Клинико-иммунологические особенности и специфическая иммунотерапия аллергических заболеваний у детей, сенсибилизированных аллергенами плесневых грибов и домашней пыли

На правах рукописи

купцова наталья владимировна

клинико-иммунологические особенности и специфическая иммунотерапия аллергических заболеваний у детей, сенсибилизированных аллергенами плесневых грибов и домашней пыли

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва- 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских

наук, профессор Караулов Александр Викторович

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук,

профессор Афанасьев Станислав Степанович

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских

наук, профессор Балаболкин Иван Иванович

Ведущая организация: Российский государственный медицинский

университет им. Н.И. Пирогова

Защита диссертации состоится «___» ________2011г. в____часов на заседании диссертационного совета Д 208.040.08 при ГОУ ВПО Первом МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский пр., д. 49.

Автореферат разослан « _____» _______________________2011года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинский наук,

профессор Миронов Андрей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия отмечается неуклонный рост числа аллергических заболеваний. По прогнозам ВОЗ, в XXI веке они займут ведущее место в структуре общей заболеваемости. Формирование аллергической реактивности человека часто начинается в детском возрасте. В связи с высокой проницаемостью гистогематических барьеров спектр потенциальных аллергенов у детей очень широк. Поэтому респираторная поливалентная аллергия у детей является актуальной проблемой современной педиатрии [Madani Y., et al., 2010]. Среди различных видов сенсибилизации при заболеваниях легких у детей существенное значение имеет грибковая, связанная с гиперчувствительностью к грибам родов Aspergillus, Alternaria, Candida, Penicillium и др. Аллергические болезни легких, обусловленные сенсибилизацией к грибам, вызваны неблагоприятными условиями проживания детей (сырость, плесень в жилых помещениях, близость загрязненных грибами отходов производства). Наряду с дерматофагоидным клещем, плесневые грибы являются одним из основных аллергенных компонентов домашней пыли. В группе больных, имеющих сенсибилизацию к домашней пыли, сочетание аллергии к домашней пыли с аллергией к грибам обнаруживается в 74%.

Для бронхиальной астмы (БА), сопровождающейся грибковой сенсибилизацией, характерны непрерывно-рецидивирующий характер и тяжелое течение заболевания, причем во многих случаях выявляется сочетание грибковой сенсибилизации с сенсибилизацией к другим группам аллергенов [Студеникин М.Я., Балаболкин И.И. 1998; Соболев А.В., 1997; Соболев А.В. с соавт., 1998; Федосеева В.Н., с соавт., 1993; Gruchalla R.S., et al., 2005; Pongracic J.A., et al., 2010].

Выявлено развитие иммунодепрессии при сенсибилизации к грибам. Найдены различия в межклеточной кооперации в ответ на аллергены C. albicans и D. farinae. Если в стимуляции лимфоцитов аллергеном D. farinae участвуют CD54, CD80 и CD86, то в стимуляции C. albicans – только CD54 и CD86. Нарушение экспрессии CD80 может быть одной из причин относительно низкого уровня синтеза IgE-антител к аллергену Candida при микогенной сенсибилизации, так как СD80 усиливает синтез антител [Kawamura M.S., et al., 1998].

Однако механизмы развития иммунодепрессии при поливалентной сенсибилизации остаются недостаточно изученными [Crameri R., et al., 2006 ]. Не описано влияние поливалентной сенсибилизации на процессы Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов, играющего ведущую роль в формировании иммунологической толерантности. Отсутствуют данные по иммунологическому мониторингу при проведении АСИТ у больных с поливалентной сенсибилизацией.

Цель исследования: Изучить клинические проявления и иммунологические показатели больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли и влияния на них аллергенспецифической иммунотерапии.

Задачи исследования:

1. Провести обследование больных с больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли с учетом особенностей клиники заболевания (длительности заболевания, тяжести течения заболевания).
2. Исследовать популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов в периферической крови у больных БА с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли в сравнении с показателями здоровых детей.
3. Исследовать активационные маркеры лимфоцитов (CD23, CD25, CD71, HLA-DR, CD95, CD54, СD178) периферической крови больных с БА с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли.
4. Провести сравнительное исследование поверхностных маркеров лимфоцитов больных с БА с моносенсибилизацией домашней пыли и больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли.
5. Изучить влияние АСИТ аллергеном из домашней пыли на клинические проявления и иммунологические показатели больных с БА с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли.

Научная новизна

Впервые проведено иммунофенотипирование больных поливалентной сенсибилизацией с использованием широкого спектра показателей Т-, В-клеточного иммунитета и NK-клеток. Впервые дана развернутая характеристика субпопуляционного состава В-лимфоцитов крови больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли;

Изучена активность иммунокомпетентных клеток при помощи поверхностных маркеров ранней и поздней стадий активации лимфоцитов; оценена интенсивность процессов апоптоза клеток во взаимосвязи с различными клиническими параметрами респираторной аллергии.

