WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Дефицит специфического гуморального иммунитета и его диагностика при le c -позитивном раке молочной железы

    1. На правах рукописи
      1. УДАЛОВА ЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Дефицит специфического гуморального иммунитета и его диагностика при LeC-позитивном раке молочной железы

14.01.12 – онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО Учреждения Российской академии медицинских наук Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН, лаборатории углеводов института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Н.Н.Тупицын

доктор химических наук,

профессор Н.В. Бовин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.В.Пинегин

доктор медицинских наук, профессор В.Ю.Сельчук

Ведущее учреждение: Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится 18 марта 2010 года в 13 часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН

(115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан « 9 » февраля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

              1. доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

Рак молочной железы (РМЖ) в структуре заболеваемости и смертности от злокачественных заболеваний среди женщин в России, а также в странах Европы и Америке занимает первое место. В России в 2007г. его доля составила 20%. Ежегодно в мире выявляют около 1 млн. новых случаев рака молочной железы, и к 2010 году прогнозируется рост заболеваемости до 1,45 млн. Статистические данные последних лет свидетельствуют о том, что во всех экономически развитых странах отмечается неуклонный рост заболеваемости и увеличение смертности от рака этой локализации, а научным исследованиям по данной проблеме отводится одно из ведущих мест в онкологической науке.

Широкое распространение при раке молочной железы получили молекулярно-биологические исследования, направленные на оценку пролиферативной активности опухолевых клеток (Ki-67), экспрессии рецепторов неблагоприятного прогноза, которые могут служить мишенями для таргетной терапии (Her2/neu). Исследуются биологические показатели, которые могут иметь диагностическое и прогностическое значение, служить маркерами лекарственной чувствительности и резистентности. Большой раздел молекулярно-биологических работ посвящен иммунологии рака молочной железы.

Иммунологические исследования в области рака молочной железы ведутся по трем основным направлениям: иммунофенотип опухолевых клеток, противоопухолевый иммунитет, иммунологическое стадирование рака молочной железы – оценка микрометастазов и циркулирующих опухолевых клеток. Исследования в области иммунодиагностики опухолей и противоопухолевого иммунитета в самое последнее время получили новое перспективное продолжение. Оказалось, что опухолеассоциированные гликаны опухолевых клеток являются мишенями естественного (врожденного) противоопухолевого гуморального иммунитета. Естественные антитела способны вызывать гибель опухолевых клеток путем индукции апоптоза или липоптоза.

В крови здоровых лиц и больных раком молочной железы присутствуют антитела к опухолеассоциированным антигенам углеводной природы (ОАА), таким как TF, Tn, SiaTn, LeС и некоторым ганглиозидам.

Один из наиболее перспективных, и в то же время недостаточно изученных углеводных ОАА – это дисахарид LeC. Он является структурным «кором» нескольких хорошо известных онкомаркеров, таких как СА19-9. Кроме того, моноклональные антитела, специфичные к дисахариду LeC, показали высокую диагностическую ценность для выявления прогностически неблагоприятных групп рака молочной железы ранних стадий. В ходе совместной работы РОНЦ РАМН и ИБХ РАН при сравнении здоровых лиц с больными раком молочной железы по уровню «естественных» антител к LeC сделан вывод о пониженном содержании антител у больных, что аналогично ситуации с другим типом антител к ОАА – анти-TF (Томсена-Фриденрайха). При этом осталось невыясненным, является ли понижение уровня антител ответом на появление опухоли, или врожденно низкое содержание антител способствует опухолевому процессу. В связи с этим, представляет несомненный интерес более детальное изучение тонкой специфичности анти-LeC антител с помощью современных молекулярных подходов, а также выделение этих антител с помощью аффинного сорбента с последующим изучением их диагностических возможностей.

У больных раком молочной железы уровень естественных антител не только к LeC, но и к некоторым другим изученным углеводным ОАА отличается от такового для нормальных доноров, таких антигенов насчитывается несколько десятков. Вместе с тем, говорить о протективной роли анти-LeC антител возможно только в тех случаях, когда опухоли (рак молочной железы) являются LeC-позитивными. Исследование уровней анти-LeC в сопоставлении с анализом экспрессии антигена на опухоли до настоящего времени не проводилось и представляет несомненную актуальность.

Цель исследования

Изучить уровень антител к LeC в сыворотке крови больных раком молочной железы во взаимосвязи с экспрессией антигена на первичной опухоли.

