Клиническое значение определения ил-6 в сыворотке крови и моче и цитохрома р450 в ткани печени у больных хроническим гепатитом с

На правах рукописи

КОРОТЧАЕВА Юлия Вячеславовна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЛ-6 В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ И ЦИТОХРОМА Р450 В ТКАНИ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ С

14.00.05 – внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Козловская Лидия Владимировна

Официальные оппоненты:

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Моисеев Валентин Сергеевич

доктор медицинских наук, профессор Ильченко Людмила Юрьевна

Ведущее учреждение:

ФГУ Учебно-научный медицинский центр Управления делами Президента Российской Федерации

Защита диссертации состоится «____»__________________2008г.

в часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.05 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 119991, Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49)

Автореферат разослан «____»__________________2008г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Елена Васильевна Волчкова

Актуальность темы

Хронический гепатит С (ХГ С) по своей медицинской и социально-экономической значимости занимает одно из ведущих мест среди заболеваний человека.

Широкая распространенность HCV-инфекции во всем мире, частота формирования хронических форм заболевания (у 75-85% больных), отсутствие средств специфической профилактики обусловливают необходимость дальнейшего изучения патогенеза, клинических проявлений, генетических основ заболевания.

ХГ С характеризуется прогрессирующим течением – при предполагаемой длительности течения HCV-инфекции от 9 до 29 лет частота исхода в цирроз печени составляет от 17до 55% и проявляется кроме поражения печени широким спектром внепеченочных проявлений, включая криоглобулинемию, рассматриваемую в настоящее время как часто выявляемый специфический иммунологический маркер этой инфекции [Игнатова Т.М.и соавт., 2000, 2004; Козловская Л.В. и соавт., 2004; Sansonno D., 2005; Seccull A., 2006].

Среди факторов патогенеза ХГ С, влияющих на характер течения и прогноз заболевания в целом, пристальное внимание в последние годы уделяют также изучению Th2-пути иммунного ответа и многофункциональному провоспалительному цитокину – интерлейкину 6 [Marinho R.T., 2004]. Установлена, главным образом в эксперименте, роль ИЛ-6 в формировании фиброза в ткани печени, клинические работы этого направления немногочисленны и их результаты противоречивы [Lapinski T. W., 2001; Malaguarnera M., 1997]. Во многом не решены вопросы участия ИЛ-6 в патогенезе поражения почек, развивающегося при ХГ С. Между тем, рассмотрение изменений уровня ИЛ-6 в сыворотке крови и моче больных ХГ С в зависимости от особенностей течения поражения печени и почек может способствовать пониманию общих механизмов вовлечения этих органов при хронической инфекции вируса гепатита С (HCV).

Малоизученным аспектом проблемы остается взаимодействие ИЛ-6 и системы цитохрома Р450 в печени. ИЛ-6 вызывает угнетение монооксигеназной активности цитохрома Р450, с другой стороны, депримация цитохрома Р450 в условиях вирусных инфекций, в том числе HCV, сопряжена с повышением продукции цитокинов, в частности ИЛ-6 [Сибиряк С.В. и соавт., 1992, 2003; Siewert E., 2000].

Изучение этих двух факторов регуляций реакций иммунитета и метаболических процессов в печени в сопоставлении с клиническим течением ХГ С, в том числе внепеченочными проявлениями, и морфологическими изменениями в печени может способствовать расширению представлений о патогенезе ХГ С и определить критерии прогноза – прогрессирования в цирроз.

Цель работы

Оценить связь уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови и моче больных ХГС с особенностями клинического течения, степенью фиброза и нарушениями экспрессии гена цитохрома Р450 в печени для определения критериев прогноза заболевания.

Задачи исследования

У больных хроническим гепатитом С на разных стадиях течения:

1. Изучить содержание в сыворотке крови провоспалительного цитокина – ИЛ-6, сопоставить его уровень с величиной криоглобулинемии как специфического иммунного маркера HCV-инфекции, других внепеченочных проявлений, степенью фиброза в ткани печени и темпом прогрессирования ХГ С в цирроз.
2. Определить связь уровня ИЛ-6 в крови с полиморфизмом гена ИЛ-6 -174 G/C.
3. У больных с ассоциированным с ХГ С гломерулонефритом исследовать экскрецию ИЛ-6 с мочой в сравнении с уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови; оценить связь мочевого и сывороточного показателей ИЛ-6 с тяжестью поражения почек.
4. Изучить экспрессию гена цитохрома Р450 (изоформы CYP2E1) в ткани печени, сопоставить ее уровень с уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови и степенью фиброза в печени.
5. На основании совокупности полученных данных определить статистически значимые критерии прогноза ХГ С (прогрессирование в цирроз).