Проведен анализ взаимосвязи выявленных изменений в иммунном статусе пациентов с особенностями клинического течения респираторной аллергии.

Практическая значимость

Полученные результаты работы существенно дополняют представления об иммунопатологических механизмах развития респираторной аллергии при поливалентной сенсибилизации и дают возможность объективной оценки эффективности проводимого лечения. Выявленные данные могут служить дополнительными иммунологическими критериями в диагностике поливалентной сенсибилизации и установления прогноза заболевания. Доказана эффективность АСИТ к аллергенам домашней пыли при лечении больных респираторной аллергией с поливалентной сенсибилизацией.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Сенсибилизация к плесневым грибам, как правило сочетается с сенсибилизацией к другим аллергенам, чаще всего к аллергену домашней пыли.
2. Развитие сенсибилизации к плесневым грибам сопровождается формированием иммунодефицитного состояния.
3. У больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам наблюдаются нарушения в системе Fas-зависимого апоптоза в сравнении с моносенсибилизацией к аллергену домашней пыли.
4. У больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам наблюдаются нарушения в системе Fas-зависимого апоптоза в сравнении с моносенсибилизацией к аллергену домашней пыли.
5. АСИТ аллергеном домашней пыли существенно снижает частоту обострения заболевания, улучшает качество жизни больных и способствует нормализации иммунологических показателей у больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам.

Внедрение результатов исследования

Результаты работы внедрены в учебный процесс на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФППОВ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор самостоятельно провел аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме, обследование и лечение 180 детей с БА и аллергическим ринитом с различными видами сенсибилизации. Автором выполнен статистический анализ полученных данных, сформулированы выводы и практические рекомендации.

Апробация. Материалы диссертации доложены на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии иммунологии иммунофармакологии», на XVII конгрессе «Человек и лекарство», на заседании научной конференции кафедры клинической аллергологии и иммунологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова 06.09.2011.

По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 13 рисунками. Указатель литературы включает 125 источников (из них отечественных - 51, зарубежных - 74).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Диссертация выполнена на кафедре клинической аллергологии и иммунологии ФППОВ Первого МГМУ им И.М.Сеченова и в аллергологическом отделении ГУЗ ДИБ №12 УЗ САО г. Москвы. В исследование было включено 67 пациентов, из них 17 детей в возрасте 4-6 лет, 24 ребенка от 7-11 лет, 26 детей в возрасте от 12-14 лет с БА, обусловленных аллергией к бытовым и грибковым аллергенам, с длительностью заболевания от 1 года до 5 лет. Диагноз БА и определение ее степени тяжести проводили на основании критериев GINA 2006, диагноз аллергический ринит на основании критериев ARIA, 2001. Из 67 пациентов у 19 детей диагностирована БА средней тяжести, контролируемого течения. У 58 пациентов БА сочеталась с аллергическим ринитом. Отдельную группу сравнения составили 12 больных БА с моносенсибилизацией к домашней пыли. Контрольная группа состояла из 10 практически здоровых детей. Всем пациентам было проведено общее клиническое обследование, которое включало: сбор анамнеза заболевания, методы объективного и инструментального исследования.

Сбор анамнеза включал: установление аллергической природы заболевания, выявления факторов риска, способствующих развитию аллергических заболеваний, оценка влияния факторов окружающей среды (климата, погоды, физических факторов), наличие наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, предположительно выявление группы аллергенов, которые являются возможной причиной заболевания, а также характер заболевания - персистирующее или интермиттирующее течение, определения «эффекта элиминации», наличие лекарственной или пищевой аллергии.

Для опроса пациентов с подозрением на наличие грибковой сенсибилизации использовали «Вопросник для лиц с подозрением на микогенную аллергию», разработанный на базе НИИ медицинской микологии имени П.Н.Кашкина.

Всем больным проводили общий клинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование крови, осмотр отоляринголога.

Инструментальные методы исследования включали электрокардиографию, исследование функции внешнего дыхания. Исследование функции внешнего дыхания проводилось методом компьютерной флоуметрии на аппарате «Спиро-тест РС» (Россия). Оценка результатов проводилась согласно границам норм и градации патологических отклонений показателей кривой «поток-объем»: форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), максимальные объемные скорости потока кривой в точках, соответствующих объему легких 75%, 50%, (МОС75, МОС50). Полученные результаты выражали в процентах от должных величин и оценивали до начала исследования. В исследование включались дети с показателями ФВД в пределах возрастной нормы. Проводили рентгенографию органов грудной клетки, придаточных пазух носа.

Аллергологическое обследование

Уровень общего IgE в сыворотке крови определили методом иммуноферментного анализа. Специфические IgE к грибковым, бытовым и эпидермальным аллергенам определяли с помощью множественного аллергосорбентного теста с применением хемолюминестентного анализа (MAST-CLA) компании «Хитачи Кемикл Диагностикс, Инк» (США). Результат выражали в классах (от 0 до 5) и в международных единицах (МЕ/мл).

