Токсикологическая характеристика бинарной каталитической системы терафтал+аскорбиновая кислота (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Кульбачевская Наталия Юрьевна

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИНАРНОЙ

КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

«ТЕРАФТАЛ+АСКОРБИНОВАЯ КИСЛОТА»

(клинико-экспериментальное исследование)

14.00.14 – онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

1. Научные руководители: доктор биологических наук

Михайлова Людмила Михайловна

доктор медицинских наук, профессор
Манзюк Людмила Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Богуш Татьяна Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор Самойленко Вячеслав Михайлович

Ведущая организация — ГУ НИИ по изысканию новых антибиотиков

им. Г.Ф. Гаузе РАМН

Защита состоится «__»____________2008 г. на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02) ГУ Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина РАМН, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан «__»_____________2008 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Химиотерапия является одним из ведущих методов в комплексном лечении злокачественных новообразований. Но, несмотря на большое количество применяемых препаратов и их комбинаций, не существует ни одного противоопухолевого препарата, который был бы совершенно безопасен в рекомендуемых для клинического применения дозах. Побочные эффекты при применении противоопухолевых препаратов отмечаются гораздо чаще, чем при других видах лекарственной терапии (Гершанович, 1982). Данные по токсическому действию этих препаратов, полученные на животных, оцениваются в качестве потенциальных рисков для человека при их клиническом применении, и обеспечивают безопасность применения новых препаратов в клинике. Поэтому четкое прогнозирование побочных и токсических эффектов новых препаратов совершенно необходимо при передаче их на I фазу клинического изучения.

В последние годы в терапии злокачественных новообразований интенсивно развивается новое перспективное направление, получившее название бинарная терапия опухолей (БТО). Механизм действия БТО связан с образованием при взаимодействии 2-х компонентов активных агентов (свободные радикалы, -частицы и др.), обладающих противоопухолевым действием. К БТО относятся фотодинамическая терапия, сочетающая применение фотосенсибилизатора с местным лазерным облучением, нейтронозахватная терапия, при которой образование -частиц происходит при ионизирующем облучении опухолевых клеток, содержащих соответствующие соединения, и бинарная каталитическая терапия, при которой образование свободных радикалов происходит при взаимодействии in vivo двух химических веществ. Одной из таких активных бинарных каталитических систем (БКС) является «Терафтал + Аскорбиновая кислота» («ТФ+АК»)(Вольпин, 1996).

1.2. Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось определение безопасности новой противоопухолевой БКС «ТФ+АК».

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Определение количественной токсичности «ТФ+АК» на животных.
2. Установление летальных, максимальнопереносимых, токсических и нетоксических доз «ТФ+АК» на животных. Выявление наиболее чувствительного вида животного к токсическому действию БКС.
3. Определение влияния «ТФ+АК» на функциональное и морфологи-
   ческое состояние органов и систем организма животных.
4. Определение начальной «стартовой» безопасной дозы «ТФ+АК» для I фазы клинического изучения.
5. Анализ токсического действия БКС, выявленного на животных, и прогнозирование токсических эффектов у человека.
6. Установление максимальнопереносимой дозы (МПД) и изучение дозолимитирующей токсичности (ДЛТ) у человека.
7. Определение влияния «ТФ+АК» на функциональное состояние органов и систем организма человека.
8. Сопоставление экспериментально прогнозируемой токсичности «ТФ+АК» с проявившейся на I фазе клинического испытания.

1. 1.3. Научная новизна

Впервые охарактеризованы количественные и качественные показатели токсичности БКС на животных; изучено влияние «ТФ+АК» на системы и органы животных после однократного и многократного применения БКС в зависимости от величины доз. Установлены особенности видовой чувствительности животных к «ТФ+АК». На основании полученных данных по количественной токсичности БКС предложена безопасная начальная (стартовая) доза «ТФ+АК» для человека на I фазу клинического изучения. На основании полученных результатов предклинического токсикологического изучения «ТФ+АК» дан прогноз возможных токсических эффектов у человека при клиническом применении «ТФ+АК». Результаты I фазы клинического испытания определили потенциальную безопасность «ТФ+АК» для человека и явились основанием для передачи БКС на II фазу клинических испытаний. Впервые изучены особенности токсикодинамики «ТФ+АК» при ее применении животным и людям, проведен сравнительный анализ прогнозируемой токсичности БКС у пациентов с реально наблюдаемой при ее клиническом применении и установлены клинико-экспериментальные параллели.

1.4. Научно-практическая значимость

Научно-практическая значимость состоит в получении обязательных данных по доклинической токсикологии БКС «ТФ+АК», необходимых для получения разрешения на ее передачу на клинические испытания, а также данных по токсичности каталитической системы, полученных при проведении I фазы клинических испытаний, необходимых для ее дальнейшего клинического изучения.

Практическая значимость состоит в получении токсико-фармакологи-
ческой характеристики БКС «ТФ+АК», которая имеет прикладное значение. Исследование направлено на разработку и внедрение в медицинскую практику новой противоопухолевой БКС «ТФ+АК».

1.5. На защиту выносятся следующие основные положения диссертации:

• Результаты полного предклинического токсикологического изучения БКС «ТФ+АК»;
• Результаты I фазы клинического изучения БКС «ТФ+АК»;
• Результаты анализа экспериментально прогнозируемой токсичности с наблюдаемой у людей по результатам I фазы клинического испытания.

1.6. Апробация результатов исследований:

Результаты исследований доложены, опубликованы и одобрены на:

Ученом совете НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;

Совместной научной конференции сотрудников НИИ ЭДиТО и НИИ КО ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;

Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты».

1.7. Публикации по теме диссертации:

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

1.8. Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 разделов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и 9 приложений. Список литературы включает 123 источника. Работа включает 18 таблиц и иллюстрирована 9 рисунками.

