WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов днк (

На правах рукописи

Катаргин Алексей Николаевич

Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки:

гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК

(14.01.12 – онкология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН

(директор — академик РАН и РАМН М.И. Давыдов)

Научный руководитель:

член-корреспондент РАМН,

доктор биологических наук,

профессор Ф.Л. Киселев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.Н. Вейко;

доктор медицинских наук М.Г. Якубовская

Ведущая организация:

Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Защита диссертации состоится “ ” 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета (Д.001.017.01) при РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

(Москва, 115478, Каширское шоссе 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан “ ” 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим агентом рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска заболевания» (HPV 16, 18 и родственные им). Прогрессия опухоли, возникающей из инфицированной HPV клетки, проходит через несколько стадий. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании многих клеточных генов. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических мутаций, так и эпигенетических изменений – эпимутаций. К эпимутациям относится, в частности, нарушение паттерна метилирования ДНК. У млекопитающих энзиматическому метилированию в ДНК подвергается главным образом цитозин в составе динуклеотидов 5 CpG. Метилирование ДНК является одним из механизмов, определяющих тканеспецифическую и аллель-специфичную экспрессию генов (импринтинг), подавление экспрессии генов на инактивированной хромосоме Х. Оно участвует также в обеспечении генетической стабильности клетки, ограничивая гомологические рекомбинации с участием повторяющихся элементов генома (повторов), их распространение по геному, их транскрипцию.

Опухолевые клетки отличаются глобальным изменением паттерна метилирования ДНК, которое носит сложный характер: в одних и тех же опухолях происходят, как глобальное деметилирование генома и активация транскрипции соответствующих генов и повторяющихся элементов, так и гиперметилирование локальных участков генома и подавление транскрипции ассоциированных с ними генов. Исследования последних лет показали, что опухоли разных локализаций могут отличаться по набору генов, подвергающихся аберрантному метилированию. Механизмы, активирующие в опухолевых клетках такие разнонаправленные процессы, как гипер- и гипометилирование ДНК, а также механизмы, определяющие специфичность маркеров метилирования для разных типов опухолей, до сих пор неизвестны. Понимание соотношения процессов гипер- и гипометилирования в опухолевой клетке особенно важно в связи с попытками использовать для противоопухолевой терапии агенты, деметилирующие ДНК (децитабин, 5-аза-цитидин, RG108 и др.).

Ранее в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза при поиске GC–богатых участков ДНК, метилирование которых может быть изменено в опухолях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями, был выявлен макросателлитный 3,3-kb повтор. Успехи в расшифровке генома человека и животных способствовали изменению взгляда на повторяющиеся элементы как на нейтральные или вредные элементы генома. Появились данные о том, что повторы участвуют в структурной организации, эволюции генома, в регуляции экспрессии генов, и эти функции некоторых повторов нарушаются при канцерогенезе. Сведения о статусе метилирования каких-либо повтряющихся элементов ДНК в опухолях шейки матки отсутствуют в литературе.

В связи с выше сказанным, исследование нарушения паттерна метилирования повторяющихся элементов как мишеней аберрантного метилирования ДНК в опухолях шейки матки представляется актуальным.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы состояла в определении статуса метилирования 3,3-kb повторов в нормальных клетках и его изменений в опухолях шейки матки.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

  1. Определить, изменяется ли статус метилирования 3,3-kb повтора в опухолях и клеточных линиях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями шейки матки; определить частоту изменения статуса метилирования 3,3-kb повтора в опухолях шейки матки;
  2. Сравнить частоту изменения статуса 3,3-kb повтора в опухолях шейки матки с частотой изменения статуса метилирования классического сателлитного повтора Sat2, известного маркера деметилирования для опухолей других локализациий;
  3. Исследовать уровень транскрипции генов семейства DUX, локализованных внутри мономера 3,3-kb повтора, в опухолевых и нормальных тканях шейки матки;

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы.

Впервые обнаружено, что в HPV-позитивных опухолях шейки матки и HPV-позитивных клеточных линиях в отличие от гипометилирования классических сателлитных повторов Sat2 происходит гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR, расположенного вблизи кластеров 3,3-kb повторов на хромосомах 4 и 10. S/MAR участвует в прикреплении ДНК к ядерному матриксу. Впервые обнаружена транскрипция генов семейства DUX, локализованных в 3,3-kb повторах, в нормальных тканях шейки матки и подавление их транскрипции в опухолях шейки матки.

Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об организации эпигенома в нормальных клетках и её изменениях в опухолях. Данные о гипометилировании одних повторов и гиперметилировании других повторов в опухолях могут быть использованы при разработке и тестировании ДНК-деметилирующих агентов. Данные об изменении в опухолевых клетках статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR могут служить основанием для исследования роли S/MAR в доменной организации хроматина в опухолевых клетках.

Апробация результатов работы.

Основные результаты работы были представлены на международных научных конференциях и симпозиумах: Second Weissenburg Simposium – Biriciana, May 2004, Bayern, Germany; 6 international multidisciplinary congress “Eurogin”, 2006, Paris, France; 23th international papillomavirus conference, 2006, Prague; 24th international papillomavirus conference, 2007, Beijing; IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск.

Структура и объём работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных в работе материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста, включают 11 таблиц и 10 рисунков. В списке цитируемой литературы приведено 190 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Обзор литературы

Обзор литературы посвящен роли повторяющихся элементов генома в норме и в канцерогенезе. Рассмотрены структура, функциональные особенности и характер метилирования LTR-содержащих и LTR-несодержащих ретротранспозонов и сателлитных повторов в нормальных и опухолевых клетках. Подробно описана структура, локализация, характер экспрессии и патогенетическое значение макросателлитных 3,3-kb повторов.

Материалы и методы

Образцы опухолей и нормальных тканей шейки матки были собраны в НИИКО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН согласно правилам этического комитета РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Подтверждение клинического диагноза и определение гистологического типа опухоли было выполнено в Отделении патоморфологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Всего в работе было использовано 50 образцов опухолей шейки матки I, II и III стадий по классификации международного союза гинекологов и акушеров FIGO (плоскоклеточный рак и аденокарциномы). Опухоли были позитивны по HPV 16 или 18 типа по данным ПЦР. В работе использовали клеточные линии, полученные из опухолей шейки матки: HeLa, SiHa, CaSki, C-33A, C4-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки HeLa и C4-1 содержат геном HPV18, клетки SiHa и CaSki - геном HPV16, C-33A - безвирусная клеточная линия с мутацией в гене р53. В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК и РНК из образцов тканей и клеточных культур гуанидинизотиоцианатным методом; электрофоретическое разделение фрагментов геномной ДНК в агарозном геле; блот-гибридизация по Саузерну; получение радиоактивно-меченых зондов; метод обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР); клонирование продуктов ПЦР; бисульфитная конверсия ДНК с последующим определением нуклеотидной последовательности конвертированной ДНК.

Результаты и обсуждение

Анализ статуса метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом блот-гибридизации по Саузерну.

Статус метилирования 3,3-kb повторов в нормальном цервикальном эпителии не был известен. Для его определения мы использовали ДНК, полученную из здоровых тканей шейки матки от больных с нецервикальной патологией. ДНК обрабатывали метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции с последующей блот-гибридизацией по Саузерну с радиоактивно-меченными зондами (рис. 1 и 2). Для оценки уровня метилирования в каждом образце определяли долю гибридизационного сигнала для высокомолекулярных полос в процентах по отношению к сигналу на всей дорожке автографа. Высокомолекулярными мы считали фрагменты, расположенные выше маркера размером 4,4 т.п.н., т.е. превышающие размер мономера повтора (3,3 т.п.н.).

A
Б A: Схема мономера 3,3 kb повтора. Изломанной стрелкой-1Б

Рисунок 1. A: Схема мономера 3,3 kb повтора. Изломанной стрелкой обозначена открытая рамка считывания DUX4, короткими стрелками – праймеры к транскриптам DUX4, квадратами - гомеобоксы. sq-1, sq-2 и sq-3 – районы, в которых исследовали статус метилирования 3,3 kb повтора методом бисульфитного сиквенирования; зонд-1 и зонд-2 ­– зонды для блот-гибридизации по Саузерну. Б: Сайты узнавания метил-чувствительных эндонуклеаз (обозначены вертикальными линиями).

В нормальных тканях высокомолекулярные фрагменты присутствуют во всех дорожках (рис 2А). Это говорит о том, что3,3-kb повторы существенно, хотя и не полностью, метилированы по сайтам узнавания всех использованных эндонуклеаз (например, 35-66% по эндонуклеазе Nae I), что согласуется с полученными ранее данными для других нормальных тканей (Tsien et al., 2001). Обращает на себя внимание тот факт, что доля сигнала высокомолекулярных фрагментов в нормальных тканях шейки матки от разных индивидуумов существенно варьирует (35%, до 66% ) Это свидетельствуют о том, что паттерн метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен.

