Кератоакантома (дифференциальная диагностика с плоскоклеточным раком кожи, совершенствование методов лечения и профилактика озлокачествления)

На правах рукописи

Кунцевич Жанна Сергеевна

Кератоакантома

(дифференциальная диагностика с плоскоклеточным

раком кожи, совершенствование методов лечения и

профилактика озлокачествления)

14.00.11 – кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

2007

Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им. М.Ф.Владимирского

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Молочков Владимир Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Казанцева Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Иванов Олег Леонидович

доктор медицинских наук, профессор Кудрина Марина Игоревна

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «___»___________г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.10 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (119991, Москва, ул.Трубецкая, д.8, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «___»_______________2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.208.040.10 доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична Эрдес

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Кератоакантома (КА) – эпидермальная опухоль кожи, в одних случаях спонтанно инволюцирующая в сроки до 3 месяцев от начала заболевания (типичная КА), в других - длительно персистирующая, достигающая гигантских (более 2 см в диаметре) размеров, рецидивирующая, трансформирующаяся в рак (атипичная КА) /Молочков В.А.,1993; Молочков В.А.и др., 2006; Kopf A.W.,1968/.

Столь непредсказуемое клиническое течение КА наряду с трудностью, а зачастую и невозможностью ее дифференциальной диагностики с плоскоклеточным раком (ПКР) кожи /Беренбейн Б.А.., 1980; Lever W., 2004 / обусловливают актуальность совершенствования методов варификации КА с использованием иммуногистохимических маркеров.

Попытки изучения с этой целью иммуногистохимической экспрессии белков пролиферации (Ki67, PCNA) /Lu S., Tiekso J. et al. 1999.; Matsatu M., Kimura S. et al., 1996.; Ren Z.P., Ponten F., 1996; Sagol O., Kurtoglu B., 1998; Narayan S., De Berker D. et al, 2002/, регуляторов клеточного цикла (циклин А и В) / Tran T.A., Ross J.S., Boehm J.R et al, 1999/, гена супрессора апоптоза р53 / Lee Y.-S., Teh M. 1994; Cain S.T. et al.1995/ пока не увенчались успехом. Причины этого лежат прежде всего в ненадежности диагностических критериев КА при изучении тангенциальных гистологических срезов инцизионных биоптатов, не дающих полного представления о типичной для КА архитектонике новообразования, что может быть поводом для ошибочной диагностики хорошо дифференцированного плоскоклеточного рака кожи /Апатенко А.К.,1973; Fisher E.R. et al.,1972/.

Отсутствие аргументированной концепции патогенеза КА и надежных клинико-лабораторных критериев отличия атипичных форм КА от ПКР кожи привело к тому, что взгляды на тактику ведения больных КА существенно различаются, варьируя от предложения ограничиваться выжиданием в надежде на спонтанную инволюцию опухоли /Emerson C.W. et al.1971; Wolf C.T. et al.,1986/ до назначения такого же лечения как при ПКР кожи /Reymann I.,1977; Penmetcha M.et al.,1987; Humm J.C. et al.,1990; Krunic A.L. et al.1998/.

Однако использование неадекватных для КА хирургических, лучевых и химиотерапевтических методов лечения не только приводит к тяжелым косметическим дефектам, иногда с нарушением функции органа (при локализации процесса на веке, половом члене, ушной раковине), но и далеко не всегда предотвращает рецидив, существенно повышающий частоту трансформации КА в ПКР /Молочков В.А., 1993; Lawrence N., Reed R.J.,1990; Hodak E. et al.,1993/.

С другой стороны, данные последних лет о важной роли иммунных механизмов в патогенезе КА /Молочков В.А. и др., 2006; Lowes M.A. et al.,1999/ подтверждаются сообщениями об эффективности ее лечения иммунотропными препаратами /Samai B., Hallo P.,2000/. Однако доказательств патогенетической обоснованности применения при атипичных КА препаратов интерферона не приводится. В этой связи важно учитывать, что разработка методов иммунотерапии КА должна основываться не только на обоснованном выборе иммунотропного препарата, но и на обеспечении достоверной дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи. /Молочков В.А.,2006/.

Цель исследования

Изучение клинических особенностей атипичных солитарных кератоакантом, совершенствование методов их дифференциальной диагностики с плоскоклеточным раком кожи на основе иммуногистохимического выявления Ki67 и р63 и иммунотропной терапии реафероном.

Задачи исследования:

1. Выделить клинико-морфологические варианты атипичных кератоакантом и установить частоту их трансформации в плоскоклеточный рак.

2. Оценить различия атипичных кератоакантом и плоскоклеточного рака кожи на основе сравнительной оценки ряда информативных цитологических и гистологических признаков.

3. Разработать объективные критерии дифференциальной диагностики атипичных кератоакантом и плоскоклеточного рака кожи при изучении экспрессии иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67 и маркера резервных полипотентных клеток р63 в опухолевом эпидермисе.

4. Разработать на основе изучения иммунного и интерферонового статуса больных атипичными кератоакантомами эффективный метод их иммунотропной терапии рекомбинантным интерфероном 2b реафероном.

Научная новизна

В работе с целью проведения дифференциальной морфологической диагностики атипичных КА и ПКР кожи впервые применено иммуногистохимическое изучение экспрессии белков Ki67 и р63. (Получен патент №2279089 на изобретение способа дифференциальной диагностики кератоакантомы и плоскоклеточного рака кожи.)

На основе изучения иммунологического и интерферонового статуса разработан новый метод лечения больных атипичными КА Реафероном.