Кожное аллергологическое тестирование проводилось в соответствии с общепринятой методикой (Адо А.Д., Польнер А.А.), с учетом дополнений Горячкиной Л.А. и др. Для проведения кожного аллерготестирования использовали аллергены из пыльца березы, ольхи, лещины, тимофеевки, овсяницы, полыни (ФГУП «НПО» Микроген» МЗ РФ г. Ставрополя), домашней пыли (ОАО «Биомед» им. И.М.Мечникова, с.Петрово-Дальнее Московская область), плесневых грибов ( «СЕВАФАРМА» а.о. Korunni 108,101 03 Praha 10 Чешская республика). Оценку скарификационных тестов проводили по общепринятой методике (Адо А.Д., Польнер А.А.). Также проводилась оценка прик-тестов аллергенов плесневых грибов.

Иммунологические методы исследования

Лимфоциты выделяли методу Boyum в градиенте плотности фиколл-верографин.

Определение относительного содержания в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих антигены CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD20, CD72, CD23, CD25, CD54, CD71, HLA-DR, CD95, CD178, мембранные иммуноглобулины mIgM и mIgG с помощью отечественных моноклональных антител ЛТ и ИКО в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

Реакцию проводили в микроварианте на стекле. В пленке “Parafilm” проделывали отверстия диаметром 3мм. Приготовленную таким образом пленку фиксировали на обезжиренное предметное стекло наплавлением. В каждую образовавшуюся лунку вносили по 10 мкл раствора поли-L-лизина (50 мкг/мл) и выдерживали 30 минут при 37°С. Эту и все последующие инкубации проводили во влажной камере. По истечении времени капли поли-L-лизина удаляли, а затем в каждую лунку вносили по 10 мкл исследуемой взвеси лимфоцитов, и препарат также выдерживали в термостате в течение 30 минут. На следующем этапе излишки клеток удаляли, а стекло промывали в стаканчике с ЗФР, после чего в лунки вносили по 4 мкл раствора соответствующих моноклональных антител. Препарат выдерживали в течение 30 мин при 4°С, затем снова промывали ЗФР и вносили в лунки по 4 мкл рабочего раствора Fab-фрагментов антимышиных антител, меченых флюорохромом. Выдерживали 30 мин при 4°С, промывали ЗФР, излишки жидкости удаляли. В лунки вносили по 20 мкл забуференного фосфатами раствора глицерина (глицерин смешивали с ЗФР 1:1 по объему). Препарат микроскопировали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа “Люмам ИЗ”. Оценивали наличие и специфичность флюоресценции (по критериям Фримель Г., 1987) не менее чем у 200 клеток. Клетки с морфологией моноцитов не учитывали. В каждом опыте проводили контроль жизнеспособности клеток с трипановым синим (не менее 95%) и неспецифического связывания меченой сыворотки (не более 4%). Процент клеток, неспецифически связавших меченые антитела, учитывали при оценки результатов опыта.

Методика проведения АСИТ

Аллергенспецифичесую иммунотерапию проводили в период стойкой ремиссии заболевания (FEV1 не менее 80% от должной величины).

Дату проводимой терапии, дозу аллергена и PNU, а также побочные реакции отмечали в карточке аллергенспецифической иммунотерапии. Для дозирования получаемых пациентами аллерговакцин была использована система стандартизации PNU, то есть единица белкового азота (1PNU равна 0,00001 мг белкового азота в 1 мл). Пациентам проводили АСИТ подкожным методом с применением водно-солевых экстрактов аллергенов по классической схеме (Порошина Н.В., Андрианова Н.В., Титова С.М.).

Начинали терапию при бытовой и грибковой сенсибилизации аллергеном из домашней пыли с дозы 0,1 PNU, количество вводимой вакцины было постоянным с постепенно повышающейся ее концентрацией, интервал между введениями аллергена 24-48 часов, в зависимости от предыдущей реакции на введение аллергена, достигая поддерживающей дозы 500 PNU. При наличии бытовой и грибковой сенсибилизации поддерживающую дозу 500 PNU вводили один раз через 20 дней круглогодично.

Эффективность АСИТ аллергеном из домашней пыли оценивалась через 1 год по следующим показателям: количество обострений БА и аллергического ринита, потребность пациентов в ингаляционной гормональной базисной терапии и симптоматической терапии, уровень общего IgE в сыворотке крови, результаты кожного тестирования, качество жизни пациента.

Статистическая обработка полученных данных производилась при помощи программы STATISTICA 7.0 в соответствии с рекомендациями по статистической обработке фармакологических экспериментов (Cалимов Р.М., 2000). Количественные данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, качественные – в виде доли в выборочной совокупности. Достоверность различий между двумя независимыми выборками количественных показателей оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни. Сравнение связанных выборок проводили с помощью критерия Вилкоксона. Для выявления различий между группами по качественным признакам использовали критерий Фишера и критерий 2. Статистически значимыми считали различия при p<0.05. Связь нескольких переменных анализировали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Все дети по результатам кожного тестирования имели положительные тесты с аллергеном из домашней пыли и аллергенами из плесневых грибов. Данная группа детей не получала кортикостероидные гомоны, цитостатики, антибиотики широкого спектра действия. Из 67 больных 34 детей жили на последних и первых этажах зданий, у 39 на стенах в ваннах комнатах была плесень. Почти все дети страдали приступами удушья, заложенностью носа в старых жилых помещениях, в сырую погоду поздней осенью, при уборке опавших листьев, ранней весной во время таяния снега, у 19 детей наблюдалась лекарственная аллергия на пенициллиновые антибиотики. Из 67 детей у 52 отмечалась отягощенная наследственность по аллергическим заболеваниям.