Положения, выносимые на защиту

1. У 36% больных хронически гепатитом С отмечается повышение уровня ИЛ-6 в сыворотке крови, коррелирующее с частотой и уровнем криоглобулинемии и связанного с ней клинического симптомокомплекса, степенью и темпом развития фиброза в ткани печени, что свидетельствует о возможности использования сывороточного показателя ИЛ-6 для оценки прогноза заболевания (прогрессирования в цирроз).
2. Отмечается связь уровня ИЛ-6 в сыворотке крови с полиморфизмом гена IL-6-174G/C: гиперпродукция ИЛ-6 достоверно чаще сочетается с носительством аллеля гена IL-6-174G, чем аллеля гена IL-6-174C, указывая на генетическую предрасположенность к повышению продукции ИЛ-6
3. Имеется прямая корреляция между тяжестью ассоциированного с ХГ С гломерулонефрита и уровнем экскреции ИЛ-6 с мочой: наиболее высокий уровень ИЛ-6 в моче отмечается у больных криоглобулинемическим гломерулонефритом с остронефритическим и нефротическим синдромами, что подтверждает значение этого показателя как маркера активности иммунного воспаления в почках.
4. У больных ХГ С прогрессирование фиброза в ткани печени сопровождается ослаблением экспрессии гена цитохрома Р450 изоформы CYP2E1 в гепатоцитах. Снижение уровня экспрессии CYP2E1 более выражено у больных с гиперпродукцией ИЛ-6 и прямо коррелирует с выраженностью и темпом нарастания фиброза.

Научная новизна

Впервые в клинических условиях у больных хроническим гепатитом С проведена оценка уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови в сопоставлении с уровнем криоглобулинемии, частотой и спектром других внепеченочных проявлений и степенью фиброза в ткани печени. Выявленные при клинико-морфологическом сопоставлении корреляции позволили сделать вывод о патогенетической роли ИЛ-6 при ХГ С и установить неблагоприятное влияние гиперпродукции ИЛ-6 на течение заболевания ( и его прогрессирование в цирроз).

Впервые у больных ХГ С с криоглобулинемическим васкулитом и поражением почек изучена экскреция ИЛ-6 с мочой. Выявлено значительное увеличение уровня экскреции ИЛ-6 у больных тяжелыми формами криоглобулинемического гломерулонефрита – с остронефритическим и нефротическим синдромами, что свидетельствует о значении «мочевого» показателя ИЛ-6 как маркера активности иммунного воспаления в почках.

Подтверждена связь уровня ИЛ-6 в крови больных ХГ С с полиморфизмом гена IL-6 –174 GC.

Впервые у больных хроническим гепатитом С на разных стадиях течения заболевания изучена экспрессия в ткани печени гена цитохрома Р450, изоформы CYP2E1. Отмечено, параллельно увеличению уровня ИЛ-6 в сыворотке крови, снижение экспрессии CYP2E1, прямо коррелирующее с темпом развития и выраженностью фиброза в ткани печени.

Практическая значимость

В результате исследования предложен информативный метод оценки прогноза ХГ С: выявление у больного ХГ С повышенного уровня в сыворотке крови и моче интерлейкина-6 является фактором риска развития криоглобулинемического васкулита, включая тяжелые формы поражения почек, и ускоренного темпа прогрессирования в цирроз

Высокий риск формирования цирроза печени подтверждается снижением в биопсийном материале печени экспрессии гена цитохрома Р450 и выявление при молекулярно-генетическом анализе полиморфизма гена IL-6-174G/C (аллеля IL-6-174G).

Внедрение результатов работы

Результаты исследования используются в практической работе гепатологического и нефрологического отделений клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М.Тареева ММА им. И.М.Сеченова, в лекционном курсе и практических занятиях со студентами кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета ММА им. И.М.Сеченова, факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова

Апробация работы

Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры терапии и профессиональных болезней медико-профилактического факультета, академической группы академика Н.А.Мухина, кафедры нефрологии и гемодиализа факультета послевузовского профессионального образования, отдела нефрологии НИЦ ММА им. И.М.Сеченова 13 ноября 2007 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе в центральных журналах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы (39 отечественных и 164 иностранных работ). Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 13 рисунками.

Основная база выполнения работы – клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М.Тареева ММА им. И.М.Сеченова (директор клиники, академик РАМН, профессор Н.А.Мухин). Морфологическое исследование ткани печени и почки выполнено на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М.Сеченова (зав.кафедрой – академик РАМН, профессор М,А.Пальцев), вирусологическое исследование – в межклинической иммунологической лаборатории ММА (зав. А.Г.Серова), лаборатории ПЦР диагностики ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ. Исследование интерлейкина-6 в сыворотке крови и моче проведено в лаборатория клинической иммунологии ГУ Института ревматологии РАМН (директор – член-корр. РАМН, профессор Е.Л. Насонов) д.м.н. профессором А.И.Сперанским. Исследование экспрессии гена цитохрома Р450, изоформы CYP2E1 в ткани печени выполнено на кафедре биологической и медицинской химии (зав. – академик РАН и РАМН В.А. Ткачук), факультета фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова) под руководством к.м.н. доцента Л.М.Самоходской. Выражаем глубокую признательность за помощь в выполнении диссертационной работы всем сотрудникам указанных подразделений.