В HPV-позитивных линиях, HeLa, SiHa, C-4I и CaSki не было выявлено никаких низкомолекулярных фрагментов (< 3.3 т.п.н.) по всем эндонуклеазам. (рис. 1Б). Это указывает на высокий уровень метилирования 3,3-kb повторов по исследованным CpG-сайтам. В то же время, в HPV-негативной клеточной линии С-33А в отличие от нормальных тканей и других клеточных линий полностью отсутствует гибридизационный сигнал в высокомолекулярной зоне (в районе маркера 23 т.п.н.) для всех эндонуклеаз, что указывает на сильное деметилирование CpG-сайтов.

 Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после-2


Рисунок 2. Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после обработки геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами. A, Б, В – гибридизация с зондом-1 к 5’-концевой области 3,3 kb повторов; A: Nc -нормальные ткани шейки матки от больных с нецервикальными патологиями; цифрами указана доля сигнала в области > 4,1 т.п.н. от общего сигнала дорожки в процентах для Nae I; Б: клеточные линии карцином шейки матки; В: парные образцы (N – прилегающий к опухоли цервикальный эпителий, T – РШМ); М – ДНК фага лямбда / Hind III.

Таким образом, в HPV-позитивных клеточных линиях наблюдалось гиперметилирование 3,3-kb повторов в отличие от HPV-негативной клеточной линии С-33А, в которой было выявлено сильное гипометилирование 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными цервикальными тканями.

При исследовании HPV-позитивных опухолей шейки матки было обнаружено, что ни в одном из 34 образцов уровень метилирования 3,3-kb повторов не снижался до уровня, характерного для HPV-негативной клеточной линии С-33А. В 18 из 34 (53%) опухолей

было выявлено повышение уровня метилирования 3,3-kb повторов (гиперметилирование) по сравнению с прилегающими к опухоли нормальными тканями (рис.2В и рис. 3, первые 18 образцов). Учитывая индивидуальную специфичность паттерна метилирования 3,3-kb повторов, каждый образец опухоли сравнивали с нормальными цервикальными тканями, полученными от того же больного.

Таким образом, в HPV-позитивных карциномах шейки матки преобладающим событием является гиперметилирование 3,3-kb повторов, а не их гипометилирование. Сопоставление частоты гиперметилирования 3,3-kb повторов с размером опухолей и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы у больных не выявило корреляций, что говорит в пользу предположения о раннем нарушении статуса метилирования 3,3-kb повторов в ходе опухолевой прогрессии.

T/N

Рисунок 3. Частота гиперметилирования 3,3-kb повторов в карциномах шейки матки. T/N – отношение доли авторадиографического сигнала в высокомолекулярной области (> 4,3 т.п.н.) в опухоли к аналогичной величине в прилегающем нормальном эпителии (для парных образцов), или к среднему значению для образцов нормального эпителия ШМ от больных с нецервикальной патологией (для клеточных линий). Приведены значения T/N для гибридизации 3,3-kb повторов с зондом-1 (рестрикция по Nae I); P – уровень значимости различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми тканями (парный критерий Вилкоксона).

    1. Подтверждение гиперметилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях и карциномах шейки матки методом бисульфитного сиквенирования ДНК

Для того чтобы убедиться, что метод блот-гибридизации по Саузерну, использованный для определения частоты гиперметилирования в опухолях, адекватно отражает статус метилирования 3,3-kb повторов, использовали метод бисульфитной конверсии ДНК с последующим определением статуса метилирования CpG-сайтов сиквенированием. Для анализа были выбраны два образца опухолей с низким и средним уровнем гиперметилирования 3,3-kb повторов (рис 3, № 409 и 268), прилегающие к ним нормальные ткани шейки матки, образцы нормальных тканей от больных с нецервикальной патологией (Nc-2 и Nc-3) и две клеточные линии с гипер- и гипометилированием 3,3-kb повторов. Исследовали три района в составе мономера повтора (рис.1 А): 1) sq-1 – район, входящий в состав зонда 1, использованного для блот-гибридизации по Саузерну; 2) sq-2 – район, соответствующий 5-концу открытой рамки считывания гена DUX4 с прилежащим к нему промотором; sq-3 – участок 3 конца мономера, деметилирование которого было показано в некоторых глиобластомах (Cadieux et al., 2006). Три исследованных района мономера 3,3-kb повторов были метилированы в разной степени в образцах нормальных тканей шейки матки (рис 4, например, образец Nc-3, 33, 62 и 49% метилированных CpG-сайтов в районах sq-1, sq-2 и sq-3, соответственно). Кроме того, две нормальные ткани статистически достоверно различались между собой по уровню метилирования, по крайней мере, по одному району. Эти результаты подтверждают индивидуум-специфичный характер метилирования 3,3-kb повторов, выявленный методом блот-гибридизации по Саузерну.