У детей в поздний осенний и ранний весенний периоды года, особенно в сырую погоду, наблюдались тяжелые приступы удушья с дыхательной недостаточностью 2-3 степени тяжести, которые купировались с применением бронхоспазмолитической и гормональной небулайзерной терапии, с возможным введением парентерально преднизолона коротким курсом.

Рисунок 1. Частота сенсибилизации к различным группам аллергенов у детей разного возраста с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам

У 67 обследованных детей, независимо от возраста наблюдалось сочетание сенсибилизации к бытовым аллергенам и аллергенам грибов (рис. 1). Сенсибилизация к пыльцевым аллергенам наиболее часто встречалась в группе детей 7-11 лет, а наиболее редко среди самых маленьких пациентов. Выраженность сенсибилизации к исследуемым аллергенам по результатам кожных проб не имела достоверных отличий у детей разного возраста, однако у детей 4-6 лет, имеющих наиболее низкую частоту сенсибилизации к пыльце, величина реакции была также несколько ниже (таблица 1).

Таблица 1. Выраженность положительных кожных проб на различные группы аллергенов у детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли (диаметр кожной реакции, мм)

Группа аллергенов	Возраст
	4-6 лет (n=17)	7-11 лет (n=24)	12-14 лет (n=26)
Бытовые	7,29±0,61	8,50±0,41	8,65±0,46
Пыльцевые	5,13±0,87	7,08±0,43	5,81±0,63
Грибковые	6,53±0,39	8,08±0,36	7,77±0,40

При оценке значимости разных видов грибов в сенсибилизации детей было показано, что в старшей возрастной группе частота сенсибилизации к грибам родов Aspergillus, встречается примерно с одинаковой частотой (рис. 2). В то же время у детей младших возрастных групп сенсибилизация к грибам рода Aspergillus встречается заметно чаще (рис. 2). При оценке интенсивности сенсибилизации к аллергенам грибов нами не выявлено достоверного различия между исследуемыми возрастными группами детей (таблица 1).

Рисунок 2. Частота сенсибилизации к аллергенам различных видов

грибов у детей разного возраста

Выявлена тенденция к более выраженным кожным реакциям на аллергены грибов Alternaria. Величина кожных реакций на антигены отдельных грибов была выражена значительно слабее, чем на бытовые или пыльцевые аллергены, или смесь аллергенов плесневых грибов.

Таким образом, установлено, что у детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам как этиологические факторы с примерно одинаковой вероятностью могут выступать грибы родов Aspergillus, Cladosporium, и Alternaria.

Таблица 2. Выраженность положительных кожных проб на различные аллергены у детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам

(диаметр кожной реакции, мм)

Аллерген из грибов	Возраст
	4-6 лет (n=17)	7-11 лет (n=24)	12-14 лет (n=26)
Aspergillus	6,88±0,46	7,08±0,36	7,46±0,38
Cladosporium	6,64±0,45	7,25±0,25	7,27±0,35
Alternaria	7,11±0,44	7,33±0,23	7,42±0,31

Изменение клинико-лабораторных показателей больных сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам под влиянием АСИТ

Для оценки эффективности терапии АСИТ аллергеном домашней пыли у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли изучили частоту развития обострений БА и аллергического ринита до, и после проведения АСИТ. Результаты получены при анализе результатов АСИТ у 26 детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам. Средний возраст обследуемых детей составил 9,73±0,55 года. Средняя продолжительность заболевания обследуемых больных составила несколько более 5 лет.

Показано, что если до проведения АСИТ частота обострений БА составляла от 5 до 16 раз в год, то после курса АСИТ аллергеном домашней пыли – от 3 до 10 раз в год. Частота обострений АР до АСИТ составляла от 4 до 9 раз в год, а после курса АСИТ – от 2 до 6 раз в год (рис. 3). Эффективность АСИТ практически не зависела от тяжести течения БА (рис. 4). Эффективность лечения АСИТ аллергического ринита также не зависела от его тяжести.

Показано, что у больных БА с легкой персистирующей формой заболевания под влиянием АСИТ не наблюдается существенных изменений содержания IgE в плазме крови (таблица 4). В группе больных БА средней тяжести наблюдается достоверное снижения уровня IgE в крови (рис. 5)

Неоднородность полученных результатов влияния АСИТ аллергенами домашней пыли на содержание IgE в плазме крови больных с поливалентной сенсибилизацией может быть связано с удельным весом сенсибилизации к домашней пыли в разных группах обследованных больных.