Автор выражает большую благодарность за помощь в работе над диссертацией своему научному руководителю профессору кафедры терапии и профзаболеваний ММА им.И.М. Сеченова, д.м.н. Л.В. Козловской.

Особую благодарность за помощь в выполнении исследования автор приносит зав. Кафедрой терапии и профессиональных болезней, академику РАМН, профессору Н.А.Мухину, зав. лаборатории клинической иммунологии ГУ Института ревматологии РАМН профессору А.И.Сперанскому, доценту кафедры биологической и медицинской химии факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова Л.М.Самоходской, заведующей гепатологическим отделением к.м.н. Л.П.Успенской и всем сотрудникам клиники нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М.Тареева ММА им. И.М.Сеченова.

Материалы и методы исследования

В исследование включено 124 больных ХГ С. Этиологическая связь поражения печени с инфекцией вируса гепатита С была подтверждена выявлением HCVAb и HCVRNA в сыворотке крови вирусологическими методами, при этом у 91 больного – с определением генотипа вируса гепатита С. В исследование не включались больные, злоупотребляющие алкоголем, имеющие сочетанную инфекцию вирусами гепатитов В и дельта, иммунодефицита человека.

1. Общие клинико-лабораторные методы исследования

Обследование больных проводилось по плану, принятому в гепатологическом отделении клиники им. Е.М.Тареева, и включало помимо общеклинических и биохимических методов, также исследование печеночных ферментов и иммунологических показателей, ультразвуковое исследование органов брюшной полости, эзофагогастродуоденоскопию.

У всех больных исследовались криоглобулины в сыворотке крови по методу R.Pellicano [1999]. У 59 больных выполнено морфологическое исследование ткани печени с оценкой индексов гистологической активности и фиброза по R.G. Knodell с установлением стадии фиброза. У 42 больных был оценен темп нарастания фиброза по отношению индекса фиброза к длительности заболевания (от момента наиболее вероятного времени инфицирования до проведения морфологического исследования или выявления HCV Ab).

2. Специальные методы обследования.

У всех 124 больных были исследовали уровень интерлейкина-6 в сыворотке крови, у 57 больных (из них у 20 с поражением почек) экскреция ИЛ-6 с мочой иммуноферментным методом с использованием тест-систем “Pro con” (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург) и «Benter MedSystems» (Австрия).

У 70 больных изучен полиморфизм гена интерлейкина-6 (IL-6). ДНК выделяли с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Для определения полиморфизма -174 G/C гена IL-6 использовали метод ПДРФ (полиморфизма длины рестриктных фрагментов).

Среди 59 больных с проведенной биопсией печени у 36 была исследована экспрессия гена цитохрома Р450 изоформы CYP2E1 методом полуколичественной real-time ПЦР. Суммарную РНК выделяли из ткани печени с помощью набора «RNAeasy Kit» (коммерческий набор «Qiagen», Израиль) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Реакцию обратной транскрипции РНК проводили с использованием коммерческого набора ЗАО «Силекс» (Россия). Анализ экспрессии гена CYP2E1 выполняли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green (коммерческий набор “Синтол”). Для контроля в качестве вспомогательного гена использовали glyceraldehyde-3-phosphate дегидрогеназа (GAPDH) и 2-микроглобулин. Праймеры к нуклеотидным последовательностям анализируемого гена подбирались с помощью программы “PrimerSelect” пакет DNASTAR (таблица 1). ПЦР проводили при условиях: 1 этап: 95С 300 сек., 2 этап: 60-62С 40-50 сек., 3 этап: 95С 15 сек, с переходом на шаг №2 (35-45 циклов). Оценивали выход продукта по отношению к GAPDH и 2-микроглобулину. Данные выражения mRNA представлены как естественный логарифм произвольных единиц.

Таблица 1. Праймеры для определения экспрессии гена CYP2E1

праймер	Forward	Reverse
CYP 2E1	5- cgtgactgtggccgacctgtt ctt-3	5-aaaatggtgtcttgggttgcctca-3
GAPDH	5-tgcaccaccaactgcttggc-3	5-ggcatggactgtggtcatgag-3
2-микро-глглобулин	5'-gatgagtatgcctgccgtgtg-3'	5'-caatccaaatgcggcatct-3'

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statsoft Statistica 6.0, достоверными считали различия при p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

I. Общая характеристика больных хроническим гепатитом С

Среди обследованных больных было 65 женщин и 59 мужчин в возрасте от 17 до 73 лет (средний возраст – 43±13,8 лет). Предполагаемая длительность течения ХГС – от 1 года до 45 лет (в среднем – 19,1±11,7 лет).