Было выявлено статистически значимое гиперметилирование 3,3-kb повторов в исследованных опухолях по сравнению с прилежащими нормальными тканями шейки матки, однако повышение уровня метилирования в трех анализируемых районах было неодинаковым (рис 4, образцы 268 и 409). Уровень метилирования Sq-2, включающего старт транскрипции гена DUX 4, существенно не изменялся в обеих опухолях. Умеренное, но статистически достоверное повышение уровня метилирования района Sq-3 (в 1,3-1,5 раза) наблюдалось в двух опухолях. Таким образом, в отличие от глиом, мы не наблюдали гипометилирования повторов в этом районе в опухолях шейки матки (Cadieux et al., 2006). Значительное повышение уровня метилирования (в 1,6-2 раза) было выявлено в районе Sq-1 в двух опухолях по сравнению с нормальными тканями от этих же больных (N 268 и N409). В наиболее гиперметилированной по данным блот-гибридизации по Саузерну клеточной линии SiHa наблюдался высокий уровень метилирования района Sq-1 (87 %), превышающий уровень метилирования всех 4 исследованных нормальных тканей и 2 опухолей. В единственной клеточной линии С-33 А, не содержащей геном HPV и сильно гипометилированной по данным блот-гибридизации по Саузерну, наблюдалось деметилирование всех трех районов. В наибольшей степени подверженным деметилированию оказался также район Sq-1 (17 % против 22 и 44 % в двух других районах этой клеточной линии). Эти данные свидетельствуют о том, что изменения статуса метилирования 3,3-kb повторов в опухолях происходят сиквенс-специфично.

Таким образом, результаты бисульфитного сиквенирования подтвердили результаты блот-гибридизации по Саузерну. Обобщенные данные по этим двум методам позволили выявить индивидуальную специфичность паттерна метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях и высокую частоту их гиперметилирования в карциномах шейки матки.

Рисунок 4. (см. страницы 10 и 11) Анализ статуса метилирования CpG-сайтов в трех фрагментах 3,3 kb повтора методом бисульфитного сиквенирования ДНК. T – плоскоклеточный РШМ, N – прилегающий цервикальный эпителий, Nc – нормальный цервикальный эпителий от больных с нецервикальной патологией (нумерация как на рис. 2 и 3); Sq-1, Sq-2, Sq-3 - фрагменты 3,3-kb повтора (см. рис. 1); один ряд символов в каждой колонке соответствует одному сиквенированному клону; каждый символ обозначает статус метилирования отдельного CpG-сайта. Указаны проценты метилированных CpG от общего числа анализированных CpG-сайтов. P – уровень значимости различий в доле метилированных CpG-сайтов: горизонтальные стрелки – отличие между разными фрагментами повтора для одного образца; вертикальные стрелки - отличие по одному и тому же фрагменту между образцами (точный критерий Фишера). Приведены только уровни значимости меньше 0,05, в остальных случаях различия между анализируемыми районами недостоверны.

    1. Гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование повторов Sat2 в клеточных линиях и опухолях шейки матки

Высокая частота гиперметилирования ДНК 3,3-kb повторов в опухолях (более 50%), ранее не была описана. Более того, сведения об изменении уровня метилирования каких-либо повторов в опухолях шейки матки к началу нашего исследования отсутствовали. Чтобы выяснить, происходит ли в HPV-позитивных карциномах шейки матки наряду с гиперметилированием 3,3-kb повторов гипометилирование других повторов, описанное для других типов опухолей, исследовали статус метилирования сателлитных повторов Sat2. Для анализа использовали обработку образцов ДНК эндонуклеазой BstBI с последующей блот-гибридизацией по Саузерну (рис 5). В нормальных цервикальных тканях, прилегающих к опухоли, не было выявлено низкомолекулярных фрагментов ДНК. Это указывает на то, что повторы Sat2 в них сильно метилированы, как и в других нормальных тканях человека. В то же время в опухолях (Т409, Т415 и Т436) и клеточных линиях карцином шейки матки наблюдалась значительная фракция низкомолекулярных фрагментов (ниже 4,4 т.п.н.), указывающая на гипометилирование повторов Sat2. Гипометилирование повторов Sat2 было обнаружено в 17 из 21 случаев (81%, рис. 5Б). В клеточных линиях, как в HPV-позитивных (HeLa, SiHa, CaSki, C-4-I), так и в HPV-негативной С-33А, также наблюдалось гипометилирование Sat2 по сравнению с условно нормальными цервикальными тканями (рис. 4В)

Таким образом, в HPV-позитивных опухолях шейки матки, как и во всех исследованных ранее типах опухолей, с высокой частотой происходит деметилирование повторов Sat2.