Научно-практическая значимость

Впервые с целью проведения дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи применен иммуногистохимический метод с использованием маркеров Ki67 и р63. Выявлены различия экспрессии этих маркеров в эпидермальных клетках КА и ПКР кожи.

Разработан эффективный, патогенетически обоснованный метод внутритканевой терапии атипичных КА отечественным препаратом Реаферон, установлена его высокая клиническая эффективность и нормализующее действие на иммунный и интерфероновый статус больного.

Положения, выносимые на защиту.

- Среди больных атипичными КА трансформация в ПКР кожи наблюдалась в 11,4% случаев.

- Экспрессия белка ядер пролиферирующих клеток Ki67 и регуляторного протеина p63, маркирующего полипотентные клетки, в КА выявляется по периферии акантотических разрастаний эпидермиса, в их базальных отделах. В ПКР кожи ядра, экспрессирующие р63 и Ki67, хаотично разбросаны в акантотических выростах и отшнурованных комплексах атипичного эпителия, т.е. выявляются и по периферии, и в центральных отделах опухолевых разрастаний эпидермиса.

- Иммуногистохимическое выявление маркера пролиферации Ki67 и регуляторного протеина p63 позволяет объективизировать проведение дифференциального диагноза между КА и ПКР кожи.

- Метод внутритканевой терапии Реафероном эффективен при лечении атипичных КА и позволяет добиться клинического выздоровления у 96% больных.

- Рецидивы атипичных КА после деструирующих методов лечения встречаются в 27,3%, после реаферонотерапии рецидивы в сроки от 2 до 5 лет (в среднем 3+0,4 года) отсутствуют, а ее патогенетическая обоснованность доказана нормализацией после лечения эффекторных звеньев иммунитета (фагоцитоза, цитотоксичности, NK-клеток), повышением способности субпопуляций лимфоцитов периферической крови к апоптозу и увеличением ИФН и ИФН – продуцирующей способности лейкоцитов крови.

Внедрение результатов исследования

Разработанный метод лечения атипичных КА внедрен в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, разработанный метод дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи внедрен в практику патолого-анатомического отделения МОНИКИ. Полученные данные включены в лекционный материал кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова, кафедры патологической анатомии ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, патолого-анатомического отделения МОНИКИ, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И.М.Сеченова (2004г.), на научно-практической конференции дерматовенерологов центрального округа Российской Федерации пролиферативные заболевания кожи (Москва 2006г.), на заседании Московского областного общества дерматовенерологов (Москва 2006г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 11 печатных работ, в том числе 1 монография.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит их введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 35 рисунками, 51 таблицей. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 167 иностранных источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования проводились в патологоанатомическом отделении МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского. Иммунологические исследования проводились на базе лаборатории национального справочного центра по интерферону НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на основании обследования и лечения 44 больных атипичными КА и 20 больных плоскоклеточным раком (ПКР) кожи. Диагноз в каждом случае устанавливался на основании анамнестических сведений, клинической картины и результатов патоморфологического исследования.

Среди больных атипичными КА мужчин было 24(54,5%), женщин 20(45,5%). Соотношение мужчин и женщин – 1,2:1. Возраст пациентов варьировал от 22 до 89 лет, средний возраст 59,98+1,4 лет.

С целью отработки алгоритма дифференциальной диагностики атипичной КА и ПКР кожи с использованием иммуногистохимического исследования в работу были включены 20 больных инфильтративно-язвенной формой ПКР кожи T1N0M0, госпитализированных в отделение ЧЛХ МОНИКИ для хирургического лечения; среди больных ПКР мужчин было 12(60%), женщин 8(40%); соотношение мужчины и женщин – 2,1:1; возраст пациентов варьировал от 35 до 74 лет, (в среднем 61,88+2,1 лет).

В работе использовали как общепринятые рутинные так и специальные методы исследования. Проточную цитофлуориметрию проводили в реакции непрямой поверхностной иммунофлюоресценции. Определяли уровни экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD20, молекул адгезии, CD11, CD50; активационных антигенов HLA-DR, CD38, CD25, CD71. Количество иммуноглобулинов классов G, A, M в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле.

Оценка интерферонового статуса. Исследование проводилось по методу С.С.Григорян (1991): определяли количество сывороточного ИФН, уровень продукции ИФН лейкоцитами при его индукции вирусом болезни Ньюкасла (ВБН), уровень продукции ИФН при его индукции стафилококковым энтеротоксином А (СЭА).

Гистологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование.

Использована методика Taylor С. R., Cote R. и Sternberger L.A.. Биопсийный материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуфференном по Лилли (рН 7,2), затем проводили по батарее спиртов и ксилолов и заливали в парафин по стандартной методике. Использовали специальный парафин с температурой плавления 54°С. Готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с полилизиновым покрытием. Депарафинизацию осуществляли по стандартной схеме. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали в микроволновом режиме при мощности 750 Вт в цитратном буфере (с рН 6,0) - 2 раза по 5 минут, затем охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 минут и наносили соответствующие первичные антитела. Инкубация с первичными антителами: 30 минут при комнатной температуре, затем на ночь (14-18 часов) при 4°C. Инкубированные срезы тщательно промывали в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6, затем наносили комплекс EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO) и инкубировали 30-40 минут при комнатной температуре, тщательно промывали в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6, и наносили красящий раствор диаминобензидина (ДАВ) - DAB+ фирмы DAKO, визуализирующий реакцию. Затем срезы отмывали в дистиллированной воде и докрашивали гематоксилином Майера.