2. Материалы и методы

Доклинические исследования проведены на здоровых взрослых половозрелых лабораторных животных: 1570 мышах-самцах и 100 мышах-самках гибридах F1(CBA x C57Bl/6J), массой 20-25 г, 440 крысах-самцах неинбредной линии, массой 150-200 г, 40 морских свинках-самках, массой 230-250 г, 27 кроликах породы «Шиншилла», массой 2-3 кг и 17 собаках породы «английский бигл», массой 8-12 кг.

Все исследования проводили на одной серии препарата терафтал (ТФ) – 081197, с использованием официнальных 5% и 10% растворов аскорбиновой кислоты (АК) для инъекции. ТФ растворяли ex tempore в стерильном физиологическом растворе хлористого натрия и в различных концентрациях вводили, с соблюдением правил асептики, внутривенно животным. АК применяли внутривенно с интервалом 1 час после применения ТФ в фиксированном весовом соотношении с ТФ 1:2,2 (по молярному коэффициенту 1:10). Во всех исследованиях токсичности «ТФ+АК» в качестве препарата сравнения использовали ТФ. День первого введения всегда принимали за 0.

Изучение местнораздражающего действия проводили на кроликах. ТФ и «ТФ+АК» вводили в краевую вену уха кролика однократно в 1%, 0,1% и 0,01% концентрациях (по ТФ). АК вводили внутривенно через 1 час после введения ТФ. Оценка местнораздражающего действия БКС проводилась макроскопически и гистологически. Полученные результаты сравнивали с результатами местнораздражающего действия одного ТФ. Контрольным животным вводили физиологический раствор хлористого натрия в том же объеме. Эвтаназия животных проводилась на 3 и 14 сутки после введения препаратов.

Исследования «острой» токсичности проводили на 3 видах живот-
ных – грызунах (мыши, крысы) и негрызунах (собаки). БКС вводили мелким животным внутривенно и внутрибрюшинно в 1% концентрации (по ТФ), крупным животным – внутривенно в 0,1-0,01% концентрациях (по ТФ).

При изучении «острой» токсичности на мелких животных определяли расчетные дозы «ТФ+АК»: LD50 – дозу, вызывающую гибель 50% животных, LD10 – дозу, которая может вызывать гибель 10% животных, LD16 – частично смертельную дозу и LD84 – дозу, близкую к LD100, и условно принятую за абсолютно смертельную дозу. Расчетные дозы препаратов БКС устанавливали по методу Литчфилда и Уилкоксона. Критериями оценки «острой» токсичности на мелких животных служили: число павших и сроки гибели животных, масса тела, клиническая картина интоксикации, поведенческие реакции и аутопсия павших и умерщвленных животных (макроскопическая оценка). Наблюдение за животными после введения «ТФ+АК» проводили в течение 30-90 дней до исчезновения окраски препаратом кожных покровов и слизистых оболочек животных. Выжившие после применения БКС животные умерщвлялись с последующим проведением аутопсии. В течение всего срока наблюдения отмечали: характер фекалиев, изменение массы тела животных, состояние глаз, носа, характер дыхания, подвижность.

Поведенческие реакции мелких животных оценивались по степени возбудимости: уровню двигательной активности и агрессивности, писку животных (вокализации). Обращали внимание на нервно-мышечную возбудимость (спонтанный тремор, судороги, изменение мышечного тонуса). Оценивали рефлексы «позы», «походки», атаксию и другие нарушения. Состояние вегетативных эффектов оценивали по величине зрачка (миоз, мид-риаз), наличию или отсутствию экзофтальма.

При макроскопической оценке павших и умерщвленных животных оценивали состояние внутренних органов и тканей (величина, изменение внешнего вида), полнокровие сосудов и органов, окраску внутренних органов и тканей и другие патологические изменения, вызванные применением БКС.

При исследовании «острой» токсичности на собаках использовали 3 уровня доз: летальную дозу (ЛД), высокую токсическую дозу (ВТД), вызывающую значительные изменения в органах и тканях, и низкую токсическую дозу (НТД), вызывающую незначительные изменения в органах и тканях животных. В качестве исходных доз при изучении «острой» токсичности «ТФ+АК» использовали дозы одного ТФ для собак, установленные в опытах по «острой» токсичности ТФ.

Критериями токсического действия БКС в опытах на собаках служили: гибель, сроки гибели, клиническая картина интоксикации, поведенческие реакции, аутопсия с гистологической оценкой. Клинические проявления интоксикации оценивались как по внешним признакам, так и с помощью клинико-лабораторных и функциональных методов исследования.

При изучении «острой» токсичности на собаках предварительно определялись фоновые показатели, считая результаты, полученные для каждой собаки, контрольными. Оценивалось действие «ТФ+АК» на периферическую кровь, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек, желудочно-кишечного тракта. При гематологическом исследовании периферической крови собак регистрировались: число эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, количество гемоглобина, скорость оседания эритроцитов, время свертывания крови и лейкоцитарная формула. Эти исследования проводили на 3, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 сутки после применения БКС. Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы оценивали с помощью электрокардиографии (ЭКГ) на 3, 7, 30 и 60 сутки после применения БКС. Определяли частоту сердечных сокращений, время систолы, время полного сокращения и систолический показатель. Исследование влияния «ТФ+АК» на артериальное давление (АД) проводили бескровным методом с помощью специального прибора в опытах на крысах при однократном внутривенном введении БКС в МПД и 1/10 LD10. Животным измеряли АД до и после введения препарата на хвостовой артерии с помощью установки Physiograph DMR-4F. Перед измерением АД животное помещалось на столик с подогревом Rat Holder Temperature Control Unit MK IV. Через 15-20 минут на хвост прикреплялся датчик для измерения давления и манжетка. Далее следовала стандартная процедура измерения АД. Наблюдение за животными проводили до восстановления фоновых показателей АД. Параллельно оценивали АД контрольных животных, которым вводили однократно физиологический раствор хлористого натрия.