Задачи исследования

  1. Оценить уровень антител к LeC в сыворотке крови больных раком молочной железы.
  2. Выделить антитела к LeC из сыворотки крови здоровых доноров и оценить возможности их использования в иммунофенотипировании рака молочной железы.
  3. Изучить экспрессию LeC на клетках рака молочной железы.
  4. Сопоставить показатели экспрессии LeC на опухолевых клетках с уровнями антител к LeC в сыворотке крови больных раком молочной железы.
  5. Оценить клинические и морфологические характеристики рака молочной железы в группах больных, различающихся по экспрессии LeC и уровню антител к LeC.

Научная новизна

Впервые показано, что рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана LeC на опухолевых клетках в большинстве случаев – 58% по данным иммуногистохимии и 72% по данным проточной цитометрии. Установлено, что обнаружение антигена в цитоплазме опухолевых клеток во всех случаях происходит при наличии мембранной экспрессии антигена. Концентрация антител к LeC в сыворотке крови больных раком молочной железы варьируют в широких пределах: практически полное отсутствие антител (7,4%), низкие уровни (44,4%), умеренные и высокие уровни (48,2%). Доказано, что концентрация антител к LeС в сыворотке крови и экспрессия LeС на опухолевых клетках имеют обратную взаимосвязь. Нарастание уровней сывороточных антител к LeС сопровождается достоверным снижением пропорции иммуногистохимически определяемых антиген-позитивных опухолевых клеток. Показано, что при отсутствии экспрессии гликана LeС на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).

Практическая значимость

Показана пригодность человеческих поликлональных антител к LeC для диагностики рака методами иммуногистохимии и проточной цитометрии. Иммуногистохимический метод рекомендуется для диагностики LeC-позитивного рака молочной железы.

Анализ группы из 55 больных раком молочной железы показал, что более чем у трети из них повышенная экспрессия антигена на опухолевых клетках сопровождается низким уровнем соответствующих антител в сыворотке крови. Эти результаты дают основание для научно обоснованной разработки адоптивной иммунотерапии рака молочной железы, основаной на применении антител к LeC.

Апробация работы состоялась 29 января 2010 года на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории клинической иммунологии опухолей, хирургического отделения опухолей молочных желез, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, лаборатории клинической биохимии НИИ Клинической онкологии Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Публикации

По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 4 глав собственных исследований, обсуждения и заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 17 рисунками. Указатель литературы содержит 168 источников, из которых 34 отечественных и 134 зарубежных.[1]

Материалы и методы

Общая характеристика больных и методы исследования

Материалом настоящей работы послужили результаты исследований опухолевого иммунофенотипа у 55 больных раком молочной железы. Установление диагноза рака молочной железы и лечение пациенток проведено в Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН в 2007-2009 годах. В нашей работе исследовались женщины в возрасте от 25 до 75 лет. Медиана составила 52 года. Наибольшую группу составили больные в возрасте 40-59 лет (64%).

  1. В исследуемой группе больные с I, IIА, IIБ и IIIА стадиями были представлены в примерно равных пропорциях 19,8-22,3% (рисунок 1).
  2.  Характеристика больных раком молочной железы по стадиям-0
  3. Рисунок 1. Характеристика больных раком молочной железы по стадиям заболевания.
  4. Хирургическому вмешательству различного объема подвергались все больные изучаемой группы. Радикальная резекция выполнена в 17 клинических случаях (30,9%), в остальных - радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц - 36 (65,5%) и радикальная мастэктомия с удалением грудных мышц - 2 (3,6%), рисунок 2.
  5.  Характеристика больных раком молочной железы по типу оперативного-1
  6. Рисунок 2. Характеристика больных раком молочной железы по типу оперативного лечения.

Менструальная функция была сохранена у 24 больных (43,6%), в периоде менопаузы – 31 женщина (56,4%), рисунок 3.

 Характеристика больных раком молочной железы по-2

Рисунок 3. Характеристика больных раком молочной железы по овариально-менструальной функции.

В правой молочной железе опухоль располагалась у 18 пациенток (32,7%), в левой – у 35 больных (63,7%), в обеих - у 2 (3,6%), рисунок 4.

 Распределение больных по локализации опухоли Варианты-3

Рисунок 4. Распределение больных по локализации опухоли

Варианты расположения опухоли в молочной железе представлены на рисунке 5.

 Распределение больных по локализации опухоли в молочной железе. -4

Рисунок 5. Распределение больных по локализации опухоли в молочной железе.