Индекс пролиферации по экспрессии Ki67 и индекс p63 вычисляли как среднее количество меченых ядер на 100 опухолевых клеток (при учете 500-1000 опухолевых клеток). Подсчет меченых ядер проводился в репрезентативных полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Края срезов, где чаще всего наблюдается неспецифическое фоновое окрашивание, не учитывались.

Методика внутритканевого введения Реаферона. Препарат вводили по 1млн. МЕ ежедневно методом внутриочаговых иньекций, курсовая доза препарата составила 10 млн. МЕ. Использовали инсулиновый шприц с длиной иглы 8 мм., толщина иглы не более 8G. Иглу вводили на границе опухоли со здоровой кожей, срез иглы направляли вниз, при каждом последующем введении отступали на 15 минут по или против часовой стрелки.

Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам с использованием пакета анализа МS Offis XP для Windows 2002, Primer of biostatistics, version 5.0.

Результаты исследования и их обсуждение.

Среди 44 больных атипичными КА были диагностированы следующие клинические формы этой опухоли: у 12(27,3%) - стойкие, у 17(38,6%) - гигантские, у 2(4,6%) - центробежные, у 2(4,6%) – мультинодулярные, у 1(2,3%) - грибовидная, у 4(9,1%) - в форме кожного рога, у 6(13,6%) – рецидивные, в том числе один случай КА при синдроме Мюир-Торре.

КА в 95,5% случаев возникала на фоне здоровой кожи, лишь у 1 пациента развитие КА отмечалось на фоне предшествующего красного плоского лишая и у 1 - базалиомы.

Атипичные КА локализовались преимущественно на открытых участках кожного покрова - 35 (79,5%), как правило, на лице (таблица 1).

Таблица 1.

Локализация атипичных кератоакантом.

локализация		лоб	Височная обл	периорбит. обл	Носогубная складка	Скат носа	Спинка носа	щеки	Околоушная обл.	спина	губы	подбородок	шея	плечо	Предплечье, кисть	бедро
Атипичная КА	Абс	3	2	3	4	3	4	3	2	2	2	3	2	3	6	2	44
	%	6,8	4,6	6,8	9,1	9,1	6,8	4,6	4,6	4,6	6,8	6,8	4,6	6,8	13,6	4,6	100

Среди больных с атипичными КА было 6 пациентов с рецидивными КА. Развитию рецидива предшествовало применение деструирующих методов лечения, которые предпринимались на стадии роста КА: хирургического иссечения в щадящих пределах (с захватом 3-5 мм от края опухоли) - в 3 случаях, электрокоагуляции - в 2, криодеструкции - в 1.

Рецидивы возникали в сроки от 7 до 14 дней после удаления новообразования.

В 5 из 6 случаев рецидивные КА трансформировались в ПКР. Таким образом, частота трансформации атипичных КА в ПКР среди обследованных нами больных составила 11,4%. В 3 из 5 случаев озлокачествившиеся КА не имели клинических отличий от КА и только в 2 случаях в них отмечалось характерное для ПКР кожи изъязвление.

Из 44 наблюдаемых нами больных атипичными КА у 27 предварительно была произведена краевая диагностическая биопсия, а у 17 опухоли были удалены полностью, что позволило оценить их гистоархитектонику.

Гистологически КА характеризуется значительным гиперкератозом и бородавчато-акантотическими разрастаниями эпидермиса. На сагиттальных срезах, проходящих через центр опухоли, видно, что акантотический эпидермис окаймляет кратер, заполненный роговыми массами. Часть пролиферирующего эпидермиса по краям кратера, истончаясь, клювовидно нависает над ним, охватывая ортокератозные роговые массы в виде «воротничка». Это напоминает чашу, заполненную рогом, что является характерной особенностью кератоакантомы. Эпидермис, выстилающий дно «чаши» неравномерно разрастается, погружаясь в дерму, на некоторых участках достигая уровня потовых желез, образуя анастомозирующие тяжи и отшнурованные комплексы неправильных очертаний.

Сущностью гистологических изменений при КА является так называемая псевдокарциноматозная гиперплазия, которую трудно, а в ряде случаев невозможно, отличить от высокодифференцированного ПКР кожи, в особенности если гистологический срез прошел через край опухоли, а не через ее центр, как обычно бывает в диагностических биоптатах.

В целях объективизации проведения дифференциальной гистологической диагностики КА и ПКР кожи мы провели в этих опухолях сравнительный анализ выраженности и диагностической информативности 19 патоморфологических признаков: клеточного полиморфизма, атипии ядер, инвазии акантотических тяжей и отшнурованных эпидермальных комплексов, частоты митозов, наличия патологических митозов, наличия зоны дисплазии эпидермиса по периферии опухоли, выраженности рогового кратера («чаши»), формирования и распада роговых жемчужин, ороговения отдельных клеток, наличия апоптотических телец, выраженности имунно-воспалительного инфильтрата в дерме и его состава (эозинофилы, плазматические клетки, лимфоциты, сегментоядерные лейкоциты), инфильтрации лейкоцитами эпидермальных комплексов, акантолиза, очагов некроза.

Оценку выраженности признака проводили полуколичественным методом [+, ++, +++]. Митотическую активность определяли по количеству фигур митоза на 10 репрезентативных полей зрения (РПЗ) с большим увеличением (х400). Количество митозов < 10 на 10 РПЗ оценивали как [+], >10 и < 20 как [++] и >20 как [+++]. Частоту патологических митозов выражали в % к общему числу учтенных митозов: < 10% -[+], < 30% - [++], 30% и более - [+++] (табл.2).