Функциональное состояние печени, почек, сердца и других органов и систем определяли по биохимическим показателям сыворотки крови собак – активность щелочной фосфатазы (ЩФ), аланиновой и аспарагиновой трансаминаз (АЛТ, АСТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), содержание билирубина, общего белка и альбуминов, глюкозы, мочевины и креатинина на 3, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 сутки после применения БКС.

Для патологоанатомических и гистологических исследований органов и тканей проводили умерщвление собак на 3 и 60 сутки после однократного применения «ТФ+АК».

Действие на желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) определяли по клинической картине интоксикации (появление рвоты, состояние стула), а также по результатам гистологического исследования.

Исследования «хронической» токсичности «ТФ+АК» проводили на крысах и собаках. Крысам «ТФ+АК» вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 10 дней. В качестве контроля использовали интактных животных. Собакам «ТФ+АК» применяли внутривенно ежедневно в течение 10 дней в 0,1% концентрации (по ТФ). При исследовании «хронической» токсичности для собак устанавливали уровни токсических доз: вызывающие значительные токсические изменения – высокие токсические дозы (ВТД); вызывающие слабые незначительные изменения – низкие токсические дозы (НТД), и не вызывающие нарушений – высокие нетоксические дозы (ВНТД). Критериями оценки «хронической» токсичности на крысах явились: число и сроки гибели животных, клиническая картина интоксикации, изменение массы тела, поведенческие реакции и аутопсия с макроскопической и гистологической оценкой. Продолжительность наблюдения за животными – 60 суток.

Внешние проявления интоксикации и изменения в поведенческих реакциях оценивались аналогично таковым при изучении «острой» токсичности «ТФ+АК». При изучении «хронической» токсичности на крысах оценивали действие БКС на периферическую кровь, функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек, ЖКТ. Гематологические исследования проводили на 1, 7, 14, 21, 30, 45 и 60 сутки после многократного применения «ТФ+АК». ЭКГ исследования проводили на 1, 15, 30 и 60 сутки после введения БКС. Исследования по изучению влияния «ТФ+АК» при многократном применении на функциональное состояние органов и систем организма крыс проводили по тестам, представленным в разделе по изучению «острой» токсичности БКС на собаках. Кроме того, при изучении «хронической» токсичности на крысах исследовали влияние «ТФ+АК» на функциональное состояние почек по суточному диурезу и клиническому анализу мочи на 1, 15, 30 и 60 сутки после окончания курса введения «ТФ+АК». Для изучения повреждающего действия БКС на органы и ткани проводили патологоанатомическое вскрытие умерщвленных животных. При этом определяли массу исследуемых органов. Фрагменты органов и тканей крыс брали для гистологического исследования. Умерщвление крыс осуществляли на 1, 30 и 60 сутки наблюдения.

При изучении «хронической» токсичности «ТФ+АК» на собаках на 1, 7, 14, 21, 30 и 60 сутки наблюдения оценивали клиническую картину интоксикации, поведенческие реакции, массу тела животных. При изучении влияния БКС на периферическую кровь использовали гематологические методы, как и при изучении «острой» токсичности. Функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, печени, почек и других органов в «хроническом» эксперименте определяли, используя те же методические подходы, что и при изучении «острой» токсичности БКС. Для определения повреждающего действия «ТФ+АК» при многократном применении на нормальные органы и ткани проводили патологоанатомические исследования павших и усыпленных собак (макроскопическая и морфологическая оценки). Умерщвление собак проводили на 1 и 60 сутки после последнего введения «ТФ+АК». Дозы БКС и ТФ представлены по ТФ и указаны в результатах исследования.

При изучении аллергизирующих свойств ТФ вводили морским свинкам в двух суммарных дозах 21 мг/кг и 2,2 мг/кг (разовые дозы – 7 и 0,7 мг/кг соответственно). Сенсибилизацию проводили на 1, 3, 5 дни. Первое введение – подкожно, 2 и 3 – внутримышечно. Препарат растворяли в физиологическом растворе хлористого натрия и применяли в 0,1% концентрации, рекомендованной для клинического применения и не оказывающей местнораздражающего действия. Вводимые животным разовые объемы – 1,5 и 0,15 мл. Животным положительной контрольной группы вводили сыворотку крупного рогатого скота (СКРС) по 0,5 мл, животным отрицательной контрольной группы вводили физиологический раствор хлористого натрия по 1,5 мл.

Разрешающие дозы препарата равнялись суммарным сенсибилизирующим (21 и 2,1 мг/кг). В связи с большим объемом препарата (4,5 мл) разрешающую дозу ТФ вводили внутрибрюшинно, т.к. внутрисердечное введение растворов в объемах, превышающих 1 мл может привести к гибели животных, а снижение объема за счет увеличения концентрации более 0,1% вызывает местнораздражающее действие. Разрешающая доза СКРС равнялась 1,5 мл, физиологического раствора – 4,5 мл (объем, соответствующий максимальному объему препарата).

После введения разрешающей дозы наблюдение за животными проводили в течение 48 часов [«Руководство по экспериментальному (доклиническому )изучению новых фармакологических веществ», 2005]. Наблюдаемые реакции оценивали по следующей шкале:

- – нет реакции

+ – слабая реакция (беспокойство, почесывание)

++ – выраженная реакция (чихание, кашель)

+++ – сильная реакция (судороги, гибель).

