Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов
На правах рукописи
КОЛБАЦКАЯ ОЛЬГА ПАВЛОВНА
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ КОСТНОГО МОЗГА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ
14.01.12 -онкология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2011.
Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ клинической онкологии Учреждения Российской академии медицинских наук Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН (директор — академик РАН и РАМН М.И.Давыдов).
Научный руководитель - доктор медицинских наук,
профессор Н.Н.Тупицын
Официальные оппоненты - доктор медицинских наук,
профессор А.А.Ярилин
доктор медицинских наук
Г.С.Тумян
Ведущее учреждение - ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования
Росздрава
Защита диссертации состоится « 16 » декабря 2011г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета при Российском онкологическом научном центре имени Н.Н.Блохина РАМН по адресу:
115478, Москва, Каширское шоссе, 24.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина РАМН
Автореферат разослан « » 2011г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Барсуков Ю.А.
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.
Костный мозг является гемопоэтическим органом. Вместе с тем в пуле лимфоцитов костного мозга присутствуют зрелые эффекторные клетки иммунной системы, способные осуществлять гуморальный и клеточный иммунный ответ, в терминах онкологии — иммунный надзор за опухолевым процессом. Костномозговые клетки-предшественницы являются мишенью для развития острых лейкозов. Процесс изначально развивается в костном мозге, поэтому представляет большой интерес изучение иммунной системы костного мозга при диагностике острого лейкоза для оценки возможных иммунодефицитных состояний, в условиях которых пролиферирует лейкозный клон.
Существуют единичные публикации о том, что у больных острыми лейкозами (ОЛ) повышено содержание NK-клеток по сравнению со здоровыми донорами в костном мозге при диагностике и в периферической крови при достижении полной ремиссии, а также о функциональной анергии цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и Т-хелперов костного мозга в остром периоде. В литературных источниках нет систематизированных данных об изменении относительного и абсолютного содержания субпопуляций Т-, В-, NK-клеток и CD56+T-клеток костного мозга больных ОЛ по сравнению с нормой, экспрессии на них молекул активации, а также о зависимости количества лимфоцитов от нозологического варианта ОЛ и фенотипических особенностей бластных клеток.
В последние годы появилась возможность точной идентификации популяции бластных клеток и отграничения ее от популяции лимфоцитов иммуноцитофлюориметрическими методами. Для этих целей, помимо характеристик светорассеяния бластных клеток, необходимо учитывать экспрессию на них общелейкоцитарного антигена CD45. Бластные клетки отличаются слабой экспрессией CD45, а зрелые лимфоциты (T, B, NK, CD56+T), напротив, – выраженной экспрессией CD45.
Проведение этих исследований открывает перспективу изучения субпопуляций лимфоцитов костного мозга, а также оценки взаимосвязи и различий между иммунофенотипическими характеристиками бластной и лимфоцитарной популяций клеток костного мозга больных ОЛ.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:
Провести сравнительную характеристику субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
- Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и NK-клеток в костном мозге больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) при диагностике,
- Изучить относительное и абсолютное содержание Т-, В- и NK-клеток в костном мозге больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) при диагностике,
- Сравнить относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных острым миелоидным лейкозом и острым лимфобластным лейкозом,
- Сравнить относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов костного мозга при иммуноподвариантах острого лимфобластного лейкоза и морфоцитохимических вариантах острого миелоидного лейкоза,
- Оценить субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга при диагностике острых лейкозов в зависимости от иммунофенотипа бластных клеток.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) анализа клеток костного мозга 124 больных острыми лейкозами получены новые научные данные. Установлены существенные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ: при ОЛЛ достоверно выше количество Т-хелперов, а при ОМЛ – Т-цитотоксических клеток, что отражается на значимо более высоком иммунорегуляторном индексе у больных ОЛЛ (0,7 ± 0,04 против 1,3 ± 0,2 р=0,005). Помимо этого, в лимфоцитарной популяции костного мозга больных ОЛЛ по сравнению с больными ОМЛ выше относительное и абсолютное количества CD19+CD5+клеток, а также лимфоцитов, коэкспрессирующих маркеры CD38 и HLA-DR (p<0,05).
Впервые установлены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга в зависимости от линейной принадлежности бластных клеток ОМЛ и от иммуноподварианта ОЛЛ. При гранулоцитарных острых лейкозах повышено количество Т-хелперов (CD45+CD4+) в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (М4 и М5 по FAB-классификации, р=0,005). В пределах В-линейных ОЛЛ выявлено, что субпопуляционный состав лимфоцитов взаимосвязан со степенью дифференцировки лейкоза: процент CD45+CD3+ Т-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с больными пре-В-иммуноподвариантом (р=0,016). При В-линейных острых лимфобластных лейкозах отмечено существенное преобладание зрелых Т-лимфоцитов (CD45+CD3+) в сравнении с Т-линейными ОЛЛ (р=0,008).