Таблица № 2.

Сравнительная оценка ряда патоморфологических признаков в атипичных кератоакантомах и плоскоклеточном раке кожи.

Форма (тип) опухоли Признак	Атипичная кератоакантома п=44								Плоскоклеточный рак кожи n=20
	Общее число положи тельно оцененных случаев		Выраженность патоморфологического признака среди положительно оцененных случаев						Общее число положи тельно оцененных случаев		Выраженность патоморфологического признака среди положительно оцененных случаев
			+		++		+++				+		++		+++
	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%
Клеточный полиморфизм	34	77,3	18	40,9	14	31,8	2	4,5	19	95	5	25	12	60	2	10
Атипия ядер	35	79,5	19	43,2	14	31,8	2	4,5	19	95	5	25	12	60	2	10
Митотическая активность	25	56,8	17	38,6	6	13,6	3	6,8	17	85	7	35	4	20	6	30
Патологические митозы	18	40,9*	13	29,5	3	6,8	2	4,5	14	70	6	30	6	30	2	10
Инвазия акантотических тяжей	37	84,1	14	31,8	14	31,8	9	20,5	20	100	6	30	8	40	6	30
Формирование роговых жемчужин	34	77,3	23	52,3	5	11,4	6	13,6	16	80	5	25	7	35	4	20
Распад роговых жемчужин	9	20,5*	4	9,1	2	4,5	3	6,3	14	70	12	60	2	10	-	0
Ороговение отдельных клеток	23	52,3	19	43,2	4	9,1	-	0	14	70	4	20	8	40	2	10
Наличие апоптотических телец	41	93,2	7	15,9	16	36,4	18	41	16	80	2	10	8	40	6	30
иммунно-воспалительный инфильтрат	42	95,5	26	59,1	3	6,8	13	29	20	100	6	30	6	30	8	40
Инфильтрация лейкоцитами эпидермальных комплексов	28	63,6	9	20,5	8	18,2	11	25	15	75	9	45	4	20	2	10
Зона дисплазии эпидермиса по периферии	4	9,1	4	9,1	-	0	-	0	4	20	2	10	2	10	-	0
Акантолиз	7	15,9*	7	15,9	-	0	-	0	6	30	6	30	-	0	-	0
Некроз опухолевых комплексов	-	0*	-	0	-	0	-	0	3	15	3	15	-	0	-	0

* - статистически достоверное отличие между группами (p<0,05)

Установлено, что частота и степень выраженности формирования и распада роговых жемчужин, апоптотических телец, ороговения отдельных клеток, воспалительного инфильтрата, инфильтрации лейкоцитами эпидермальных комплексов в различных формах атипичных КА не отличаются по степени выраженности. Клеточный полимарфизм, укрупнение ядер, инвазия акантотических тяжей, митотическая активность и патологические митозы регистрируются при всех формах атипичных КА, однако их максимальная выраженность отмечена среди рецидивных и стойких КА.

Клеточный полиморфизм определяется в КА и ПКР кожи в 77,3% и 95% случаев соответственно. Интенсивность [+++] отмечена в 4,5% случаев КА и в 10% случаев ПКР, [++] - в 31,8% случаев КА и в 60% ПКР, [+] - в 40,9% случаев КА и 25% случаев ПКР.

Атипия ядер определяется в КА и ПКР кожи в 79,5% и 95% случаев соответственно. Интенсивность [+++] отмечена в 4,5% случаев КА и в 10% случаев ПКР, [++] - в 31,8% случаев КА и в 60% ПКР, [+] - в 43,2% случаев КА и 25% случаев ПКР.

Митозы определялись в КА и ПКР кожи в 56,8% и 85% случаев соответственно, что не является достоверным различием, но выраженность митотическая активность [+++] определялась в 30% случаев ПКР и только в 6,8% случаев КА. Патологические митозы определялись в КА и ПКР кожи в 40,9% и 70% случаев соответственно. Частота патологических митозов [++] и [+++] отмечена в 40% случаев ПКР и в 11,3% КА, однако в 6,8% случаев КА частота патологических митозов была такой же и даже выше, чем в ПКР.

Основная трудность проведения дифференциального диагноза между ПКР и КА состоит в том, что в КА, как и в ПКР, имеет место инвазивный рост акантотических тяжей эпидермиса, лишенных базальной мембраны, он выявлен нами в 84,1% атипичных КА. Глубокая инвазия эпидермальных тяжей с отшнуровкой мелких комплексов клеток – это признак, который ставит под сомнение доброкачественность процесса при атипичных КА.

Атипическое ороговение с образованием «жемчужин», которое как полагают характерно для плоскоклеточного рака, в нашем исследовании встретилось в 80% случаев ПКР и 77,3% случаев атипичных КА.

Распад роговых жемчужин определялся в КА достоверно реже, чем в ПКР - в 20,5% и в 70% случаев соответственно, хотя выраженность данного патоморфологического признака интенсивностью [+++] отмечена только в КА в 6,8% случаев.

Ороговение отдельных клеток определялось в КА и ПКР кожи в 52,3% и 70% случаев соответственно, что не является достоверным различием. Выраженность данного патоморфологического признака интенсивностью в [+++] в КА не отмечена, в ПКР отмечается в 10% случаев, [++] - в 9,1% и 40%, [+] - 43,2% и 20% случаев КА и ПКР кожи соответственно.