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методам вариационной и альтернативной статистики и методу Стьюдента-Фишера с использованием статистической программы «STATISTICA». За достоверные принимали различия при p0,05.

I фаза клинического изучения препарата ТФ и БКС «ТФ+АК» проведена в НИИ КО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН на базе отделений химиотерапии, фармакологии и химиотерапи, изучения новых противоопухолевых препаратов. Исследование проведено по двум протоколам: применение ТФ в монорежиме (1 протокол) и «ТФ+АК» (2 протокол). Всего в исследование включено 36 больных, которым проведено 58 курсов лечения. У всех больных диагноз злокачественной опухоли подтвержден морфологически. Все больные имели распространенный опухолевый процесс, не подлежали другим методам специального лечения и не получали другого лечения.

Больные подвергались предварительному обследованию, включавшему клинический осмотр с консультациями невропатолога и офтальмолога, ряд лабораторных исследований: клинический анализ крови, биохимический анализ крови. 15 больным проводились тесты, характеризующие состояние свертывающей системы крови – коагулограмма с определением активированного парциального тромбопластинового времени, протромбинового времени, концентрации фибриногена, фибринолитической активности, толерантности плазмы к гепарину, функциональных свойств тромбоцитов а также этаноловый тест. С целью учета степени распространения процесса и его динамики, а также для обнаружения побочных эффектов выполнялись необходимые рентгенологические, ультразвуковые, эндоскопические исследования, компьютерная томография и магнитно-резонансная томография. Специальное противоопухолевое лечение, если оно ранее проводилось, было закончено не позднее, чем за 1 месяц до начала клинических испытаний, проводившихся на фоне прогрессирования опухолевого процесса, но при общем статусе не ниже 70% по шкале Карновского.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты доклинических исследований. В результате изучения местнораздражающего действия ТФ и «ТФ+АК» показано, что ТФ в виде 1% раствора вызывает повреждение стенки вен и образование тромбов, в связи с чем не может быть рекомендован для клинического применения. ТФ в виде 0,1% и 0,01% растворов не вызывает местнораздражающего действия при однократном внутривенном введении животным и может быть рекомендован для клинического применения. АК в 5% концентрации не оказывает влияния на местнораздражающее действие ТФ в каталитической системе.

Результаты изучения «острой» токсичности ТФ и «ТФ+АК» представлены в таблице 1.

Таблица 1. Дозы (мг/кг), характеризующие токсичность ТФ и БКС «ТФ+АК»у животных при однократном внутривенном применении

Вид и пол животных	Характеристика доз
	ТФ						«ТФ+АК»
	ЛД10	ЛД16		ЛД50		ЛД84	ЛД10	ЛД16		ЛД50		ЛД84
Мыши	75	100		110		130	42	47		61		82
Мыши	85	92		115		140	45	49		67		88
Крысы	29	31		34		40	20	21		26		32
Крысы	30	32		37		44	26	27		32		38
Собаки	Уровни доз
	ВНТД		НТД		ВТД	ЛД	ВНТД		НТД		ВТД	ЛД
	1,6		16		48	160	–		1,6		16	160

Дозы каталитической системы представлены по ТФ.

При изучении «хронической» токсичности «ТФ+АК» на крысах и собаках определены 3 уровня токсических доз: ВТД для крыс и собак, НТД для крыс и собак и ВНТД для крыс (табл.2).

Таблица 2. Дозы, характеризующие токсичность БКС «ТФ+АК» на животных при многократном ежедневном введении в течение 10 дней

Вид и пол животных	Путь введения	Уровни токсических доз (мг/кг)
		ВТД		НТД		ВНТД
		раз.	сумм.	раз.	сумм.	раз.	сумм.
Крысы	в/бр	20	200	10	100	2	20
Собаки	в/в	4,8	48	1,6	16	–	–

Анализ данных по количественной токсичности БКС выявил «узкую» широту токсического действия и «узкую» широту смертельного действия «ТФ+АК». Установлено, что БКС при однократном применении токсичнее одного ТФ в 1,5-2 раза. Исключение составляют крысы. Величины количественной токсичности «ТФ+АК» для крыс не отличаются от величины количественной токсичности ТФ для этого вида животного.

В тоже время, сопоставляя результаты количественной токсичности «ТФ+АК» на разных видах животных, установлено, что наиболее чувствительным видом животного к ее токсическому действию, как и к токсическому действию одного ТФ при внутривенном введении в дозах, рассчитанных как на массу тела, так и на поверхность тела, являются крысы (LD50 = 26 мг/кг), затем мыши (LD50 = 61 мг/кг) и собаки (LD = 160 мг/кг).

Основываясь на этих данных, коэффициент видовой чувствительности (КВЧ) «ТФ+АК» определен как отношение LD (условно принятая за LD50) для собак к LD50 для крыс при однократном внутривенном применении и равен 6,15 (из расчета на массу тела животных), что соответствует средне выраженным различиям в видовой чувствительности животных. При определении КВЧ БКС «ТФ+АК» в дозах, рассчитанных на поверхность тела, он составляет величину, равную 20,8, что соответствует выраженным различиям в чувствительности к БКС разных видов животных и указывает на возможность видовой чувствительности человека к «ТФ+АК». Выявленные различия в чувствительности разных видов животных к БКС и ТФ могут быть связаны не только с характером и особенностями их токсического действия, но и с тем фактом, что животные большинства видов синтезируют эндогенную АК в разных количествах. ТФ, являясь сильным генератором высокоактивных свободных радикалов, уже вне каталитической системы способен вступать во взаимодействие с АК, синтезируемой животными, образуя при этом, какое-то количество свободно-радикальных частиц, но недостаточное для противоопухолевого действия. Соотношение препаратов в БКС является оптимальным для реализации противоопухолевого действия. При введении БКС животным АК, синтезируемая ими, по-видимому, может изменять соотношение препаратов в БКС и тем самым влиять на степень ее переносимости. Однако необходимо иметь в виду, что некоторые виды животных в процессе эволюции утратили способность вырабатывать АК. К таким животным относятся: морские свинки, приматы, семговые рыбы и, наконец, человек, степень толерантности которого к АК очень высокая (Cameron, 1979). Этот факт следует учитывать при клиническом применении БКС «ТФ+АК».

