Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злок а чественных новообразований
На правах рукописи
УДК 615.277.3.015.2:616-006-092.4/.9
Каршиева Саида Шамильевна
Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злокачественных новообразований
14.00.14 – онкология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009 г.
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Трещалина Елена Михайловна
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАЕН Барышников Анатолий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Переверзева Элеонора Рафаиловна
ГУН НИИ по изысканию новых
антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН
доктор медицинских наук, Доненко Федор Витальевич
ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН
Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава
Защита диссертации состоится «_____»_____________2009 г.
на заседании диссертационного cовета (Д.001.017.02)
ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН
(115478, Москва, Каширское шоссе, 24).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического
научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН.
Автореферат разослан « _____» _____________ 2008 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Самостоятельное применение цитодифференцирующих агентов (ЦДА) в онкологии связано с доказанным феноменом программированной гибели некоторых злокачественных клеток путем запуска терминальной дифференцировки. В последнее время активно изучается возможность повышения эффективности лечения некоторых распространенных форм злокачественных новообразований путем комбинированного применения их друг с другом и с химиотерапией [Абелев Г.И., 2001 г.; Волкова М.А., 2002 г.;]. Особую актуальность приобретает совершенствование схем комбинированного лечения с использованием ЦДА, отличающихся сравнительно низкой токсичностью [Уоррел Р.П., 2002 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. Механизм антипролиферативного действия одного из них был изучен на примере полностью трансретиноевой кислоты (ПТРК) - натурального метаболита витамина группы А. Противоопухолевый эффект ПТРК осуществляется за счет прямой стимуляции дифференцировки и индукции апоптоза в клетках больных острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ). Данные доклинического изучения продемонстрировали также перспективность поиска новых ЦДА в ряду производных ПТРК, например 13-цис-ретиноевой кислоты. Определенные надежды связывают с включением производных ретиноевой кислоты в схемы лечения рака почки [Волкова М.А. и др. 2001 г.; Савченко В.Г. и др. 2004 г.; Bartolini G. et al., 2004]. Другим известным примером использования дифференцирующего подхода в терапии иммунозависимых злокачественных опухолей является терминальная дифференцировка клеток под влиянием цитокинов. Дифференцировка, индуцированная интерфероном (ИФН), хорошо изучена в культуре клеток волосатоклеточного лейкоза человека. Этот эффект рассматривается как результат активации внутриклеточных ферментов, обуславливающих функции клеток [Рукавицин О.А. и др., 2004 г., Кадагидзе З.Г., 2003 г.; Caraglia M. et al., 2005]. Улучшение результатов лечения больных с диссеминированной меланомой и раком почки за счет использования 2-ИФН позволило добиться длительных ремиссий и рекомендовать этот препарат в качестве «золотого» стандарта лечения [Носов Д.А., 2005 г.].
Среди новых ЦДА наиболее интересны и перспективны низкомолекулярные соединения, в числе которых трихостатин, депудецин, трапоксины, апицидины и производные гидроксамовой кислоты [Monneret C., 2005]. В настоящем исследовании углубленно изучено одно из соединений этого типа - новый отечественный оригинальный псевдопептид дикарбамин (Dcr), представляющий собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты. Анализ консервативного лечения некоторых форм рака, в числе которых меланома, рак почки и ОПЛ, показывает, что, несмотря на увеличение числа лекарственных средств (ЛС) различных групп, результаты остаются неудовлетворительными. Отдельные схемы химиотерапии (ХТ), иммунотерапия или цитодифференцирующая терапия не приводят пока к полным клиническим эффектам. Поэтому в настоящее время особую актуальность приобретает вопрос совершенствования комбинированного лечения за счет сочетания ХТ и иммунотерапии с индукторами дифференцировки. Однако использование ЦДА может привести к таким нежелательным эффектам, как снижение эффективности лечения за счет уменьшения пролиферативного пула опухолевых клеток или блокирования общей с иммунокорректором мишени.
В связи с этим, чрезвычайно актуально обоснование в эксперименте рациональных схем применения комбинаций с использованием противоопухолевых цитостатиков и средств иммунотерапии с ЦДА.
Цель исследования
Выявить роль индукторов дифференцировки различного механизма действия в эффективности противоопухолевой терапии на моделях опухолей животных и человека.
Задачи исследования:
- Выявить in vitro и in vivo на моделях гемобластоза и меланомы степень модификации эффективности комбинированного лечения индукторами дифференцировки при различных схемах применения.
- Определить in vivo влияние цитодифференцирующих агентов ПТРК,
2-ИФН и Dcr на опухолевый рост и эффективность некоторых схем комбинированной химиотерапии на моделях экспериментальных гемобластозов и меланом. - Исследовать in vitro и in vivo возможный механизм антипролиферетивного и противоопухолевого действия индукторов дифференцировки на клеточном и тканевом уровнях.
Научная новизна
Впервые разработана модель перевиваемого дифференцирующегося гемобластоза на мышах линии DBA2 и гибридах BDF1 с использованием культуры клеток DS19 эритробластоза Френд (ЭБФ), адекватная для доклинического изучения цитодифференцирующих агентов in vivo.
Впервые в экспериментах на перевиваемом ЭБФ и меланомах мышей и человека in vitro и in vivo изучены свойства известных индукторов дифференцировки (ПТРК, 2-ИФН) и нового препарата Dcr в монорежиме, в сочетании друг с другом и с противоопухолевыми цитостатиками (дакарбазином (DTIC), цисплатином (ЦП).