Апоптотические тельца обнаруживались в 93,2% случаев КА и в 80% случаев ПКР кожи. Выраженность данного патоморфологического признака интенсивностью [+++] определялась в 40,9% случаев КА и в 30%случаев ПКР, [++] - в 36,4% и 40%, [+] - в 15,9% и 10% случаев КА и ПКР соответственно.

Мы определили выраженность и состав иммунно-воспалительного инфильтрата - признак который рассматривался некоторыми имсследователями как перспективный в плане дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи. Инфильтрат определяется в 52,3% случаев КА и в 70% случаев ПКР кожи. Выраженность инфильтрата интенсивностью [+++] определялась в 29,5% и 40% случаев, [++] - в 6,8% и 30%, [+] - в 59,1% и 30% случаев КА и ПКР соответственно.

Инфильтрация эпидермальных комплексов лейкоцитами определялась в КА и ПКР кожи в 63,6% и 75% случаев соответственно; интенсивность [+++] отмечена в 25% случаев КА и в 10% случаев ПКР, [++] - в 18,2% случаев КА и 20% случаев ПКР, [+] - в 20,5% случаев КА и 45% случаев ПКР.

Зона дисплазии эпидермиса по периферии опухоли встретилась в незначительном количестве случаев как КА (9,1%), так и ПКР кожи (20%). Выраженность данного патоморфологического признака [+++] и при КА и при ПКР не определялась, [++] - в 10% случаев ПКР, [+] - в 9,1% и 10% случаев КА и ПКР соответственно.

Акантолиз встретился в 15,9% случаев КА и в 30% случаев ПКР - [+].

Некроза опухолевых клеток отмечен только при ПКР, но всего в 15% случаев. Считать этот признак надежным дифференциально диагностическим критерием КА и ПКР кожи нельзя, т.к. в подавляющем большинстве случаев раннего рака некротические изменения отсутствуют.

Таким образом, достоверно реже по суммарным значениям в атипичных КА встречались патологические митозы, распад роговых жемчужин, акантолиз и полностью отсутствовали в КА очаги некроза опухолевых клеток.

В результате тщательно проведенного сравнительного патоморфологического исследования биоптатов КА и ПКР кожи мы пришли к выводу, что обнаруженные нами различия патоморфологической картины атипичной КА и ПКР кожи являются недостаточно убедительными. Ни один из учтенных признаков не может быть признан достаточно чувствительным для того, чтобы провести окончательный дифференциальный диагноз КА и ПКР кожи и который мог бы являться диагностическим критерием лишь одной из этих опухолей.

Хотя в соответствии с международной гистологической классификацией опухолей кожи (ВОЗ, 1996) КА относится к опухолеподобным поражениям кожи из эпидермиса, присутствие в КА гистологических и цитологических признаков злокачественности, присущих ПКР кожи, не просто затрудняет дифференциальную диагностику, но в некоторых случаях делает ее невозможной.

Наиболее убедительным признаком, как мы уже упоминали, является сохранение характерной для КА гистоархитектоники, которую мы имели возможность наблюдать в 17 из 44 атипичных КА, когда новообразования были удаленны полностью.

Перед проведением патоморфологического исследования с использованием иммуногистохимических маркеров Ki67 и р63 биоптаты КА и ПКР были разделены на 3 группы:

- в группу 1 были включены операционные биоптаты 14 полностью удаленных КА, диагноз которых был установлен на основании характерной для этой опухоли гистоархитектоники;

-в группу 2 – секторальные диагностические биоптаты 16 КА, с наиболее близкими к плоскоклеточному раку патоморфологическими признаками.

-в группу 3 - биоптаты 20 ПКР кожи.

Контролем служили фрагменты здоровой кожи 3 пациентов (в возрасте от 45 до 65 лет), полученные при пластических операциях в отделении челюстно-лицевой хирургии МОНИКИ.

Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии с маркером пролиферации Ki67.

В гистологических препаратах здоровой кожи отмечалось специфическое окрашивание в ядрах клеток базального слоя эпидермиса; количественно оценка Ki67 - позитивных ядер составило 15,33±2,4, что достоверно ниже индекса пролиферации в КА.

Таблица 3.

Количественная оценка экспрессии Ki67 в кератоакантоме и плоскоклеточном раке кожи.

Форма (тип) опухоли	Атипичные КА			Плоскокле- точный рак кожи
	Атипичные КА (1 группа) n=14 М+m(%)	Атипичные КА (2 группа) n=16 М+m(%)	Все КА
Ki67 позитивные клетки (%)	23,83±2,4	26,39±2,01	25,19±1,5	29,04 ±2,4	p>0,05

* - статистически достоверное отличие между группами (p<0,05). М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка средней

Индекс пролиферации в биоптатах КА 1 и 2 групп не имел существенных отличий от ПКР кожи (табл.3), однако в КА Ki67 экспрессировался в клетках базального слоя бородавчато-акантотических разрастаний эпидермиса, а при ПКР кожи зона его экспрессии расширялась, специфически окрашенные ядра клеток выявлялись как по периферии, так и в центральных отделах эпидермальных опухолевых тяжей и комплексов.

В 25 атипичных КА выявлена базальная экспрессия Ki67. В пяти КА определялась диффузная экспрессия Ki67. При анализе этих наблюдений установлено, что это с рецидивные КА, в двух из которых определяются клинические и морфологические признаки трансформации в ПКР кожи

Результаты иммуногистохимического исследования маркера камбиальных полипотентных клеток р63.