На основании полученных данных по количественной токсичности установлено отсутствие зависимости токсичности БКС от пола животных. Определен индекс кумуляции «ТФ+АК». Он составляет величину, равную -5,6% для крыс и -7% для собак, что говорит об отсутствии кумулятивных свойств БКС.

На основании данных по количественной токсичности БКС определена ее начальная («стартовая») безопасная доза для человека на 1 фазу клинических испытаний (Grieshaber, 1986). Она составляет: ТФ – 12,95 мг/м2 + АК – 28,49 мг/м2 с последующей эскалацией доз по модифицированному методу Фибоначчи (Collins, 1986).

Результаты доклинического изучения БКС показывают, что токсические осложнения у животных, вызываемые «ТФ+АК», связаны как с особенностями токсического действия одного ТФ (высокая органотропность), так и с особенностями токсического действия БКС (образование свободных радикалов). Анализ данных показал, что сферами токсческого действия БКС и ТФ являются легкие, печень, почки, свертывающая система крови, сердечно-сосудистая система, кожа, ЦНС. В связи с этим выявлены специфические токсические осложнения у животных при применении БКС, которые имеют видоспецифический, дозозависимый и обратимый характер. Пульмональная токсичность, проявляющаяся у грызунов в виде отека легких, острой пневмонии с геморрагическим плевритом, эмфиземы легких, гепатизации и фиброза легочной ткани; у собак – в виде клинических признаков бронхита или бронхопневмонии при отсутствии плеврального выпота. Рентгенологические исследования позволили заподозрить развитие пульмонита у собак (сопоставление клинических признаков легочной токсичности с изменениями на рентгенограммах). Токсические пульмониты, связанные с действием БКС на легкие возникющее, вероятнее всего, вследствие специфического повреждения капилляров (расширение, увеличение проницаемости) и появления на этом фоне расстройств микроциркуляции с последующим развитием легочной гипоксии, возникают при применении «ТФ+АК» у грызунов в ЛД и МПД, у собак – в ЛД и ВТД. Аналогичные токсические пульмониты способны вызывать и другие противоопухолевые препараты, широко применяемые в онкологической практике (блеомицин, миелосан и др.). Отмечено сходство признаков легочной токсичности «ТФ+АК» и блеомицина, механизм действия которого также основан на образовании свободных радикалов, а причиной токсического действия на легкие является повреждение эндотелия капилляров легких (Гершанович, 1982).

Токсическое действие «ТФ+АК» на сосудистую систему проявляется расширением периферических сосудов, при этом АД резко падает, вызывая у животных быстрый и стойкий гипотензивный эффект. При введении БКС в 1/10 МПД или 1/10 ВТД наблюдается кратковременное повышение АД, стабилизирующим фактором которого является АК.

Кардиотоксическое действие «ТФ+АК» является следствием развития у животных легочных осложнений. При развитии пульмонитов у животных появляются ЭКГ-признаки токсического действия на сердце, что свидетельствует о неспецифическом вторичном действии БКС на функции сердца.

При применении «ТФ+АК» и ТФ в ЛД и ВТД, отмечено повреждающее действие на почки и печень. Токсичность БКС проявляется в увеличении активности АЛТ, уменьшении содержания мочевины и гипопротеинемии, которая возникает за счет уменьшения количества альбуминов, что приводит к нарушению синтезирующей и барьерной функций печени. Уменьшение количества общего белка (альбуминов) в сыворотке крови также говорит о нарушении почечного фильтра и об увеличенной проницаемости стенок капиллярных сосудов.

Нефротоксическое действие «ТФ+АК» является следствием специфического токсического действия ТФ на почки и связано с продолжительным и непосредственным его контактом с почками в процессе длительного выведения из организма, что может привести к нарушению выделительной функции почек.

Сосудистые нарушения, вызванные «ТФ+АК», аналогичны сосудистым нарушениям, вызываемым одним ТФ, но при применении БКС в большей степени выражен геморрагический синдром.

Отмечено действие БКС на периферическую кровь, рассматриваемое как ДЛТ, проявляющееся возникновением у животных отсроченной тромбоцитопении, которой предшествует раннее увеличение числа тромбоцитов при незначительном снижении числа эритроцитов. Зафиксирована тенденция к увеличению общего числа лейкоцитов за счет увеличения абсолютного и относительного числа сегментоядерных нейтрофилов и кратковременной относительной лимфоцитопении.

«ТФ+АК» может оказывать влияние на ЖКТ вследствие токсического действия ТФ, обладающего способностью вызывать у животных тошноту и рвоту (эметическое действие) нервно-рефлекторного генеза.

Установлено дозозависимое влияние БКС на функциональное состояние ЦНС, которое проявляется развитием у животных признаков острой нейротоксичности. Оказывая в ЛД, ВТД и МПД угнетающее влияние на ЦНС, «ТФ+АК» вызывает у животных состояние оглушенности, адинамии, гиподинамии, стойкой спонтанной агрессии, единичные судороги, нарушение рефлекса «норки», изменение рефлекса «позы», подавление физиологических функций: снижение эмоционального статуса, различных видов активности в «открытом поле», уменьшение болевой чувствительности, угнетение поведения при попытке выработки УРПИ (когнитивные функции), гипотермию. Такое подавляющее действие сопровождается усилением напряженности, проявляющейся тенденцией к повышению агрессивности и судорог. Снижение или отсутствие рефлекса «норки», ухудшение когнитивных функций мозга и снижение АД после применения БКС – все это положительно коррелирует с центральным угнетающим действием адренергической системы.