 A Б В Гипометилирование повторов Sat2 в карциномах-6 A
 Б В Гипометилирование повторов Sat2 в карциномах шейки-7 Б В

Рисунок 5. Гипометилирование повторов Sat2 в карциномах шейки матки. N – прилегающий к опухоли цервикальный эпителий, T – РШМ. A: Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после обработки геномной ДНК метил-чувствительной эндонуклеазой Bst BI, гибридизация с олигонуклеотидом специфичным для Sat2; М – ДНК фага лямбда / Hind III. Б и В: T/N – отношение доли авторадиографического сигнала в высокомолекулярной области (> 4,3 kb) в опухоли к аналогичной величине в прилегающем нормальном эпителии (для парных образцов), или к среднему значению образцов нормального эпителия ШМ (для клеточных линий). P – уровень значимости различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми тканями (парный критерий Вилкоксона).

Профиль метилирования генов и повторов в опухолях шейки матки

Для 13 образцов из нашей выборки, был известен статус метилирования семи генов-супрессоров опухолевого роста и двух типов повторов (Таблица 1). Из представленных данных видно, что в одной и той же опухоли могут одновременно присутствовать гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование повторов Sat2 (таблица 1, образцы 289, 235, 284). В то же время, в ряде опухолей наблюдалось изменение статуса только одного из повторов (образцы 234, 438, 431). Это указывает на независимое изменение статуса метилирования двух типов повторов в опухолях. Гиперметилирование 3,3-kb повторов наблюдается в опухолях с разным числом гиперметилированных маркеров (от 1 до 4), т.е. оно не является следствием общей активации системы метилирования в этих опухолях.

Анализ паттерна метилирования отдельных опухолей показал, что опухоли отличаются друг от друга по набору генов и повторов, изменивших статус метилирования по сравнению с нормальными прилегающими тканями, т.е. каждая опухоль имеет индивидуальный паттерн метилирования. Таким образом, этот анализ говорит не только о независимом характере процессов гипо- и гиперметилирования в опухолях, но и о независимости изменения статуса метилирования каждого маркера от других маркеров. Уникальный для каждой опухоли паттерн метилирования говорит скорее о нарушении в опухоли специфической для каждого гена и повтора эпигенетической регуляции, чем об общем нарушении работы системы метилирования.

№ случая тип HPV RARb2 * TIMP2 * HMLH * FHIT * TIMP3 * E-cad * INK4a (p16) * * 3,3-kb Sat2 (демет.
)
1 282 16 н/т
2 286 16 н/т
3 289 18
4 275 16 н/т
5 234 18
6 411 16 н/т
7 235 16 н/т
8 450 16 н/т
9 284 16 н/т н/т
10 438 16 н/т н/т
11 444 16
12 434 16
13 431 16

Таблица 1. Профиль метилирования генов и повторов в опухолях шейки матки.

Черный прямоугольник – гиперметилирование; серый прямоугольник – гипометилирование; белый прямоугольник - статус метилирования неизменен по отношению к прилегающим нормальным тканям; «н/т» - не тестировали.

* Использованы данные, полученные в лаборатории ранее.

** Во всех исследованных опухолях отсутствует метилирование промотора гена р16 и присутствует мРНК и белок р16 (Ivanova, T. A., Katargin, et al., 2007).

Исследование уровня экспрессия генов DUX в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом ОТ-ПЦР

В составе копии 3,3-kb повтора, клонированной из области D4Z4, ранее была обнаружена безинтронная открытая рамка считывания, названная DUX4. Низкий уровень транскриптов генов семейства DUX, в том числе и DUX4, был обнаружен ранее в некоторых тканях взрослого организма. Чтобы установить, присутствуют ли какие-либо транскрипты генов семейства DUX в нормальных тканях и опухолях шейки матки, и зависит ли уровень их транскрипции от статуса метилирования 3,3-kb повторов, мы анализировали уровень транскрипов методом ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к гену DUX4.

