WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных

На правах рукописи

Самусенко Алексей Владимирович

Механизмы гибели клеток при действии

оливомицина и его производных

14.00.14 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Российском онкологическом научном центре

имени Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Научный руководитель

доктор медицинских наук А. А. Штиль

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.М. Бухман,

доктор медицинских наук, профессор И. В. Высоцкая.

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет.

Защита диссертации состоится ____ _________ 2009 г. на заседании специализированного Ученого Совета Д.001.017.01 при

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан ____ _________ 2009 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого Совета

доктор медицинских наук Ю.В. Шишкин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Антибиотики-производные ауреоловой кислоты – оливомицин, хромомицин А3 и митрамицин – соединения с высокой биологической активностью. Особую важность представляет оливомицин – соединение, структура которого впервые описана отечественными исследователями. Клинические испытания показали, что монохимиотерапия оливомицином приводит к значительному уменьшению объема опухолей лимфоидной ткани и саркомы матки. Побочное действие препарата – общерезорбтивная токсичность – обусловливает необходимость поиска структурных аналогов этого перспективного вещества с меньшей токсичностью и выяснения молекулярных механизмов гибели клеток при действии этого класса противоопухолевых соединений.

Выявлена внутриклеточная мишень оливомицина – двухцепочечная ДНК, с малой бороздкой которой оливомицин связывается в виде димера в присутствии Mg2+, преимущественно в GC-богатые участки. Этот факт позволяет рассматривать оливомицин как агент, повреждающий структуру дуплекса. Ожидаемыми последствиями такого повреждения следует считать нарушение матричных процессов – транскрипции генов, синтеза ДНК.

Молекулярные механизмы клеточной гибели при действии производных ауреоловой кислоты не изучены. Например, клетки могут погибать по механизму апоптоза, сопровождающемуся активацией каскадов каспаз, митохондриальными событиями и фрагментацией геномной ДНК. Последнее означало бы, что гибель реализуется до необратимых этапов. Это существенно, т.к. в опухолевых клетках могут быть блокированы те или иные пути гибели в результате отбора при прогрессии опухоли и лечебных воздействий.

Цель исследования – получение новых знаний о молекулярных механизмах гибели опухолевых клеток человека при действии оливомицина и его новых производных.

Задачи:

1. Изучить цитотоксичность оливомицина для культивируемых клеток опухолей человека, в том числе сублиний с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости.

2. Установить влияние оливомицина на матричные процессы в бесклеточной системе и в культуре клеток: синтез ДНК и генную транскрипцию.

3. Выявить роль “ядрышкового стресса” в цитотоксичности оливомицина.

4. Исследовать новые производные оливомицина, выбрать менее токсичные и установить механизм снижения цитотоксичности для оптимизации препаратов этого химического класса, пригодных для предклинических испытаний.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Оливомицин – высокоактивное противоопухолевое соединение. В субмикромолярных концентрациях оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток благодаря связыванию с двухцепочечной ДНК и нарушению транскрипции и репликации ДНК.
  2. Введение заместителя в боковую цепь оливомицина снижает связывание с ДНК и уменьшению цитотоксичности, что важно для создания клинических препаратов на основе ауреоловой кислоты.

Научная новизна

Новым являются систематическое исследование молекулярных механизмов гибели клеток при действии оливомицина и его производных. Впервые исследована токсичность новых соединений для культивируемых линий опухолей молочной железы, толстой кишки, меланомы, лейкоза - клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к ряду лекарств.

Впервые определены типы клеточной гибели, вызываемой оливомицином. Установлено, что это соединение вызывает апоптоз в низких концентрациях (в наномолярном диапазоне) в течение 24 часов воздействия. Апоптоз сопровождается межнуклеосомной деградацией ДНК.

При исследовании механизма регуляции матричного синтеза оливомицином впервые установлен эффект оливомицина на транскрипционный аппарат: транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. Впервые проведен детальный анализ нарушений экспрессии генов в ответ на действие оливомицина методом микрочип-анализа. Показано, что соединение ингибирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I и II, но не РНК-полимеразой III.