Данные гистологического исследования хирургически удаленной молочной железы представлены на рисунке 6.

 Гистологическая характеристика опухолей молочных желез В-5

Рисунок 6. Гистологическая характеристика опухолей молочных желез

В большинстве клинических случаев - 44 (80,2%) обнаружена II степень злокачественности, реже наблюдалась III степень – у 10 (18%) больных. I степень злокачественности отмечена лишь в 1 (1,8%) случаев, таблица 1.

Таблица 1.

Распределение больных раком молочной железы в зависимости от степени злокачественности

Степень злокачественности опухоли Количество больных абс. Частота %
I 1 1,8
II 44 80,0
III 10 18,2
Всего 55 100

Распределение больных в зависимости от рецепторного статуса опухоли было следующим: у большинства больных опухоли содержали рецепторы эстрогенов и прогестерона (РЭ+РП+) 25 (52,3%). В 13 (29,5%) клинических случаях не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Опухоль, положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по рецепторам прогестерона (РЭ+РП-), обнаружена у 8 (18,2%) больных, рисунок 7.

 Статус рецепторов эстрогенов и прогестерона опухоли Уровень-6

Рисунок 7. Статус рецепторов эстрогенов и прогестерона опухоли

Уровень рецептора Her2/neu в первичной опухоли определен также у 47 больных. В 30 (64,4%) случаях опухоль не содержала рецепторов к Her2/neu(-), у 10 (21,2%) больных реакция расценена как 1+, у 2 (4,2%) больных - Her2/neu(2+), у 5 (10,2%) больных Her2/neu(3+), рисунок 8.

 Экспрессия рецептора Her2/neu при раке молочной железы в-7

Рисунок 8. Экспрессия рецептора Her2/neu при раке молочной железы в анализируемой группе больных.

В работе использованы антитела к антигенам эпителиальных клеток, лейкоцитам и к субпопуляциям лимфоцитов, а также аффинно выделенные из сыворотки крови человека антитела к LeC. Специфичность использованных в работе МКА представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Специфичность использованных МКА

Кластер дифференцировки, название Специфичность
1 KL-I Панцитокератины
2 CD 326 EpCam, BER EP4
3 CD45 лейкоциты
4 CD3 T-клетки
5 CD19 B-клетки
6 Антитела к LeC (пока не кластеризованы) LeC

Примечание: KL-1 J.Brochier (Франция), Ber EP-4, CD326, CD3, CD19 - Becton Diсkinson (США). Выделение антител к LeC из сыворотки крови человека подробно описано далее в настоящем разделе. Полиакриламидные конъюгаты углеводов и аффинный сорбент LeC-sepharose получены от фирмы Лектинити (Москва).

Методы исследования.

Определение уровней антител к LeС в сыворотке крови.

Полистирольные иммунопланшеты (MaxiSorp, Nunc, Denmark) сенсибилизировали полиакриламидным гликоконъюгатом, содержащим дисахарид LeC (LeC-PAA, 30 кДа, 20 мол % LeC), и полиакриламидом без углеводного лиганда в качестве отрицательного контроля (РАА), концентрация 10 мкг/мл в натрий-карбонатном буфере (Na2CO3/NaHCO3: 0.05 M, pH 9.6) в течение ночи (16 часов) при 4оС. Между всеми этапами планшеты промывали четыре раза 0,1 % Твин-20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ: 0.15 М, рН 7.4). Оставшиеся потенциальные места связывания на полистироле блокировали 1 % БСА в ФСБ в течение 40 мин при 37оС. Затем планшеты инкубировали с донорской сывороткой крови в последовательных двукратных разведениях в ФСБ, содержащем 0.3 % БСА, начиная с 1:20 в течение 60 мин при 37оС. Затем в планшеты добавляли меченые пероксидазой хрена антитела козла против IgG, IgM и IgA человека (Southern Biotech, USA) в разведении 1:4000 в ФСБ, содержащем 0.3 % БСА, и инкубировали в течение 60 мин при 37оС. На заключительном этапе планшеты инкубировали с фосфатно-цитратным буфером (0.075 М, рН 5), содержащем 0.04 % о-фенилендиамина и 0.03 % Н2О2 в течение 20 мин при комнатной температуре. Цветную реакцию останавливали 1 М H2SO4. Оптическую плотность определяли при 492 нм на многопараметровом счетчике (Victor2, Perkin Elmer, USA). Каждый эксперимент дублировался.