Факторами риска инфицирования чаще были оперативные вмешательства (23%) и гемотрансфузии (12%), реже парентеральное введение наркотиков (10%), донорство (4%), стоматологические вмешательства (5%) и другие.

Среди 91 больного с исследованным генотипом HCV преимущественно определялись генотипы 1в (у 65%) и генотип 3а (у 23%); генотипы 2а и 1а выявлены менее чем у 10% больных.

Клиническая картина поражения печени суммирована в таблице 2. Наиболее частым симптомом среди клинических проявлений поражения печени была гепатомегалия (88,7%), реже выявлялись спленомегалия (9,6%), расширение воротной и/или селезеночной вен (12%), варикозное расширение вен пищевода (ВРВП) различной степени выраженности (8,8%), асцит (5,6%). Желтуха наблюдалась только у 9,6% больных. При анализе основных биохимических показателей сыворотки крови чаще (у 71,8%) выявлялось умеренное повышение активности трансаминаз (АСТ, АЛТ), реже отмечали снижение активности ХЭ (у 9,6%) и повышение уровня билирубина (у 9,6%). По данным иммунологического исследования ревматоидный фактор выявлен у 50,8%, повышение уровня СРБ у 19,3% и снижение гемолитической активности комплемента (СН50) у 30,6% больных.

При морфологическом изучении биопсийного материала печени 59 больных, у большинства определена I степень (63%) и II степень фиброза (23%). Больные с III и IV степенью фиброза составили в нашем исследовании меньшинство (соответственно 8% и 3%). Однако к 3 больным с IV степенью фиброза нами были причислены 20 больных, которым биопсия печени не проводилась, с клинико-лабораторными и УЗ-признаками ЦП (гепатоспленомегалия, портальная гипертензия) и таким образом, по данным клинико-лабораторного и морфологического исследования, группу больных с IV степенью фиброза (цирроза печени – ЦП) составили у 23 пациента.

Среди 42 больных с рассчитанным темпом прогрессирования фиброза печени более чем у половины (55%) отмечался медленный темп прогрессирования (менее 0,1 ед. фиброза/год (0,056±0,02), у 20% – средний темп прогрессирования (0,1-0,13 ед. фиброза/год (0,1±0,01), и у 25% – быстрый темп нарастания фиброза в ткани печени (> 0,13 ед.фиброза в год (0,45±0,57).

Таблица 2. Характеристика печеночных проявлений ХГ С (n=124)

симптомы:	Число больных n= 124	%
Гепатомегалия	110	88,7
желтуха	12	9,6
Признаки портальной гипертензии: спленомегалия расширение воротной/селезеночной вен Варикозное расширение вен пищевода (ВРВП) асцит	12 15 11 7	9,6 12,1 8,8 5,6
Лабораторные показатели:
трансаминаз (АСТ, АЛТ)	89	71,8
холинэстеразы	12	9,6
билирубина	12	9,6
Иммунологические показатели:
РФ	63	50,8
СРБ	24	19,3
СН50	38	30,6

Системные проявления наблюдались среди 124 обследованных нами больных у 59 (48%) и развились в среднем через 24±11,4 лет от начала ХГ С, причем группа больных с системными проявлениями, независимо от степени фиброза, отличалась большей длительностью заболевания (24,5±11,4), по сравнению с группой больных без системных проявлений (15,6±10,6; р<0,01). Среди 59 больных с системными поражениями у 17 (14%) они отмечались уже в дебюте заболевания.

Криоглобулинемия составила в целом по группе 35,5% (у 44 из 124 больных), развивалась в среднем через 22,5±11,8 лет от начала HCV-инфекции. Полученные нами данные практически не отличаются от приводимых в литературе: частота СКГ среди лиц, инфицированных HCV, в Европе оценивается от 34% в Италии до 54% во Франции. Срок течения HCV-инфекции до появления криоглобулинемии составлял в этих наблюдениях также более 20 лет.

Криоглобулинемия являлась интегральным признаком, с которым сочетались другие системные проявления, спектр которых был достаточно широк. Все наблюдаемые нами системные проявления, кроме двух – синдром Шегрена и поражение щитовидной железы, встречались значительно чаще у больных с КГ, чем без КГ: среди 20 больных с поражением почек КГ выявлялась у 15; среди 18 больных с кожным геморрагическим васкулитом – у 14; среди 11 больных с артралгиями – у 8; среди 9 с периферической нейропатией – у 8; симптомы поражение желудочно-кишечного тракта, легких и мышц отмечено нами только у больных с криоглобулинемией (рис. 1).