В каждом из препаратов здоровой кожи экспрессия р63 была обнаружена в ядрах кератиноцитов, расположенных исключительно в базальном слое эпидермиса, количественно р63-позитивных клеток в гистопрепаратах здоровой кожи составило 54,6±7,4%.

Статистически значимых различий в количестве клеток, экспрессирующих р63 между КА и ПКР обнаружено не было (таблица 4), однако в КА экспрессия р63 была выявлена в ядрах кератиноцитов по периферии бородавчато-акантотических разрастаний эпидермиса, в их базальных отделах, а в ПКР кожи зона экспрессии этого маркера расширялась: он выявлялся в ядрах кератиноцитов, беспорядочно разбросанных по акантотическим выростам и отшнурованным комплексам атипичного эпителия.

Таблица 4.

Экспрессия р63 в кератоакантоме и плоскоклеточном раке кожи..

Форма (тип) опухоли	Атипичные КА			Плоскокле- точный рак кожи
	Атипичные КА (1 группа) n=14 М+m(%)	Атипичные КА (2 группа) n=16 М+m(%)	Все больные КА
р63позитивные клетки	51,36±2,5	54,06±2,7	52,8±1,7	58,65±2,1	p>0,05

* - статистически достоверное отличие между группами (p<0,05). М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка средней

Базальная экспрессия р63 выявлена в 25 атипичных КА аналогично экспрессии пролиферативноклеточного маркера Ki67. В пяти КА определялась диффузная экспрессия р63. При анализе этих наблюдений установлено, что это рецидивные КА, в двух из которых определяются клинические признаки трансформации в ПКР кожи.

Таким образом, установлено что в ПКР кожи, в отличие от КА, р63 выявлялся как по периферии, так и в центральных отделах опухолевых разрастаний эпидермиса, что имеет важное дифференцально-диагностическое значение.

Результаты лечения атипичных кератоакантом реафероном

Лечению реафероном, проводившемуся 24 больным атипичными КА (стойкие у 9, гигантские у 7, центробежные у 2, в форме кожного рога у 2, рецидивные у 2, грибовидная у 1, мультинодулярная у 1) предшествовало изучение их иммунного и интерферонового статуса.

Как видно из табл. 4, у больных атипичными КА было выявлено достоверное снижение количества CD8+ клеток и как следствие этого повышение иммунорегуляторного индекса, была отмечена тенденция к повышению количества CD16+ клеток (натуральных киллеров); у 55,6% больных была обнаружена недостаточность Т-супрессоров/ЦТЛ, обеспечивающих противовирусную и противоопухолевую защиту. В следствие дисбаланса клеток повышение иммунорегуляторного индекса (ИРИ) имело место в 77,8% случаев.

У 66,7% пациентов имелась недостаточность Т-хелперного звена иммунитета, свидетельствующая о снижении общей иммунореактивности организма. У 44,5% больных обнаружено увеличение среди популяций клеток естественных киллеров. Количество CD20+ клеток (В-лимфоцитов) имело тенденцию к уменьшению у 66,4% больных.

При исследовании функциональной активности клеточного звена иммунитета выявлено достоверное снижение количества CD54+ клеток и низкая способность лимфоцитов периферической крови к апоптозу, о чем свидетельствовал низкий уровень экспрессии маркера апоптоза СD95 (FAS-антигена) (табл.5). При индивидуальном анализе готовность к апоптозу отмечалась только у 25% больных, у остальных уровень клеток, несущих маркер CD95, был значительно ниже чем в контрольной группе.

Таблица 5

Субпопуляционный состав лимфоцитов крови у больных атипичными КА.

Исследуемые показатели		Больные атипичными КА M±m (n=24)	Группа контроля M±m (n=25)
CD3	%	69.5 ± 2.5	67.5 ± 4,6	(p>0.05).
CD4	%	38.3 ± 5.3	43,9 ± 3.7	(p>0.05).
CD8	%	18.6 ± 3.1*	28,1 ± 3,6	(p<0.05).
CD4/CD8		2.3 ± 0.2*	1.9 ± 0.1	(p<0.05).
NK (CD16)	%	16.7 ± 2.2	13.9± 1.6	(p>0.05).
CD20	%	8.1 ± 2.8	10.1± 1.5	(p>0.05).
CD95	%	23.9 ± 6.5*	52.0 ± 11.0	(p<0.05).
CD54	%	4.2 ± 1.2*	22.0 ± 8.0	(p<0.05).

* - статистически достоверное отличие от физиологической нормы (p<0,05). М – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка средней

Интерфероновый (ИФН) статус характеризовался низкой продукцией ИФН- и ИФН– лейкоцитами крови in vitro при их адекватной стимуляции, что свидетельствовало об истощении системы ИФН.

Полученные данные явились основанием для назначения больным рекомбинантного препарата ИНФ-2в Реаферона.

В результате лечения уменьшение диаметра опухоли на 50% было отмечено через 1,5-3,5 нед (в среднем через 2,8±0,2 нед) после окончания курса лечения, а в сроки от 3 до 7 нед (в среднем через 5,8±0,2 нед) после лечения наступило выздоровление. Лишь в 1 случае эффект отсутствовал и через 2 мес. больной был проведен второй курс лечения Реафероном, завершившийся через 8 нед выздоровлением. Таким образом, эффект однокурсового лечения Реафероном составил 96%, а с учетом проведения одному пациенту повторного курса лечения-100%.

