Анализ закономерностей экспрессии генов, ассоциированной с прогрессией гепатокарцином
На правах рукописи
ШАВОЧКИНА ДАРЬЯ АНДРЕЕВНА
Анализ закономерностей экспрессии генов,
ассоциированной с прогрессией гепатокарцином
Специальность 14.01.12 – онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва
2010
Работа выполнена в Лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза Учреждения Российской академии медицинских наук Российский oнкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (директор – академик РАН и РАМН, д.м.н., проф. М.И.Давыдов)
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, Наталия Леонидовна Лазаревич
профессор
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук Марианна Геннадьевна Якубовская
Доктор биологических наук Лариса Евсеевна Гуревич
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, МГУ им. М. В. Ломоносова
Защита диссертации состоится «___» _______ 2010 года в ___ часов
на заседании диссертационного совета (Д.001.017.01) РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.
С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке
РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН
Автореферат разослан «___» _________ 2010 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.м.н., профессор Ю.В. Шишкин
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Регуляция жизнедеятельности клеток в многоклеточном организме осуществляется при участии огромного количества комплексных сигнальных путей, которые контролируют изменение транскрипции определенных групп генов. Закономерности регуляции экспрессии генов в процессе канцерогенеза, и при гепатоканцерогенезе в частности, изучены недостаточно полно и представляют интерес для современной экспериментальной онкологии, поскольку в будущем могут привести к идентификации новых опухолевых маркеров и мишеней для направленной терапии.
Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) - одна из наиболее распространенных форм опухолей, возникающая из основных клеток печени, гепатоцитов. Факторами риска, способствующими развитию этого заболевания, являются хронические вирусные инфекции (вирусы гепатита В и С), цирроз печени, хронические алкогольные отравления, воздействие химических гепатоканцерогенов. Исследование генетических нарушений, а также изучение изменений характера экспрессии генов позволили выявить ряд факторов, вовлеченных в процесс формирования ГК. Гепатоканцерогенез представляет собой многостадийный процесс, сопровождающийся постепенным снижением уровня дифференцировки клеток, увеличением скорости пролиферации, утратой эпителиальной морфологии и приобретением способности к метастазированию. Процесс опухолевой прогрессии связан с генетическими нарушениями, ведущими к изменению экспрессии генов, кодирующих опухолевые супрессоры, онкогены, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов. В то же время, механизмы развития злокачественного фенотипа эпителиальных опухолей во многом определяются свойствами исходной ткани, давшей начало опухоли.
Для исследования механизмов гепатоканцерогенеза в лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей ранее было проведено крупномасштабное исследование транскрипционных нарушений при прогрессии ГК мыши, в ходе которого были выявлены гены, уровни экспрессии которых значительно отличались в опухолях и в нормальной печени. Было идентифицировано более 20 генов, кодирующих потенциальные опухолевые маркеры (экспрессия этих генов повышена в гепатокарциномах по сравнению с нормальной печенью) и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в дедифференцированных ГК по сравнению с медленнорастущими дифференцированными опухолями.
Согласно исследованиям, проведенным в нашей лаборатории, прогрессия гепатокарцином связана с нарушениями функции гепатоспецифических транскрипционных факторов (ГЯФ, HNF), определяющих экспрессию большинства функциональных генов печени. Ключевым регулятором дифференцировки гепатоцитов является гепатоспецифический транскрипционный фактор 4, HNF4. Транскрипция гена HNF4 осуществляется с двух независимых промоторов Р1 и Р2, в результате чего образуются две группы изоформ HNF4Р1 и HNF4Р2. Изоформы группы HNF4Р2 экспрессируются в эмбриональной печени и регулируют активность ранних генов, таких как альфа-фетопротеин (АФП), и в норме не выявляются после рождения, их замещают изоформы группы HNF4Р1, которые предпочтительно активируют экспрессию генов дифференцировочных маркеров печени. В то же время экспрессия HNF4Р2 изоформ может возобновляться на ранних этапах гепатоканцерогенеза и свидетельствовать о начальных этапах процесса дедифференцировки [Lazarevich et al., 2004]. Кроме того, по данным многих авторов, существенное влияние на дифференцировочный статус гепатоцитов оказывает их взаимодействие с внеклеточным матриксом и межклеточные взаимодействия. Сведения о ключевых механизмах гепатоканцерогенеза ограничены, а закономерности тканеспецифической регуляции экспрессии генов, вовлеченных в этот процесс, по-прежнему остаются недостаточно изученными.
Настоящая работа посвящена поиску наиболее общих закономерностей экспрессии генов тканеспецифических транскрипционных факторов, генов, ассоциированных с дифференцировкой и поддержанием эпителиального фенотипа, регуляцией клеточной пролиферации и апоптоза при прогрессии гепатокарцином мыши и человека. Мы использовали три различные модельные системы, комплексный анализ которых позволил выявить несколько групп генов и установить некоторые закономерности изменения уровней транскрипции, сопровождающие различные стадии гепатоканцерогенеза.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлся анализ изменения экспрессии генов, кодирующих ГЯФ, маркеры дифференцировки и генов, гиперэкспрессированных в других типах опухолей, на различных этапах гепатоканцерогенеза мыши, и верификация наиболее значимых закономерностей на коллекции архивных образцов ГК человека. Для достижения поставленной цели нами были выдвинуты следующие задачи:
- Инициировать гепатоканцерогенез в клетках печени мышей внутрибрюшинной инъекцией диэтилнитрозамина (0.1 г/кг веса), провести гистологическую характеристику образцов печени и ГК на разных сроках после введения канцерогена.
- Провести анализ экспрессии генов, вовлеченных в процесс гепатоканцерогенеза, в панели образцов печени и ГК мыши на разных сроках после индукции диэтилнитрозамином.
- На модели низкодифференцированной культуры ГК мыши выяснить, какие из выявленных изменений в паттерне экспрессии генов могут быть опосредованы нарушением взаимодействия клеток с компонентами внеклеточного матрикса.
- Провести гистологическое описание образцов ГК человека, полученных при резекции опухолей у пациентов РОНЦ.
- Разработать методику иммуногистохимического окрашивания послеоперационных срезов ГК антителами к одному из ключевых регуляторов дифференцировки гепатоцитов HNF4. Сравнить уровни синтеза и внутриклеточную локализацию двух групп изоформ HNF4 и исследовать возможную связь этих признаков с отдаленными результатами хирургического лечения пациентов с ГК.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
Научная новизна темы определяется исследованием закономерностей транскрипции целого ряда генов, возможная роль которых в возникновении и прогрессии опухолей печени ранее не изучалась. На различных этапах гепатоканцерогенеза мышей, индуцированного внутрибрюшинным введением канцерогена диэтилнитрозамина, проведен анализ экспрессии 38 генов, продукты которых участвуют в процессах дедифференцировки, эпителиально-мезенхимального перехода, регуляции скорости пролиферации клеток при прогрессии опухолей, а также генов, гиперэкспрессия которых ранее была описана для других типов опухолей. В эту группу попали гены, кодирующие гепатоцитарные ядерные факторы и маркеры дифференцировки, факторы роста семейства TGF (Transforming Growth Factors, Трансформирующий Фактор Роста), рецептор TGF типа (бетагликан), циклин G1, EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, Рецептор Эпидермального Фактора Роста), гены, продукты которых участвуют в передаче сигнала по TGF-зависимому сигнальному пути и являются малоизученными транскрипционными факторами: TSC22 (TGF -Stimulated Clone 22, TGF –стимулированный клон 22), TGIF (5’TG3’ interacting factor - 5’TG3’ взаимодействующий фактор), Tbi68 (TGF inducible protein 68 kDa, TGF индуцируемый белок 68 кДа).
