- в 36 недель; 8,33±1,58х103 копий пар на мкл- у женщин с «незрелой» шейкой матки, р>0,05), достигая минимальных значений в группе женщин с «недостаточно зрелой» шейкой матки (4,20±1,30х103 копий пар/мкл р<0,02 по сравнению с группой со «зрелой» шейкой матки). Однако к моменту родоразрешения отмечалось повышение уровня экспрессии мРНК TIMP-1 нейтрофилами периферической крови (18,72±5,25х103 копий пар/мкл). Для уточнения соотношения про- и антипротеолитической активности периферических нейтрофилов у женщин с разной степенью подготовленности к родам был рассчитан индекс соотношения активности ММР-9 и TIMP-1. Анализ этого показателя выявил преобладание антипротеолитической активности нейтрофилов на начальных этапах процесса подготовки организма к родам, которое сменялось доминированием протеолитической активности периферических нейтрофилов при полностью «созревшей» шейке матки.
Известно, что MMP-9, или желатиназа, гидролизует коллаген и эластин базальных мембран (Соболева Г.М., 2007). Выявленное нами повышение уровня экспрессии ММР-9 нейтрофилами в процессе «созревания» шейки матки с одной стороны свидетельствует о том, что изменения в синтезе протеолитических молекул могут способствовать непосредственному разрушению структурных компонентов межклеточного матрикса, а также опосредованно вызывать больший приток фагоцитов в ткани шейки матки, дегрануляция которых приводит к увеличению концентрации деструктивных веществ на локальном уровне. Выявленное нами повышение уровня экспрессии мРНК ММР-9 периферическими нейтрофилами на начальных этапах «созревания» шейки матки может быть связано с одновременным снижением уровня ее непосредственного ингибитора- ТIМP-1.
Рекрутирование нейтрофилов в ткань шейки матки определяется в основном высоким локальным уровнем продукции IL-8, являющегося одним из наиболее сильных хемоаттрактантов для нейтрофилов (Trnblom S.A, 2005). Однако особенности системной продукции IL-8 на разных этапах подготовки организма к родам остаются до конца не установленными.
Нами было выявлено, что процесс «созревания» шейки матки на системном уровне не сопровождался значительными изменениями экспрессии нейтрофилами мРНК IL-8. Анализ относительного содержания IL-8+ нейтрофилов в периферической крови беременных женщин с разной степенью готовности организма к родам показал, что в группе со «зрелой» шейкой матки уровень IL-8+ нейтрофилов был минимальным- 61,28±3,51%, в группе женщин с «недостаточно зрелой» шейкой матки относительное содержание IL-8+ нейтрофилов составило- 62,73±3,4%. У женщин с «незрелой» шейкой матки уровень IL-8+ периферических нейтрофилов был достоверно выше, чем в группах женщин со «зрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки- 72,75±2,07% (р<0,01, р<0,05, соответственно). В 36 недель гестации относительное содержание на системном уровне IL-8+ нейтрофилов было максимальным: 82,96±1,82% (р<0,001 по сравнению со всеми группами). Изучение относительного содержания IL-8+ моноцитов в периферической крови не выявило четкой динамики изменения данного показателя в клинических группах.
Более низкое содержание IL-8+ нейтрофилов в крови женщин со «зрелой» шейкой матки может быть связано с перераспределением из кровотока в ткань активированных нейтрофилов, продуцирующих IL-8, за счет их высокой адгезионной и миграционной активности. Повышение содержания тканевых нейтрофилов, мигрировавших из сосудистого русла под действием направленного хемотаксиса, приводит, в свою очередь, к еще более выраженной выработке провоспалительных цитокинов и протеолитических ферментов, приводящих к дезорганизации соединительной ткани в структуре шейки матки при ее «созревании».
С целью выявления возможных механизмов, определяющих изменение функциональной активности нейтрофилов периферической крови в конце гестационного периода, нами было изучено сывороточное содержание TGF2 у женщин с различной степенью «зрелости» шейки матки. Анализ полученных результатов выявил постепенное снижение содержания TGF2 в сыворотке крови беременных женщин в процессе подготовки организма к родам. Так, в группах женщин со «зрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки данный показатель составил 430,76±255,07 пг/мл и 835,63±303,46 пг/мл соответственно. Достоверно выше были показатели в группах обследованных с «незрелой» шейкой матки и в 36 недель беременности: 1259,26±297,13пг/мл и 1630,09±605,20 пг/мл (р<0,05 в обоих случаях по сравнению со «зрелой» шейкой матки).