Впервые выявлена роль нарушений структуры ядрышка - сегрегации его компонентов - как фактора индукции клеточной гибели при действии оливомицина.

Новыми являются данные об активации оливомицином р53-зависимой транскрипции – промотор-репортерной конструкции с р53-зависимой регуляторной областью и гена р21, экспрессия которого опосредована р53.

Впервые показано, что оливомицин непосредственно ингибирует синтез ДНК. Оливомицин вызывает торможение синтеза ДНК в первые часы воздействия.

Впервые изучена серия новых производных оливомицина с модификациями отдельных химических групп в молекуле. Новые производные проявляли меньшую цитотоксичность, чем оливомицин. При этом цитотоксичность новых производных оставалась достаточно высокой (в микромолярном диапазоне концентраций). Снижение цитотоксичности нового производного обусловлено более низкой константой связывания с двухцепочечной ДНК.

Научно-практическая значимость исследования

Изучение механизмов цитотоксического действия оливомицина и его новых производных позволит определить критерии для структурной оптимизации химических соединений и в перспективе создать эффективные препараты для лечения онкологических заболеваний на основе высокоактивного класса ДНК-связывающих производных ауреоловой кислоты.

Апробация работы.

Диссертация обсуждена 17 июня 2009 г. на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии, регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов регуляции иммунитета, биохимии опухолей, канцерогенных веществ, вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, биохимической фармакологии, медицинской химии, лаборатории электронной микроскопии отдела патологической анатомии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Основные материалы диссертации представлены на следующих конференциях: III международный симпозиум по мишень-направленной терапии опухолей TAT-2005, Амстердам, Нидерланды, 2005, “Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им. проф. Н.Н.Петрова”, Санкт-Петербург, 2006 и конференция “Cancer therapeutics: the road ahead“, Капри, Италия, 2007.

Публикации.

По материалам диссертации опубликованы 4 журнальные статьи и тезисы 3 международных конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 100 страницах машинописи и состоит из введения, глав “Обзор литературы”, “Материалы и методы исследования”, “Результаты исследования”, обсуждения и выводов. Работа содержит 22 рисунка и 4 таблиц. Библиографический материал включает ссылки на 135 источников литературы.

Материалы и методы исследования

Клеточные линии.

Использованы линии трансформированных клеток человека: К562 (лейкоз) и вариант К562i/S9, несущий вектор, экспрессирующий Pgp; HepG2 (гепатома); А549 (рак легкого); MCF-7 (рак молочной железы) и сублиния MCF-7Dox, полученная при отборе на устойчивость к доксорубицину - противоопухолевому препарату, транспортируемому Pgp; BE(2)C (нейробластома); A2780 (рак яичника) и резистентный к цисплатину вариант A2780/DDP4; HCT116 (рак толстой кишки) и вариант HCT116WafConALacZ c интегрированной в геном конструкцией, включающей участок промотора гена р21 c р53-зависимыми регуляторными элементами и ген-репортер (-галактозидаза). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 или ее модификациях с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 2мM L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 370С, 5% CO2. В экспериментах использовались клетки в логарифмической фазе роста. Реактивы приобретены в фирме “Sigma” (США) кроме особо оговоренных случаев. Оливомицин и его производные получены в НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН (Tevyashova et al., 2009). Структура соединений подтверждена данными 1Н- и 13С-ЯМР спектроскопии. Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при 40С.

Определение цитотоксичности соединений.

Диапазон цитотоксических концентраций различных веществ оценивали по способности клеток восстанавливать бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия в формазан (МТТ-тест). Клетки в 96-луночных планшетах (5х104 клеток на лунку) инкубировали с исследуемым препаратом в различных концентрациях 24-72 ч. при 370С, 5%СО2. После окончания инкубации в лунки вносили 100 мкг МТТ на 2 ч., растворяли формазан в ДМСО и измеряли оптическую плотность при длине волны возбуждения 540 нм. Цитотоксичность выражали в процентах оптической плотности формазана, образованного клетками, инкубированными с исследуемым препаратом, к оптической плотности формазана в контрольных лунках (Shchekotikhin et al., 2007).