Рисунок 3. Изменение частоты обострений аллергических заболеваний у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли под влиянием АСИТ аллергеном домашней пыли

Рисунок 4. Изменение частоты обострений БА у больных с поливалентной сенсибилизацией под влиянием АСИТ аллергенами домашней пыли

Рисунок 5. Изменение содержания IgE в крови больных БА с поливалентной сенсибилизацией под влиянием АСИТ аллергенами домашней пыли (БАЛПТ – БА с легким персистирующим течением, БАСрТ – БА средней тяжести)

Изучение влияния АСИТ на уровень IgE в крови детей разного возраста показали его большую эффективность у детей старшего возраста (таблица 3). Если у детей 4-6 лет концентрация IgE в крови практически не менялась, то у детей 12-14 лет она достоверно снижалась (p<0,05).

Положительная динамика лабораторных показателей под влиянием АСИТ сопровождалась аналогичными изменениями клинических показателей.

Таблица 3. Изменение сывороточного уровня IgE у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам под влиянием АСИТ

	Возраст
	4-6 лет	7-11 лет	12-14 лет
До АСИТ	415,13±55,67	607,90±69,06	558,65±78,23
После АСИТ	440,86±73,21	521,27±59,75	423,09±56,00

Из 67 пациентов, получившим АСИТ у 52 при контакте с аллергеном из домашней пыли, в сырую дождливую погоду уменьшились симптомы БА и аллергического ринита по сравнению с детьми не получавшими АСИТ.

После проведения АСИТ у 48 детей через год уменьшился объем фармакотерапии, у 19 детей объем терапии остался прежним. Обострения БА и аллергического ринита протекали легче, купировались меньшим объемом фармакотерапии.

Таблица 4. Изменение частоты обострений БА (за 1 год) у детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам под влиянием АСИТ

	Возраст
	4-6 лет	7-11 лет	12-14 лет
До АСИТ	7,02±0,51	8,44±0,72	11,43±0,64
После АСИТ	4,33±0,63	6,33±0,75	7,38±0,68

Влияние курса АСИТ аллергеном домашней пыли на течение БА у детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам отражено в таблице 4. Показано, что во всех обследуемых группах больных наблюдалось снижение частоты развития обострений БА (p<0,05). Наибольшее снижение частоты обострений зарегистрировано в старшей возрастной группе.

Сравнительная характеристика поверхностного фенотипа лимфоцитов детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли и с сенсибилизацией к домашней пыли

При оценке популяционного состава Т-лимфоцитов было показано, что для всех аллергических заболеваний характерна тенденция к снижению содержания в крови цитотоксических лимфоцитов CD8+ (табл. 5). В то же время у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и доиашней пыли наблюдается достоверное снижение содержания в крови Т-лимфоцитов, связанное в первую очередь, со снижением содержания в крови Т-хелперов.

При оценке субпопуляций NK-клеток, было выявлено достоверное снижение содержания в крови больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам CD16+-лимфоцитов (рисунок 6). Если у больных с сенсибилизацией к домашней пыли этот показатель составил 16,03±4,06%, то у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли 9,59±1,58%.

Таблица 5. Сравнительная характеристика популяций и субпопуляций Т-лимфоцитов у детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли и детей с сенсибилизацией к аллергену домашней пыли

маркеры	здоровые дети n=10	больные с сенсибилизацией к домашней пыли n=12	больные с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли n=14
	Содержание лимфоцитов в %
CD3	64,83±2,98	61,75±1,75	55,32±1,66*
CD4	38,08±1,49	38,03±1,12	33,10±1,58*
CD8	28,1±1,45	25,81±1,62	25,04±2,43

Примечание: -p<0,05; достоверность различий между группами больных.

Рисунок 6. Популяции и субпопуляции NK-клеток у детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам и сенсибилизацией к домашней пыли

Оценка состояния популяции В-лимфоцитов у обследуемых больных показало, что при сенсибилизации к домашней пыли содержание этих клеток в крови достоверно увеличено, в то время как при сенсибилизации к плесневым грибам и домашней пыли этот показатель ниже, чем у здоровых людей (p<0,05).

Число лимфоцитов, несущих поверхностные IgM и IgG было увеличено во всех группах больных, однако у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли было достоверно ниже, чем у больных с сенсибилизацией к домашней пыли (таблица 6).

Таблица 6. Популяции и субпопуляции В-лимфоцитов у детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли и сенсибилизацией к домашней пыли

маркеры	здоровые дети n=10	больные с сенсибилизацией к домашней пыли n=12	больные с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам n=14
	содержание лимфоцитов в %
CD20	17,00±1,26	21,72±1,13	13,39±1,87*
CD72	11,16±1,17	12,15±0,79	10,03±1,37
IgM	5,25±0,43	13,02±1,05	8,33±2,31*
IgG	6,21±1,23	15,55±0,99	9,54±1,87*

Примечание: -p<0,05; достоверность различий между группами больных.