Продукты ОТ-ПЦР ожидаемых размеров были выявлены в нормальных тканях шейки матки и большинстве условно нормальных тканях шейки матки, прилежащих к опухолям (рис. 6; таблица 2). Учитывая низкий уровень экспрессии мРНК в нормальных тканях, для подтверждения подавления транскрипции генов DUX в опухолях ПЦР продукты переносили на мембрану и гибридизовали с P32-меченным олигонуклеотидом, специфичным к гену DUX4. В 30 из 44 (68,2%) карцином шейки матки продукты ПЦР или отсутствовали, или были слабее, чем в прилегающих тканях (рис. 6, образцы № 436 и 409, соответственно, таблица 2). Продукты ПЦР отсутствовали в 4 HPV-позитивных клеточных линиях и в 5 из 19 (26,3%) нормальных цервикальных тканей, прилежащих к опухолям. Последнее наблюдение говорит о раннем подавлении транскрипции генов DUX в процессе развития опухолей шейки матки.

Для подтверждения того, что в ходе ПЦР амплифицировались лишь мРНК, родственные генам DUX, продукт ПЦР (299 п.н.), полученный с кДНК С-33А, был клонирован, и 11 копий сиквенированы. Все копии были высокогомологичны генам DUX4 (90-100 %) и DUX10 (89-99,7%).

Таким образом, показано присутствие транскриптов, высокогомологичных генам DUX4 и DUX10 в нормальных тканях шейки матки. Полное отсутствие транскриптов или снижение их уровня более чем в 3 раза по сравнению с условно нормальными тканями шейки матки было обнаружено в 68% цервикальных карцином.

 Анализ экспрессии генов DUX в нормальном эпителии-8

Рисунок 6. Анализ экспрессии генов DUX в нормальном эпителии ШМ, РШМ и цервикальных клеточных линиях методом ОТ-ПЦР. Электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР с DUX4-специфичными праймерами (размер продукта ПЦР - 299 п.н.); Р32 - результаты гибридизации продуктов ПЦР с DUX-специфичным радиоактивным олигонуклеотидным зондом (верхний ряд в каждой панели), RT-обратная транскриптаза. GAPDH – ген «домашнего хозяйства», контроль количества кДНК. CaSki + 5-aзa-дC (клетки CaSki, обработанные в ходе культивации 5-аза-дезоксицитидином. Т –опухоль, N прилегающий к опухоли нормальный эпителий, Nc-1, Nc-2 и Nc-3 –эпителий ШМ от больных с нецервикальной патологией.

        1. Таблица 2. Экспрессия генов семейства DUX в опухолях, клеточных линиях и нормальных тканях шейки матки.
Образцы кол-во Присутствие транскриптов Подавление транскрипции
Нормальные ткани шейки матки 5 5
Нормальный эпителий, прилегающий к РШМ 19 14 5 (26,3 %)**
Рак шейки матки (РШМ) 44 14 30 (68,2 %)*
Клеточные линии РШМ HPV-позитивные линии HPV-негативная линия 4 1 0 1 4** 0

* отсутсвие транскриптов или снижение их уровня не менее чем в 3 раза по сравнению с прилежащим к опухолям нормальным эпителием;

**транскрипты не были обнаружены

    1. Сравнение статуса метилирования и транскрипции 3,3-kb повторов в клеточных линиях и опухолях шейки матки

Для 24 парных образцов были получены одновременно данные по статусу метилирования 3,3-kb повторов и транскрипции генов DUX (таблица 3). Во всех 10 образцах опухолей с гиперметилированием 3,3-kb повторов экспрессия DUX отсутствовала. В 4 гиперметилированных клеточных линиях экспрессия DUX также отсутствовала и была выявлена только в сильно гипометилированной линии C-33A. Таким образом, гиперметилирование 3,3-kb повторов во всех случаях сопровождается подавлением экспрессии генов DUX. Тем не менее, в 8 из 18 (44%) опухолей с подавлением экспрессии DUX не наблюдалось изменений статуса метилирования повтора. Это указывает на то, что помимо метилирования ДНК существуют другие механизмы подавления транскрипции генов DUX в опухолях.

При обработке клеток деметилирующим агентом 5-аза-дезоксицитидином реактивация транскрипции DUX наблюдалась только в одной из 4 гиперметилированных линий, CaSki (рис.6.) Этот эксперимент подтверждает предположение о том, что в подавлении транскрипции генов в карциномах DUX могут играть роль, как гиперметилирование ДНК, так и другие механизмы.