Межнуклеосомная деградация ДНК.

Для изучения межнуклеосомной деградации ДНК клетки (2х106), инкубированные с 100 нМ оливомицина 24-72 ч., осаждали при 1000g, надосадочную жидкость центрифугировали при 12000g в течение 15-20 минут, осадки объединяли и лизировали в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, рН 7,4, 0,35М NaCl, 0,5% NP-40, 2 мМ MgCl2, 1мМ дитиотрейтола. ДНК экстрагировали смесью фенола и хлороформа (1:1) и осаждали этанолом в присутствии 0,3 М ацетата натрия при –200С. Осадок обрабатывали РНК-азой А 20 мин. при 650C и анализировали в электрофорезе в 1,5% агарозном геле.

Исследование клеточного цикла.

Клетки обрабатывали оливомицином или оставляли необработанными (контроль), после окончания инкубации осаждали центрифугированием. К осадку клеток добавляли 0,4 мл буфера, содержащего 0,1% цитрата натрия, 0,3% детергента NP-40, 100 мкг/мл РНКазы А и 50 мкг/мл пропидия иодида и перемешивали на vortex. Исследовали флуоресценцию на проточном цитофлуориметре по FL2, накапливая 10000 событий для каждого образца.

Изучение р53-зависимой активации транскрипции.

Клетки HCT116WafConALacZ обрабатывали 24 ч. митоксантроном (0,5 мкM) или 5-фторурацилом (3 мкM). В опытах по ингибированию транскрипции одновременно с этими препаратами добавляли 100 нМ оливомицина или 5 мкM оливина. После инкубации клетки лизировали в буфере, содержащем 1мM MgCl2, 250 мM Tris-HCl, pH 7,4, 0,02% NP-40 и 0,2% о-нитрофенил--D-галактопиранозид (субстрат -галактозидазы) и инкубировали при 370С 30 мин. Активность -галактозидазы (по оптической плотности лизатов, =414 нм) относили к общей концентрации белка в лизатах (удельная активность). Регуляцию транскрипции (индекс активации) выражали как отношение удельной активности -галактозидазы в клетках, обработанных противоопухолевыми препаратами, к удельной активности фермента в необработанных клетках. Для статистической обработки данных использовали t-критерий Стъюдента (Kaluzhny et al., 2009).

Электронная микроскопия.

Клетки НСТ116 рассевали на предметные стекла, обрабатывали оливомицином и фиксировали глутаровым альдегидом. Трансмиссивную электронную микроскопию выполняли в отделе патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (Н.А.Филиппова) на микроскопе JEM-1200 EX-II (Япония).

Исследование экспрессии генов.

Клетки инкубировали с оливомицином в 6-луночных планшетах (105 на лунку в 3 мл). Тотальную РНК выделяли с помощью TRIzol. Обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию проводили по ранее разработанному протоколу (Walter et al., 1996). Праймеры для анализа экспрессии гена р21: 5’-GGAAGACCATGTGGACCTGT-3’ (прямой) и 5’-ATGCCCAGCACTCTTAGGAA-3’ (обратный). Праймеры для амплификации кДНК бета-актина: 5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’ (прямой) и 5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’ (обратный) (Шишкин и соавт., 2005). Продукты реакции анализировали в 1% агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и анализировали с помощью Gel Documentation System.

Исследование репликации ДНК.

Клетки К562 в 96-луночных планшетах инкубировали с оливомицином или его производным ЛХТА-1207 2 часа, добавляли 1 мкКи 3Н-тимидина и инкубировали 2 часа. Затем клетки лизировали водой, переносили на целлюлозную мембрану, просушивали и переносили во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость. Измеряли количество импульсов в минуту на счетчике фирмы Beckman.