Выделение естественных анти-Lec антител из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии.

Сыворотку крови здорового донора II (A) группы (25 мл) инкубировали при 56оС в течение 30 минут для инактивации системы комплемента, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали при 4оС (13 000g). Супернатант разводили 1:1 ФСБ / 0.02 % NaN3 (0.15 М, рН 7.4). Сыворотку наносили на колонку с адсорбентом LeС-sepharose 6 FF (2 мл), уравновешенным ФСБ / 0.02% NaN3, со скоростью потока 80-300 мкл/мин при комнатной температуре. Сыворотку, прошедшую через колонку, собирали для дальнейшего сравнительного анализа с исходной сывороткой методом ИФА. Адсорбент промывали по 15 объёмов колонки сначала ФСБ / 0.02% NaN3 / 0.5% Твин-20 под контролем проточного УФ-детектора (Bio-Rad, USA) до исчезновения белков в смыве и затем ФСБ / 0.02 % NaN3. Элюцию связавшихся с адсорбентом антител проводили Tris-OH / 0.02 % NaN3 (0.2 M, pH 10.4. Фракции, содержащие антитела, немедленно нейтрализовали буфером Gly-HCl / 0.02% NaN3 (2 M, pH 2.5). Концентрацию антител во фракциях определяли методом поглощения при = 280 нм с помощью спекторофотометра. Для расчёта концентрации белка во фракциях принимали следующее соотношение: раствору с концентрацией иммуноглобулинов (для IgG, IgM, IgA) 1 мг/мл соответствует 1.4 оптической единицы.

Специфичность выделенных антител анализировали методом ИФА, используя полиакриламидные гликоконъюгаты. Антитела хранили при +4oC в течение недели, или замораживали при -20оС на длительное хранение.

После элюции антител колонку промывали дистиллированной водой (5 объёмов колонки), затем адсорбент регенерировали 0.1 Н NaOH (5 объёмов колонки) и опять промывали дистиллированной водой (5 объёмов колонки).

Биотинилирование антител.

Готовили раствор аффинно выделенного иммуноглобулина (4 мг/мл) в 100 mМ карбонатном буфере (pH = 8,4). Растворяли 10 мг биотин-N-гидроксисукцинимидного эфира в диметилсульфоксиде. Добавляли к раствору антител раствор биотинового реагента из расчета 80 мкг биотина на 1 мг белка и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 часов. Несвязавшийся биотин отделяли гель-фильтрацией на колонке PD-10, уравновешенной PBS.

Иммуногистохимическое исследование было проведено по стандартной методике (Tupitsyn N.N., Kadagidze Z.G. et al., 1995) на криостатных срезах опухолей с использованием мышиных моноклональных антител к общелейкоцитарному антигену CD45 и панцитокератинам KL-1, а также человеческих антител к LeC, меченых биотином. Перед нанесением человеческих антител неспецифическое связывание блокировали неиммунной кроличьей сывороткой (DakoCytomation, Denmark). Проявление мышиных антител осуществляли с помощью FITC-меченой антисыворотки против иммуноглобулинов мыши (BDB, USA). Проявление взаимодействия человеческих анти-LeС антител с опухолевыми клетками осуществляли с помощью FITC- или фикоэритрин (РЕ)-меченого стрептавидина.

Методом трехцветной проточной цитометрии на приборе FACScan оценена мембранная экспрессия LeС на опухолевых клетках и на интратуморальных лимфоцитах. Из фрагмента хирургически удаленной опухоли получали суспензию опухолевых клеток и интратуморальных лимфоцитов с использованием аппарата Medimashin (BDB, USA). Клетки окрашивали флуоресцентно мечеными антителами к общелейкоцитарному антигену CD45-PE/Cy5, общеэпителиальному антигену НЕА-125 или EpCAM-1-PE и антителами к LeС. Проявление связывания человеческих антител осуществляли с помощью стрептавидин-FITC. Cубпопуляции интратуморальных Т- и В-лимфоцитов, связывающих anti-LeС, изучали с помощью напрямую меченых флуорохромами антител CD3-PE/Cy5 и CD19-PE.

Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии антигенов на опухолевых и иммунокомпетентных клетках с помощью МКА.

Непрямая реакция поверхностной иммунофлуоресценции (РИФ) на криостатных срезах.