Отдельное внимание уделено генам, изменение экспрессии которых ассоциировано с нарушением эпителиальной морфологии гепатоцитов: гену snail, кодирующему репрессор транскрипции гена Е-кадхерина, гену виментина, экспрессия которого является отличительной чертой мезенхимальных клеток, а также генам 3 субъединицы интегрина, модулирующей взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом, и фибронектина, являющегося его основным компонентом. Анализ закономерностей экспрессии генов был проведен с использованием модельной системы, включающей образцы, полученные после индукции гепатоканцерогенеза у мышей инъекцией диэтилнитрозамина, на разных этапах формирования опухоли. Одним из ранних событий при химически индуцированном канцерогенезе у мышей оказалась активация эмбриональной группы изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4 - HNF4P2. Мы установили, что на начальных этапах химически индуцированного гепатоканцерогенеза у мышей происходит активация экспрессии генов факторов семейства TGF, кроме того, в исследованных образцах печени и ГК мы выявили гиперэкспрессию некоторых TGF-зависимых генов (TSC22, Tbi68, TGIF, остеопонтин). По результатам проведенной работы ген аспарагинсинтетазы (ASNS) охарактеризован как наиболее перспективный маркер гепатоканцерогенеза.
При исследовании спектра экспрессируемых генов в клоне низкодифференцированной культуры Н33 при взаимодействии клеток со внеклеточным матриксом мы установили, что наиболее значимым событием стало подавление экспрессии гена TGF2 при культивировании клеток в трехмерном коллагеновом геле. Исследования, проводимые на различных модельных системах, показывают, что изменение активности TGF сигнального пути является частым событием при гепатоканцерогенезе. Практически все предшествовавшие исследования роли цитокинов семейства TGF в гепатоканцерогенезе сводились к изучению биологических эффектов TGF1. В представленной работе впервые показано, что снижение экспрессии гена TGF2 при культивировании клеток в трехмерном коллагеновом матриксе является признаком частичной нормализации фенотипа опухолевых клеток.
В настоящем исследовании разработан метод иммуногистохимического окрашивания, позволяющий дифференциально выявлять локализацию двух групп изоформ HNF4 на послеоперационных срезах опухолей печени человека. Мы показали, что подавление транскрипции группы изоформ HNF4Р1 и активация экспрессии группы эмбриональной сплайс-формы HNF4Р2 маркируют различные стадии гепатоканцерогенеза.
Изучение взаимосвязи паттерна экспрессируемых генов с уровнем дифференцировки опухоли представляет интерес для фундаментальной науки. Необходимо отметить, что работ по исследованию уровней синтеза и локализации белковых продуктов изоформ транскрипционного фактора HNF4 в клетках гепатокарцином человека раннее не проводилось. В контексте накопленных за последнее время данных о ключевой роли транскрипционного фактора HNF4 в процессах дифференцировки гепатоцитов, представляется чрезвычайно актуальным исследование закономерностей экспрессии групп его изоформ при таком распространенном заболевании, как ГК. Выявление потенциальных маркеров отдельных этапов гепатоканцерогенеза и прогрессии ГК является важным этапом в исследовании механизмов опухолевой прогрессии и открывает возможности для разработки новых методов диагностики и прогнозирования течения ГК.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 29 сентября 2009 года на совместной научной конференции лабораторий механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, иммунохимии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов канцерогенеза и молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Материалы работы докладывались на международной школе-конференции для молодых ученых «Ядерные рецепторы и механизмы передачи внутриклеточных сигналов» (Греция, 2007), конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» в 2008 г. (Санкт-Петербург), на 19 Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2009).
По результатам диссертационной работы опубликовано 2 научных статьи и 11 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 14 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», «Список использованной литературы». Список литературы содержит 215 источников, в том числе 15 в отечественных рецензируемых изданиях.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Целью данной работы было выявить новые закономерности экспрессии генов, маркирующие различные этапы опухолевой трансформации клеток печени.
Была проведена индукция гепатоканцерогенеза у мышей внутрибрюшинным введением канцерогена - диэтилнитрозамином (ДЭНА). Мы проводили гистоморфологическое исследование образцов печени, а также определяли изменения паттерна экспрессируемых генов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
На следующем этапе работы перед нами стояла задача выяснить, как изменится спектр экспрессии наиболее значимых генов, выявленных в предшествующей части работы, при взаимодействии клеток с компонентами внеклеточного матрикса (ВКМ). Для этого в качестве объекта исследования мы использовали клон Е12 низкодифференцированной культуры гепатокарциномы мыши Н33, которая ранее была получена из быстро растущей ГК при исследовании модели одноступенчатой прогрессии. Клетки клона Е12 культивировали в двухмерном и трехмерном коллагеновом геле. Анализ изменения спектра экспрессии генов проводили методом ОТ-ПЦР.
Заключительным этапом исследования стали эксперименты по разработке метода дифференциального иммуногистохимического выявления двух групп изоформ одного из ключевых регуляторов дифференцировки гепатоцитов – транскрипционного фактора HNF4 на послеоперационных парафиновых срезах опухолей печени человека, а также анализ взаимосвязи уровней синтеза и локализации изоформ HNF4P1 и HNF4P2 в ГК человека с уровнем дифференцировки опухолевых клеток.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ закономерностей экспрессии генов при химически индуцированном гепатоканцерогенезе у мышей.
В качестве экспериментальной системы для исследования закономерностей экспрессии генов, вовлеченных в прогрессию гепатокарцином, нами была выбрана модель химически индуцированного гепатоканцерогенеза мышей. Мышам линии BDF (гибрид линий C57B1 и DBA) внутрибрюшинно вводили генотоксический канцероген диэтилнитрозамин (ДЭНА) в физиологическом растворе (0.1 г/кг веса животного). По прошествии 3, 6 дней или 2.5 месяцев проводили забор тканей печени, подвергшейся действию ДЭНА, а по прошествии 6-11 месяцев проводили забор сформировавшихся опухолей.
- Гистологический анализ
Был проведен гистологический анализ образцов тканей печени и химически-индуцированных ГК. Поскольку нас интересовала взаимосвязь между степенью сохранения дифференцировки клеток и паттерном экспрессируемых генов, был проведен гистоморфологический анализ.
Уровень дифференцировки и степень сохранения морфологии клеток печени определяли исходя из следующих критериев: степень сохранения в печени балочной структуры; сохранение эпителиального фенотипа; размер и плоидность клеток; пролиферативный статус клеток печени; наличие очагов некрозов; врастание в опухоль тяжей соединительной ткани. Всего было исследовано 85 образцов печени мышей: образцы, полученные на разных временных промежутках после индукции ДЭНА (3, 6 суток, 2.5 месяца), ДЭНА-индуцированные ГК (полученные по прошествии 6-11 месяцев после индукции), спонтанные ГК, развившиеся у нескольких животных в контрольной группе мышей (11-14 месяцев). В работе представлены как гистологическая характеристика, так и типичные результаты исследования методом ОТ-ПЦР 6 образцов тканей печени мыши по прошествии 3, 6 дней и 2.5 месяцев после индукции ДЭНА, 5 ДЭНА-индуцированных ГК и 4 спонтанных ГК, развившихся в контрольной группе мышей. Характерная морфология исследованных образцов приведена на рисунке 1.
Рисунок 1. Типичная гистология исследованных образцов тканей печени мыши. 1 - нормальная печень мыши; 2, 3, 4 – печень мышей спустя 3, 6 суток и 2,5 мес. после действия ДЭНА, соответственно; 5 - ДЭНА-индуцированная ГК, 6 – спонтанно возникшая ГК. Стрелками отмечены полиплоидная клетка (2) и митоз (4). Окраска гематоксилин-эозин (1*200).
При исследовании гистологических препаратов тканей мыши было установлено, что на 3 сутки после введения канцерогена в структуре печени обнаруживаются изменения, выражающиеся в дистрофии цитоплазмы гепатоцитов и гипертрофии отдельных клеток, в то время как на 6 сутки после инъекции сохраняются признаки повреждения части клеток печени. На гистологических препаратах тканей печени регулярно встречаются клетки, погибшие в митозе (плотная темно-окрашенная цитоплазма, конденсация хроматина митотических ядер). Картина, наблюдаемая на гистологических препаратах на 3 и 6 сутки после индукции канцерогеном, соответствует типичной картине токсической гепатопатии. Через 2.5 месяца после инъекции ДЭНА в печени структура долек местами нарушена, выявляются признаки жировой дистрофии, признаки повреждения отдельных ядер гепатоцитов, деструкции цитоплазмы некоторых гепатоцитов, признаки регенерации на периферии долек.