Таблица 3. Корреляция между гиперметилированием 3,3-kb повторов и подавлением экспрессии генов семейства DUX в опухолях шейки матки и клеточных линиях.

Экспрессия мРНК Гиперметилирование
есть нет
Карциномы шейки матки
отсутствует / подавлена 10 8
не изменена* 0 6
Всего 10 14
Клеточные линии
отсутствует / подавлена не изменена* Всего 4 0 4 0 1 1

* не изменена по сравнению с нормой

    1. Анализ статуса метилирования S/MAR в клеточных линиях карцином шейки матки с гипо- и гиперметилированием 3,3-kb повторов

S/MAR был обнаружен в локусах 4q35 и 10q26 перед кластерами 3,3-kb повторов (Petrov A et al., 2006; Рис. 7, А). S/MAR (от англ. scaffold/matrix attachment region) – это специфический участок ДНК, узнаваемый белками, обеспечивающими связывание ДНК с ядерным матриксом. Связывание ДНК с ядерным матриксом приводит к доменной организации хроматина. Известно, что некоторые белки, участвующие в прикреплении ДНК к ядерному матриксу, связываются со своими сайтами узнавания только в том случае, если они метилированы. Однако, ничего неизвестно о влиянии статусов метилирования S/MAR на прикрепление их к ядерному матриксу. Данные о статусе метилирования S/MAR в нормальных тканях и об изменении этого статуса при каких-либо патологиях, а также о корреляции статусов метилирования S/MAR и 3,3-kb повторов отсутствуют. Для того чтобы установить наличие или отсутствие связи между статусом метилирования 3,3-kb повторов и S/MAR на 4 и 10 хромосомах, мы выбрали две клеточные линии карцином шейки матки, резко различающиеся по уровню метилирования 3,3-kb повторов - SiHa и С-33А. В клетках SiHa 3,3-kb повторы сильно метилированы, а клетках С-33А они сильно деметилированы по сравнению с нормальными тканями шейки матки и клеточной линей SiHa (рис. 2). На рис. 7. представлены результаты бисульфитного сиквенирования S/MAR на 4 и 10 хромосомах. Уровни метилирования S/MAR в двух клеточных линиях карцином шейки матки достоверно различаются и коррелируют с уровнем метилирования 3,3-kb повторов каждой из них (S/MAR - 14 % и 54 %; район Sq-1 3,3-kb повтора - 17 %, и 87% для С-33А и SiHa, соответственно). Эти данные впервые демонстрируют, что в клеточных линиях карцином происходит изменение статуса метилирования S/MAR и это изменение может происходить координировано с изменением статуса метилирования 3,3-kb повторов: наблюдается или гипо- или гиперметилирование и S/MAR и 3,3-kb повторов одновременно.

A Б Анализ статуса метилирования S/MAR в нормальных тканях и-9
Б
Рисунок 7. Анализ статуса метилирования S/MAR в нормальных тканях и клеточных линиях карцином шейки матки методом бисульфитного сиквенирования. А. Схема прителомерного локуса хромосомы 4. Стрелками указано расположение генов в локусе. Увеличенным шрифтом обозначен исследованный район S/MAR (NT 022792 GenBank); Б. Статус метилирования S/MAR. Белый кружок - неметилированный CpG-динуклеотид, черный кружок - метилированный CpG-динуклеотид в последовательности S/MAR; каждый ряд кружков представляет один клон; цифры – количество метилированных CpG-динуклеотидов в процентах от общего числа анализированных CpG-динуклеотидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Снижение транскрипции 3,3-kb повторов за счет метилирования ДНК или других механизмов происходит с высокой частотой (68%) в карциномах шейки матки. Какова же роль гиперметилирования 3,3-kb повторов и подавления их транскрипции в канцерогенезе?

Мы обнаружили транскрипты генов семейства DUX в нормальных тканях шейки матки. Транскрипты генов семейства DUX были выявлены ранее в отдельных фетальных и взрослых тканях (Beckers et al., 2001; Ding et al., 1998; Lyle et al., 1995). Однако до сих пор не удалось получить каких-либо доказательств того, что белковые продукты генов DUX присутствуют в нормальных клетках. Некоторые свойства белков DUX известны в настоящее время. Продукты экзогенной трансляции мРНК генов DUX4 и DUX10 обладают свойствами транскрипционных факторов. DUX4 обладает проаптотическими свойствами, а его прямая транскрипционная мишень – ген PITX1, является активатором гена р53 и негативным регулятором RAS-сигнального пути. Не исключено, что белок DUX4 может присутствовать в нормальных тканях в крайне низких концентрациях и может быть одним из первичных спусковых факторов, запускающих каскад транскрипционных факторов, регулирующих онкогены и опухолевые супрессоры. Высокая частота снижения транскрипции в цервикальных опухолях (68%) может служить косвенным указанием на существование белков DUX в нормальных тканях.