Расчет константы связывания исследуемых веществ с ДНК.

Константу связывания с ДНК определяли по Скэтчарду как изменение интенсивности флуоресценции оливомицина или производного ЛХТА-1297при добавлении ДНК: /[ДНК] = 1/Ka-/Ka; [ДНК]своб.=[ДНК]t-[ДНК]b=[БСА]t-[вещество]t*(I-Io)/(Imax-Io); [вещество] своб =[ вещество t*(Imax-I)/(Imax-Io); [вещество] связ. =[вещество]t*(I-Io)/(Imax-Io); =[ вещество] связ./[вещество]t=[ДНК] связ./[вещество]t. В данных уравнениях Ka – константа связывания, Io, Imax, I – значения интенсивности флуоресценции, минимальной, максимальной и текущей соответственно, [вещество] и [DNA] – концентрации ииседуемого вещества и ДНК, индексы связ. и своб. - концентрации соединения, связанного с ДНК и свободного (Ol’shevskaya et al., 2008).

Результаты исследования

Структура оливомицина представлена на рис.1.

 Структура оливомицина. При исследовании цитотоксичности-0

Рис.1. Структура оливомицина.

При исследовании цитотоксичности установлено, что оливомицин вызывает гибель клеток лейкоза человека (линия К562) в наномолярных концентрациях: доза, снижающая выживание на 50% (IC50), составляет ~ 30 нМ. В этом же диапазоне концентраций (IC50=20-50 нМ) оливомицин вызывал гибель клеток линий HepG2, А2780, A549, MCF-7, BE(2)C и HCT116. Цитотоксичность оливомицина была одинаковой для клеток HCT116, экспрессирующих проапоптотический белок р53, и сублинии с делецией р53. Далее, оливомицин вызывал гибель клеток A2780 (линия дикого типа) и A2780/DDP4, причем цитотоксическое действие оливомицина было даже более выраженным в клетках, устойчивых к цисплатину: IC50 оливомицина для клеток А2780 оказалась в интервале 25-50 нМ, тогда как для А2780/DDP4 – 12,5-25 нМ. Таким образом, развитие устойчивости клеток к цисплатину не сопровождается снижением чувствительности к оливомицину. Не выявлено различий в чувствительности к оливомицину клеток меланомы FEMX и изогенной сублинии, устойчивой к ростингибирующему действию дексаметазона. Эти результаты указывают на широту терапевтического диапазона оливомицина.

Изучение механизмов гибели клеток при действии оливомицина свидетельствует о том, что препарат индуцирует апоптоз. Уже в первые часы воздействия оливомицин вызывал изменения, характерные для апоптоза: краевую конденсацию хроматина и нарушение целостности ядра (рис.2 А,Б).

Рис. 2. Ультраструктура клеток НС1116 после действия оливомицина (100 нМ, 4 ч).

А: краевая конденсация хроматина. Первоначальное увеличение 4000; Б – распад ядерного материала на крупные фрагменты. Первоначальное увеличение 20000.

Более продолжительная (24-48 час.) обработка клеток приводила к межнуклеосомной фрагментации ДНК (рис. 3). К 48 час. воздействия наряду с низкомолекулярными фрагментами наблюдается и деградация высокомолекулярного пула молекул ДНК. Таким образом, гибель клеток при действии оливомицина сопровождается выраженным нарушением целостности ДНК.

 0 24 48 час. Фрагментация ДНК при действии оливомицина. Клетки-3

0 24 48 час.

Рис. 3. Фрагментация ДНК при действии оливомицина.

Клетки линии НСТ116 инкубированы с 200 нМ оливомицина 24-48 час. Анализ целостности ДНК (электрофорез в 1% агарозном геле).

Деградация ДНК подтверждена в исследовании плоидности ДНК в клетках, обработанных оливомицином: суб-G1 пик гистограммы (соответствующий фрагментированной ДНК) обнаруживали через 24-48 час. инкубации с 50-500 нМ оливомицина.