Гистологическому анализу были подвергнуты и образцы первичных гепатокарцином мыши, полученные по прошествии 6-11 месяцев после индукции ДЭНА, а также гепатокарцином, спонтанно возникших у нескольких взрослых мышей, не подвергавшихся воздействию ДЭНА, по прошествии 11-14 месяцев. Исходя из критериев оценки уровня дифференцировки клеток, из 11 проанализированных случаев ГК, развившихся у ДЭНА-индуцированных мышей, 7 были охарактеризованы как высокодифференцированные ГК, 3 - как умеренно дифференцированные ГК и одна опухоль имела смешанное строение – гепатохолангиокарцинома, метастазирующая в легкие. Из 5 ГК, спонтанно развившихся у контрольной группы мышей, 3 были охарактеризованы как высокодифференцированные ГК, 2 - как умереннодифференцированные.
- Анализ экспрессии генов в исследуемых тканях печени мыши
методом ОТ-ПЦР
Следующим этапом работы стало исследование уровней транскрипции генов, экспрессирующихся в панели исследуемых образцов тканей печени мыши. Для этого из образцов печени и ГК была выделена суммарная клеточная РНК, которая была подвергнута реакции обратной транскрипции (ОТ-реакция) с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Для проведения ПЦР использовали разработанные ранее специфические праймеры к кДНК исследуемых генов. Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле. Полученные данные подтверждали повторной ПЦР реакцией с независимо ревертированных кДНК. В качестве контроля нормального уровня экспрессии генов в печени мыши использовали РНК из нормальной печени мыши линии BDF. В реакцию обратной транскрипции брали равное количество РНК каждого образца; для полного подтверждения равенства количества РНК, взятой в реакцию, проводили дополнительное выравнивание по результатам ПЦР с праймерами к гену GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы), который равномерно экспрессируется во всех клетках. Результаты ОТ-ПЦР анализа представлены на рисунках 2-4. Экспрессия генов была исследована в образцах печени мышей, которые относились к трем различным группам: 1) печень мышей, подвергшаяся действию ДЭНА, через разные промежутки времени (3, 6 суток, 2.5 месяца) после индукции канцерогеном; 2) ткань химически индуцированных ГК, полученных по прошествии 6-11 мес. после индукции; 3) спонтанные ГК.
Мы исследовали спектры экспрессии печень-специфических генов: альбумина, онко-эмбрионального маркера АФП, FTF, транстиретина и основных ГЯФ (HNF1, ; FOXA1, 2, 3;HNF4, C/EBP, ; HNF6, OC2).
Тот факт, что экспрессия альбумина, основного маркера зрелых гепатоцитов, наблюдалась во всех исследованных образцах тканей печени, подтверждает, что все образцы, в том числе опухоли, развившиеся в контрольной группе животных, имеют гепатоцитарное происхождение, а также свидетельствует о четком соответствии результатов гистологических и молекулярных методов оценки уровня дифференцировки исследуемых тканей. Во всех исследованных образцах, кроме нормальной печени и одной из индуцированных ГК, экспрессировался ген АФП, который является маркером механического или химического повреждения печени и гепатоканцерогенеза [Abelev and Eraiser, 1999]. Индукция экспрессии гена АФП наблюдается уже на 3 день после индукции ДЭНА. Основными транс-активаторами экспрессии этого гена являются факторы FTF и HNF1 [Spear, 1999], однако значительных изменений уровней их транскрипции в соответствующих образцах мы не обнаружили.
Уровень экспрессии большинства генов гепатоспецифических белков и ГЯФ в индуцированных образцах и нормальной печени мышей был сходным: HNF1,; FOXA2, OC2, HNF6, C/EBP (за исключением печени одного из животных на 3 сутки после индукции, где наблюдали небольшое увеличение экспрессии, и одной из спонтанных ГК, где экспрессия этого гена отсутствовала), FTF и транстиретина. Мы наблюдали активацию транскрипции гена C/EBP, которая сохранялась на протяжении 2.5 месяцев после и была зарегистрирована в 1 индуцированной и 2 спонтанных ГК.
Рисунок 2. Экспрессия печень-специфических генов (А) и генов, экспрессия которых ассоциирована с поддержанием эпителиального фенотипа (Б), при химически индуцированном гепатоканцерогенезе мышей. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам в агарозном геле. Образцы нормальной печени взрослой мыши (п.), через 3 суток (1, 2), 6 суток (3, 4), 2.5 мес. (5, 6) после действия канцерогена, индуцированных (оп1 - оп5) и спонтанных (сп1 - сп4) ГК.
Мы наблюдали активацию транскрипции гена C/EBP, которая сохранялась на протяжении 2.5 месяцев после и была зарегистрирована в 1 индуцированной и 2 спонтанных ГК. С/ЕВP и - коэкспрессируются в печени и могут формировать при связывании с ДНК как гомо-, так и гетеродимеры. В отсутствие С/ЕВP повышается пролиферация гепатоцитов. Соотношение уровней факторов С/EBP и C/EBP в гепатоцитах отражает пролиферативный статус клетки [Costa et al., 2003; Hayashi et al., 1999]. Возможно, активация экспрессии этого гена на 3 сутки после индукции связана с быстрой пролиферацией клеток печени при регенерации, в то же время экспрессия этого гена в ГК, по-видимому, говорит об увеличении скорости пролиферации клеток в уже сформировавшихся опухолях.
Повышение уровня экспрессии генов FOXA1 и 3 по сравнению с нормальной печенью мыши было выявлено как в индуцированной печени, так и в ДЭНА-индуцированных и спонтанных ГК. Транскрипционные факторы семейства FOXA способны регулировать экспрессию различных генов, экспрессирующихся в эмбриогенезе, например АФП. Возможно, что увеличение экспрессии генов транскрипционных факторов FOXA1 и 3 связано с активацией транскрипции гена АФП.
Мы исследовали экспрессию транскрипционного фактора HNF4, являющегося ключевым регулятором дифференцировки клеток печени. Ранее на модели одноступенчатой прогрессии гепатокарциномы мыши было показано, что ускорение пролиферации и дедифференцировка этого типа опухолей сопровождаются нарушением транскрипции гена HNF4, а его экзогенная экспрессия приводит к частичной реверсии злокачественного фенотипа [Lazarevich et. al, 2004]. В настоящем исследовании мы показали, что во всех исследованных образцах ткани печени мышей ген HNF4 экспрессируется на том же уровне, что и в нормальной печени. Это подтверждает данные гистоморфологического исследования о высоком уровне дифференцировки клеток исследованных тканей.
В настоящее время описано девять изоформ HNF4. Транскрипция гена HNF4 на разных этапах онтогенеза и в различных тканях может осуществляться с двух альтернативных промоторов - Р1 и Р2. Для зрелых гепатоцитов характерна экспрессия изоформ 1-6 с промотора Р1 (далее - HNF4Р1), в то время как в эмбриональной печени транскрипция осуществляется преимущественно с Р2 промотора (7-9 изоформы, далее - HNF4Р2). На 3 сутки после введения канцерогена в индуцированной печени мышей была выявлена экспрессия эмбриональной группы изоформ HNF4P2, которая не регистрировалась ни на 6 сутки, ни через 2.5 месяца, но была обнаружена почти во всех индуцированных и спонтанных ГК, развившихся в контрольной группе мышей. Активация экспрессии HNF4P2 изоформ на 3 сутки после индукции может свидетельствовать о повреждении структуры печени при действии канцерогена, а появление этой группы изоформ в индуцированных и спонтанных ГК, вероятно, указывает на начавшуюся дедифференцировку клеток и тенденцию к развитию эмбрионального, менее дифференцированного печеночного фенотипа, поскольку принято считать, что изоформы HNF4Р2 являются эмбриональным вариантом HNF4 и предпочтительно активируют маркеры незрелых гепатоцитов [Torres-Padilla et al, 2001], например, ген АФП.
Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – процесс, заключающийся в утрате эпителиальной морфологии и в переходе к мезенхимальному фенотипу, является одним из важнейших этапов прогрессии опухолей. Перед нами стояла задача выяснить, экспрессия каких генов, ассоциирована с изменением клеточной морфологии, нарушается при действии химических канцерогенов (Рис. 2Б). В исследованных образцах печени мыши, подвергшихся действию ДЭНА, а также в спонтанных и индуцированных ГК, мы наблюдали тенденцию к сохранению экспрессии генов, кодирующих компоненты межклеточных контактов (Е-кадхерин, коннексин 32), при одновременной активации транскрипции генов мезенхимальных маркеров Snail (транскрипционный репрессор Е-кадхерина), виментина и 3 субъединицы интегрина. Эти результаты позволяют говорить о том, что, по всей видимости, в клетках печени, подвергшейся воздействию ДЭНА, а также индуцированных и спонтанных ГК, активировались процессы, приводящие к изменению морфологии клеток печени, при сохранении большинством клеток основных эпителиальных свойств. Вероятно, изменение активности рассмотренных генов не является абсолютно необходимым условием для дедифференцировки, а индукция ЭМП может осуществляться разными путями.
Исследования, проведенные на различных модельных системах, указывают на то, что нарушение TGF сигнального пути является частым событием при гепатоканцерогенезе. Факторы роста семейства TGF участвуют в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза в клетках печени [Yungling et al., 2004]. Показано, что высокий уровень TGF в плазме крови пациентов с ГК является неблагоприятным прогностическим признаком [Tsai et al., 1997; Kim et al., 2000].
Мы исследовали экспрессию генов, кодирующих факторы роста семейства TGF (1, 2, 3), их рецепторы, а также транскрипционные факторы (TSC22, TGIF) и другие белки (Tbi68), участвующие в передаче сигнала по TGF-сигнальному пути (Рис. 3).
Рисунок 3. Экспрессия генов, продукты которых участвуют в передаче сигнала по TGF сигнальному пути, при химически индуцированном гепатоканцерогенезе мышей. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам в агарозном геле. Образцы нормальной печени взрослой мыши (п.), через 3 суток (1, 2), 6 суток (3, 4), 2.5 мес. (5, 6) после действия канцерогена, индуцированных (оп1 - оп5) и спонтанных (сп1 - сп4) ГК.
В образцах печени мышей, подвергшихся действию ДЭНА, а также в спонтанных и индуцированных ГК, нами выявлено значительное повышение экспрессии генов TGF1, -2 и (в меньшей степени) -3 по сравнению с нормальной печенью. Повышенный уровень экспрессии этих факторов, а также активация транскрипции гена бетагликана, являющегося рецептором ІІІ типа для трансформирующих факторов роста, способствуют приобретению клеткой независимости от внешних ростовых сигналов, и, возможно, приводит к нарушению эпителиальной морфологии [Buendia, 2000; Miller et al., 2002]. Существенных изменений в экспрессии генов, кодирующих другие рецепторы TGF, по сравнению с нормальной печенью мыши, в печени, подвергшейся воздействию канцерогена, и исследованных ГК выявлено не было. Одновременно в исследованных образцах печени мы наблюдали активацию генов, кодирующих транскрипционные факторы и другие белки, участвующие в передаче сигнала по TGF сигнальному пути (TGIF, TSC22, Tbi68). Таким образом, уже на начальных этапах канцерогенеза происходит активация транскрипции генов, способствующих клеточной пролиферации.
Рисунок 4. Экспрессия генов, изменение транскрипции которых ассоциировано с канцерогенезом. Фотография электрофореза продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам в агарозном геле. Образцы нормальной печени взрослой мыши (п.), через 3 суток (1, 2), 6 суток (3, 4), 2.5 мес. (5, 6) после действия канцерогена, индуцированных (оп1-оп5) и спонтанных (сп1-сп4) ГК.
Ранее при исследовании изменений уровней экспрессии генов в ходе одноступенчатой прогрессии ГК мыши [Lazarevich et al., 2004] методом гибридизации с кДНК микрочипами был идентифицирован ряд генов, нарушение экспрессии которых наиболее четко отражает развитие злокачественного фенотипа ГК в этой системе. К настоящему моменту установлено, что большая часть этих генов гиперэкспрессируется и в других типах опухолей. В этой работе были исследованы уровни экспрессии следующих генов: остеопонтина, аннексина 2, кавеолина 1, циклина G1, аспарагинсинтетазы (ASNS), цитохезина 1, Axl (рецепторная тирозинкиназа), SLPI (Секреторный лейкоцитарный ингибитор протеаз) (Рис. 4).
Воздействие канцерогена вызвало активацию экспрессии генов остеопонтина, SLPI, кавеолина 1, Axl, цитохезина 1, аннексина 2, циклина G1, которая сохранялась на протяжении 2.5 месяцев. Известно, что ген остеопонтина гиперэкспрессируется в метастазирующих опухолях, экспрессия генов SLPI и Axl повышена в инвазивных и быстро пролиферирующих карциномах. Таким образом, можно предположить, что коэкспрессия этих генов связана с увеличением скорости пролиферации клеток печени в процессе регенерации после действия ДЭНА. Увеличение уровней транскрипции генов SLPI и Axl, наблюдаемое в ДЭНА-индуцированных и спонтанных ГК, вероятно, свидетельствует об увеличении скорости пролиферации уже трансформированных опухолевых клеток.
Гены аннексина 2, цитохезина 1 и циклина G1 также начинают экспрессироваться с 3 дня после индукции ДЭНА, однако их транскрипция была зарегистрирована не во всех индуцированных и спонтанных ГК. Аннексин 2 является Са2+-связывающим белком, цитохезин 1, являясь членом семейства малых ГТФаз участвует в ГТФ-ГДФ обмене, оба белка вовлечены в передачу ряда внутриклеточных сигналов. Циклин G1 относится к группе циклинов, связанных с Src киназой, и является мишенью р53. Гиперэкспрессия циклина G1 может способствовать пролиферации клеток при формировании опухолей. Одновременная активация экспрессии этих генов после индукции ДЭНА, вероятно, может приводить к тому, что клетки приобретают способность модулировать сигнальные пути, что на ранних сроках после индукции ДЭНА способствует регенерации клеток печени, а в индуцированных и спонтанных ГК приводит к увеличению скорости пролиферации клеток опухоли.
В образцах печени мышей, подвергшихся действию ДЭНА, нами выявлена индукция экспрессии активированной изоформы EGFR, содержащей тирозинкиназный домен - EGFR-TK, которая не характерна для нормальных гепатоцитов, в отличие от неактивированной формы EGFR, транскрибирующейся и в нормальных дифференцированных гепатоцитах. Индукция транскрипции изоформы EGFR-TK как по прошествии 3, 6 суток и 2.5 месяцев после воздействия канцерогена, так и в ДЭНА-индуцированных и спонтанных ГК может свидетельствовать об активации рецептора EGFR и индуцируемых им сигнальных путей, что может вносить вклад в увеличение скорости пролиферации гепатоцитов при регенерации клеток печени или роста опухолей на более поздних стадиях гепатоканцерогенеза.
Среди исследованных генов особо стоит отметить ген ASNS. Его транскрипция не регистрировалась в нормальной печени и в образцах печеночной ткани после индукции ДЭНА, однако выявлялась в химически индуцированных ГК и одной спонтанной ГК. Гиперэкспрессия гена ASNS описана при опухолях яичника и лимфобластной лейкемии. Активация транскрипции этого гена только в индуцированных и спонтанной ГК, а также данные, полученные ранее на других модельных системах, дают возможность рассматривать этот ген в качестве потенциального маркера гепатоканцерогенеза. Это предположение требует дальнейших исследований.