Выявленное прогрессивное снижение содержания TGF2 в периферической крови при подготовке организма к родам может приводить к снижению активности иммуносупрессорных реакций с одновременной активацией нейтрофилов, что проявляется в значительном повышении экспрессии интегриновых молекул на их поверхности и усилении экспрессии нейтрофилами генов протеолитических ферментов, разрушающих экстрацеллюлярный матрикс при «созревании» шейки матки. Снижение сывороточного уровня TGF2 может определять уменьшение активности TIMP-1, что также можно расценивать как один из механизмов, лежащих в основе деструктивных изменений коллагенового остова шейки матки при ее ремоделировании перед родами.
Для уточнения механизмов, определяющих ответ организма на подготавливающую к родам терапию, в группах с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки был проведен анализ взаимосвязи клинических и иммунологических показателей с эффективностью проводимых медикаментозных назначений.
Анализ полученных данных показал, что количество женщин с «созревшей» шейкой матки к моменту родов на фоне проводимого лечения было достоверно выше во второй группе (94,3%), чем в третьей (70,7%) (р<0,01).
При оценке клинических факторов, влияющих на эффективность подготовки организма к родам отмечено, что среди женщин с эффективной подготовкой было больше соматически здоровых (37,1%), реже встречалась анемия (38,7%) и НЦД (19,4%), чем среди тех, у кого подготовка была без эффекта: 28,6% (р<0,02), 71,4% (р<0,02) и 57,1% (р<0,01) соответственно. Данные гинекологического анамнеза не были связаны с эффективностью проводимой подготавливающей терапии.
При анализе характера экспрессии интегриновых молекул периферическими фагоцитами у женщин, имевших при поступлении «незрелую» и «недостаточно зрелую» шейку матки установлено, что для беременных с эффективной подготовкой организма к родам, изначально был характерен более высокий уровень CD62L+ (53,74±5,74%) и CD49е+ (38,13±1,72%) нейтрофилов, а также CD62L+ моноцитов (56,54±3,37%) в периферической крови по сравнению с аналогичными показателями у женщин, у которых проводимая медикаментозная подготовка не оказала эффекта (21,75±1,35%, р<0,001; 28,18±2,98%, р<0,01; 31,35±1,75%, р<0,001 соответственно). Относительное содержание CD49е позитивных моноцитов на системном уровне у женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки не было связано с последующей эффективностью подготовки организма к родам.
Вероятно, при недостаточно высоком уровне экспрессии CD62L и CD49е молекул на поверхности нейтрофилов и CD62L молекул на поверхности моноцитов нарушается миграция этих пулов клеток в ткани шейки матки и угнетается взаимодействие нейтрофилов с белками внеклеточного матрикса, в частности, с фибронектином, что может приводить к нарушению физиологического процесса ремоделирования тканей шейки матки у женщин в конце гестации.
На основании выявленной закономерности нами был разработан новый способ прогнозирования «созревания» шейки матки у женщин перед родами. Предлагаемый способ заключается в том, что у беременных в 38-39 недель гестации в периферической крови определяют относительное содержание CD49е позитивных нейтрофилов и при значении нейтрофилов равном 24,6% или более прогнозируют «созревание» шейки матки, а при значении менее 24,6% -отсутствие «созревания» шейки матки к 40 неделям гестации. Точность заявляемого способа составила- 82%, чувствительность- 91% и специфичность- 64% (положительное решение о выдаче патента на изобретение от 01.10.09).
Так же было установлено, что группа женщин с изначально «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки и с неудавшейся подготовкой к родам характеризовалась более высоким содержанием IL-8+ нейтрофилов в периферической крови (75,90±1,30%), по сравнению с аналогичным показателем в группе женщин, где шейка матки стала «зрелой» к моменту родов (67,65±2,37%, р<0,01).