Сравнение содержания основных популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных с сенсибилизацией к домашней пыли и сенсибилизации к плесневым грибам и домашней пыли позволяет сделать вывод о наличии у больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам изменений в крови, характерных для иммунодефицитного состояния. Это проявляется одновременным снижением содержания в крови Т-лимфоцитов (CD3+), В-лимфоцитов (CD20+) и NK-клеток (CD16+).

Следующим этапом наших исследований стало изучение содержания в крови обследуемых лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные активационные антигены (табл. 7).

Содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих низкоафинный рецептор для IgE CD23, было повышено в обеих группах больных.

Содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих ранние маркеры активации CD25 и CD71 у больных с сенсибилизацией к домашней пыли не превышало показателей здоровых детей, что отражает отсутствие процессов активации лимфоцитов у этих детей в стадию ремиссии (табл. 7). У больных с поливалентной сенсибилизацией, несмотря на клиническую ремиссию, содержание CD25+ и CD71+ было достоверно повышено (p<0,05).

Содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих рецептор адгезии CD54 (ICAM1), было повышено в обеих группах больных.

Таблица 7. Сравнительная характеристика поверхностных активационных маркеров лимфоцитов у детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли и сенсибилизацией к домашней пыли

маркеры	здоровые дети n=10	больные с сенсибилизацией к домашней пыли n=12	больные с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли n=14
	содержание лимфоцитов в %
CD23	6,00±0,95	13,49±0,86	10,07±2,43
CD25	5,91±1,49	5,30±0,87	10,24±2,29*
CD71	5,66±1,41	3,91±1,43	10,09±2,14*
HLA-DR	13,80 ±1,73	10,74 ± 2,93*	14,57±1,39
CD54	5,46±1,39	11,77±4,02	12,30±2,76
CD95	9,20 ±0,82	5,13 ± 2,52	9,57±1,55*
CD178	5,30±0,96	4,82±2,34	16,66±2,44*

Примечание: -p<0,05; достоверность различий между группами больных.

Содержание в крови лимфоцитов, экспрессирующих рецептор индукции апоптоза CD95, у больных с сенсибилизацией к домашней пыли было достоверно снижено (p<0,05), в то время как в группе больных с поливалентной сенсибилизацией оно было близко к показателям здоровых детей (табл. 7). Напротив, содержание в крови CD178+-лимфоцитов несущих Fas-лиганд, запускающий апоптоз в клетках, было резко повышено в группе больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам (табл. 7).

Вероятно, у больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам интенсивность апоптоза лимфоцитов существенно выше, чем у больных с сенсибилизацией к домашней пыли.

Таким образом, результаты проведенного изучения нарушений в иммунной системе больных с грибковой сенсибилизацией выявили развитие иммунодефицитного состояния, проявляющегося снижением содержания в крови Т-, В-, и NK-лимфоцитов. Механизм выявленного иммунодефицита, по-видимому, связан с усилением апоптоза лимфоцитов у этих больных.

Влияние АСИТ на иммунофенотип лимфоцитов у детей с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли

Исследование действия АСИТ на показатели иммунного статуса провели на лимфоцитах периферической крови 14 детей с поливалентной сенсибилизацией в возрасте от 7 до 12 лет, которым проводили СИТ водно-солевыми экстрактами аллергенов домашней пыли.

Выявлено повышение относительного содержания в крови количества Т-лимфоцитов, которое регистрировалось через 3 и 6 месяцев после окончания курса АСИТ (табл. 8). Это повышение не было связано с изменением содержания хелперных (CD4+) или цитотоксических (CD8+) Т-лимфоцитов (табл. 8).

Таблица 8. Влияние АСИТ на содержание в крови больных детей с поливалентной сенсибилизацией Т-лимфоцитов и их субпопуляций

маркеры	до АСИТ	После АСИТ	3 мес	6 мес
	содержание лимфоцитов в %
CD3	55,32±1,66	55,44±1,87	58,26±1,28*	60,24±1,35*
CD4	33,10±1,58	34,45±1,63	34,71±1,84	35,13±1,75
CD8	25,04±2,43	22,74±1,65	23,18±1,33	25,81±1,22

Примечание: -p<0,05; достоверность различий с контрольной группой.

Относительное содержание CD16+-лимфоцитов в крови больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам под влиянием АСИТ достоверно повышалось, причем нарастание количества CD16+-клеток увеличивалось с течением времени, прошедшего после проведения курса АСИТ (рис. 7). Изменение числа CD56+-лимфоцитов были незначительны.

Рисунок 7. Влияние АСИТ на содержание в крови больных детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам NK-лимфоцитов

Изучение влияния АСИТ на В-клеточное звено иммунной системы позволило выявить выраженные изменения в крови больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам (табл. 9).