Впервые нами было выявлено, что при диагностике острых лейкозов взрослых субпопуляционный состав лимфоцитов взаимосвязан с иммунофенотипическими особенностями бластов. Это обнаружено в результате сравнения количества лимфоцитарных популяций как в пределах каждого нозологического варианта ОЛ, так и между ОМЛ и ОЛЛ. Влияние на субпопуляционный состав лимфоцитов оказывает экспрессия на бластных клетках ОМЛ молекул CD7 и HLA-DR. При ОЛЛ субпопуляционный состав Т-клеток был взаимосвязан с экспрессией на бластах молекул HLA-DR, CD13 и CD33.
Полученные нами результаты дают новые факты к пониманию патогенеза острых лейкозов с точки зрения взаимодействия бластных клеток с иммунной системой костного мозга.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Результаты проведенного исследования позволяют более точно оценить состав субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами. Выявление значимых различий между субпопуляциями лимфоцитов при острых миелоидных лейкозах и острых лимфобластных лейкозах позволяет оценить особенности эффекторных субпопуляций лимфоцитов у этих больных. Это, в свою очередь, способствует более углубленному пониманию механизмов противоопухолевого иммунитета у больных ОЛ, что может быть учтено при разработке протоколов иммунотерапии и иммунокоррекции при лечении ОЛ.
Непосредственное практическое значение имеет доказанная возможность проточно-цитометрического определения процентного содержания лимфоцитов костного мозга для последующего их анализа в абсолютных цифрах. Изучены и количественно подтверждены возможности разграничения бластной и лимфоцитарной популяций клеток костного мозга иммуноцитофлюориметрически на основе характеристик рассеяния света лазерного луча клетками и уровней экспрессии ими общелейкоцитарного антигена CD45. В ходе работы при цитометрическом анализе костного мозга выявлены случаи В-линейных и Т-линейных ОЛЛ, когда бластную и лимфоцитарную популяции было невозможно разграничить по уровню экспрессии CD45, так как бласты экспрессировали этот антиген на высоком уровне. Этот результат свидетельствует о необходимости разработки новых методов гейтинга для анализа лимфоцитарной популяции в подобных случаях.
АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация апробирована на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории иммунологии опухолей, клинико-диагностической лаборатории централизованного клинико-лабораторного отдела, отделения химиотерапии гемобластозов, отделения трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии, отделения биотерапии опухолей НИИ КО, отдела химиотерапии гемобластозов НИИ ДОиГ РОНЦ им Н.Н.Блохина РАМН 26 октября 2010 года.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертация изложена на 220 страницах, состоит из введения, 6 глав, в которых представлены данные литературы, результаты собственных исследований, заключения и выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 50 таблицами и 6 рисунками. Библиографический указатель включает 11 отечественных и 201 зарубежный источник.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
Исследуемую группу составили 124 больных острыми лейкозами, проходивших морфоцитохимическую и иммунофенотипическую диагностику в лаборатории иммунологии гемопоэза (руководитель — д.м.н. проф. Н.Н.Тупицын) РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в период с 2004 по 2010 годы. У 57 больных был установлен диагноз острого миелоидного лейкоза, у 67 больных — острого лимфобластного лейкоза. У всех больных диагноз острого лейкоза был установлен впервые, без предшествующего химиолучевого лечения или наличия миелодиспластического синдрома.
Среди обследованных больных в группе ОМЛ было 26 (45,6%) женщин и 31 (54,4%) мужчина, средний возраст у больных ОМЛ – 46,7 года. В группе ОЛЛ также было больше мужчин – 42 (62,7%), чем женщин – 25 (37,3%), средний возраст больных ОЛЛ составляет 33,3 года.
Морфоцитохимическое и иммунофенотипическое исследование бластов проводились в пунктатах костного мозга. Взятие костного мозга в количестве не более 0,5мл осуществлялось в пробирки Vacutainer с сухим ЭДТА. Из доставленных пунктатов готовили мазки для морфологического и цитохимического исследований, производился подсчет миелокариоцитов и иммунофенотипирование. Окраска морфологических препаратов проводилась по методу Паппенгейма.
Подсчет миелограммы проводился двумя морфологами (по 250 клеток) при иммерсионной микроскопии препаратов костного мозга.
При цитохимическом исследовании определяли активность в бластных клетках следующих ферментов: миелопероксидазы (МПО), липидов в реакции с суданом черным Б, -нафтил-ацетат-эстеразы (НЭ) самостоятельно и в реакции с ингибированием фторидом натрия (NaF), PAS-положительного вещества в диффузной/диффузно-гранулярной или гранулярной форме.
Диагноз ОМЛ у всех больных устанавливался на основании критериев ФАБ-классификации и последующих ВОЗ-классификаций (2001 и 2008г.г.), число бластных клеток во всех случаях превышало 20%, таблица 1.