Замороженные срезы (толщина 4-6 мкм) помещали по три среза на поверхность обезжиренных предметных стекол. Срезы фиксировали в ацетоне при комнатной температуре в течение 4 секунд. Перед окраской антителами срезы фиксировали в течение 10 минут в ацетоне при 4ОС. Последующие этапы реакции проводили при комнатной температуре во влажной камере. Инкубировали срезы 10 минут в среде 199, рН 7,2-7,4. МКА наносили на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Наносили FITC-меченые F(ab)2–фрагменты антисыворотки против иммуноглобулинов мыши на 30 минут. Отмывали в среде 199 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе. Срезы накрывали покровным стеклом, и характеризовали антигенположительные клетки и структуры. Специфические реакции учитывали на микроскопе Axioplan-2 (Германия).

Прямая реакция иммунофлуоресценции на криостатных срезах.

Срезы опухолей молочных желез фиксировали в ацетоне, как описано выше. Отмывали в среде 199 в течение 10 минут. Затем наносили FITC-меченые антисыворотки или моноклональные антитела и инкубировали 30 минут. Отмывали в среде 199 в течение 10 минут. Клетки консервировали 50% глицерином на физиологическом растворе и учитывали специфическое свечение на люминисцентном микроскопе.

После реакции иммунофлуоресценции препараты просматривали на люминесцентном микроскопе Axioplan 2 (Германия) при увеличении объектива х40, окуляра х10.

      1. Учет реакций.

Иммунофенотипирование опухолевых клеток.

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом, предложенным Hammerling et al. (1987). Выделяли три типа взаимодействия антител с опухолевыми клетками:

Отрицательная реакция (-): менее 10% антигенположительных опухолевых клеток.

Мозаичная реакция (+/-): антиген присутствовал на части (от 10% до 80%) опухолевых клеток.

Мономорфная реакция (+): антиген экспрессируется большинством (более 80%) опухолевых клеток.

      1. Статистическая обработка результатов исследования.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 13. С применением теста Колмогорова-Смирнова проверялась гипотеза о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: Манна-Уитни (две выборки) или Краскела-Уоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения, использовались коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману.

Результаты исследования и обсуждение.

Мы изучили возможность иммуноаффинного выделения антител к LeC из донорской крови, для этого был проведен скрининг сывороток крови здоровых женщин с целью определения уровней антител к LeC.

Из сыворотки крови здоровой женщины-донора с высокими титрами антител к LeС, выделили эти антитела методом аффинной хроматографии.

На рисунке 9 представлена концентрация антител в сыворотке до и после аффинной хроматографии. Антитела элюировали с колонки и метили биотином.

АБ

Рисунок 9. Выделение поликлональных антител для исследования экспрессии LeC. А – исходная концентрация антител к LeC в сыворотке донора. Б – концентрация антител после аффинной хроматографии.

Важно отметить, что, несмотря на различный уровень антител у разных доноров, «спектр» эпитопной специфичности, определенный с помощью ИФА и набора из десяти РАА-гликоконъюгатов (в этот набор вошли родственные LeC олигосахариды), был практически идентичным у всех проверенных доноров. Поэтому, гистохимический реагент на основе поликлональных антител, выделенный из крови человека, можно считать моноспецифическим, и в дальнейшем надежно воспроизводить.

Определение антител к LeC в сыворотке крови больных проводили методом ИФА. Экспрессия LeC на клетках рака молочной железы нами изучена двумя методами - иммунофлуоресцентным окрашиванием свежезамороженных срезов опухолевой ткани и методом трехцветной проточной цитометрии. Антиген обнаружен в 70% случаев рака молочной железы (35 из 50 случаев).

Для оценки возможности изучения экспрессии LeС на опухолевых клетках нами был использован LeС-позитивный рак молочной железы. Экспрессия гликана на опухолевых клетках была доказана с использованием моноклональных антител LU-BCRU-G7 (любезно предоставлены P.Rye, Норвегия).

При использовании иммуногистохимического метода положительная реакция отмечена в 18 из 31 случая рака молочной железы (58%). Нами были выделены три группы больных: с отсутствием экспрессии LeС на опухолевых клетках (42%), с мозаичной экспрессией LeС (19,3%), и с мономорфной экспрессией LeС (38,7%). В антиген-положительных случаях цитоплазматическая реакция была отчетливой, а однозначно высказаться об экспрессии антигена на мембране опухолевых клеток не представлялось возможным.

Мы оценили взаимосвязь между экспрессией LeC и уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли.