Возможно, это обусловлено нарушением своевременной миграции высокоактивных IL-8+ нейтрофилов в ткани шейки матки, что приводит к замедлению процессов деструкции ее коллагенового остова в процессе «созревания».
Анализ уровня экспрессии мРНК MMP-9, TIMP-1 и IL-8 периферическими нейтрофилами, а также сывороточного содержания TGF2 у женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки не выявил зависимости этих показателей от эффективности последующей подготовки организма к родам.
Сравнительный анализ особенностей течения родов у обследованных женщин показал, что среди всех пациенток наибольший процент родов без осложнений был представлен в группе женщин со «зрелой» шейкой матки (63,3%), достоверно ниже он был в группе с «незрелой» шейкой матки (36,6%) (р<0,02). Большая часть женщин во всех группах была родоразрешена через естественные родовые пути, однако доля этих родов в третьей группе была несколько меньше: 80,0%, 80,0% и 65,9% по группам соответственно. У 36,6% женщин в третьей группе имело место дородовое излитие околоплодных вод, что достоверно выше, чем во второй группе (14.3%, р<0,02). Аномалии родовой деятельности встретились у 36,6% рожениц третьей группы, что в 3 раза превышает аналогичный показатель женщин первой группы - 16,7% и в 1,9 раз второй группы- 22,9%.
При изучении динамики родового процесса у обследуемых женщин было отмечено, что наименьшая продолжительность родов была в первой группе- 462,47±34,25 мин. Во второй и третьей группах данный показатель составил: 579,41±27,27 мин (р<0,01 по сравнению с первой группой) и 539,74±30,98 мин соответственно. Увеличение продолжительности родов в основном отмечено за счет удлинения первого периода родов.
В группе с «незрелой» шейкой матки при ретроспективном анализе выявлена большая частота родоразрешений путем операции кесарево сечение: 20%, 20,0% и 34,1% по группам соответственно. Обращало на себя внимание, что чаще всего плановые операции выполнялись в третьей группе (14,6%) по сравнению с первой, где кесарево сечение выполнялось только в экстренном порядке (р<0,05). В структуре показаний к кесареву сечению в третьей группе значительное место занимало отсутствие готовности организма к родам (14,6%). Наиболее частым показанием к оперативному родоразрешению в первой группе была острая гипоксия плода (10,0%). Следует отметить, что в третьей группе в потужном периоде родов достоверно чаще использовалось наложение акушерских щипцов и вакуум экстракция плода (9,8%, р<0,05 по сравнению с первой группой)
При рассмотрении данных о состоянии детей при рождении и в раннем неонатальном периоде было установлено, что у 9,7% детей третьей группы отмечались при рождении признаки СЗРП (р<0,05 по сравнению с первой и второй группами). Количество здоровых детей было практически одинаковым во всех обследованных группах (63,3%, 65,7% и 56,1% соответственно по группам).
Ретроспективный анализ взаимосвязи полученных иммунологических данных и последующего характера течения родов показал, что у женщин с изначально «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки, у которых впоследствии развился патологический прелиминарный период (ППП), отмечалась сниженная экспрессия мРНК ММР-9 (4,86±1,80х104 копий пар/мкл- у женщин без ППП, 0- у женщин с ППП, р<0,01) и мРНК IL-8 (9,21±3,86 копий пар/мкл и 2,01±1,14 копий пар на мкл соответственно, р<0,05) периферическими нейтрофилами и более низкие показатели индекса соотношения уровней экспрессии мРНК ММР-9 и TIMP-1 периферическими нейтрофилами (0,88±0,28 и 0 соответственно, р<0,01). Кроме того, сниженные показатели уровня экспрессии мРНК IL-8 периферическими нейтрофилами были ассоциированы с развитием аномалий родовой деятельности у женщин с изначально «незрелой» и «созревающей» шейкой матки (11,74±4,2586 копий пар/мкл - при физиологических родах, 3,14±1,1486 копий пар/мкл - при родах с АРД, р<0,05). Остальные изученные нами иммунологические показатели не были связаны с развитием аномалий родовой деятельности у обследованных женщин.