Таблица 9. Влияние АСИТ на содержание в крови больных детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам В-лимфоцитов и их субпопуляций

Маркеры	до АСИТ	После АСИТ	3 мес	6 мес
	содержание лимфоцитов в %
CD20	13,39±1,87	16,31±1,13*	18,14±1,70*	17,96±1,37*
CD72	10,03±1,37	9,28±1,28	14,38±1,08*	12,71±1,34
IgM	8,33±2,31	17,23±1,17*	12,73±1,32*	8,35±1,55*
IgG	9,54±1,87	14,34±1,15*	15,41±1,42*	7,72±1,37

Примечание: -p<0,05; достоверность различий с контрольной группой.

Содержание В-лимфоцитов (CD20+) под влиянием АСИТ существенно увеличилось, прирост содержания этих клеток произошел уже в процессе проведения АСИТ. Содержание активированных В-лимфоцитов (CD72+) в крови больных поливалентной сенсибилизацией под влиянием АСИТ также увеличилось, однако только через 3 месяца после окончания курса АСИТ.

Содержание в крови Ig-продуцирующих клеток возрастало в процессе проведения АСИТ, оставалось повышенным через 3 месяца, и возвращалось к исходному уровню через 6 месяцев после окончания курсам АСИТ.

Максимальная концентрация IgM+-лимфоцитов в крови наблюдалась к концу курса АСИТ, а максимальная концентрация IgG+-лимфоцитов – через 3 месяца после завершения АСИТ. Это согласуется со сроками развития первичного (IgM) и вторичного (IgG) иммунного ответа на антиген.

Таким образом, под влиянием АСИТ у больных с сенсибилизацией к домашней пыли плесневым грибам наблюдается увеличение содержания в крови Т-, В- и NK-лимфоцитов. Учитывая наличие у этой группы больных иммунодефицита, который проявляется снижением содержания в крови перечисленных популяций лимфоцитов, возникающие под влиянием АСИТ изменения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов следует оценивать как компенсаторные. Кроме того, развивающееся у больных с сенсибилизацией к аллергенам домашней пыли и плесневым грибам под влиянием АСИТ увеличение содержания в крови IgG+-лимфоцитов является, по-видимому, отражением запуска синтеза в организме блокирующих антител.

При изучении влияния АСИТ на активационные маркеры лимфоцитов детей с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам получили прирост всех изучаемых активационных маркеров, однако динамика изменений различных аллергенов существенно различалась (табл. 10).

Содержание в крови больных с сенсибилизаций к домашней пыли и плесневым грибам активированных лимфоцитов, несущих маркеры ранней активации CD25, CD71 достигало максимума уже в процессе проведения АСИТ, оставалось повышенным через 3 месяца после окончания курса АСИТ, и возвращалось к исходным показателям через 6 месяцев после лечения. Содержание в крови этих же больных активированных лимфоцитов, несущих низкоаффинный рецептор для IgE – CD23 также возрастало к концу курса АСИТ, достигало максимума через 3 месяца после проведения АСИТ и снижалось до исходного уровня к 6 месяцу после окончания лечения (табл. 10).

Таблица 10. Влияние АСИТ на содержание лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры, в периферической крови больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли

маркеры	до АСИТ	После АСИТ	3 мес	6 мес
	содержание лимфоцитов в %
CD23	10,07±2,43	14,96±1,31*	26,92±1,31*	9,54±1,45
CD25	10,24±2,29	23,04±1,51*	22,84±1,66*	8,07±1,43
CD71	10,09±2,14	21,88±1,86	17,93±1,41*	6,46±1,32
HLA-DR	14,57±1,39	19,38±1,39*	24,96±1,63*	25,36±1,73*
CD54	12,30±2,76	26,91±2,20*	30,48±1,62*	18,45±1,52*
CD95	9,57±1,55	12,65±1,89	11,04±1,78	9,47±1,42
CD178	16,66±2,44	17,53±3,23	38,40±2,42*	40,29±1,77*

Примечание: -p<0,05; достоверность различий с контрольной группой.

Содержание в крови обследуемых больных лимфоцитов, несущих маркер поздней активации HLA-DR, увеличивалось к окончанию курса АСИТ, достигая максимума к 3-6 месяцу после лечения. Похожим образом изменялось содержание в крови лимфоцитов, несущих рецептор адгезии ICAM-1 (CD54), в этом случае наиболее высокое содержание лимфоцитов с соответствующим маркером наблюдалось через 3 месяца после окончания АСИТ (табл. 10).

Отдельного внимания заслуживают результаты оценки влияния АСИТ на систему Fas-зависимого апоптоза. Выявлено, что в процессе АСИТ содержание в крови лимфоцитов, несущих рецептор индукции Fas-зависимого апоптоза несколько повышалось (р>0,05), а затем возвращалось к исходным показателям. Повышения содержания CD95-позитивных лимфоцитов под влиянием АСИТ, описанного в литературе [Abdulamir A.S., et al., 2009; Lombardi V., et al., 2010], у обследуемой группы больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли не наблюдалось. По-видимому, это связано с исходно высоким содержанием CD95+-лимфоцитов в крови этих больных по сравнению с больными с моносенсибилизацией к домашней пыли.