Существует альтернативная точка зрения на функцию 3,3-kb повторов. Предполагают, что 3,3-kb повторы выполняют регуляторную функцию, не связанную с кодированием белков, и в нормальных клетках участвуют в формировании и поддержании структуры хроматина в субтеломерных локусах 4 и 10 хромосом, возможно, тем самым, подавляя экспрессию генов, расположенных в этих районах (Tawil and Van Der Maarel, 2006). В связи с этим представляет интерес дальнейшее исследование вопроса о том, влияет ли изменение статуса метилирования 3,3-kb повторов и S/MAR на изменения доменной организации локуса в опухолевых клетках и экспрессию генов в нем.

Таким образом, для получения ответа на вопрос о том, какую роль играет гиперметилирование 3,3-kb повторов и подавление их транскрипции при канцерогенезе, необходимы дальнейшие исследования.

  1. Выводы
    1. Впервые в HPV-позитивных опухолях шейки матки и в 4 HPV-позитивных клеточных линиях обнаружено гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Гиперметилирование 3,3-kb повторов наблюдается в 53% опухолей.
    1. Статус метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен; изменение статуса метилирования в опухолях происходит сиквенс-специфично.

3) Обнаружено гипометилирование повторов Sat2 по сравнению с нормальными тканями в 80 % случаев рака шейки матки и в 5 клеточных линиях. Гиперметилирование 3,3-kb повторов и гипометилирование Sat2 в клетках рака шейки матки происходят независимо.

4) Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования по сравнению с нормальными тканями специфического участка ДНК S/MAR, расположенного на хромосомах 4 (4q35) и 10 (10q26).

5) Транскрипты, высокогомологичные генам DUX4 и DUX10, обнаружены в нормальных тканях шейки матки; подавление транскрипции генов DUX обнаружено в 68 % опухолей шейки матки как с гиперметилированием 3,3-kb повторов, так и без него.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Киселева Н.П., Катаргин А.Н., Гра Д.В. Эпигеномика и канцерогенез: уникальность паттерна метилирования ДНК опухолевой клетки.// Вопросы онкологии. – 2007. – № 1. – C. 14.
  1. Киселева Н.П., Катаргин А.Н., Гра Д.В. Уникальность паттерна метилирования опухолевой клетки.// Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. – 2008. – C. 228.
  1. Ivanova T., Kisseljova N., Petrenko A., Katargin A., Kisseljov F. New cellular sequences hypermethylated in cervical tumors.// Second Weissenburg Simposium, Biriciana, Bayern, Germany. – 2004. – p. 49.
  1. Kisseljov F., Kisseljova N., Katargin A., Volgareva G., Golovina D., Skvortsov D., Rubtsova M., Zvereva M. Epigenetic changes in cervical carcinomas.// 6th International Multidisciplinary Congress “Eurogin”, Paris, France. – 2006. – FC54-12.
  1. Kisseljov F., Kisseljova N., Katargin A., Ivanova T., Volgareva G., Golovina D., Donzova O., Skvortsov D. Epigenetic markers of cervical tumor progression.// Abstracts of 23th International Papillomavirus Conference, Prague. – 2006. – P-287.
  1. Ivanova T., Golovina, D., Zavalishina, L., Volgareva, G., Katargin, A., Andreeva Y., Frank G., Kisseljov F., Kisseljova N. Up-regulation of expression and lack of 5' CpG island hypermethylation of p16 INK4a in HPV-positive cervical carcinomas.// BMC Cancer. – 2007. – Vol. 7. – p. 47.
  1. Katargin A., Kisseljova N. Both Hypomethylation And Hypermethylation of DNA Repeats In HPV-Positive Cervical Carcinomas.// Abstracts of 24th international papillomavirus conference, Beijing. – 2007. – PS21-02.
  1. Katargin A., Pavlova L., Kisseljov F., Kisseljova N. Hypermethylation of genomic 3.3-kb repeats is frequent event in HPV-positive cervical cancer.// BMC Medical Genomics. – 2009. – Vol. 2. – p. 30.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.