Таблица 1. Распределение больных ОМЛ по FAB-вариантам.
| Вариант | Число больных | |
| Абсолютное | Относительное (%) | |
| М0 (миелобластный с минимальной дифференцировкой) | 5 | 8,8 |
| М1 (миелобластный без созревания) | 21 | 36,8 |
| М2 (миелобластный с созреванием) | 7 | 12,3 |
| М3 (промиелоцитарный) | 7 | 12,3 |
| М4 (миеломонобластный) | 8 | 14,0 |
| М4эоз.(миеломонобластный с эозинофилией) | 4 | 7,0 |
| М5а (монобластный без созревания) | 2 | 3,5 |
| М5б (монобластный с созреванием) | 0 | 0 |
| М6 (эритробластный) | 2 | 3,5 |
| М7 (мегакариобластный) | 1 | 1,8 |
| Всего | 57 | 100 |
Иммунофенотипирование у всех больных проводилось методом прямой иммунофлюоресценции с использованием тройной флюоресцентной метки. Панель моноклональных антител (МКА) включала антитела к общелейкоцитарному антигену CD45, стволовоклеточному антигену CD34, линейно-нерестриктированным антигенам CD38 и HLA-DR, антигенам миелоидной линии дифференцировки CD13 и CD33, моноцитарной – CD14 и CD64, эритроидной – гликофорину А (GlyA), мегакариоцитарной – CD61, общему антигену острого лимфобластного лейкоза CD10 (CALLA), В-линейным антигенам (CD19, CD20, CD22, CD23), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8, CD1a) и NK-клеточному антигену CD56. Маркер расценивался как положительный при обнаружении его более чем на 20% бластов. Для верификации диагноза использовались цитоплазматические и ядерные маркеры CD22, CD3, Tdt, MPO.
Анализ данных иммунофенотипирования проводился методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). Собиралось от 20 000 до 50 000 событий.
Установление гейта бластных клеток проводилось на основании характеристик светорассеяния в метке с общелейкоцитарным антигеном CD45. Бластные клетки характеризуются более слабой экспрессией CD45 по сравнению со зрелыми лимфоцитами и созревающими/зрелыми клетками миелопоэза, рис.1.
Рис.1. Пример гейтинга по CD45/SSC лимфоцитарной и бластной популяций костного мозга при ОЛЛ из В-линейных предшественников (пре-пре-В иммуноподвариант), R1-лимфоциты, R2-бласты.
Распределение больных по подвариантам ОЛЛ представлено в таблице 2.
Таблица 2. Распределение больных ОЛЛ по иммуноподвариантам.
| Вариант | Число больных | |
| Абсолютное | Относительное (%) | |
| Про-В | 6 | 9 |
| Пре-пре-В | 28 | 42 |
| Пре-В | 1 | 1,5 |
| Пре-Т | 32 | 47,5 |
| Всего | 67 | 100 |
В работе нами применены два метода оценки процента лимфоцитов в костном мозге больных ОМЛ — морфологический (по миелограмме) и проточно-цитометрический. Пример цитометрического определения лимфоцитов приведен на рис.2.
Рис.2. Пример цитометрического определения процентного содержания лимфоцитов в костном мозге больного ОМЛ (М3-подвариант):
R1 – гейт лейкоцитов, R2 – гейт лимфоцитов, R3 - ядерные эритроидные клетки, эритроциты, тромбоциты, дебрис. По данным цитометрии количество лимфоцитов среди лейкоцитов – 3,2%. Цитометрически определяемый процент лимфоцитов среди миелокариоцитов составляет 3,13% (с поправкой на содержание ядерных эритроидных клеток по миелограмме).
Оба метода хорошо коррелировали между собой, достоверных различий в процентном содержании лимфоцитов, определяемых морфологически и цитометрически, не установлено. Поскольку цитометрически можно более точно подсчитать процентное содержание лимфоцитов при их низком количестве (при высоком бластозе) ввиду возможности оценки десятков тысяч клеток, то при дальнейшем изложении приводим проценты лимфоцитов в соответствии с цитометрическим методом.
Следует отметить, что в большинстве случаев на основании гейтинга по экспрессии CD45 бластная и лимфоцитарная популяции четко разделялись во всех случаях ОМЛ, а при ОЛЛ в части случаев (исключены из анализа) бласты характеризовались яркой экспрессией CD45-антигена. Подтверждением эффективности разделения служило отсутствие зрелых Т или В-клеток в бластном гейте и, напротив, отсутствие клеток с маркерами предшественников в лимфоцитарном гейте.
Все цитометрические данные были проанализированы на персональном компьютере с использованием программы WinMDI 2.8. Статистическая обработка данных проведена с помощью пакета программ SPSS 15 и включала корреляционный анализ, сравнение средних. При определении достоверности параметрических признаков применялся критерий Стьюдента. Сравнительный анализ непараметрических данных производился при помощи построения таблиц сопряженности признаков (с использованием критерия 2).