При отсутствии LeC на опухолевых клетках, а также при его мозаичной экспрессии, слабый, умеренный и выраженный типы инфильтрации опухоли лимфоцитами наблюдались с одинаковой частотой (33%). При мономорфном окрашивании опухолевой ткани антителами к LeC преобладала незначительная инфильтрация опухоли лимфоцитами (50%). Достоверной взаимосвязи между этими признаками не выявлено, р=0,87.

Так как основной целью работы явилось изучение сывороточных антител к LeC у больных раком молочной железы, а эти антитела могут взаимодействовать с опухолевыми клетками только при условии экспрессии LeC на мембране, то установление именно мембранной экспрессии LeC имело принципиальное значение. Оценка мембранной экспрессии антигена на опухолевых клетках была проведена методом многоцветной проточной цитометрии, поскольку иммуногистохимический метод не позволял сделать однозначное заключение относительно мембранной экспрессии LeC в случаях наличия антигена в цитоплазме опухолевых клеток. Исследование проведено у 29 больных раком молочной железы на материале хирургически удаленной опухоли.

При выявлении опухолевых клеток в проточно-цитометрических экспериментах нами отдано предпочтение оценке мембранной экспрессии ЕрСАМ, а не панцитокератинам, которые использовались в иммуногистохимических исследованиях. Подобный выбор обусловлен тем, что ЕрСАМ экспрессирован на мембране клеток, и для его выявления не требуется разрушения клеточной мембраны. При такой постановке реакции антитела к LeC не попадают в цитоплазму клеток, а выявляют только мембранный антиген, что и явилось основной целью нашего исследования.

На рисунке 10 представлены принцип метода и мономорфная экспрессия LeC на опухолевых клетках.

А. Б. В.

Рисунок 10. Выявление мембранной экспрессии LeC на клетках рака молочной железы методом многоцветной проточной цитометрии. А – гейт лимфоцитов (ось Х – CD45, ось У – SSC). Б – гейт опухолевых клеток (ось Х – CD45, ось У – CD326). В – антиген LeC мономорфно экспрессирован на опухолевых клетках и отсутствует на лимфоцитах (ось Х – окрашивание антисывороткой к LeC, ось У – экспрессия CD45).

При оценке мембранной экспрессии LeC на клетках рака молочной железы методом многоцветной проточной цитометрии, которая была выполнена у 29 больных, у большинства больных – 21 (72,4%) мембранная экспрессия LeC присутствовала на опухолевых клетках, а у 8 (27,6%) - отсутствовала. Преобладала мономорфная экспрессия антигена (13 случаев), реже отмечен мозаичный тип реакции (8 наблюдений). К случаям с мономорфной экспрессией мы относили таковые при наличии антигена на 70-100% клеток, отсутствие антигена констатировали при обнаружении менее 20% LeC-позитивных клеток, во всех остальных случаях экспрессия считалась мозаичной. У 8 больных с отсутствием экспрессия LeC, среднее количество антиген-позитивных клеток составило 5,0% ±2,2%, диапазон от 0% до 15%, также у 8 больных наблюдалась экспрессия LeC на значительной пропорции клеток, среднее значение - 57,3%±3,9%, диапазон от 38% до 68%, у 13 больных наблюдалась мономорфная экспрессия LeC, среднее значение 87,5 %±2,2%, диапазон от 73% до 100%.

Выявление в сыворотке крови человека антител к LeС было выполнено методом ИФА. Нами были выделены три уровня концентрации антител:

  1. 0,1 OD 0,2 – низкий (фоновый уровень),
  2. 0,3 OD 0,5 – средний,
  3. 0,6 OD 1,3 – высокий уровень.

У 4 пациентов (7,4%) в сыворотке крови антитела к LeС отсутствовали, у 24 пациентов (44,4%) пациентов наблюдался средний уровень и у 26 пациентов (48,2%) наблюдался высокий уровень. Раздельно изучили взаимосвязь уровней антител к LeC с экспрессией LeС на опухоли, определяемой иммуногистохимически и методом проточной цитометрии.

Установлено существование достоверной взаимосвязи между уровнями антител в крови и экспрессией LeC на опухолевых клетках (иммуногистохимический метод, р = 0,015). По мере нарастания уровня антител к LeC в сыворотке крови (низкий-средний-высокий), частота мономорфной экспрессии гликана на опухоли снижалась: 100% - 54% - 19% соответственно, а пропорция отрицательных случаев, напротив, повышалась (рисунок 11). Независимым параметром является уровень антител.