В 9 случаях на месте бывшей опухоли остался рубец или участок рубцовой атрофии, вполне приемлемые в косметическом отношении; в 13 случаях на месте опухоли остался участок видимо здоровой кожи.

В каждом случае лечение переносилось удовлетворительно. Побочные эффекты были отмеченные в 22 (91,6%) случаях и сводились к возникавшему в первый день лечения подъему температуры тела до 37,2-38,3 С, которая быстро нормализовывалась после приема внутрь 0.5г парацетамола. В 18(75%) случаях отмечалась перифокальная гиперемия, которая проходила через 2 дня после окончания курса лечения и не требовавшая прекращения лечения.

После лечения (табл.6), уровень Т-супрессоров/ЦТЛ имел тенденцию к повышению как по абсолютному, так и по относительному содержанию; за счет снижения количества CD4+ клеток и увеличения количества CD8+ клеток возросло количество больных с нормальным ИРИ. Уровень Т-хелперов после лечения не превышал показатели в группе здоровых доноров. Положительные изменения субпопуляционного состава приводили к нормализации общего количества Т-лифмоцитов. Количество больных с нормальным содержанием Т-клеток возросло за счет уменьшения количества больных с Т-клеточной лимфопенией.

Количество больных с низким и высоким содержанием В-клеток снизилось с 66,7% до 44,5% и с 33,3% до 22,2% соответственно, при этом у 33,4% больных произошла нормализация количества этих клеток.

Эффект реаферона сопровождался тенденцией к нормализации количества NK-клеток (нормальное количество этих клеток до лечения отмечалось в 33,3%, после лечения- в 55,6% случаев).

Таблица 6.

Изменение усредненных показателей субпопуляций лимфоцитов в результате лечения реафероном.

Исследуемые показатели		Больные КА до лечения M±m (n=24)	Больные КА после лечения M±m (n=24)
CD3	%	69.5 ± 2.5	65.2 ± 4.5	(p>0.05).
CD4	%	38.3 ± 5.3	36.3 ± 3.6	(p>0.05).
CD8	%	18.6 ± 3.1	21.2 ± 2.6	(p>0.05).
CD4/CD8		2.3 ± 0.2	1.9 ± 0.2*	(p<0.05).
NK (CD16)	%	16.7 ± 2.2	14.2 ± 2.1	(p>0.05).
CD20	%	8.1 ± 2.8	11.0 ± 3.2	(p>0.05).
CD95	%	23.9 ± 6.5	29.4 ± 7.7*	(p<0.05).
CD54	%	4.2 ± 1.2	14.8 ± 5.6*	(p<0.05).

M – средняя арифметическая; m – стандартная ошибка средней.

* - статистически достоверное отличие от исходного уровня (до лечения) (p<0.05).

После лечения произошло статистически достоверное повышение количество CD95+ клеток (количество больных с их нормальным содержанием увеличилось на 12,5% и составило 37,5% против 25%) и CD54+ клеток, хотя по усредненным показателям содержание их не достигало уровня физиологической нормы.

Повышение до уровня показателей в группе здоровых доноров содержания клеток, экспрессирующих маркер CD54, присутствующий на мембране В-лимфоцитов, поляризованных в сторону Т-клеток, участвующих в процессах индукции, пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов в антителообразующие клетки, также свидетельствовал об активации иммунной системы, в частности об усилении кооперативного взаимодействия Т- и В-лимфоцитов.

При анализе усредненных показателей интерферонового статуса больных атипичными КА, после курса реаферонотерапии, отмечалось увеличение ИФН продуцирующей способности как ИФН, так и ИФН. Уровень же сывороточного ИФН после применения Реаферона сохранялся на том же уровне, что и до лечения и не отличался от уровня сывороточного ИФН в контрольной группе.

Индивидуальный анализ показателей ИФН статуса у больных атипичными КА после курса реаферонотерапии показан на рисунке 4. У пациентов, показатели ИФН которых после лечения не достигли показателей группы контроля, отмечалась тенденция к их увеличению по сравнению с показателями до лечения.

Рис 4. Степень изменения показателей ИФН больных атипичными КА после лечения.

Уровень продукции ИФН после лечения Реафероном согласно данным индивидуального анализа представлен на рисунке 5. Количество больных с низкой продуцирующей способностью ИФН после лечения уменьшилось на 27,8%.

Рис. 5. Степень изменения показателей ИФН больных атипичными КА после лечения.

Отдаленные результаты лечения внутриочаговыми инъекциями реаферона, прослеженные у 22 пациентов в сроки от 1 года до 4 лет (в среднем 3,4 года), свидетельствовали об отсутствии рецидивов, в связи с чем мы считаем, что препараты ИФН2 в виде предложен­ной нами методики монотерапии высокоэффективны и могут быть успешно использованы в лечении атипичных КА. Методика показана при любых формах и лока­лизациях опухоли и практически не имеет проти­вопоказаний. Преимуществом метода является возможность его использования в амбулаторной практике.

Таким образом, учитывая патогенетическую обоснованность применения в терапии КА Реаферона по 1 млн МЕ 1 раз в сутки ежедневно (на курс №10) методом внутриочаговых иньекций препарата и выраженную клиническую эффективность предлагаемого метода лечения, его можно считать одним из наиболее рациональных подходов к лечению атипичных кератоакантом и применять в качестве метода выбора при амбулаторном лечении атипичных КА.