Результаты исследования
Нами были изучены морфологические, цитохимические и иммунофенотипические особенности клеток костного мозга 124 больных острым лейкозом при диагностике заболевания. Применен метод гейтинга клеток костного мозга по CD45/SSC и подтверждена возможность разделения лимфоцитарной и бластной популяций по уровню экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45. Это дало нам возможность изучить состав популяций резидуального лимфоцитарного ростка и выявить изменения в их соотношении, характерные для больных острым лейкозом.
Нами также было обнаружено, что не во всех случаях ОЛЛ возможно провести гейтинг по CD45/SSC, так как у половины больных Т-линейным ОЛЛ (59,4%) и у 14,3% больных В-линейным ОЛЛ отмечалась выраженная экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 на бластах, и отделить лимфоцитарную популяцию от бластной было невозможно. Эти случаи исключены из дальнейшего анализа.
В составе лимфоцитарных популяций костного мозга больных острым лейкозом (ОМЛ и ОЛЛ) преобладали зрелые Т-клетки, также присутствовали В-клетки, NK-клетки и CD3+CD56+Т-клетки.
По результатам нашей работы было определено, что существуют достоверные различия количественного состава лимфоцитарных популяций в зависимости от нозологического варианта острого лейкоза. Эта закономерность характерна как для двух основных вариантов (ОМЛ и ОЛЛ), так и для морфоцитохимических вариантов ОМЛ и иммунофенотипических вариантов ОЛЛ. Помимо этого, были выявлены достоверные различия содержания лимфоцитарных популяций в зависимости от особенностей иммунофенотипа бластных клеток.
Острые миелоидные лейкозы
Содержание миелокариоцитов в анализируемой группе больных ОМЛ (57 человек) в среднем составило 116,0 ± 17,1 х 109/л, с широким диапазоном от 7,0 до 625,0 х 109/л. Преобладали случаи с нормоклеточным костным мозгом (в диапазоне 44,5 — 196 тыс/мкл) — 49,2%, у трети больных костный мозг был гипоклеточным — 19 (33,3%) и лишь у 10 (17,5%) гиперклеточным. Бластные клетки в костномозговых пунктатах больных ОМЛ составляли в среднем 72,9 ± 2,7% от всех миелокариоцитов (диапазон 20 — 97,4%).
Относительное содержание лимфоцитов костного мозга, выявляемых морфологически и цитометрически, достоверно не различалось — 6,1 ± 0,8% и 5,5 ± 0,7% (р>0,05). В абсолютных цифрах содержание лимфоцитов, определенных двумя методами, также было практически одинаковым — 4,1 ± 0,7 и 3,7 ± 0,4 тыс/мкл (р>0,05). Пунктаты с нормальным процентом лимфоцитов составляли большинство случаев — 47,4%, со сниженным — 38,6% случаев и с повышенным — всего 14% случаев.
Общее количество Т-лимфоцитов, которое оценивалось нами по экспрессии CD7-маркера, в костном мозге больных ОМЛ составило 68,5 ± 2,1%, по экспрессии CD3-маркера — 75,3 ± 2,0%, по экспрессии CD5-маркера — 72,8 ± 2,0%. Наши результаты соответствуют тем количествам CD7+ и CD3+Т-клеток, которые были определены Ratei R. et al. (2005) при изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОЛ. Уровень Т-хелперов составил в среднем 27,0 ± 1,2%, ЦТЛ — 43,2 ± 1,5% среди лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ. Процент CD56+CD3-NK-клеток в костном мозге больных ОМЛ — 13,4 ± 1,3%, процент CD56+CD3+Т-клеток — 8,4 ± 1,2%, а процент В-лимфоцитов — 11,6 ± 1,1%.
Наши результаты показали, что существует различие в содержании клеток-эффекторов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от морфоцитохимического варианта: относительное содержание Т-хелперов и иммунорегуляторный индекс достоверно выше при моноцитоидном варианте ОМЛ по сравнению с гранулоцитарным, таблица 3.
Таблица 3. Сравнение относительных и абсолютных количеств CD4+ Т-клеток между гранулоцитарными и моноцитоидными ОМЛ.
| Субпопу- ляция | Количест-во | Варианты ОМЛ | Достоверность различия средних | |
| Гранулоцитар-ный | Моноцитоид-ный | |||
| M ± m (n=40) | M ± m (n=14) | |||
| CD4+ | Отн. | 25,8 ± 1,4 | 30,4 ± 2,2 | 0,005 |
| Абс. | 1,0 ± 0,2 | 1,2 ± 0,3 | 0,408 | |
| CD4/CD8 | 0,6 ± 0,04 | 0,9 ± 0,1 | 0,017 | |
В целом, иммунорегуляторный индекс костного мозга больных ОМЛ составил 0,7 ± 0,04, что свидетельствует о преобладании субпопуляции ЦТЛ над Т-хелперами. В случае моноцитоидных ОМЛ CD4/CD8-соотношение составило 0,9 ± 0,1, что означает практически равное количество ЦТЛ и Т-хелперов. Но при гранулоцитарном ОМЛ процент ЦТЛ почти вдвое превышал процент Т-хелперов, о чем свидетельствует CD4/CD8-соотношение 0,6 ± 0,04. Это наблюдение можно объяснить либо большей выраженностью ответа ЦТЛ на развитие лейкемического клона и/или меньшим токсическим воздействием бластов на Т-хелперы в случае моноцитоидных ОМЛ.