Исследование взаимодействия оливомицина с внутриклеточной мишенью – двухцепочечной ДНК показало, что в присутствии ДНК увеличивается интенсивность полос (=534 нм и =450 нм) в спектре флуоресценции оливомицина, свидетельствуя об образовании комплекса ДНК-оливомицин (рис.4.)

 Спектры флуоресценции оливомицина (8.35·10-7 M) в 10 мM Tris-HCl-4

Рис.4. Спектры флуоресценции оливомицина (8.35·10-7 M) в 10 мM Tris-HCl буфере (pH 7,5), 50 мкM MgCl2.

Константу комплексообразования определяли по методу Скэтчарда, измеряя интенсивность флуоресценции (при =534 нм) при добавлении возрастающих количеств ДНК в раствор оливомицина (рис. 5).

 График Скэтчарда для комплексов оливомицина и ДНК. Вычисленная-5

Рис. 5. График Скэтчарда для комплексов оливомицина и ДНК.

Вычисленная константа связывания Ka=3.66х104 M-1.

Следствием образования комплексов оливомицин-ДНК, важным для установления механизма противоопухолевого действия этого соединения, может являться ингибирование матричных процессов – транскрипции и репликации ДНК. Изучены эффекты оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразами I, II и III. При инкубации клеток MCF-7 в присутствии 12.5 нМ оливомицина на электронных микрофотографиях видна сегрегация ядрышек, проявляющаяся в перераспределении гранулярного и фибриллярного компонентов (рис.6). Этот феномен - признак ингибирования РНК-полимеразы I.

А Б

Рис. 6. Сегрегация ядрышек при действии оливомицина.

Клетки рака молочной железы MCF-7 обработаны 12,5 нМ оливомицина 3 часа и фиксированы для электронной микроскопии. Видно перераспределение компонентов ядрышек (сегрегация).

Для изучения влияния оливомицина на РНК-полимеразу II вначале исследовано действие соединения на р53-зависимую транскрипцию. Для индукции р53 использованы противоопухолевые препараты митоксантрон и 5-фторурацил (5-ФУ). Блокирующее действие оливомицина на р53-зависимую транскрипцию возрастало с увеличением его концентрации и проявлялось уже при 25 нМ. Оливомицин (100 нМ) полностью отменял активируемую 5-ФУ (колонки 3 и 4; p<0.05) или митоксантроном (колонки 5 и 6; p<0.05) транскрипцию -галактозидазы (рис.7). Важно, что оливомицин предотвращал не только индуцибельную (вызванную воздействием индукторов р53) транскрипцию, но и базальную активность промотора (колонки 1 и 2; p<0.05).

Рис. 7. Изменение р53-зависимой транскрипции под действием оливомицина.

1 – необработанные клетки HCT116WafConALacZ, 2 – оливомицин, 3 – 5-ФУ, 4 – 5-ФУ+оливомицин, 5 – митоксантрон,

6 – митоксантрон + оливомицин. Данные 5 независимых экспериментов.

В соответствии с результатами экспериментов в модельной системе – линии клеток со стабильно трансфецированной промотор-репортерной конструкцией, оливомицин подавлял базальную и активированную противоопухолевыми препаратами экспрессию эндогенного гена р21, регулируемого посредством р53 (рис. 8).

 Оливомицин ингибирует экспрессию гена p21. Клетки линии НСТ116-8

Рис. 8. Оливомицин ингибирует экспрессию гена p21.

Клетки линии НСТ116 обработаны согласно указанным подписям. Выделена РНК, проведена обратная транскрипция и ПЦР. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Для изучения активированной транскрипции клетки обрабатывали 0,5 мкМ митоксантрона (митокс.) и 10 мкМ этопозида (этоп.). Концентрация оливомицина 0,5 мкМ. Бета-2-микроглобулин использован в качестве внутреннего контроля ПЦР.