Отмечено дозозависимое проходящее окрашивание кожных покровов и слизистых оболочек животных при применении БКС. Исчезновение окрашивания животных наблюдается через 14-30 дней после применения «ТФ+АК». Окрашивание – фактор, лимитирующий клиническое применение «ТФ+АК».

Все указанные токсические проявления имеют дозозависимый и обратимый характер. Функциональная обратимость токсических эффектов – 14-60 дней. БКС в ВНТД не вызывает токсических эффектов у животных.

БКС «ТФ+АК» более токсична при однократном применении, чем при многократном. При многократном применении некоторые виды ее токсического действия менее выражены (пневмотоксичность, нейротоксичность, сосудистые нарушения) или полностью отсутствуют (кардиотоксичность). Однако, химиотерапевтические исследования показали преимущество в противоопухолевой эффективности БКС при однократном применении. В связи с этим «ТФ+АК» была рекомендована для клинического применения при однократном внутривенном введении.

Анализ данных по предклиническому изучению токсичности «ТФ+АК» выявил отсутствие цитотоксического влияния БКС на нормальные ткани с выраженной пролиферативной активностью. За исключением небольшого количества препаратов, все противоопухолевые цитостатики, используемые в клинике в терапевтических дозах, вызывают угнетение гемопоэза и диспепсический синдром. «ТФ+АК» не вызывает токсической лейкопении и гранулоцитопении. Лишь в ЛД и ВТД зафиксирована кратковременная быстропроходящая тромбоцитопения. Отсутствует интестинальная токсичность и анорексия.

3.2. Результаты I фазы клинического изучения. Лечение по 1 протоколу проведено 12 больным. Стартовая доза ТФ в монорежиме составила 23,13 мг/м2. ТФ растворяли в изотоническом 0,9% растворе хлористого натрия и вводили внутривенно капельно в течение 30-40 минут. Эскалация дозы ТФ в монорежиме проведена до 523% от начальной стартовой. Дальнейшее увеличение дозы признано нецелесообразным, так как ТФ в монорежиме не обладает противоопухолевым действием.

Побочные реакции при применении ТФ в монорежиме:

• у всех больных (100%) отмечено окрашивание мочи в синий цвет;
• окрашивание кожи (с дозы 81 мг/м2 (350%) – у 4 больных (33,3%));
• боли в спине или пояснице — у 2 больных (16,6%);
• флебит или некроз в месте введения — у 2 больных (16,6%);
• кожный зуд или парестезии — у 2 больных (16,6%);
• головная боль после лечения – у 1 больного (8,3%);
• рвота – у 1 больного (8,3%);
• боли за грудиной и бронхоспазм — у 1 пациентки (8,3%);
• коллапс – у 1 пациентки (4%).

При применении ТФ в дозах 23,13 мг/м2 – 80,95 мг/м2 (100-350%), 7 курсов из 13 (53,8%) не сопровождались жалобами со стороны пациентов. Влияния ТФ на основные показатели периферической крови (гемоглобин, лейкоциты, тромбоциты) не отмечено ни у одного больного. У одной больной через 8 минут после начала инфузии ТФ в дозе 146 мг/м2 (523%) отмечено резкое снижение АД. Введение препарата было немедленно прекращено. Путем внутривенного капельного введения жидкости (полиглюкин, раствор глюкозы, физиологический раствор) и преднизолона (90 мг внутривенно) удалось стабилизировать АД и вывести пациентку из тяжелого состояния.

Лечение по 2 протоколу проведено 25 больным, из них одна пациентка ранее получила 2 курса лечения ТФ в монорежиме. Стартовые дозы ТФ и АК составляли 12,95 мг/м2 и 28,49 мг/м2 соответственно. 25 больных получили 45 курсов лечения БКС «ТФ+АК»: по 1 курсу получили 16 больных, 2 курса – 2 больных, 3 курса – 5 больных, 4 курса – 1 больной и 6 курсов – 1 пациент.

ТФ растворяли в изотоническом 0,9% растворе хлористого натрия и вводили внутривенно капельно в течение 40-50 минут. АК 10% или 5% офи-цинальный раствор растворяли в 10-20 мл дистиллированной воды и вводили внутривенно струйно через 20-30 минут после окончания инфузии ТФ.

Программа эскалации доз ТФ и АК выполнена полностью.

Побочные реакции при применении БКС «ТФ+АК»:

• у всех 25 больных (100%) отмечено окрашивание мочи в синий цвет;
• окрашивание кожи – у 17 пациентов (от 58,3 мг/м2 (450%) и выше);
• рвота — у 1 больного (4%);
• головокружение — у 1 больного (4%);
• кожный зуд — у 2 больных (8%);
• крапивница — у 2 больных (8%);
• онемение пальцев стоп 1 степени — у 1 больного (4%);
• боли в мышцах через 24 ч — у 1 больного (4%);
• кратковременное снижение АД — у 2 больных (8%);
• коллапс – у 1 пациентки (4%).

Влияния препаратов БКС на основные показатели периферической крови (гемоглобин, лейкоциты, тромбоциты) не отмечено ни у одного больного.

На основании данных по токсичности БКС, полученных на I фазе клинического изучения рекомендованы дозы для II фазы клинических испытаний – ТФ – 67,9 мг/м2 и АК – 149,6 мг/м2.

Сопоставление экспериментальных и клинических данных.

Анализ данных, полученных при доклинических токсикологических исследованиях и результатов I фазы клинического изучения ТФ и «ТФ+АК» позволяют провести параллели между токсическими эффектами, полученными в эксперименте и клинике.