Рисунок 1. Частота системных проявлений у больных ХГ С в зависимости от наличия криоглобулинемии

Поражение почек у большинства больных с КГ (15 из 20) развивалось в среднем через 3,2±2,86 года после первых симптомов КГ, часто после появления кожного васкулита (пурпуры). Это согласуется с устоявшимся к настоящему времени представлением об ассоциированном с вирусом гепатита С поражении почек как о проявлении криоглобулинемического васкулита – преимущественно криоглобулинемическом гломерулонефрите (морфологически мезангиокапиллярном гломерулонефрите). И действительно, у 3 больных (с остронефритическим и нефротическим синдромами и выраженной гематурией) при биопсии почки нами были выявлены морфологические признаки криоглобулинемического мезангиокапиллярного гломерулонефрита.

Клинически по нашим данным, как и по данным литературы, у большинства – 12 (60%) больных наблюдался умеренный мочевой синдром, у 5 (25%) – нефротический синдром и у 3 (15%) – тяжелый остронефритический синдром (у всех с эритроцитурией более 100 в поле зрения и высокой артериальной гипертензией – сист. АД от 160 до 200 мм.рт.ст., диаст. АД от 100 до 120 мм.рт.ст.) с развитием у 2 из них быстропрогрессирующего гломерулонефрита с увеличением сывороточного креатинина за короткий срок от нормального уровня до 3,8 и 7,0 мг/дл). Артериальная гипертония (АД > 140/90 мм.рт.ст.) наблюдалась у 75% больных с поражением почек.

II. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови у больных ХГ С

Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови наблюдавшихся нами 124 больных ХГ С составил в целом по группе 7,4±14,8 пг/мл (от 5 до 110 пг/мл), что превышает этот показатель у здоровых людей (до 5 пг/мл); частота выявления гиперпродукции ИЛ-6 – 35% (у 44 из 124) соответствует данным литературы (34-37%). Среди 44 больных с повышенным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови у большинства – 66% повышение было умеренным (до 2 норм), у 27% – значительным (до 5 норм) и у 7% больных наблюдалась выраженная гиперпродукция ИЛ-6 (более 10 норм) (рис. 2).

Рисунок 2. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови у больных ХГ С (n=124)

При сопоставлении уровня ИЛ-6 в сыворотке крови со степенью фиброза печени у 79 больных ХГ С (в том числе у 20 с ЦП по клинико-лабораторным и УЗ признакам), было отмечено, что у больных с нормальным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови достоверно чаще (у 57%, р=0,005) отмечалась 1 (легкая) степень фиброза печени, в то время как среди больных с повышенным уровнем ИЛ-6 достоверно чаще (у 52%, р=0,004) наблюдался цирроз печени (таблица 3).

Таблица 3. Степень фиброза у больных ХГ С в зависимости от уровня ИЛ-6 в сыворотке крови

Степень фиброза	ИЛ-6 (n=25)	N ИЛ-6 (n=54)	Р
1 (легкая)	6 (24%)	31 (57%)	0,005
2 (умеренная)	5 (20%)	9 (16%)	0,9
3 (тяжелая)	2 (8%)	2 (4%)	0,7
4 (цирроз)	13 (52%)	11 (20%)	0,004

Анализ темпа прогрессирования фиброза печени в зависимости от уровня сывороточного ИЛ-6 показал, что в группе больных с нормальным уровнем сывороточного ИЛ-6 у большинства – 21 из 33 определен медленный темп прогрессирования фиброза печени, у 6 – умеренный и у 6 – быстрый. И напротив, в группе больных с повышенным уровнем ИЛ-6 у большинства – 6 из 9 отмечался быстрый темп прогрессирования, только у 1 – медленный и еще у 2 – умеренный (рис. 3).

Рисунок 3. Темп прогрессирования фиброза печени у больных с нормальным (n=33) и повышенным (n=9) уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови

Оценка клинического течения заболевания в группах больных с повышенным и нормальным уровнем ИЛ-6 показала, что среди больных с гиперпродукцией ИЛ-6 системные проявления выявлялись достоверно чаще – у 33 (75%) из 44, чем среди больных с нормальным уровнем ИЛ-6 – у 26 (27%) из 80 (р=0,0000). Это касалось в первую очередь пурпуры, КГ, поражения почек. Та же закономерность отмечена и при определении частоты других системных проявлений в анализируемых группах (табл. 4).