Итак, в этой части работы на экспериментальной модели химически индуцированного гепатоканцерогенеза мышей выявлен ряд ранних изменений экспрессии генов, кодирующих тканеспецифические факторы, белки семейства TGF, белки, участвующих в поддержании морфологии клеток, а также возможные маркеры ГК. Регуляция дифференцировочного и пролиферативного статуса клеток - это многофакторный процесс, и нарушение функций какого-то из его участников не обязательно приводит к критическим последствиям, однако может стать отправной точкой для формирования и роста опухоли.
2. Анализ закономерностей экспрессии генов при культивировании клеток культуры Н33 в трехмерном коллагеновом матриксе
Известно, что прогрессия ГК связана с постепенной утратой характерных черт строения исходной ткани. Клетки эпителиальных тканей в норме тесно связаны между собой и с базальной мембраной, образованной компонентами ВКМ [Thiery, 2002; Abelev and Lazarevich, 2006]. В стандартной двумерной (2М) культуре нормальных гепатоцитов специфическая структура эпителиальной ткани не воспроизводится, и происходит быстрая дедифференцировка клеток. In vivo ткани и органы обладают трехмерной (3М) структурой и функционируют в 3М-окружении, поэтому нам представлялось важным выяснить, зависит ли экспрессия выявленных в первой части работы генов от взаимодействия клеток с компонентами ВКМ при культивировании в 3М-матриксе. Для этой цели мы использовали клон культуры быстрорастущей дедифференцированной гепатомы мыши Н33 [Кудрявцева и др., 2001] - Е12. Клон Е12 отличается от других клонов культуры Н33 наибольшей скоростью роста, а также наименьшей способностью расти в суспензии и образовывать на пластике подобие монослоя. Клетки исходной опухоли и ее культуры характеризуются отсутствием контактов с ВКМ, утратой характерной для эпителия организации цитоскелета и полярности клеточной мембраны, отсутствием экспрессии альбумина и гепатоспецифических транскрипционных факторов HNF4, HNF1, C/EBP и HNF6 [Lazarevich et al., 2004]. Из эпителиальных и гепатоцитарных признаков в ней сохранилась слабая экспрессия трансферрина, белка адгезионных контактов Е-кадхерина и цитокератина 18. Наряду с цитокератином в клетках Н33 экспрессируется виментин – белок промежуточных филаментов мезенхимальных клеток.
В культуре Н33 повышена экспрессия многих TGF-индуцируемых генов, экспрессия которых характерна для злокачественных опухолей (EDA+ сплайс-формы фибронектина, остеопонтина, 3 субъединицы интегрина, Snail, виментина).
В сотрудничестве с сотрудниками лаборатории иммунохимии опухолей мы проводили культивирование клеток клона Е12 в 2М- и ЗМ- коллагеновом матриксе. Чтобы получить 3М-культуры, исследуемые клетки растили внутри или между двумя слоями геля, который по составу и происхождению соответствует их физиологии, а также применяли специально разработанные полимеры. При культивировании клона Е12 в геле коллагена клетки образуют сфероиды. По сравнению с 2М-культурой в сфероидах наблюдается изменение цитоскелета клеток в сторону эпителиального фенотипа, а также увеличенное отложение фибрилл ВКМ между клетками и образование на внешней поверхности сфероидов неполного аналога базальной мембраны - оболочки из фибрилл фибронектина. Экспрессия виментина, маркера произошедшего в клетках ГК эпителиально-мезенхимного перехода, в 3М-культуре сохранилась, внутриклеточная локализация этого белка стала подмембранной. Для того чтобы выяснить, как культивирование в трехмерном матриксе влияет на транскрипцию наиболее значимых генов, мы исследовали экспрессию 25 генов в клетках клона Е12, культивировавшихся в культурах 2М и 3М с помощью метода полуколичественной ОТ-ПЦР (Рис. 5).
При культивировании в коллагеновом геле не произошло изменений в транскрипции гепатоспецифических транскрипционных факторов HNF4, HNF1, C/EBP и HNF6, репрессия которых, как мы установили ранее, сопровождает прогрессию ГК мыши и, по крайней мере частично, определяет дедифференцировку гепатоцитов [Lazarevich et al., 2004]. Очевидно, процесс дедифференцировки в этих клетках нарушил ключевые механизмы, восстановить которые изменением условий культивирования не удалось. Культивирование в трехмерном матриксе не вызвало изменений экспрессии маркера дифференцированных гепатоцитов альбумина, однако экспрессия гена онко-эмбрионального белка АФП несколько повысилась. В высокодифференцированных ГК мыши обычно наблюдается активация этого гена, который не экспрессируется во взрослой печени, в то время как дальнейшая прогрессия таких опухолей в сторону более злокачественного фенотипа может сопровождаться подавлением транскрипции АФП [Флейшман и др., 2008]. Таким образом, некоторое повышение уровня АФП в сфероидах можно рассматривать как дополнительное указание на то, что клетки в 3М-культуре приобретают более дифференцированный фенотип.
Рисунок 5. Экспрессия генов в клетках клона Е12, культивировавшегося в 2М (дорожка 2) или 3М (дорожка 3) коллагеновом геле. Дорожка 1 - нормальная печень взрослой мыши. Стрелками обозначены две сплайс-формы фибронектина 1: EDA+ (720 п.н.) и EDA- (565 п.н.).
По данным ОТ-ПЦР анализа (Рис. 5), культивирование в трехмерном коллагеновом геле ведет к некоторой активации транскрипции Е-кадхерина, несмотря на продолжающуюся экспрессию его репрессора Snail. Изменений профиля экспрессии других генов, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальным переходом, мы не обнаружили. Важно отметить, что в клетках сфероидов не наблюдалось снижения ни общего количества мРНК фибронектина, ни его изоформы EDA+. Наиболее значимым изменением среди проанализированных генов оказалось подавление в сфероидах транскрипции гена TGF2, но не TGF1. В исходной опухоли уровень транскрипции гена TGF2 оказался повышенным, а клетки культуры Н33 активно секретировали этот фактор в культуральную среду. Подавление экспрессии TGF2 в 3М-культуре Е12 в коллагеновом геле отражает ее частичную нормализацию. Изменения экспрессии генов TGF-респонсивных транскрипционных факторов и бетагликана мы не обнаружили.
По итогам анализа экспрессии ряда генов на модели химически индуцированного гепатоканцерогенеза у мышей несколько из них были охарактеризованы нами как потенциальные маркеры гепатоканцерогенеза. Мы проанализировали спектры экспрессии этих генов (кавеолина 1, аннексина 2, циклина G1) в клетках культуры клона Е12 (Рис. 5), культивировавшегося в ЗМ-матриксе. Значимых изменений в экспрессии этих генов при культивировании клеток в 3М-матриксе по сравнению с 2М-матриксом нами выявлено не было.
3. Исследование уровней синтеза и локализации изоформ белка HNF4 в опухолях печени человека
Исследование, проведенное в первой части работы, позволило нам выявить некоторые новые закономерности экспрессии генов гепатоспецифических транскрипционных факторов, однако оставалось неясным, распространяются ли результаты, полученные на этих экспериментальных моделях, на ГК человека. В сотрудничестве с отделением опухолей печени и поджелудочной железы НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН (руководитель – проф. Ю.И. Патютко) нами было отобрано и исследовано 37 клинических образцов ГК человека, полученных при резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН.