Новым фактом, установленным в нашей работе, явилось повышение количества лимфоцитов, коэкспрессировавших линейно не рестриктированные маркеры (CD38+HLA-DR+), в группе больных острыми моноцитоидными лейкозами по сравнению с больными гранулоцитарным ОМЛ (р=0,035), таблица 4.
Таблица 4. Сравнение между гранулоцитарными и моноцитоидными ОМЛ количества лимфоцитов, коэкспрессирующих активационные маркеры CD38 и HLA-DR.
| Субпопуля-ция | Количество | Варианты ОМЛ | Достовер-ность различия средних | |
| Гранулоцитар-ный | Моноцитоид- ный | |||
| M ± m (n=34) | M ± m (n=13) | |||
| CD38+ HLA-DR+ | Отн. | 4,7 ± 0,8 | 8,4 ± 1,8 | 0,035 |
| Абс. | 0,2 ± 0,04 | 0,3 ± 0,1 | 0,102 | |
В настоящее время является общепризнанным тот факт, что экспрессия различных линейно не рестриктированных антигенов (CD34, CD38, CD56) является прогностически значимой при ОМЛ, поэтому мы провели оценку лимфоцитарных субпопуляций в зависимости от особенностей иммунофенотипа бластов. Наше предположение о том, что иммунофенотипические особенности бластных клеток могут влиять на состав лимфоцитарных популяций, подтвердилось полученными результатами.
Изучение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от иммунофенотипических особенностей бластных клеток выявило ряд закономерностей. Так, при коэкспрессии на миелобластах Т-лимфоцитарного антигена CD7 достоверно выше проценты CD5+ и CD8+Т-клеток, а также активированных CD38+ лимфоцитов по сравнению с CD7-негативными ОМЛ, таблица 5.
Таблица 5. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ (М0-М5а варианты) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена CD7.
| Субпопуляции лимфоцитов | Иммунофенотип ОМЛ | Достоверность различия средних | |
| CD7>=20% (n=10) | CD7<20% (n=44) | ||
| CD38 (отн.) | 31,2 ± 6,6 | 17,8 ± 2,0 | 0,010 |
| CD 38 (абс.) | 1,3 ± 0,5 | 0,7 ± 0,2 | 0,110 |
| CD8 (отн.) | 49,4 ± 4,6 | 41,1 ± 1,5 | 0,032 |
| CD8 (абс.) | 2,0 ± 0,5 | 1,4 ± 0,2 | 0,228 |
| CD5 (отн.) | 81,0 ± 4,3 | 70,1 ± 2,2 | 0,038 |
| CD5 (абс.) | 3,2 ± 0,8 | 2,6 ± 0,4 | 0,469 |
Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ в зависимости от уровня экспрессии на бластных клетках антигена HLA-DR показало, что при экспрессии данного антигена имеется статистически достоверное повышение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR (p=0,028). Но абсолютные количества HLA-DR-позитивных лимфоцитов при сравнении достоверно не различаются (р=0,348). При повышенной экспрессии HLA-DR-маркера отмечается достоверное повышение как относительного количества лимфоцитов с активационным маркером CD23 (р=0,004), так и их абсолютного количества (р=0,026), таблица 6.
Таблица 6. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ (варианты М0-М5а) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена HLA-DR.
| Субпопуляции лимфоцитов | Иммунофенотип ОМЛ | Достоверность различия средних | |
| HLA-DR>=20% | HLA-DR< 20% | ||
| HLA-DR (отн.) | 25,6 ± 2,5 (n=38) | 16,0 ± 2,8 (n=16) | 0,028 |
| HLA-DR (абс.) | 0,9 ± 0,2 (n=37) | 0,6 ± 0,2 (n=17) | 0,348 |
| CD23 (отн.) | 6,6 ± 1,7 (n=33) | 21,5 ± 6,3 (n=14) | 0,004 |
| CD23 (абс.) | 0,3 ± 0,1 (n=33) | 1,0 ± 0,5 (n=14) | 0,026 |
Острые лимфобластные лейкозы
Содержание миелокариоцитов в анализируемой группе больных ОЛЛ (67 человек) в среднем составило 176,6 ± 22,5 тыс/мкл с широким диапазоном от 5,0 до 720 тыс/мкл. Преобладали случаи с нормоклеточным костным мозгом (в диапазоне 44,5 — 196 тыс/мкл) — 47,6%, почти в трети случаев ОЛЛ клеточность была повышена (27,2%) и в 20,4% случаев отмечено снижение абсолютного количества миелокариоцитов. Бластные клетки в костномозговых пунктатах больных ОЛЛ в среднем составляли 86,5 ± 1,8% от всех миелокариоцитов (диапазон 28,2 – 99,2%).