Таблица 4. Распределение системных проявлений у больных с повышенным и нормальным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови

Группа	Гиперпродукция ИЛ-6 (n=80)	Норм. значения ИЛ-6 (n=44)
криоглобулинемия	23 (53%)	21 (26%)	р=0,0039
поражение почек	13 (30%)	7 (9%)	р=0,0026
пурпура	11(25%)	7 (9%)	р=0,028
артралгии	7 (16%)	4 (5%)	р=0,04
поражение легких	4 (9%)	1 (1%)	р=0,028

Криоглобулинемия в группах больных с повышенным уровнем ИЛ-6 отмечалась не только чаще, но и была более выраженной (табл. 5). Наиболее высокий уровень КГ – 4(++++) был выявлен у больной с самым высоким в нашем наблюдении уровнем ИЛ-6 (110 пг/мл).

Таблица 5. Степень выраженности криоглобулинемии у больных с повышенным и нормальным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови

криоглобулинемия	ИЛ-6 (n=44)	N ИЛ-6 (n=80)	р
1(+)	10 (23%)	16 (20%)	0,7
2(++)	7 (16%)	4 (5%)	0,04
3(+++)	5 (12%)	1 (1%)	0,01
4(++++)	1 (2%)	–

В группе больных с гиперпродукцией ИЛ-6 криоглобулинемия проявлялась и более яркой клинической картиной. Так, среди этих больных достоверно чаще отмечалось прогностически наиболее значимое поражение почек, проявляющееся нефротическим синдромом (у 4 (9%) из 44, в противоположной группе только у 1 (1,25%) из 80, р=0,034)) и остронефритическим синдромом – только у больных с высоким уровнем ИЛ-6 (у 3 (7%) среди 44, у 2 из них с быстропрогрессирующим течением (БПГН)). Что касается частоты выявления мочевого синдрома, то она мало различалась в сравниваемых группах, составив 14 и 17,5% (р>0,05).

Таким образом, гиперпродукция ИЛ-6 при ХГ С сочетается с более тяжелой клинической картиной заболевания, с развитием криоглобулинемического васкулита и связанного с ним симптомокомплекса, включая поражение почек, а также высоким риском формирования цирроза печени.

Патогенетическая роль ИЛ-6 в развитии криоглобулинемического васкулита с поражением почек подтверждается выявленной нами высокодостоверной прямой связью уровня ИЛ-6 в сыворотке крови с криоглобулинемией и другими связанными с ней проявлениями (см. табл. 4).

III. Уровень ИЛ-6 в моче больных ХГ С

Среди 57 больных с измеренным в моче ИЛ-6 увеличение его содержания от 5,0 до 320,0 пг/мл (в среднем 49,7 ± 63,7 пг/мл) было выявлено у 40 (70%) больных, из них у 18 (90%) из 20 с поражением почек.

При этом у больных с тяжелым поражением почек уровень ИЛ-6 в моче был в 10 раз выше, чем у здоровых и в 3 раза выше, чем у больных с умеренным мочевым синдромом (рис. 4).

Рисунок 4. Средний уровень ИЛ-6 в моче при поражении почек.

Самые большие индивидуальные показатели ИЛ-6 в моче (320 пг/мл, 270 пг/мл и 184 пг/мл) оказались у больных с ОНС – наиболее клинически активной формой поражения почек.

У больных ХГ С и поражением почек величина экскреции с мочой ИЛ-6 прямо коррелировала с клинико-лабораторными показателями активности гломерулонефрита: уровнем эритроцитурии, функциональными почечными показателями, тяжестью артериальной гипертензии. В то же время нами не было выявлено прямой связи между уровнем ИЛ-6 в крови и моче. Также не было отмечено корреляции между уровнем ИЛ-6 в моче и выраженностью протеинурии (табл. 6), что может указывать на локальное почечное происхождение «мочевого» показателя ИЛ-6 и его значение как маркера активности иммунного воспаления в почке.

Таблица 6. Взаимосвязь уровня ИЛ-6 в моче с клинико-лабораторными показателями поражения почек у больных ХГ С

Лабораторные показатели	ИЛ-6 мочи (пг/мл)
Эритроцитурия	Rs=0,33 p<0,01
Креатинин сывротки (мг/дл)	Rs=0,33 p<0,01
СКФ по Кокрафту-Гоулту (мл/мин)	Rs=0,27 p<0,05
АГ	Rs=0,28 p<0,05
Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови	Rs=0,21 p>0,05
Протеинурия	Rs=0,24 p>0,05

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования «мочевого» показателя ИЛ-6 в оценке прогноза поражения почек у больных ХГ С.