В таблице представлены данные по токсичности каталитической системы «ТФ+АК», полученные в эксперименте и клинике (I фаза).

ОЖИДАЕМЫЕ токсические эффекты у человека	НАБЛЮДАЕМЫЕ токсические эффекты у человека
Гемодинамические нарушения
Коллапс, отек легких (при нарушении рекомендуемой скорости введения ТФ).	Коллапс.
Пульмональная токсичность
Бронхит, трахеобронхит, бронхопневмония, эмфизема легких, фиброз легких.	Не отмечена.
Изменение коагулирующих свойств крови
Уменьшение времени свертывания крови. При передозировке – развитие токсической коагулопатии, ДВС-синдром.	У 60% больных – снижение концентрации фибриногена и умеренное снижение агрегационных свойств тромбоцитов. У 20% больных – повышение концентрации фибриногена и агрегационных свойств тромбоцитов.
Гематологическая токсичность
Кратковременная эритропения, тромбоцитопения; тромбоцитоз.	Не отмечена.
Сердечно-сосудистая токсичность
Изменения ЭКГ, вторичный дистрофический миокардит, гипотензия.	Кратковременная гипотония.
Печеночная токсичность
Увеличение активности печеночных трансаминаз, развитие гипопротеинемии (альбуминемии).	Не отмечена.
Почечная токсичность
Возможна только при передозировке (отравлении), а также как следствие гемодинамических нарушений.	Не отмечена.
Функциональные нарушения со стороны ЦНС
Угнетающее действие на ЦНС, снижение эмоциональных функций, активности, угнетение когнитивных функций мозга, легкое обезболивающее действие, повышение агрессивности и единичные судороги, проявления периферической нейропатии – изменения, передачи возбуждения через сгибатели.	Головокружение, онемение пальцев стоп, боли в мышцах.
Желудочно-кишечные нарушения
Эметическое действие – рвота и тошнота нервно-рефлекторного генеза.	Рвота и тошнота нервно-рефлекторного генеза.
Окрашивание
Проходящее окрашивание кожи, слизистых глаз, полости рта и наружных половых органов в синий цвет.	Окрашивание кожи, слизистых глаз, полости рта и наружных половых органов в синий цвет.
Аллергические реакции
Препарат обладает слабыми аллергизирующими свойствами	Бронхоспазм (при вдыхании холодного воздуха).
Токсикодермия
Кожный зуд, отеки.	Кожный зуд, крапивница

Отмечено совпадение экспериментальных и клинических данных по следующим видам токсичности: гемодинамические нарушения, которые проявлялись у животных расширением периферических сосудов и резким снижением артериального давления, как в опытах по «острой» и «хронической» токсичности, так и в специальных исследованиях по влиянию ТФ и «ТФ+АК» на АД, проявились при клиническом применении коллапсом, который был зафиксирован в конце инфузии ТФ у 1 пациентки (4%) и кратковременным снижением АД после инфузии БКС у 2 пациентов (8%).

Изменения коагулирующих свойств крови, которые прявлялись у животных дозозависимым изменением числа тромбоцитов и уменьшением времени свертывания крови, также проявились у больных при клинических испытаниях усилением агрегационных свойств тромбоцитов и изменениями в системе гемостаза.

Функциональные изменения ЦНС проявлялись развитием у животных дозозависимых признаков острой нейротоксичности – угнетающим влиянием на ЦНС и подавлением физиологических функций. В ходе I фазы у больных были отмечены следующие побочные эффекты, относящиеся к нарушениям центральной и периферической нервной системы: головокружение (4%), онемение пальцев стоп (4%), боли в мышцах (4%) и парестезии (8%).

Эметическое действие ТФ и «ТФ+АК», проявившееся у больных тошнотой и рвотой в 4% случаев, а также вызывающее у животных тошноту и рвоту имеет, по видимому, нервно-рефлекторное происхождение, так как препарат не вызывает органических изменений в желудочно-кишечном тракте, что подтверждается данными морфологических исследований.

Аллергические реакции, отмеченные в эксперименте в виде слабой реакции проявились у одной больной бронхоспазмом при вдыхании холодного воздуха после инфузии ТФ.

Основной побочный эффект в виде окрашивания кожи и слизистых оболочек в эксперименте носил дозозависимый характер и исчезал у животных через 14-30 дней после применения ТФ и БКС. У больных этот эффект появлялся начиная с дозы ТФ – 58,3 мг/м2 (450% от начальной «стартовой») и был более стойким.

Необходимо, однако, подчеркнуть естественную возможность некоторых расхождений. Так, наряду с воспроизведенными токсическими эффектами, полученными в ходе I фазы клинического изучения ТФ и «ТФ+АК», у человека не были отмечены некоторые токсические эффекты, наблюдаемые у животных, такие как пульмональная, печеночная, почечная и кардиотоксичность. Появление такого рода ложноположительных прогнозов, скорее всего, обусловлено тем фактом, что в ходе I фазы клинического изучения препаратов ДЛТ не была достигнута. Возможно, при дальнейшей эскалации дозы ТФ, либо при его случайной передозировке подобные проявления токсичности будут иметь место.

Выводы

1. Дана предклиническая токсикологическая характеристика бинарной каталитической системы «ТФ+АК» – нового оригинального направления для лечения злокачественных новообразований. Определены показатели количественной и проявления качественной токсичности при применении каталитической системы различным видам животных в зависимости от величины доз и режимов.