Мы определили цитометрическим методом количество лимфоцитов в костном мозге больных ОЛЛ со слабой экспрессией CD45-маркера на бластах аналогично тому, как был проведен подсчет числа лимфоцитов в костном мозге больных ОМЛ. При сравнении между собой относительных количеств лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ, подсчитанных морфологически и цитометрически, достоверных различий не выявлено (4,0 ± 0,6% против 4,8 ± 0,8%, р=0,242). В абсолютных цифрах содержание лимфоцитов по результатам двух методов также было практически одинаковым: 4,0 ± 0,7 тыс/мкл морфологически и 4,4 ± 0,6 тыс/мкл цитометрически (р=0,641). В большинстве пунктатов (61%) отмечалось снижение процента лимфоцитов, нормальное относительное количество лимфоцитов было в 36,4% случаев и повышенное — всего в 2,6% случаев.
Среди субпопуляций костного мозга больных ОЛЛ мы определили 71,1 ± 2,5% CD7-позитивных Т-лимфоцитов, 71,5 ± 2,3% CD3+Т-клеток и 74,1 ± 2,1% CD5+Т-клеток, что также соответствует результатам, приведенным в статье Ratei R. et al. (2005). Уровень Т-хелперов составил 33,0 ± 1,9%, ЦТЛ — 36,3 ± 2,3%. Относительное содержание CD56+CD3-NK-клеток было в среднем 15,2 ± 1,9%, CD56+CD3+Т-клеток — 10,9 ± 5,4%, а уровень В-лимфоцитов — 10,2 ± 1,2%, что соответствует тем количествам CD19+клеток, которые приведены в статье Ratei R. et al.
При изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных В-линейными ОЛЛ нами были выявлены новые данные, свидетельствующие о достоверных различиях в количестве Т-лимфоцитов в зависимости от степени дифференцировки лейкоза. Так, процент CD3+Т-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с больными пре-В-подвариантом (р=0,016), таблица 7.
Таблица 7. Сравнение количества CD3+ субпопуляции Т-лимфоцитов костного мозга у больных В-ОЛЛ (пре-пре-В и пре-В иммуноподварианты).
| Количество CD3+ лимфоцитов | Больные В-ОЛЛ (M ± m) | Достоверность различия средних | |
| Пре-пре-В иммуноподвариант (n=24) | Пре-В иммуно- подвариант (n=13) | ||
| Отн. | 75,2 ± 2,5 | 62,1 ± 5,4 | 0,016 |
| Абс. | 2,6 ± 0,4 | 2,6 ± 0,5 | 0,928 |
Обнаружено, что субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ взаимосвязан с линейной коммитированностью бластных клеток: относительное содержание зрелых CD3+Т-клеток существенно выше при лейкозах из В-линейных предшественников по сравнению с пре-Т-клеточными лейкозами (р=0,006), таблица 8.
Таблица 8. Сравнение количества CD3+ субпопуляции костного мозга при В-линейных и Т-линейных ОЛЛ.
| Количество CD3+ субпопуляции | Больные ОЛЛ (M ± m) | Достоверность различия средних | |
| В-линейные подварианты (n=27) (n=27) | Пре-Т подвариант (n=12) | ||
| Отн. | 75,6 ± 2,1 | 62,1 ± 5,4 | 0,006 |
| Абс. | 2,7 ± 0,4 | 2,6 ± 0,5 | 0,844 |
Мы можем предположить, что бластные клетки ОЛЛ из В-линейных предшественников отличаются либо большей иммуногенностью по сравнению с пре-Т-иммуноподвариантом, либо более высоким уровнем активационно-индуцированного апоптоза Т-лимфоцитов в случае Т-ОЛЛ.
Взаимосвязь лимфоцитарных популяций и особенностей иммунофенотипа бластов характерна также и для ОЛЛ. С помощью непараметрических тестов мы выявили, что у стволовоклеточных ОЛЛ достоверно выше процент CD3+Т-клеток в случае В-линейных по сравнению с Т-линейными лейкозами (76,4 ± 2,2% против 59,3 ± 11,4% р=0,022). Но сравнение абсолютных количеств CD3+Т-клеток между этими группами достоверных различий не выявило.
При CD38-позитивных ОЛЛ количество CD3+Т-клеток достоверно выше в случае В-линейных ОЛЛ по сравнению с пре-Т ОЛЛ (73,3 ± 2,5% против 62,1 ± 5,4% р=0,042). Абсолютные количества CD3+ лимфоцитов не различались (р=0,710).