Для выяснения способности оливомицина препятствовать синтезу второй цепи ДНК в бесклеточной системе, мы применили собственный вариант polymerase stop assay. Оливомицин вносили в реакционные смеси в увеличивающихся количествах и проводили ПЦР с праймерами, амплифицирующими кДНК бета-актина. Контролем служили образцы ПЦР в отсутствие оливомицина. Обнаружена зависимость количества продукта амплификации от концентрации антибиотика в реакционной смеси (рис. 9).

 Влияние оливомицина на синтез второй цепи ДНК. В реакционную смесь-9

Рис. 9. Влияние оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

В реакционную смесь добавляли оливомицин в конечных концентрациях 0,1, 1, 10, 100 µМ. В контрольные пробы добавляли эквивалентное количество ДМСО. Проводили ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлена фотография электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. К- ПЦР в отсутствие матрицы.

Для детализации механизмов влияния оливомицина на функции клеток, важные для выживания, проведен микрочип-анализ транскрипции 18 000 генов человека. Для анализа использовалась тотальная РНК клеток линии рака толстой кишки HCT116, инкубированных с 0,5 нМ оливомицина 4-24 час. Оливомицин оказывал значительное ингибирующее действие на ~30% исследованных генов (диапазон ингибирования 2-60 раз). В то же время оливомицин активировал транскрипцию ~40% генов, например, гена каспазы-1 (63-кратная активация) и цитохрома с (27-кратная активация). Таким образом, оливомицин вызывает выраженное влияние на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой II. Это влияние не сводится к ингибированию; антибиотик вызывает дисбаланс в транскрипционной активности клетки.

При изучении действия оливомицина на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III (в ПЦР с праймерами, амплифицирующими гены 7SL, tРНК-Tyr и 5S-РНК, транскрибируемые этой полимеразой II), мы не получили значимых изменений транскрипции этих продуктов. Таким образом, влияние оливомицина на генную транскрипцию разнонаправленно. Если оливомицин блокирует транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой I в наномолярных концентрациях в первые минуты воздействия, то действие соединения на транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой II, разнонаправленно и заключается в подавлении экспрессии одних генов и активации других. На транскрипцию, опосредованную РНК-полимеразой III, оливомицин действия не оказывает.

Комплексообразование с ДНК позволяет предположить, что оливомицин препятствует репликации ДНК. Действительно, эксперименты по включению радиоактивного тимидина в клетки линии НСТ116 свидетельствуют о способности оливомицина подавлять синтез ДНК в логарифмически растущей культуре (рис.10). В качестве положительного контроля ингибирования включения 3Н-тимидина использован афидиколин – блокатор ДНК-полимеразы. Оливомицин (500 нМ, 2 часа) резко снижал синтез ДНК, и этот эффект сохраняется на протяжении последующих часов. Совпадение диапазона концентраций, при которых оливомицин ингибирует синтез ДНК, и концентраций, вызывающих гибель клеток, позволяет утверждать, что одним из механизмов цитотоксичности оливомицина является ингибирование репликации.

Рис. 10. Влияние оливомицина на репликацию (по включению Н3-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали указанными концентрациями оливомицина 2 часа, затем вносили 1 мкКи Н3-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа. О репликации судили по включению радиоактивной метки. Афид, афидиколин, олив. – оливомицин. Представлены данные 3-х экспериментов.

Таким образом, оливомицин обладает важными свойствами: 1) вызывает апоптоз опухолевых клеток человека различной тканевой принадлежности, 2) токсичен для клеток, экспрессирующих механизмы устойчивости к ряду ксенобиотиков, 3) подавляет генную транскрипцию 4) подавляет репликацию ДНК. О высокой противоопухолевой активности препарата свидетельствует то, что оливомицин вызывает указанные эффекты в наномолярных концентрациях в течение относительно кратковременной обработки. Поскольку цитотоксичность, антитранскрипционное и антирепликативное действие оливомицина проявляются в одном и том же диапазоне концентраций, гибель клеток при действии препарата связана с его способностью ингибировать транскрипцию и синтез ДНК.