IV. Полиморфизм гена ИЛ-6-174 G/C у больных ХГ С.

С целью определения возможности генетической предрасположенности к гиперпродукции ИЛ-6 и связанных с ней клинических проявлений –криоглобулинемического васкулита и поражения почек, нами был изучен полиморфизм гена ИЛ-6 174G/С у 70 больных ХГ С. У большинства – 31 (44%) выявлен IL-6-174 GС генотип, 26 (37%) – IL-6-174 GG генотип и у 13 (19%) – IL-6-174 СС генотип. При этом среди больных с высоким уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови, независимо от наличия или отсутствия у них системных проявлений, преобладал аллель G -174 GC полиморфизма гена IL-6, в то время как в группе с нормальным уровнем ИЛ-6 – аллель С -174 GC полиморфизма гена IL-6 (р<0,05) (рис.5)

Рисунок 5. Распределение аллелей полиморфизма гена ИЛ-6 среди больных с высоким и нормальным уровнем ИЛ-6 в сыворотке крови

Подробный анализ влияния полиморфизма на наиболее прогностически значимые клинические проявления криоглобулинемического васкулита, в первую очередь поражения почек, оказался невозможным из-за недостаточной численности этой группы.

VI. Экспрессия гена цитохрома Р-450 в ткани печени больных

ХГ С

Поскольку одним из эффектов ИЛ-6 является его влияние на систему Р450, в том числе на уровень mRNA белков различных изоформ цитохрома в гепатоцитах, мы исследовали в ткани печени 36 больных ХГ С экспрессию гена цитохрома Р-450, изоформы CYP2E1.

Нами была отмечена тенденция к снижению уровня экспрессии mRNA CYP2E1 в группе больных с повышенным содержанием ИЛ-6 в сыворотке крови по сравнению с группой больных, имеющих нормальный уровень ИЛ-6 в сыворотке крови (0,7 против 1,5) (рис.6).

Рисунок 6. Экспрессия гена CYP-450 при повышенном и нормальном уровне ИЛ-6 в сыворотке крови.

При сопоставлении уровня экспрессии гена цитохрома Р-450 со степенью морфологческих изменений в ткани печени оказалось, что при 4 (цирроз печени) степени фиброза уровень экспрессии mRNA CYP2E1 оказался достоверно ниже (р<0,05) по сравнению с 1 (легкой) и 2 (умеренной) степенях фиброза печени (рисунок). Также нами была выявлена прямая достоверная корреляция между степенью снижения уровня экспрессии mRNA CYP2E1 и темпом прогрессирования фиброза печени (Rs=0,28 p=0,03) (рис. 7).

Рисунок 7. Экспрессия гена CYP-450 в зависимости от стадии фиброза печени

Согласно данным литературы, снижение экспрессии цитохрома Р450 в печени сопровождается нарушением процессов свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты. В следствие избыточного накопления продуктов перекисного окисления липидов происходит активация звездчатых клеток с повышением продукции коллагена – одного из основных компонентов экстрацеллюлярного матрикса (фиброза). С другой стороны, повышение концентрации продуктов свободно-радикального окисления способствует стимуляции выработки цитокинов, в том числе ИЛ-6.

С помощью монофакторного и многофакторного дискриминантного анализа нами выделены статистически значимые критерии прогноза течения ХГ С. По результатам монофакторного анализа независимыми факторами неблагоприятного прогноза (прогрессирования в цирроз) были возраст (р=0,012), уровень ИЛ-6 в сыворотке крови (р= 0,001), экспрессия гена цитохрома Р450 (изоформы CYP2E1) (р=0,03), системные проявления (в том числе криоглобулинемия) (р=0,048). При многофакторном анализе как независимые факторы прогноза имеют значение возраст (р=0,01), уровень ИЛ-6 в сыворотке крови (р=0,026) и поражение почек (р=0,015) (табл. 7).

Выводы

1. У 36% больных хроническим гепатитом С выявляется повышение уровня в сыворотке крови интерлейкина-6; среди больных с повышенным уровнем сывороточного ИЛ-6 по сравнению с больными без его повышения чаще выявляется криоглобулинемия (56% против 26%, р<0,01) и связанные с ней системные проявления, включая поражение почек (30% против 9%, p<0,01), а также большая степень выраженности фиброза в печени и быстрый темп его нарастания (p<0,01).
2. Гиперпродукция интерлейкина-6 с повышением его уровня в сыворотке крови достоверно чаще сочетается с носительством аллеля гена IL-6 -174G, чем гена IL-6 -174C (р<0,05).
3. Ассоциированный с ХГ С криоглобулинемический гломерулонефрит у 90% больных сопровождается экскрецией интерлейкина-6 с мочой, уровень которой пропорционален тяжести поражения почек: наиболее высокий уровень экскреции отмечается при развитии остронефритического и нефротического синдромов, и прямо не коррелирует с уровнем интерлейкина-6 в сыворотке крови, отражая активность местной (локально-почечной) иммуновоспалительной реакции.

4. При прогрессировании фиброза печени у больных хроническим гепатитом С, параллельно с нарастанием уровня ИЛ-6 в сыворотке крови, наблюдается ослабление экспрессии гена цитохрома Р450 в гепатоцитах, прямо коррелирующее со степенью фиброза печени и темпом его нарастания (Rs=0,28 p=0,03).