Таким образом, проведение специфической иммунотерапии аллергеном домашней пыли у больных с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам весьма эффективно. На фоне АСИТ наблюдаются изменения популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, отражающие преодоление имеющегося у этих больных иммунодефицитного состояния.

Выводы

1. У детей при наличии сенсибилизации к плесневым грибам и домашней пыли наблюдается более тяжелое течение аллергических заболеваний в сравнении с моносенсибилизацией к домашней пыли.
2. В результате лечения АСИТ у больных с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли наблюдается снижение частоты обострений заболевания, улучшение качества жизни больных, сопровождаемое снижение содержания в сыворотке крови общего IgE.
3. У больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли имеет место иммунодефицитное состояние, проявляющееся снижением содержания в крови Т-лимфоцитов, в основном за счет субпопуляции Т-хелперов. Снижено содержание в крови CD16+-лимфоцитов (NK-клеток). Общее количество В-лимфоцитов (CD20+) ниже чем у здоровых и больных с сенсибилизацией к домашней пыли, содержание активированных В-лимфоцитов (sIgG+ и sIgM+) выше чем у здоровых, но ниже чем у больных с сенсибилизацией к домашней пыли.
4. У больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к плесневым грибам и домашней пыли наблюдаются нарушения в системе индукции Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов, проявляющиеся существенным увеличением содержания в крови CD95+ и CD178+-лимфоцитов.
5. В процессе проведения АСИТ аллергеном домашней пыли у больных с грибковой сенсибилизацией наблюдается нормализация популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов, отражающее выход этих больных из иммунодефицитного состояния.
6. Под влиянием АСИТ наблюдается выраженное увеличение содержания в крови лимфоцитов, экспрессирующих лиганд Fas-зависимого апоптоза CD178.

Практические рекомендации

1. При тяжелом течении аллергических заболеваний, а также наличие анамнеза, предполагающего наличие грибковой сенсибилизации рекомендуется кожное тестирование с аллергенами плесневых грибов.

2.Больным с бронхиальной астмой с сенсибилизацией к домашней пыли и плесневым грибам рекомендуется проводить аллергенгенспецифическую иммунотерапию аллергеном из домашней пыли.

3.При обследовании детей с сочетанием аллергических заболеваний и признаков иммунодефицитного состояния рекомендуется исключать наличие сенсибилизации к плесневым грибам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Караулов А.В., Сидоренко И.В., Купцова Н.В., Панкова Г.Ф. Роль грибковой сенсибилизации у детей в формировании бронхиальной астмы и аллергического ринита. / Успехи медицинской микологии / 2006, т.9, -с. 125.
2. Каземирский. А.Н., Купцова Н.В., Салмаси Ж.М., Рябинина З. В.,Порядин Г. В. Влияние антигенспецифической иммунотерапии на FAS — систему индукции апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной астмой /Российский аллергологический журнал. – 2009, №3, вып 1,(тезисы)-с.21-22.
3. Салмаси Ж.М., Порядин Г. В., Купцова Н.В., Рябинина З.В. Влияние АСИТ на иммунную систему больных аллергией отличается от действия антигена при естественной экспозиции. / Сборник материалов XVII конгресса «Человек и лекарство», -М., 2010, -с. 242.
4. Салмаси Ж.М., Рябинина З.В., Купцова Н.В., Сидоренко И.В., Караулов А.В., Порядин Г.В., Терентьев А.А., Каземирский А.Н. Влияние аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) на состояние клеточного иммунитета у детей с атопической бронхиальной астмой и круглогодичным аллергическим ринитом /Российский иммунологический журнал, 2010, т. 4 (13), №2, -с. 182-186.
5. Купцова Н.В., Рябинина З.В.,Тютчева О.В., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Каземирский А.Н., Терентьев А.А. Fas-FasL взаимодействие вызывает иммунодефицит у детей, больных атопической бронхиальной астмой с грибковой сенсибилизацией. /Фундаментальные исследования, 2010,№6, с. 58-64.
6. Караулов А.В. Купцова Н.В., Салмаси Ж.М., Терентьев А.А.,Порядин Г.В. Сравнительная характеристика поверхностного фенотипа лимфоцитов детей с атопической астмой с микогенной и клещевой сенсибилизацией (статья). /Российский аллергологический журнал, 2010, №5,вып.1,-с.254-255.

Список сокращений

БА - бронхиальная астма

БАСрТ - бронхиальная астма средней тяжести

БАЛПТ - бронхиальная астма легкого персистирующего течения

АР - аллергический ринит

АСИТ – аллергенспецифическая иммунотерапия

Ig E, G, M, A, - иммуноглобулины

mIgM –мембранный иммуноглобулин М

mIgG - мембранный иммуноглобулин G

CD – кластеры дифференцировки –обозначения маркерных клеток

HLADR - система лейкоцитарных антигенов человека

ICAM-1- межклеточные молекулы адгезии