Для подавления генной транскрипции и репликации, приводящей к индукции клеточной гибели, требуется высокая аффинность взаимодействия оливомицина с ДНК. Следовательно, производные оливомицина с меньшей константой комплексообразования с дуплексом будут менее токсичны. При этом необходимо выбрать производные с приемлемой противоопухолевой активностью для культивируемых опухолевых клеток. В НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф.Гаузе РАМН синтезирован ряд производных оливомицина. На культуре клеток HCT116 изучена способность новых производных вызывать гибель клеток в течение 72 час. воздействия (МТТ-тест). Оказалось, что все новые производные менее токсичны, чем оливомицин. Для детального исследования выбрано соединение ЛХТА-1297 (рис. 11) – производное с объемным адамантильным заместителем в боковой цепи агликона. Опираясь на методы определения противоопухолевых свойств, использованные в экспериментах с оливомицином, мы исследовали способность ЛХТА-1297 связываться с двухцепочечной ДНК, влиять на синтез второй цепи ДНК in vitro и репликацию в логарифмически растущей культуре.

 Структура ЛХТА-1297. Цитотоксичность (IC50) ЛХТА-1297 для клеток-10

Рис. 11. Структура ЛХТА-1297.

Цитотоксичность (IC50) ЛХТА-1297 для клеток НСТ116 составила в среднем 110 нМ, что приемлемо для противоопухолевого препарата, поскольку соединение активно в субмикромолярных концентрациях. Константу связывания ЛХТА-1297 с ДНК определяли по изменению интенсивности флуоресценции (=520 нм) при добавлении ДНК (рис. 12).

Рис. 12. График Скэтчарда для взаимодействия ЛХТА-1297 и ДНК.

Ka1=2.94х103 M-1; Ka2=1.32х104 M-1.

Из рис.12 следует, что константы связывания ЛХТА-1297 с ДНК меньше, константа связывания оливомицина. Это позволило предположить, что влияние ЛХТА-1297 на матричные процессы менее выражено, чем у оливомицина. При проведении ПЦР с праймерами, фланкирующими кДНК бета-актина, в присутствии ЛХТА-1297 видно, что данное производное не препятствует реакции даже в высоких концентрациях (рис. 13). ЛХТА-1297 не влиял на включение клетками 3Н-тимидина в концентрациях до 2,4 мкМ, тогда как оливомицин подавлял репликацию уже в субмикромолярных концентрациях (рис.14). Таким образом, ЛХТА-1297 оказался менее активным, чем оливомицин, и как цитотоксический агент, и как ингибитор синтеза ДНК in vitro и в живых клетках. Ослабление этих свойств у ЛХТА-1297 можно объяснить меньшей

константой связывания с ДНК в сравнении с оливомицином.

Рис. 13. Сравнение влияния ЛХТА-1297 и оливомицина на синтез второй цепи ДНК.

В реакционную смесь добавляли ЛХТА-1297 или оливомицин. Проводили ПЦР, используя кДНК бета-актина в качестве матрицы. Представлен электрофорез продуктов ПЦР в 1% агарозном геле. Дорожки: 1-маркер молекулярных масс ДНК; 2-ДМСО; 3,4,5,6-оливомицин 1, 10, 50, 100 мМ соответственно; 7,8,9,10 - ЛХТА-1297 в концентрациях 1, 10, 50 и 100 мМ соответственно.

 Сравнение влияния ЛХТА-1297 и оливомицина на репликацию ДНК (по-12

Рис. 14. Сравнение влияния ЛХТА-1297 и оливомицина на репликацию ДНК (по включению 3Н-тимидина).

Клетки НСТ116 обрабатывали оливомицином или ЛХТА-1297 2 часа, затем вносили 1 мкКи 3Н-тимидина и продолжали инкубацию 2 часа. Представлены данные 3-х экспериментов.