5. На основании многофакторного дискриминантного анализа повышение интерлейкина-6 в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С является независимым фактором неблагоприятного прогноза течения заболевания (р=0,026), наряду со старшим возрастом (р=0,01) и поражением почек (р=0,015).

Практические рекомендации

1. У больных хроническим гепатитом С для оценки прогноза (прогрессирования в цирроз) может быть рекомендовано исследование уровня ИЛ-6 в сыворотке крови.
• Больные с повышенным уровнем ИЛ-6 (> 2 норм), особенно при наличии криоглобулинемии и связанного с ней симптомокомплекса (общей слабости, пурпуры, артралгий, изменений в анализах мочи и др.), составляют группу риска быстрого темпа прогрессирования фиброза; этим больным показана активная ПВТ и/или иммуносупрессивная терапия.
2. У больных ХГ С с поражением почек - криоглобулинемическим гломерулонефритом с целью мониторирования иммунного воспаления в почке целесообразно исследовать уровень ИЛ-6 в моче.
• Выявление высокого уровня ИЛ-6 в моче или его дальнейшее повышение свидетельствует об активности гломерулонефрита и является показанием для назначения или коррекции иммуносупрессивной терапии, и напротив, стойкое снижение экскреции ИЛ-6 с мочой является критерием уменьшения активности ГН и возможности снижения дозы иммуносупрессивной терапии и присоединения ПВТ.

3. При доступности более сложных и дорогостоящих методов молекулярно-генетического анализа дополнительное назначение для оценки риска нарастания фиброза в печени и, следовательно, прогноза заболевания в целом, имеет исследование полиморфизма гена ИЛ-6 и определение экспрессии генов цитохрома Р450 (риск выше у больных с выявлением аллеля G полиморфизма гена IL-6-174G/С, снижением экспрессии изоформы CYP2E1 в ткани печени, особенно у больных с повышенным уровнем ИЛ-6).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Л.В.Козловская, Н.Б.Гордовская, Е.Ю.Малышко, С.В.Тэгай, Ю.В.Коротчаева, В.А.Варшавский, Н.Г.Мирошниченко. «Поражение почек у больных со смешанной криоглобулинемией» // Успехи нефрологии-Москва, 2001г. – с.209 – 216.
2. Л.В.Козловская, Н.Б.Гордовская, Е.Ю.Малышко, С.В.Тэгай, Ю.В.Коротчаева, В.А.Варшавский, Н.Г.Мирошниченко, С.Ю.Милованова, Н.А.Константинова. «Криоглобулинемическое поражение почек – особенности течения и лечение» // Нефрология и диализ – 2002г. – т.4 – №1 – с.4 – 8
3. С.В.Тэгай, Ю.В.Коротчаева, Л.В.Козловская, Н.Б.Гордовская. «Мезангиокапиллярный гломерулонефрит, ассоциированный с вирусом гепатита С» // Материалы научно-практической конференции, посвященных 55-летию сотрудничества ММА им.И.М.Сеченова и здравоохранения Тульской области. – Тула 2002г. – с.309-311.
4. С.В.Тэгай, Ю.В.Коротчаева, С.Ю.Милованова, Е.Ю.Малышко, Н.А.Константинова. «Клиническое значение выявления смешанной криоглобулинемии у больных с поражением почек» // Клиническая лабораторная диагностика – 2002г. – №9 – с.33.
5. Козловская Л.В., Гордовская Н.Б., Малышко Е.Ю., Тэгай С.В., Коротчаева Ю.В., Милованова С.Ю. «Клиническое значение смешанной криоглобулинемии» // Российский медицинский журнал.– 2003.– № 4.– С. 11–15.
6. Л.В.Козловская, Н.Б.Гордовская, Е.Ю.Малышко, С.В.Тэгай, Ю.В.Коротчаева, В.А.Варшавский, Н.Г.Мирошниченко. «Поражение почек у больных со смешанной криоглобулинемией» // Центрально-Азиатский медицинский журнал. – 2004– т.X – приложение 5 – с.29-34
7. С.Милованова, С. Тэгай, Ю. Коротчаева, Л. Козловская. «Поражение почек, ассоциированное с инфицированием вирусами гепатита В и С» // Врач – 2007. – №6. – с.70-74
8. Ю.В.Коротчаева, Н.Б.Гордовская, Л.В.Козловская, А.И.Сперанский. Исследование интерлейкина-6 у больных хроническим гепатитом С. // Сборник тезисов Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной нефрологии» – 2007г. – Москва – с.43-44.

Список сокращений.

АД артериальное давление

ИЛ-6 интерлейкин-6

КГ криоглобулинемия

КГГН криоглобулинемический гломерулонефрит

ПВТ противовирусная терапия

СРБ С-реактивный белок

ХГ С хронический гепатит С

ЦП цирроз печени