ВЫВОДЫ

1. Среди 44 случаев атипичной КА доля стойких составила - 12(27,3%), гигантских - 17(38,6%), центробежных - 2(4,6%), мультинодулярных - 2(4,6%), грибовидных - 1(2,3%), в форме кожного рога - 4(9,1%), рецидивных - 6(13,6%). Трансформация атипичных КА в плоскоклеточный рак произошла в 5(11,6%) случаях на сроке от 2,5 до 4 месяцев, в среднем через 3,3+0,2 мес.

2. В результате сравнительной полуколичественной оценки ряда информативных гистологических и цитологических признаков, проведенной в 44 случаях атипичных КА и 20 случаях ПКР кожи установлена их недостаточная чувствительность для проведения дифференциального диагноза. Клеточный полиморфизм определялся в КА и ПКР кожи в 77,3% и 95% случаев соответственно; атипия ядер определяется в КА и ПКР кожи в 79,5% и 95% случаев соответственно; патологические митозы определялись в КА и ПКР кожи в 40,9% и 70% случаев соответственно, частота патологических митозов 30% и выше отмечена в 40% случаев ПКР и в 11,3% случаев КА; формирование и распад роговых жемчужин встречались в 77,3% и 20,5% атипичных КА, в ПКР - в 80% и в 70% случаев соответственно; инвазивный рост акантотических тяжей эпидермиса определялся в 84,1% случаев атипичных КА.

3. КА и ПКР кожи не имеют статистически значимых различий по индексу экспрессии Ki67 и доле (проценту) опухолевых клеток, экспрессирующих р63, однако достоверно отличаются по локализации меченых клеток в опухолевых тяжах и комплексах: базальной в КА, и диффузной - в ПКР.

4. Разработан высокоэффективный метод лечения атипичных КА, основанный на внутриочаговом введении препарата рекомбинантного ИФН2b Реаферона. Его клиническая эффективность доказана в 100% случаев. Патогенетическим обоснованием эффективности лечения является нормализация после лечения эффекторных звеньев иммунитета (фагоцитоза, цитотоксичности, NK-клеток), повышение способности субпопуляций лимфоцитовпериферической крови к апоптозу и увеличение ИФН и ИФН – продуцирующей способности лейкоцитов крови. Рецидивы после реаферонотерапии в сроки от 2 до 5 лет (в среднем 3+0,4 года) отсутствуют (после деструирующих методов рецидивы отмечены в 27,3% случаев).

Практические рекомендации:

Разработанный нами метод внутритканевой терапии атипичных КА является высокоэффективным и доступным в ценовом отношении, рекомендуется для применения в клинической и амбулаторной практике врачей дерматологов и онкологов.

Разработанный нами метод дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи, основанный на применении иммуногистохимических маркеров: регуляторного протеина р63 и маркера пролиферации Ki67 позволяет:

- своевременно установить диагноз трансформации в плоскоклеточный рак у больных атипичными КА, клинически еще не имеющих достоверных признаков малигнизации;

-верифицировать КА в случаях, гистологически расцененных как ПКР, что позволяет избежать лучевой терапии и неадекватных травматических операций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Молочков В.А., Кунцевич Ж.С. К иммунотерапии и профилактике озлокачествления атипичных кератоакантом //Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2002.- №3.- С.4-8.

2.Молочков В.А. Кунцевич Ж.С. "Иммунотропные препараты в терапии атипичных кератоакантом" //Хронические дерматозы. Вопросы патогенеза, биохимической и иммунологической адаптации, терапии, профилактики.- Рязань, 2002.-С.70-71.

3.Кунцевич Ж.С.. Синдром Мюир-Торре //Материалы научно практической конференции "Актуальные проблемы дерматоонкологии. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога" 26-27 ноября 2002.-М., 2003.-С.65.

4.Молочков В.А., Кунцевич Ж.С. Лечение атиптичных кератоакантом Реафероном//Материалы научно практической конференции "Актуальные проблемы урогенетальных инфекций, передаваемых половым путем. Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога" 27-28 ноября 2003.-М., 2003.-С.82.

5.Кунцевич Ж.С. Случай развития кератоакантомы на фоне красного плоского лишая//Российский журнал кожных и венерических болезней 2003.- №4.-С.11-14.

6.Молочков В.А. Кунцевич Ж.С. Меланома, симулирующая кератоакантому. //Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2003.- №4.- С.4-7.

7.Молочков В.А. Кунцевич Ж.С. Выбор тактики и лечения атипичных кератоакантом /Тезисы научных работ первого Российского конгресса дерматовенерологов 1- й том.- 2003.-С.155.

8.Молочков В.А., Казанцева И.А. Кунцевич Ж.С., Бочкарева Е.В. Кератоакантома. Клиника, диагностика, лечение, трансформация в рак «Бином».- Москва.-2006.- 176с.

9.Кунцевич Ж.С. Бочкарева Е.В. Интерферон 2b в лечении атипичных кератоакантом. //Альманах клинической медицины.- ХV.-М:-МОНИКИ.-2007.-С.205-208.

10.Кладова А.Ю., Куевда Д.А., Молочков В.А., Кунцевич Ж.С., Прокофьев А.А., Багапш Л.С. К ассоциации кератоакантом с вирусом папилломы человека. // Альманах клинической медицины.-ХV..-М:-МОНИКИ -2007.-С.187-191.

11. Хлебникова А.Н. Бочкарёва Е.В. Кунцевич Ж.С. Ароматические ретиноиды в лечении атипичных кератоаконтом //Альманах клинической медицины. -ХV.-М:-МОНИКИ.-2007.-С.290-292.