 Взаимосвязь между уровнем антител к LeC в сыворотке крови и-15

Рисунок 11. Взаимосвязь между уровнем антител к LeC в сыворотке крови и пропорцией LeC-позитивных опухолевых клеток, выявляемых иммуногистохимически.

Сопоставление средних уровней антител в зависимости от экспрессии LeС на опухолевых клетках показало, что при мономорфной экспрессии LeC на опухолевых клетках средние уровни антител (OD) достоверно более низкие, чем при полном или частичном отсутствии антигена на опухоли (р = 0,018), таблица 3.

Таблица 3

Взаимосвязь между уровнем антител в сыворотке крови больных раком молочной железы и экспрессией LeС на опухолевых клетках (иммуногистохимия)

Группы Экспрессия LeC на опухоли (иммуногистохимия) Уровень антител к LeC в сыворотке крови
1 Отрицательная (n=13) 0,72±0,08
2 Мозаичная (n=6) 0,7±0,13
3 Мономорфная (n=12) 0,46±0,06

Экспрессия LeC на опухоли, выявляемая проточно-цитометрическим методом, не была достоверно взаимосвязана (р=0,927) с уровнями сывороточных антител к LeC (рисунок 12), что, по-видимому, обусловлено большей чувствительностью метода проточной цитометрии в сравнении с иммуногистохимией. Это подтверждено при одновременном использовании двух методов: при отрицательной или слабой экспрессии LeC в иммуногистохимии (13% случаев) проточно-цитометрически антитела обнаружены на мембране опухолевых клеток.

 Связь между уровнями антител в сыворотке крови и экспрессией LeC-16

Рисунок 12. Связь между уровнями антител в сыворотке крови и экспрессией LeC на опухолевых клетках, выявляемой методом проточной цитометрии.

При изучении взаимосвязи экспрессии LeC на опухолевых клетках и уровней антител к LeC в сыворотке крови пациенток нами были выделены четыре группы больных. Первая группа - экспрессия LeС на опухолевых клетках и наличие антител к LeС в сыворотке крови – к ней относятся 17 больных (34%), вторая группа – отсутствие экспрессии LeС на опухолевых клетках и низкие уровни антител к LeС в сыворотке крови – 6 больных (12%), третья группа – отсутствие LeС на опухолевых клетках и наличие антител к LeС в сыворотке крови больных – 9 (18%). Эти исследования позволяют выделить наиболее важную для нас четвертую группу пациенток – с экспрессией LeС на опухолевых клетках и низким уровнем антител к LeС в сыворотке крови (частота по данным иммуногистохимии была примерно одинаковой – 35-36%), рисунок 13. В данной группе целесообразно, на наш взгляд, изучение возможностей адоптивной терапии для восполнения дефицита антител к LeС, что может быть действенным в профилактике развития отдаленных метастазов у больных.

 Распределение больных с различной экспрессией LeC на-17  Распределение больных с различной экспрессией LeC на-18

Рисунок 13. Распределение больных с различной экспрессией LeC на опухолевых клетках в сопоставлении с уровнями антител к LeC.

Нами была изучена взаимосвязь экспрессии LeС на опухолевых клетках с морфологическими и клиническими характеристиками опухоли.

Оценивались морфологические характеристики опухоли и ее рецепторный статус, в том числе: гистологический тип опухоли, степень злокачественности, размер рT, рецепторы эстрогенов, прогестерона, Her2/neu. В числе клинических характеристик опухоли были изучены: возраст больных, менструальная функция, критерии T, N, M по классификации TNM, локализация опухолевого процесса в молочной железе, характер выполненного оперативного лечения.

Существенной связи между экспрессией LeС на опухолевых клетках с большинством клинических признаков мы не наблюдали. Вместе с тем, достоверная связь экспрессии LeС на опухолевых клетках отмечена с такой важнейшей характеристикой опухолевого процесса, как поражение регионарных лимфатических узлов. В случаях отсутствия LeС на опухолевых клетках, достоверно чаще выявлялись метастазы в регионарные лимфатические узлы (рисунок 14).

 Связь экспрессии LeC с наличием метастазов в регионарные-19

Рисунок 18. Связь экспрессии LeC с наличием метастазов в регионарные лимфатичеcкие узлы (N+).

При использовании иммуногистохимического метода, экспрессия LeС достоверно чаще отмечена при инфильтративном дольковом раке, рисунок 15.