Нам представлялось важным выяснить внутриклеточную локализацию и оценить уровень синтеза независимо регулируемых групп изоформ гена HNF4, являющегося одним из ключевых регуляторов дифференцировки гепатоцитов, иммуногистохимическим методом. Согласно литературным данным, HNF4 в основном экспрессируется в печени, почках, поджелудочной железе и кишечнике [Tanaka et al., 2006]. Нарушение экспрессии гена HNF4 описано для нескольких типов карцином, однако выяснить, какой вклад вносит каждая из изоформ в процесс формирования и прогрессии опухолей, к настоящему времени не удалось. Дифференциальный анализ уровней синтез различных групп изоформ исследуемого белка был призван выяснить, может ли изменение спектра синтезируемых изоформ HNF4 рассматриваться в качестве возможного прогностического фактора для исследуемого типа опухолей. В представленной части работы мы исследовали уровень синтеза и внутриклеточного распределения групп изоформ HNF4Р1 и HNF4Р2 в клинических образцах ГК человека.
Для дифференциального анализа уровней синтеза белков HNF4Р1 и HNF4Р2 нами были отобраны парафиновые блоки образцов тканей 37 клинических случаев ГК человека, полученные при резекции опухолей в РОНЦ РАМН в 1999-2008 годах. Было проведено клиническое описание этих случаев. Ранее в нашей лаборатории был проведен анализ экспрессии изоформ HNF4 методом ОТ-ПЦР для тех случаев, когда в нашем распоряжении имелись образцы опухолей и окружающих тканей печени, достаточные для выделения РНК (9 образцов), которые в данной работе были исследованы методом иммуногистохимии. В работе были использованы мышиные моноклональные антитела, специфические к Р1 или Р2 группам изоформ белка HNF4 человека, полученные и охарактеризованные ранее группой японских ученых [Tanakа et al., 2002, Tanaka et al., 2006].
Для каждого клинического случая ГК отдельно исследовали уровень синтеза каждой из изоформ. При анализе результатов ИГХ окраски образцов ГК учитывали процент ядер опухолевых клеток, окрашенных антителами к каждой из изоформ, а также интенсивность окрашивания. Также была проанализирована внутриклеточная локализация исследуемого белка. Внутренним положительным контролем при окраске антителами к P1 группе изоформ HNF4 служили ядра гепатоцитов, составляющих окружающую опухоль ткань печени, на том же серийном срезе, а для Р2 группы изоформ положительным контролем служила окраска антителами ядер холангиоцитов, клеток, образующих желчные протоки, в которых описан синтез HNF4P2 изоформ. Для того чтобы исключить из исследования карциномы не гепатоцитарного происхождения, образцы тканей были подвергнуты ИГХ окрашиванию с использованием антител HepPar1, антигеном для которых является один из ферментов цикла мочевины карбомоил фосфат синтетаза 1 (CPS1), синтезирующийся исключительно в клетках гепатоцитарного происхождения.
При формализации полученных данных для статистического анализа за негативно окрашенные принимали препараты, в которых доля окрашенных ядер опухолевых клеток составляла менее 10%, умеренно окрашенные – препараты, в которых этот показатель составлял 10-50%, за интенсивно окрашенные – препараты, содержащие 50-100% окрашенных опухолевых клеток. Интенсивность окраски оценивали по системе от «+» до «+++». Типичные результаты окрашивания представлены на рисунке 6, где приведены как случаи, не ассоциированные с инфекциями вирусами гепатита, так и случай, ассоциированный с инфекцией вирусом гепатита В (рис. 6).
При исследовании уровней синтеза изоформ транскрипционного фактора HNF4 (Табл. 1) в ГК человека мы установили, что в 70% (26 случаев) всех исследованных ГК синтез изоформ HNF4P1 в опухолевых клетках был снижен по сравнению с неопухолевой тканью печени. В 16% (6 случаев от всех исследованных ГК) синтез изоформ HNF4P1 был полностью подавлен. Для случаев, не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита этот показатель, падение иди полное подавление синтеза изоформ группы HNF4P1, составил 92% (22 из 24 проанализированных случаев) и 77% (10 из 13 случаев) для ГК, ассоциированных с инфекциями вирусами гепатита. Эти данные согласуются с результатами проведенных раннее методом ОТ-ПЦР исследований, в которых было выявлено снижение уровня экспрессии изоформ HNF4Р1 в опухолях по сравнению с окружающей тканью печени.
В 92% (34 случая) всех исследованных ГК была выявлена активация синтеза группы эмбриональных изоформ HNF4Р2 в опухолевых клетках. Для случаев, как не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатитов, так и ассоциированных эта цифра составила 92% (22 из 24 ГК, а также 12 из 13 ГК соответственно). Эти данные также согласуются с результатами проведенного ранее ОТ-ПЦР анализа. В 56% (21 случай от всех исследованных ГК) активация синтеза этой группы изоформ наблюдалась и в неопухолевой ткани печени, окружающей ГК.
5% (2 образца), от всех ГК, составили случаи, где не было зарегистрировано синтеза ни одной из изоформ. Необходимо отметить, что в таких препаратах цитоплазма клеток была интенсивно окрашена антителами к обеим группам изоформ. Один из таких случаев был ассоциирован с инфекцией вирусом гепатита В.
Таблица 1. Изменение экспрессии белковых изоформ HNF4 в ГК человека. – общее количество ГК, – ГК, не ассоциированные с инфекциями вирусами гепатита, – ГК, ассоциированные с инфекциями вирусами гепатита. «-» - синтез белка подавлен, стрелками (,, ) соответственно обозначено снижение, повышение или сохранение на том же уровне синтеза белка в опухоли по сравнению с образцами неопухолевой ткани печени того же пациента.
| ГК | HNF4P1 | HNF4P2 | Цитоплазматическая окраска | ||||||||
| – | – | HNF4P1 | HNF4P2 | ||||||||
| I | 37 | 6 (16%) | 26 (70%) | 0 | 5 (14%) | 3 (8%) | 0 | 34 (92%) | 0 | 6 (16%) | 17 (46%) |
| II | 24 (62%) | 5 (21%) | 17 (75%) | 0 | 2 (8%) | 2 (8%) | 0 | 22 (92%) | 0 | 4 (17%) | 10 (42%) |
| III | 13 (38%) | 1 (15%) | 9 (62%) | 0 | 3 (23%) | 1 (8%) | 0 | 12 (92%) | 0 | 2 (14%) | 7 (50%) |
Помимо этого еще 4 случая ГК, ассоциированные с инфекциями вирусов гепатита, имели интенсивную цитоплазматическую окраску антителами к изоформам HNF4P2 группы или обеим группам изоформ (1 случай) и при этом сохраняли ядерную окраску. Это наблюдение позволяет предположить возможность существования дополнительных механизмов изменения активности транскрипционного фактора HNF4 на уровне регуляции его внутриклеточной локализации. Можно предположить, что при инфекциях вирусами гепатита В или С не происходит нормальной компартментализации HNF4 и он накапливается в цитоплазме, о чем свидетельствует специфическое окрашивание цитоплазмы опухолевых клеток пациентов, инфицированных HBV/HCV. Подобный механизм секвестрирования белками вируса описан для транскрипционного фактора р53. Проверка этих предположений требует дальнейших исследований.
Уровень дифференцировки всех исследованных ГК был преимущественно умеренным, а структура опухолей - солидной или солидно-альвеолярной. Активация синтеза эмбриональной группы изоформ HNF4Р2 свидетельствует о начале процесса дедифференцировки клеток печени, что подтверждается данными гистоморфологического анализа.
Рисунок 6. Локализация изоформ белка HNF4 в ГК человека, не ассоциированных с инфекцией вирусами гепатита. (1, 2) и ассоциированной с инфекцией вирусом гепатита В (3). А - окрашивание гематоксилином и эозином. Б - иммуногистохимическая идентификация изоформ HNF4P1; В - иммуногистохимическая идентификация изоформ HNF4P2. 1-«Р1+ /Р2+» ГК, 2-«Р1- /Р2+» ГК, 3 – «Р1+ /Р2+» (HBV +), стрелкой указана область опухолевых клеток с окрашенной цитоплазмой (1*200).
Для того чтобы исследовать возможность использования изменения спектра синтезируемых изоформ HNF4 в качестве прогностического фактора для исследуемого типа опухолей был проведен предварительный анализ отдаленных результатов хирургического лечения исследованных случаев ГК.