Этот факт чрезвычайно важен и нуждается в дальнейшем изучении. Дело в том, что в целом по группе экспрессия CD38 не ассоциировалась с большей выраженностью уровней Т-клеток. Однако в группе CD38-позитивных ОЛЛ проценты CD3+ клеток в костном мозге больных В-линейными ОЛЛ были достоверно выше, чем при Т-линейных ОЛЛ, что отражает общую закономерность преобладания CD3+ клеток в костном мозге больных В-линейными ОЛЛ в сравнении с Т-линейными ОЛЛ при диагностике. Важно отметить, что прямой ассоциации экспрессии CD38 с В-линейностью не отмечено. Напротив, частота экспрессии CD38-антигена при лейкозах из В-линейных предшественников составила 69,3%, а при Т-линейных – 100%.
Сравнение CD56-негативных В-линейных ОЛЛ и пре-Т ОЛЛ выявило достоверные различия в субпопуляциях Т-клеток. Относительные количества CD3+ Т-лимфоцитов были достоверно выше в случае В-ОЛЛ (75,0 ± 2,5% против 58,3 ± 5,7% р=0,004), а также и CD5+Т-лимфоцитов (77,4 ± 2,4% против 65,0 ± 4,9% р=0,015). Абсолютные количества CD3+ и CD5+Т-клеток достоверно не различались (р>0,050).
Сравнение субпопуляций костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ
Впервые нами был выявлен факт, что у больных острым лейкозом может существовать значительный дисбаланс содержания клеток-эффекторов, который отмечается преобладанием Т-хелперов или ЦТЛ в зависимости от нозологического варианта ОЛ. При сравнении относительного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ нами было отмечено, что процент ЦТЛ достоверно выше у больных ОМЛ (р=0,011), а процент Т-хелперов достоверно выше у больных ОЛЛ (р=0,006). Достоверные различия иммунорегуляторных индексов CD4/CD8 у этих двух групп больных (р=0,003) подтверждают сделанное нами наблюдение (табл.9). Высокий иммунорегуляторный индекс, полученный нами при оценке Т-клеточных субпопуляций костного мозга больных ОЛЛ (1,3 ± 0,2), свидетельствует о преобладании Т-хелперов над ЦТЛ.
Таблица 9. Сравнение относительных и абсолютных количеств CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток больных ОМЛ и ОЛЛ.
| Субпопуля-ции | Количество лимфоцитов | Больные ОМЛ (n=57) | Больные ОЛЛ (n=34) | Достовер-ность различия средних |
| CD4+ | Отн. | 27,0 ± 1,2 | 33,0 ± 1,9 | 0,006 |
| Абс. | 1,0 ± 0,1 | 1,3 ± 0,2 | 0,160 | |
| CD8+ | Отн. | 43,2 ± 1,5 | 36,3 ± 2,3 | 0,011 |
| Абс. | 1,5 ± 0,2 | 1,3 ± 0,2 | 0,371 | |
| CD4/CD8 | 0,7 ± 0,04 | 1,3 ± 0,2 | 0,003 |
Общее количество Т-клеток, которое оценивалось по экспрессии CD3, CD5 и CD7-антигенов, у больных ОМЛ и ОЛЛ не различалось, как и относительное содержание CD56+CD3-NK-клеток, CD56+Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (p>0,05). Мы можем предполагать, что количественные различия в содержании лимфоцитарных популяций костного мозга при развитии острого лейкоза в основном затрагивают клетки-эффекторы (Т-хелперы и ЦТЛ).
Мы выявили, что в зависимости от варианта острого лейкоза существуют различия в составе В-лимфоцитарной популяции. Так, у больных ОМЛ статистически достоверно выше процент CD22+В-лимфоцитов (12,0 ± 1,5% против 6,5 ± 0,9% р=0,004) по сравнению с больными ОЛЛ, но абсолютные количества данной субпопуляции достоверно не различаются (р=0,084). Напротив, у больных ОЛЛ достоверно выше количество CD19+CD5+субпопуляции В-лимфоцитов как в относительном значении (1,8 ± 0,3% против 4,8 ± 1,1% р=0,002), так и в абсолютном (0,1 ± 0,02тыс/мкл против 0,2 ± 0,06тыс/мкл, р=0,010).
Мы можем предполагать, что лейкемический клон оказывает воздействие и на гуморальное звено иммунитета костного мозга, механизмы которого различаются в зависимости от биологии бластных клеток, варианта ОЛ.
Сравнение количества лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ, коэкспрессирующих маркеры CD38+ и HLA-DR+, показало, что у больных ОЛЛ достоверно выше как относительное количество данной субпопуляции (11,8 ± 2,7% против 5,6 ± 0,8% р=0,004), так и абсолютное (0,6 ± 0,2 тыс/мкл против 0,2 ± 0,04тыс/мкл, р=0,013).