 Частота экспрессии LeC (иммуногистохимический метод) при-20

Рисунок 15. Частота экспрессии LeC (иммуногистохимический метод) при гистологических вариантах рака молочной железы.

Сопоставление уровней антител к LeС проведено с теми же клиническими и морфологическими характеристиками, что и для экспрессии гликана на опухоли.

Из числа проанализированных признаков только возраст больных был связан с уровнями антител к LeС в сыворотке крови. При практически полном отсутствии антител средний возраст больных был достоверно более высоким. Возможно, именно с этим связано то, что при отсутствии антител все больные были в менопаузе. Однако эти признаки достоверно не взаимосвязаны, рисунок 16.

 Связь уровня антител к LeC с возрастом больных и их-21  Связь уровня антител к LeC с возрастом больных и их-22

Рисунок 16. Связь уровня антител к LeC с возрастом больных и их менструальной функцией.

Таким образом, экспрессия LeC наблюдается на опухолевых клетках у большинства больных раком молочной железы и повышается по мере снижения уровня антител к LeC. Анализ взаимосвязи между этими признаками позволяет выделить группу пациентов (35% больных раком молочной железы) с низким уровнем антител в сыворотке крови и экспрессией LeC на опухоли. На наш взгляд эти больные могут быть кандидатами для адоптивной иммунотерапии специфическими антителами к LeC.

ВЫВОДЫ

  1. Рак молочной железы характеризуется экспрессией гликана LeC на опухолевых клетках: 58% случаев по данным иммуногистохимии, и 72% - по данным проточной цитометрии.
  2. Антиген LeC присутствует как в цитоплазме опухолевых клеток, так и в составе клеточной мембраны.
  3. Уровень сывороточных антител к LeС достоверно обратно пропорционален доле антиген-позитивных опухолевых клеток, выявленных иммуногистохимически, р = 0,015. Независимым параметром является уровень антител.
  4. Антиген LeС иммуногистохимически обнаруживается на опухолевых клетках достоверно чаще при инфильтративном дольковом раке (80,0%) в сравнении с инфильтративным протоковым раком (53,8%), р = 0,043.
  5. При отсутствии экспрессии гликана LeС на клетках рака молочной железы метастазы в регионарные лимфатические узлы наблюдаются достоверно чаще, чем в антиген-позитивной группе (88% и 51% соответственно, р = 0,05).
  6. Уровень антител к LeС в сыворотке крови больных раком молочной железы не взаимосвязан с морфологическими и клиническими характеристиками опухолевого процесса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Я.А.Удалова, Н.В.Бовин, П.Обухова Н.В Шилова, А.М.Ковригина, В.В.Тимошенко, О.Е.Галанина, З.Г.Кадагидзе, В.П.Летягин, Н.Н.Тупицын. Мембранная экспрессия LeС на клетках рака молочной железы. Опухоли женской репродуктивной системы 2009, №3-4, c.43-48.
  2. N.Tupitsyn, N.Bovin, Ya.Udalova. Relationship of tumor Lewis C expression and serum anti- Lewis C in breast cancer patients. AFC 1 ESCCA 2009, POS-CF-13, p.79
  3. Y.Udalova, N.Bovin, O.Galanina, Z.Kadagidze, N.Tupitsyn. Tumor Lewis C expression and serum antibodies to Lewis C in breast cancer patients. ICACT 21-st International congress on anti-cancer treatment. Paris, France, Palais des Congres, 1st-5th February 2010, CF-13, p.193-194
  4. Y.A. Udalova, N.N. Tupitsyn, N.V. Bovin, Z.G. Kadagidze, O.E. Galanina, N.B. Borovkova, V.V. Podolsky, S.A. Shinkarev, N.A. Gadetskaya, V.P. Letyagin, A.A. Subbotina. Tumor-associated glycan Lewis C in breast cancer. Haematopoiesis Immunology, 2009, Vol.6, №2, P.45-54.

Подписано в печать 18.02.2010. Формат 6084/16.
Бумага офисная «SvetoCopy». Тираж 100 экз. Заказ № 119.

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН
115478, Москва, Каширское ш., 24


[1] Автор выражает благодарность П.Обуховой и О.Галаниной за помощь в выделении и эпитопной специфичности человеческих антител, Г.Пазаниной и В.Северову (все из ИБХ РАН) за синтез гликанов; А.Филатову (Институт иммунологии РАМН) за биотинилирование антител.



 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.