Общую и безрецидивную выживаемость рассчитывали в зависимости от следующих факторов: уровень дифференцировки клеток опухолей (низкий, умеренный, высокий), доля окрашенных ядер опухолевых клеток антителами к HNF4P1 и HNF4P2 (0-100%), интенсивность окраски ядер (0 - +++), наличие цитоплазматической окраски (нет/есть). Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы SPSS (SPSS Inc, Chicago, Illinois). Общую выживаемость оценивали по методике Kaplan-Meier. Достоверность различия между кривыми выживаемости в зависимости от факторов оценивали при помощи log-rank test. В многофакторном анализе использовали Cox model (Регрессия Коха), используя пошаговый выбор факторов, чтобы идентифицировать независимые показатели смертности. Различие между кривыми выживаемости считали достоверным при р<0.05.
Статистическую обработку данных проводили на 33 образцах ГК: 4 ГК были исключены из статистического исследования в связи со смертью пациентов в послеоперационный период. Исходя из результатов, полученных при расчете общей выживаемости (данные представлены в полном тексте диссертации), можно сделать вывод, что сохранение экспрессии изоформ HNF4P1 и активация экспрессии изоформ HNF4P2 в опухолевых клетках является благоприятным прогностическим фактором, поскольку средняя продолжительность жизни после хирургического лечения составляет 33 месяца, в то время как отсутствие синтеза обеих групп изоформ (Р1 и Р2) является неблагоприятным фактором прогноза. Для пациентов, в опухолях которых не выявляется синтез ни одной из групп изоформ, рассчитать общую выживаемость не удалось. Безрецидивная выживаемость в случаях отсутствия синтеза обеих групп изоформ в опухолевых клетках составляет в среднем около 25 месяцев (данные представлены в полном тексте диссертации).
При исследовании вероятностей учитываемых факторов при подсчете продолжительности жизни после хирургического лечения, в многофакторном анализе (таблица 2) мы установили, что достоверным фактором, влияющим на продолжительность жизни, является сохранение синтеза взрослой группы изоформ HNF4P1 и его интенсивность (р=0.005 и 0.002, соответственно). Эти данные носят предварительный характер, поскольку архив парафиновых блоков ГК содержит ограниченное количество образцов и охватывает недостаточно большой промежуток времени после хирургического лечения. Особо необходимо отметить тот факт, что данные исследования проводятся впервые. На сегодняшний момент в клинической практике не применяется каких либо прогностических факторов, позволяющих с достаточной достоверностью предопределить течение такого заболевания, как ГК. Поиск прогностических факторов является важной частью исследования механизмов гепатоканцерогенеза, поскольку позволит расширить возможности диагностики и последующей терапии опухолей этого типа.
Таблица 2. Выживаемость больных гепатоцеллюлярным раком после хирургического лечения, в зависимости от факторов прогноза. Многофакторный анализ (Cox model).
| Факторы | Многофакторный анализ р < 0.005 |
| Уровень дифференцировки | 0.9 |
| Доля HNF4P1 окрашенных ядер | 0.005 |
| Доля HNF4P2 окрашенных ядер | 0.46 |
| Интенсивность HNF4P1 окрашенных ядер | 0.002 |
| Интенсивность HNF4P2 окрашенных ядер | 0.31 |
| Цитоплазматическая окраска HNF4P1 | 0.8 |
| Цитоплазматическая окраска HNF4P2 | 0.4 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В представленной работе проведен анализ изменений экспрессии генов, продукты которых участвуют в дифференцировке и поддержании эпителиального фенотипа, ростом и пролиферацией, а также могут быть потенциальными маркерами ГК. Исследования проводили на трех различных системах: при химически индуцированном гепатоканцерогенезе мышей, при культивировании клеток клона Е12 культуры низкодифференцированной ГК мыши в 2М и 3М коллагеновом матриксе и в гепатокарциномах человека.
Исследование экспрессии генов на модели химически индуцированного гепатоканцерогенеза показали, что индукция клеток печени канцерогеном приводит к активации транскрипции генов, характерных для недифференцированных гепатоцитов (АФП). Анализ экспрессии генов основного блока печень-специфических ГЯФ показал, что индукция клеток печени сопровождается активацией транскрипции эмбриональной группы изоформ (HNF4P2) транскрипционного фактора HNF4, являющегося ключевым регулятором дифференцировки гепатоцитов. Мы установили, что уже на 3 сутки после индукции ДЭНА в печени мышей происходит активация экспрессии эмбриональной группы изоформ HNF4P2. Совместная экспрессия двух групп изоформ (HNF4P1 и HNF4P2) свидетельствует о том, что в опухолях все они вносят вклад в общий уровень HNF4, в то время как в нормальной печени преобладают изоформы HNF4P1. Группы изоформ (Р1 и Р2) обладают различными транс-активационными свойствами, поскольку изоформы HNF4Р2 предпочтительно активируют транскрипцию эмбриоспецефических генов (АФП), в то время как изоформы группы HNF4Р1 активируют транскрипцию дифференцировочных маркеров печени. Мы полагаем, что появление транскриптов HNF4Р2 после индукции печени канцерогеном является маркером повреждения клеток печени, в то время как активация экспрессии изоформ этой группы в ГК свидетельствует о дедифференцировке клеток опухоли и возвращению их к менее дифференцированному «эмбриональному» фенотипу.
На исследованной модели химически индуцированного гепатоканцерогенеза мышей мы продемонстрировали активацию генов, кодирующих компоненты TGF-сигнального пути. Представители семейства TGF являются мощными регуляторами клеточного роста. В норме воздействие TGF на эпителиальные клетки приводит к активации в них проапоптотической программы. В то же время, эпителиоциты, претерпевшие ЭМП, оказываются резистентными к действию TGF: напротив, под влиянием этого фактора в таких клетках активируются пролиферативные и антиапоптотические каскады. Уже на начальных этапах химически индуцированного повреждения клеток печени (на 3 сутки после введения ДЭНА) происходит активация экспрессии генов факторов семейства TGF, кроме того, в исследованных образцах печени и ГК выявлена гиперэкспрессия ряда TGF-зависимых генов (TSC22, Tbi68, TGIF, остеопонтин). Логично предположить, что приобретение устойчивости к проапоптотическому действию TGF и последующая активация TGF-респонсивных генов являются маркерами опухолевой прогрессии.
В общей сложности в образцах печени мышей, подвергшихся действию ДЭНА, а также в химически индуцированных и спонтанных ГК мышей проведен анализ экспрессии 38 генов. Мы показали, что уже на этапе инициации гепатоканцерогенеза активируется экспрессия активированной формы EGFR-TK, генов кавеолина 1, остеопонтина, Axl, SLPI и цитохезина 1, гиперэкспрессия которых описана и в других типах опухолей. По результатам проведенной работы ген ASNS охарактеризован как наиболее перспективный маркер гепатоканцерогенеза. Изучение значимости и механизмов описанных изменений представляется нам важным направлением дальнейших исследований.
Важным этапом проведенной работы стал анализ влияния трехмерного матрикса на экспрессию генов, выявленных на первой стадии исследования, в культуре клеток дедифференцированной ГК. Было выявлено подавление экспрессии гена TGF2 при культивировании клеток культуры Н33 в коллагеновом геле, что отражает частичную нормализацию агрессивного фенотипа опухолевых клеток. Однако культивирование клеток в трехмерном матриксе оказалось недостаточным для восстановления в клетках культуры Н33 экспрессии печень-специфических транскрипционных факторов.