Нами также было выявлено, что состав лимфоцитарных популяций различается при экспрессии линейно не рестриктированных антигенов на бластах, независимо от варианта ОЛ: при HLA-DR-негативных острых миелоидных лейкозах отмечено более высокое содержание Т-лимфоцитов (CD45+CD3+клеток) по сравнению с HLA-DR-негативными острыми лимфобластными лейкозами (75,6 ± 3,9% против 55,2 ± 7,7% р=0,016), в то время как сравнение популяций клеток-эффекторов ОМЛ и ОЛЛ без учета экспрессии HLA-DR-антигена не выявило достоверных различий в количестве CD3+ Т-клеток (р>0,05).
К настоящему времени опубликовано большое количество экспериментальных и исследовательских работ, в которых изучалось взаимодействие лимфоцитарной и бластной популяций костного мозга больных острым лейкозом, где было отмечено выраженное прямое токсическое воздействие миелобластов на лимфоциты и нарушение механизма "двойного распознавания" Т-лимфоцитами лимфобластов. Но, помимо этого, мы можем предположить наличие пока не выявленных механизмов взаимодействия лимфоцитарной и бластной популяций, зависящих от особенностей фенотипа бластов и экспрессии на них линейно не рестриктированных молекул и антигенов, характерных для другого варианта острого лейкоза. Поэтому мы считаем, что изучение одной лишь лимфоцитарной популяции костного мозга больных острым лейкозом без учета особенностей бластной популяции является неполным.
ВЫВОДЫ
1) На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) исследования у 124 больных установлено, что острые лейкозы взрослых характеризуются специфическими для каждой нозологической формы изменениями субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при диагностике заболевания.
2) Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом характеризуется достоверно более высокими уровнями зрелых Т-хелперных клеток (CD45+CD4+) в сравнении с уровнями этих клеток у больных острым миелоидным лейкозом (р=0,011).
3) В костном мозге больных острым миелоидным лейкозом присутствуют зрелые цитотоксические клетки (CD45+CD8+) в значительно большем количестве по сравнению с числом этих клеток у больных острым лимфобластным лейкозом (р=0,01).
4) Иммунорегуляторный индекс (соотношение CD4/CD8) лимфоцитов костного мозга значимо более высокий у больных острым лимфобластным лейкозом, чем у больных острым миелоидным лейкозом (1,3 ± 0,2 и 0,7 ± 0,1, р=0,005).
5) Выявлена взаимосвязь количества лимфоцитов-эффекторов костного мозга с линейной коммитированностью бластных клеток острых миелоидных лейкозов: содержание Т-хелперов и иммунорегуляторный индекс CD4/CD8 значимо более высокие при гранулоцитарных лейкозах в сравнении с лейкозами моноцитарной дифференцировки (р=0,005 и р=0,017 соответственно).
6) Степень активации лимфоцитов костного мозга взаимосвязана с линейной коммитированностью бластных клеток острых миелоидных лейкозов: процент лимфоцитов, коэкспрессирующих маркеры CD38 и HLA-DR, достоверно выше при моноцитоидных ОМЛ, чем при гранулоцитарных (р=0,035).
7) Отмечается зависимость состава Т-лимфоцитов костного мозга от линейной принадлежности бластных клеток ОЛЛ: содержание зрелых Т-лимфоцитов (CD45+CD3+) значимо выше при лейкозах из В-линейных предшественников в сравнении с лейкозами из Т-линейных предшественников (р=0,008).
8) Иммунофенотипические особенности бластных клеток взаимосвязаны с субпопуляционным составом лимфоцитов костного мозга больных острыми лейкозами: при HLA-DR-негативных острых миелоидных лейкозах наблюдается достоверно более высокое содержание CD3+Т-клеток в сравнении с HLA-DR-негативными острыми лимфобластными лейкозами — 75,6 ± 3,9% и 55,2 ± 7,7% (р=0,016).
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
- Колбацкая О.П., Андреева Л.Ю., Серебрякова И.Н., Тупицын Н.Н. Субпопуляции лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами. Детская онкология. 2005; №4. стр.28-33.
- Купрышина Н.А., Френкель М.А., Колбацкая О.П., Андреева Л.Ю., Серебрякова И.Н., Тупицын Н.Н. Липиды в бластах при остром лимфобластном лейкозе. Клиническая геронтология. 2005; т.11. №10. стр.31-34.
- Колбацкая О.П., Серебрякова И.Н., Андреева Л.Ю., Тупицын Н.Н. Иммунный статус костного мозга при диагностике острых лейкозов. Сборник «Актуальные вопросы теоретической, экспериментальной и клинической онкологии. 2006. Оренбург, стр.100-110.
- Колбацкая О.П., Тупицын Н.Н. Лимфоциты костного мозга при диагностике острых лейкозов. Медицинская иммунология. 2006; том8. №2-3. стр.342.
- Лебедева Н.Б., Купрышина Н.А., Колбацкая О.П., Гривцова Л.Ю., Жарова З.Д., Френкель М.А. Сравнительная иммуноморфологическая характеристика бластов при ОЛЛ взрослых. Онкология и радиология Казахстана. 2010. №3-4 (16-17).