Как известно, отсутствие преобладания эстрогенов над прогестероном - одна из причин ППП, то есть влияние прогестерона при ППП более выражено, чем при физиологических родах (Чернуха Е.А., 2005). Можно предположить, что выявленные нами отличия в уровне экспрессии мРНК IL-8 и ММР-9 у женщин с ППП, были связаны именно с увеличением активности прогестерона, приводящего непосредственно к снижению продукции провоспалительных цитокинов, таких как TNF, IFN, IL-8 и IL-1, а также опосредованно за счет ингибирующего действия прогестерона на синтез индуктора IL-8– IL-1.
В патогенезе аномалий родовой деятельности одну из главных ролей играет ригидность шейки матки, при которой может происходить инверсия тройного нисходящего градиента, что приводит к асинхронности и аритмичности сокращений различных отделов матки. Повышение ригидности шейки матки у рожениц, как правило, обусловлено отсутствием ее «зрелости» (Чернуха Е.А., 2005). Более низкий уровень экспрессии мРНК IL-8 может определять снижение миграции нейтрофилов в ткани шейки матки из сосудистого русла с последующим нарушением продукции в ткани шейки матки необходимых факторов, участвующих в ее «созревании», что может проявится в замедлении процессов ремоделирования соединительнотканного остова шейки матки при подготовке к родам.
Таким образом, суммируя полученные нами результаты можно сделать заключение о том, что процесс подготовки организма к родам и связанные с ним структурные изменения ткани шейки матки ассоциированы со значительными изменениями функционального состояния клеток фагоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилов, в периферической крови беременных женщин. В процессе «созревания» шейки матки происходит прогрессивное усиление экспрессии интегриновых молекул на поверхности периферических нейтрофилов и моноцитов, определяющих способность клеток к выходу из сосудистого русла и взаимодействию с белками внеклеточного матрикса, повышение экспрессии периферическими нейтрофилами мРНК протеолитических ферментов, сопровождается снижением циркулирующего пула нейтрофилов, экспрессирующих внутриклеточно IL-8. Изменения функционального состояния периферических фагоцитов, по-видимому, могут быть взаимосвязаны с системной продукции TGF2, которая значительно снижается при подготовке организма к родам. Особенности функционального состояния периферических фагоцитов у женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки связаны с эффективностью последующей медикаментозной подготовки организма к родам. Успех медикаментозной терапии ассоциирован с изначально более высокими показателями, характеризующими экспрессию СD49е и СD62L молекул нейтрофилами, повышенным уровнем СD62L+ моноцитов и со сниженным содержанием IL-8+ нейтрофилов в периферической крови женщин. Особенности экспрессии мРНК IL-8 и ММР-9 периферическими нейтрофилами связаны с последующим развитием патологического прелиминарного периода, аномалий родовой деятельности. Показатель относительного содержания CD49e+ нейтрофилов в периферической крови женщин с «незрелой» шейкой матки может быть использован для прогнозирования «созревания» шейки матки перед родами.
Выводы:
- Медико-биологическими факторами риска, влияющими на отсутствие готовности шейки матки к родам, у первобеременных женщин молодого возраста при доношенной беременности являются наличие у них нейроциркуляторной дистонии и анемии.
- Динамика экспрессии интегриновых молекул на поверхности фагоцитов периферической крови в процессе «созревания» шейки матки у первобеременных женщин характеризуется прогрессивным повышением показателей CD49e+ и CD62L+ нейтрофилов и CD62L+ моноцитов. В процессе подготовки организма к родам происходит снижение содержания IL-8+ периферических нейтрофилов, наименьший уровень IL-8+ периферических нейтрофилов отмечается у женщин со «зрелой» шейкой матки.
- У женщин с «незрелой» шейкой матки отмечается сниженный уровень экспрессии мРНК ММР-9 периферическими нейтрофилами по сравнению с аналогичным показателем у женщин со «зрелой» шейкой матки. У женщин с «недостаточно зрелой» шейкой матки в периферической крови снижена экспрессия мРНК TIMP-1 нейтрофилами по сравнению с таковым при «зрелой» шейке матки, что приводит к относительному преобладанию протеолитической активности нейтрофилов. Женщины со «зрелой» шейкой матки характеризуются максимальными значениями экспрессии мРНК ММР-9 и TIMP-1 нейтрофилами крови при выраженном доминировании протеолитической активности периферических нейтрофилов.