В представленной работе проведены пилотные эксперименты по исследованию нарушений экспрессии изоформ ключевого регулятора роста и дифференцировки гепатоцитов транскрипционного фактора HNF4 в ГК человека и предпринята попытка использования изменения паттерна экспрессируемых изформ HNF4 в качестве фактора прогноза для этого типа опухолей. С помощью специфических антител к изоформам гена HNF4 впервые показано на белковом уровне, что прогрессия ГК сопровождается снижением синтеза взрослых изоформ, реактивацией группы изоформ HNF4Р2, не выявляемых в нормальной взрослой печени, в то время как высокозлокачественные дедиффернцированные опухоли характеризуются отсутствием синтеза обеих групп изоформ. Предварительный статистический анализ отдаленных результатов хирургического лечения показал, что достоверным положительным прогностическим фактором является сохранение в клетках ГК экспрессии взрослой группы изоформ HNF4Р1. HNF4 – транскрипционный фактор, находящийся на пересечении различных сигнальных путей, контролирующих пролиферативные, морфологические и дифференцировочные свойства гепатоцитов, нарушение его нормальной транскрипционной активности сообщает опухолевой клетке целый ряд селективных преимуществ, способствующих развитию высокозлокачественного фенотипа.
Наши дальнейшие исследования будут направлены на изучение механизмов регуляции экспрессии изоформ гена HNF4 и анализ возможности использования изменений уровней синтеза HNF4 в качестве фактора прогноза для этого типа опухолей.
ВЫВОДЫ
1. Проведен анализ изменения экспрессии генов на различных этапах гепатоканцерогенеза мышей, индуцированного диэтилнитрозамином. Впервые описана активация экспрессии эмбриональной группы изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4P2 в печени мышей, подвергшихся действию канцерогена (3 сутки после инъекции), а также ДЭНА-индуцированных и спонтанных ГК.
2. При химической индукции гепатоканцерогенеза у мышей выявлена активация экспрессии генов, не характерных для нормальных гепатоцитов - активной формы EGFR, содержащей тирозинкиназный домен, факторов семейства TGF и TGF-зависимых генов, в том числе транскрипционных факторов, участвующих в передаче сигнала по TGF-сигнальному пути, а также генов, гиперэкспрессирующихся в других типах опухолей: остеопонтина, кавеолина 1, цитохезина 1, Axl, циклина G1.
3. Из 38 проанализированных генов наиболее перспективным потенциальным маркером гепатоканцерогенеза представляется ген аспарагинсинтетазы (ASNS).
4. При культивировании клеток низкодифференцированной ГК мыши Н33 в трехмерном коллагеновом матриксе происходит подавление экспрессии гена TGF2, что является признаком частичной нормализации фенотипа опухолевых клеток.
5. В гепатокарциномах человека выявлено снижение или полное подавление синтеза изоформ группы P1 ключевого фактора гепатоцитарной дифференцировки HNF4 (86% случаев) и активация синтеза эмбриоспецифических изоформ HNF4Р2 (92% случаев). Статистически достоверным фактором, влияющим на продолжительность жизни пациентов после хирургического лечения гепатоцеллюлярного рака, является сохранение синтеза группы изоформ HNF4P1
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Cтатьи:
1. N.L. Lazarevich, D.A. Shavochkina, D.I. Fleishman, I.F. Kustova, O.V. Morozova, E.S. Chuchuev, Y.I. Patyutko. Deregulation of Hepatocyte Nuclear Factor 4 (HNF4) as a marker of epithelial tumors progression // Experimental oncology. – 2010.-Т. 32, № 3.-С. 167-171.
2. Т.Д. Рудинская, Н.И. Куприна, Н.Л. Лазаревич, М.И. Полянская, Д.А. Шавочкина, В.С. Полторанина, Н.В. Энгельгардт. Частичная реверсия фенотипа низкодифференцированной гепатокарциномы в трехмерной культуре // Онтогенез.- 2010. – Т. 41, №1.- С. 58-65.
Тезисы конференций:
- Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И., Шавочкина Д.А., Морозова О.В., Чучуев Е.С., Патютко Ю.И. Нарушение экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора 4 при прогрессии эпителиальных опухолей // 19 Российский онкологический конгресс, 17-19 ноября 2009 г., Москва; Сборник тезисов, с. 57-59.
- Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И., Шавочкина Д.А., Морозова О.В., Чучуев Е.С., Патютко Ю.И. Снижение экспрессии Гепатоцитарного Ядерного Фактора 4 как индикатор прогрессии гепатоцеллюлярной карциномы // Международный симпозиум в рамках Сибирско-Тайваньского Форума «Опыт и перспективы развития сотрудничества между российскими и тайваньскими учеными в области изучения молекулярно-генетических механизмов развития злокачественных новообразований и использования результатов фундаментальных исследований в онкологии», 16-17 сентября 2009 г., Томск, Россия. Сборник тезисов, с. 42-44.
- Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И., Макарова М.В., Доннер Н.Е., Шавочкина Д.А., Кустова И.Ф., Чучуев Е.С., Патютко Ю. II. Тканеспецифические транскрипционные факторы в координации активности сигнальных путей при опухолевой прогрессии // II международный симпозиум «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека», 22-23 января 2009 г., Москва. Сборник тезисов, с. 18-19.
- D. Fleyshman, O. Morozova, D. Alpern, M. Makarova, D. Shavochkina, A. Gahramanov, E. Chuchuev, Y. Patutko, N. Lazarevich. Loss of HNF41 expression as a marker of hepatocellular carcinoma progression // AACR Centennial Conference “Translational Cancer Medicine”, November 3-6, 2008, Jerusalem, Israel, Abstract book, рр. 54-55.
- Н.Л. Лазаревич, Д.И. Флейшман, Д.В. Альперн, М.В. Макарова, Д.А. Шавочкина, О.В. Морозова, Ю.И. Патютко, А.Д. Гахраманов, Е.С. Чучуев. Нарушение экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора 4 при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином. Материалы XV международного конгресса хирургов-гепатологов стран СНГ (Казань, 17 – 19 сентября 2008 г.) // Анналы хирургической гепатологии. – 2008. – Т. 13, №. 3.- С. 59-60.
- Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И., Макарова М.В., Альперн Д.В., Шавочкина Д.А., Морозова О.В., Патютко Ю.И. Гепатоцитарный ядерный фактор 4 в прогрессии опухолей печени // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008, Новосибирск. Сборник тезисов с. 417-419.
- Д.А. Шавочкина, И.Ф. Кустова, А.Г. Кузнецова, Н.Л. Лазаревич. Анализ закономерностей экспрессии тканеспецифических генов в клетках и клонах протоковой аденокарциномы человека MiaPaca2. Тезисы докладов Школы-Конференции молодых ученых «Методы культивирования клеток», Санкт-Петербург, 6-10 октября. // Цитология. – 2008. - Т. 50 № 9.- С. 830-831.
- И.Ф. Кустова, Д.А. Шавочкина, А.Г. Кузнецова, Н.Л. Лазаревич. Гепатоцитарные ядерные факторы в канцерогенезе протоковых клеток поджелудочной железы // Материалы V съезда онкологов и радиологов СНГ, 14-16 мая 2008 г, Ташкент. Сборник тезисов, с. 56-57.
- D. A. Shavochkina, D.I. Fleyshman, M.V. Makarova, A.G. Kuznetzova, O.V. Morozova, N.L. Lazarevich. Tissue-specific alterations of gene expression on the initial studies of liver carcinogenesis in mice // Spetses Summer School on Nuclear receptor signaling, Greece, 2007, Abstract book, pp. 57-59.
- D.I. Fleishman, M.V. Makarova, D.V. Alpern, D.A. Shavochkina, A.G. Kuznetzova, O.V. Morozova, Y.I. Patyutko. Gene expression alterations in hepatocarcinogenesis // EMBO/FEBS advanced course “Molecular Mechanisms in Signal Transduction and Cancer”, Spetses Island, Greece, August 15-24, 2007, Abstract book, pp. 58-59.
- N. Lazarevich, D. Fleishman, O. Chernobelskaya, M. Makarova, D. Alpern, D. Shavochkina, A. Kuznetsova O. Morozova, Y. Patyutko. Dysfunction of tissue-specific transcriptional network is an important determinant of hepatocellular carcinoma progression // EACR-19 Meeting Proceedings, Budapest, Hungary 1-4 July 2006, abstract book, pр.174.