Выводы
1. Оливомицин - высокоактивный противоопухолевый антибиотик: гибель культивируемых клеток опухолей человека наступает при действии субмикромолярных концентраций соединения. Оливомицин одинаково токсичен для клеток дикого типа и сублиний, устойчивых к действию дексаметазона и цисплатина. Оливомицин не преодолевает множественную лекарственную устойчивость, опосредованную Р-гликопротеином, тогда как делеция р53 не защищает клетки от токсичности оливомицина.
2. Молекулярный механизм гибели клеток при действии оливомицина – апоптоз, сопровождающийся межнуклеосомной деградацией ДНК. 
3.Апоптоз при действии оливомицина вызывается образованием высокоаффинных комплексов соединения с двухцепочечной ДНК, трансактивацией р53-зависимых генов, ингибированием синтеза ДНК и нарушениями транскрипции, опосредованной РНК-полимеразами I и II. 
4. Антитранскрипционное действие оливомицина выражается в индукции сегрегации ядрышка и подавлении экспрессии десятков генов. 
5. Новые производные оливомицина являются менее аффинными ДНК-лигандами, менее токсичны и значительно слабее ингибируют матричные синтезы в бесклеточной системе и в культуре клеток. Достаточна высокая цитотоксичность новых производных  - в микромолярных концентрациях – позволяет утверждать, что модификации химической структуры оливомицина позволят оптимизировать соединения и получить производные, обладающие противоопухолевой активностью при меньшей общерезорбтивной токсичности.

Публикации по теме диссертации

1. Симонова В.С., Самусенко А.В., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Штиль А.А. Внутриклеточная концентрация ксенобиотика как ключевой фактор цитотоксичности: роль Р-гликопротеина. // Доклады Российской Академии наук. – 2004. – Т. 394. – С. 90-93.

2. Tevyashova A.N., Shtil A.A., Olsufyeva E.N., Simonova V.S., Samusenko A.V., Preobrazhenskaya M.N. Carminomycin, 14-hydroxycarminomycin and its novel carbohydrate derivatives potently kill human tumor cells and their multidrug resistant variants. //Journal of Antibiotics. – 2004. – Vol. 57. – Р. 143-150.

3. Симонова В.С., Самусенко А.В., Филиппова Н.А., Тевяшова А.Н., Лынив Л.С., Кулик Г.И., Чехун В.Ф., Штиль А.А. Оливомицин вызывает апоптоз опухолевых клеток и подавляет р53-индуцированную транскрипцию. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – Т. 139. – С. 455-459.

4. Самусенко А.С. Нарушения клеточного цикла и старение клеток в ответ на повреждение ДНК. //Вопросы онкологии. – 2009. – Т. 5.- в печати.

5. Shtil A.A., Zatsepina O.V., Grigorian I.A., Komarov P.G., Samusenko A.V., Simonova V.S., Shishkin A.A., Strom E.N., Azare J., Filippova N.A.. Olivomycin, a DNA binding anticancer agent, is a potent genome-wide transcriptional inhibitor. In: Abstracts of 3d International symposium of targeted anticancer therapies TAT-2005, Amsterdam, the Netherlands. - 2005. – Р. 84.

6. Самусенко А.В., Штиль А.А. ДНК-связывающий антибиотик оливомицин ингибирует транскрипцию и вызывает апоптоз опухолевых клеток. Материалы конференции “Фундаментальная онкология. 2-е Чтения им.проф. Н.Н.Петрова”. Санкт-Петербург, 2006. Вопросы онкологии. – 2006. – Т. 52. - С. 30-31.

7. Shtil A.A., Dezhenkova L.G., Samusenko A.V., Filippova N.A., Tevyashova A.N., Olsufyeva E.N., Preobrazhenskaya M.N. Olivomycin A induces multiple mechanisms of tumor cell death. In: Abstracts of International meeting ‘Cancer therapeutics: the road ahead’. Capri. Italy. – 2007. - Р. 27.



 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.