2. Определены токсические и переносимые дозы каталитической системы «ТФ+АК» при однократном и многократном применении животным. Показано, что наиболее чувствительным видом животных при пересчете как на массу тела, так и на поверхность тела являются крысы (ЛД50 = 26 мг/кг или 153,4 мг/м2), затем мыши (ЛД50 = 61 мг/кг или 183 мг/м2) и собаки
(ЛД = 160 мг/кг или 3200 мг/м2). Определена «узкая» широта токсического действия каталитической системы, что свидетельствует о существующей опасности передозировки.

3. Установлено, что каталитическая система «ТФ+АК» не обладает кумуляцией токсического действия на разных видах животных. Iк составляет величину, равную – 5,6%, при расчете по данным количественной токсичности для крыс, и величину, равную – 7% для собак, что свидетельствует об отсутствии кумулятивных свойств каталитической системы.

4. Токсическое действие «ТФ+АК» на периферическую кровь, свертывающую систему крови, функции печени, почек, желудочно-кишечный тракт, сердце и дыхательную систему животных является дозозависимым и обратимым.

5. Дозолимитирующими видами токсичности каталитической системы являются: действие на сердечно-сосудистую систему (снижение артериального давления, коллапс), действие на свертывающую систему крови (глубокие изменения в системе гемостаза вплоть до развития острого ДВС синдрома), токсические легочные осложнения (токсические пульмониты).

6. Каталитическая система «ТФ+АК» не оказывает повреждающего действия на нормальные ткани с выраженной пролиферативной активностью (гонады, костный мозг, слизистая оболочка ЖКТ).

7. Окрашивание кожных покровов и слизистых оболочек животных в сине-зеленый цвет, вызываемое терафталом и каталитической системой «ТФ+АК», зависит от дозы ТФ и носит обратимый характер.

8. Для I фазы клинического изучения рекомендована начальная «стартовая» безопасная доза «ТФ+АК»: терафтал – 12,95 мг/м2 + 28,49 мг/м2 аскорбиновой кислоты.

9. При I фазе клинического изучения каталитической системы «ТФ+АК» максимальнопереносимая доза и дозолимитирующая токсичность у человека не достигнуты. Установлено токсическое действие «ТФ+АК» на сердечно-сосудистую систему, свертывающую систему крови и кожу человека, что полностью совпадает с данными предклинических токсикологических исследований. Установлено, что каталитическая система не оказывает побочного действия на периферическую кровь, функциональное состояние печени, почек, сердца и других органов человека.

10. Установлена корреляция между экспериментальным прогнозированием токсических эффектов каталитической системы и их клиническим проявлением, что подтверждается данными по токсичности, полученными на I фазе клинических испытаний «ТФ+АК».

11. Рекомендуемые дозы для II фазы клинических испытаний – терафтал – 67,9 мг/м2 и аскорбиновая кислота – 149,6 мг/м2.

2. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Коняева О.И., Членова Е.Л., Меркулова И.Б., Ермакова Н.П., Кульбачевская Н.Ю., Михайлова Л.М. Изучение влияния терафтала (ТФ) и бинарной каталитической системы «ТФ+АК» на репродуктивную активность крыс. // Российский биотерапевтический журнал. – 2003. – №.1. – Т.2. – С. 28.

2. Членова Е.Л., Коняева О.И., Мещерикова В.В., Ермакова Н.П., Кульбачевская Н.Ю., Михайлова Л.М. Изучение безвредности сочетанного применения каталитической системы «ТФ+АК» и слабой гипертермии. // Российский биотерапевтический журнал. – 2003. – №.1. – Т.2. – С. 48.

3. Кульбачевская Н.Ю., Манзюк Л.В., Михайлова Л.М. Клинико-экспери-
ментальное изучение токсичности противоопухолевой каталитической системы «терафтал+аскорбиновая кислота» («ТФ+АК»). // Российский биотерапевтический журнал. – 2004. – №.2. – Т.3. – С. 70.

4. Меркулова И.Б., Михайлова Л.М., Кульбачевская Н.Ю., Абрамова Т.В., Чикунова Ю.Е., Членова Е.Л., Ермакова Н.П., Коняева О.И., Липатова В.Е. Патоморфологическая оценка местнотканевых реакций при внутриплевральном введении каталитической системы «ТФ+АК» у экспериментальных животных. // Российский биотерапевтический журнал. –2005. – №.1. – Т.4. –С. 62.

5. Михайлова Л.М., Кульбачевская Н.Ю., Меркулова И.Б., Коняева О.И., Членова Е.Л., Ермакова Н.П., Сергеев А.А., Чикунова Ю.Е., Абрамова Т.В., Липатова В.Е. Токсичность противоопухолевой бинарной каталитической системы «Терафтал + аскорбиновая кислота» при внутриплевральном введении животным. // Российский биотерапевтический журнал. – 2005. – №.1. – Т.4. – С. 63.

6. Манзюк Л.В., Бредер В.В., Гершанович М.Л., Бородкина А.Г., Кармановская О.Б., Кульбачевская Н.Ю., Болотина Л.В., Королева Л.А., Корман Д.Б., Маджуга А.В. Результаты I-II фазы клинических испытаний каталитической системы «Терафтал + аскорбиновая кислота». // Российский биотерапевтический журнал. – 2005. – №1. – Т.4. – С. 105-107.

7. Ермакова Н.П., Михайлова Л.М., Трифонов А.И., Малышев И.Ю., Кульбачевская Н.Ю. Влияние терафтала и бинарной каталитической системы «Терафтал+аскорбиновая кислота» на артериальное давление. // Российский биотерапевтический журнал. – 2006. – №1. – Т.5. – С. 14.

8. Ермакова Н.П., Коняева О.И., Членова Е.Л., Кульбачевская Н.Ю., Ми-
шин А.И., Сергеев А.А., Михайлова Л.М. Лечение острых отравлений, вызванных Терафталом. // Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – №.1. – Т.7. – С. 40.