- Процесс подготовки организма к родам сопровождается прогрессивным снижением содержания TGF2 в сыворотке крови, уровень которого у первобеременных женщин со «зрелой» шейкой матки значительно ниже аналогичного параметра у женщин с «незрелой» шейкой матки.
- При неэффективной комплексной подготовке организма к родам у первобеременных женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки отмечаются исходно сниженные уровни CD49e+ и CD62L+ нейтрофилов, а также CD62L+ моноцитов на фоне повышенного количества IL-8+ нейтрофилов. Уменьшение экспрессии мРНК ММР-9 и мРНК IL-8 периферическими нейтрофилами у женщин с «незрелой» и «недостаточно зрелой» шейкой матки связано с последующим развитием аномалий родовой деятельности.
- Высокие значения CD49е позитивных нейтрофилов (24,6 % или более) у первобеременных женщин с «незрелой» шейкой матки в 38-39 недель беременности позволяют прогнозировать «созревание» шейки матки к 40 неделям гестации с точностью 82%.
Практические рекомендации:
У первобеременных первородящих женщин, поступающих на дородовую госпитализацию в 38-39 недель гестации с «незрелой» шейкой матки, с целью прогнозирования ее «созревания» целесообразно определять относительное содержание CD49е позитивных периферических нейтрофилов и при его значении, равном 24,6% или более, прогнозировать «созревание» шейки матки, а при значении менее 24,6% -отсутствие «созревания» шейки матки к 40 неделям гестации.
Список опубликованных работ по теме диссертации:
1. Динамика сывороточного содержания TGF2 и уровня экспрессии MMP-9 и TIMP-1 периферическими нейтрофилами в процессе подготовки организма женщины к родам [Текст] / Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Н.К. Дорофеева, Ю.С. Анциферова // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т.10, №2. - С. 248-249.
2. Изменение экспрессии СD49е молекул фагоцитами периферической крови в процессе подготовки организма к родам у женщин с неосложненной беременностью и гестозом [Текст] / Н.К. Дорофеева, Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова // Иммунологические аспекты репродукции человека: материалы междунар. науч. - практ. конф. - Новосибирск, 2009. - С. 28 — 30.
3. Исследование особенности содержания периферических фагоцитов CD 49е+ в крови женщин с разной степенью готовности организма к родам [Текст] / Н.К. Дорофеева, Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова // Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии: сборник науч. работ и материалов науч. - практ. конф. молодых ученых, посвященной 75- летию со дня рождения основателя института, проф., З.д.н. РФ Виктора Николаевича Городкова. - Иваново, 2007. - С. 86 - 87.
4. Особенности экспрессии CD 49e молекул фагоцитами периферической крови беременных женщин с разной степенью зрелости шейки матки [Текст] / Н.К. Дорофеева, Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Ю.С. Анциферова // Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3. - Прил. 1. - С. 17 - 18.
5. Особенности экспрессии генов MMP-9 и TIMP-1 нейтрофилами периферической крови женщин в процессе подготовки организма к родам [Текст] / Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Н.К. Дорофеева и др. // Вестник российской военно-медицинской академии. - 2009. - Прил. 1. - С. 498.
6. Характеристика экспрессии генов IL-8, MMP-9 и TIMP-1 нейтрофилами периферической крови женщин при подготовке организма к родам [Текст] / Л.В. Посисеева, Н.Ю. Сотникова, Н.К. Дорофеева и др. // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4 - 5. - С. 415 - 416.
Список условных сокращений
мРНК – матриксная рибонуклеиновая кислота
ППП- патологический прелиминарный период
СЗРП – синдром задержки развития плода
ФНО (TNF) – фактор некроза опухоли
CD- молекулы дифференцировки лимфоидных клеток
FITC- флюоресцеин изотиоционат
IFN – интерферон
IL – интерлейкин
MMP- матриксная металлопротеиназа
РЕ- фикоэритрин
RT-PCR (ПЦР) – полимеразноцепная реакция
TGF- трансформирующий фактор роста
TIMP- тканевой ингибитор матриксной металлопротеиназы