Впервые определены терапевтические дозы Dcr на различных моделях опухолевого роста животных и человека в монорежиме и в сочетании с цитостатиками. Для мышиных опухолей установлен диапазон разовых терапевтических доз 0,5-4,5 мг/кг при 5-30-кратном введении per os, для опухолей человека диапазон разовых терапевтических доз 1,5-4,5 мг/кг при 5-10-кратном p/o введении.
Впервые найдены эффективные комбинации и подобраны режимы введения различных индукторов дифференцировки (Dcr, 2-ИФН и ПТРК) и противоопухолевых цитостатиков (ЦП и DTIC). Установлен синергизм Dcr и 2-ИФН при последовательном введении в отношении ЭБФ и при одновременном введении в отношение ксенографтов меланомы человека Mel6. Найдено аддитивное усиление эффективности ЦП и DTIC при сочетании с Dcr и Dcr с ПТРК при последовательном введении.
Впервые найдены концентрации ПТРК, 2-ИФН и Dcr для проявления антипролиферативного и цитодифференцирующего действия на культурах клеток меланомы человека MS и Mel5, а также эффективные дозы in vivo на ЭБФ в монорежиме и в комбинациях.
Впервые установлено, что антипролиферативное и противоопухолевое действие ПТРК, 2-ИФН, ДМСО и Dcr сопряжено со следующими проявлениями цитодифференцировки: изменение фенотипического профиля клеток (промиелоцитарный лейкоз человека NB4, HL60) интенсификацией меланиногенеза (культуры клеток меланомы человека MS и Mel5, и п/к ксенографты Mel6); увеличение активности апоптоза, снижение активности митоза и возрастание зоны некроза в опухолях мышей и человека (гемобластоз ЭБФ, меланома В16, Mel6, Mel7); перераспределение клеток по фазам клеточного цикла - задержка клеток в стационарной фазе G0/G1 и накопление в фазе S без выхода в митоз (гемобластозы NB4, HL60, меланомы B16, Mel6, Mel7).
Научно-практическая значимость
В результате исследований получены новые данные о свойствах различных цитодифференцирующих агентов на моделях опухолевого роста, имеющие фундаментальное значение. Установлены новые феномены антипролиферативной активности ПТРК, 2-ИФН и Dcr на культурах клеток меланомы человека и животных MS, Mel5, B16, а также антипролиферативной и противоопухолевой активности Dcr на культурах клеток ОПЛ, перевиваемых гемобластозе и меланомах животных и человека.
Перспективными для клинического изучения являются экспериментальные данные, полученные:
- по способности Dcr ингибировать пролиферацию клеток и опухолевый рост меланомы животных и человека с увеличением выживаемости.
- о синергизме между 2-ИФН и Dcr
- об аддитивном усилении эффективности комбинаций с включением цитостатиков ЦП или DTIC и цитодифференцирующих препаратов ПТРК или Dcr.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на заседании Ученого Совета НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, 2006 г.; на VI и VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», (М/о, с-з «Московский», 2007, 2008 гг.); на Российской конференции по меланоме c международным участием, проводимой совместно с Европейской школой онкологии и Всемирной рабочей группой по меланоме (Москва, 2008 г.); 7 июня 2008 г. на межлабораторной конференции в НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с участием лаб. клеточного иммунитета, лаб. фармакокенетики, лаб комбинированной терапии опухолей, лаб. фармакологии и токсикологии, лаб. экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаб. синтетических противоопухолевых веществ, а также лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Гаузе РАМН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 научные статьи в рецензируемых журналах и 2 тезиса.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы «обзор литературы», главы «материалы и методы», 4 глав собственных результатов, выводов, списка литературы, списка сокращений. Список литературы включает 133 публикаций, из них 40 отечественных и 93 иностранных источников. Работа иллюстрирована 62 рисунками и 34 таблицами.
Материалы и методы исследования
Использованные в работе ЦДА. 1) Дикарбамин (Dcr, ООО «Фарминтерпрайсез») представляет собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты (М.м. 225) в разовых дозах 1,0-4,5 мг/кг р/о ежедневно в течение 5-13 дней. 2)Политрансретиноевая кислота (ПТРК, Sigma) вводили мышам п/к ежедневно в течение 5 дней в разовой дозе 0,3 мг/кг. 3)РФН (2а-ИФН) вводили мышам п/к в разовой дозе 10 тыс. МЕ/кг ежедневно в течение 5-ти дней; 4)Интрон-А (ИН-А (2b-ИНФ), Шеринг-Плау) использовали в концентрациях 7-70-700 МЕ/мл инкубировали в культуре клеток в течение 72 часов. Противоопухолевые средства. 1)Цисплатин (ЦП, Teva) вводили в разовой дозе 3 мг/кг в/б 3-кратно с интервалом в 48 часов ; 2)Дакарбазин (DTIC, Lachema) вводили мышам в разовой дозе 200 мг/кг в/б ежедневно в течение 3-х дней (суммарная доза 600 мг/кг).
Лабораторные животные
Эксперименты выполнены на изогенных мышах-самках DBA2, C57Bl6 и BDF1 разведения ГУ РОНЦ и из питомника РАМН «Столбовая», которых содержали в виварии ГУ РОНЦ на брикетированных кормах. Для трансплантации опухолей человека использованы иммунодефицитные мыши-cамки Balb/с nude разведения ГУ РОНЦ, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке с соблюдением требований, предъявляемым к конвенциональным животным.
Модели опухолевого роста. Использованы культуры клеток опухолей человека и перевиваемые опухоли мышей и человека из Банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ. Культуры клеток: 2 линии клеток ОПЛ человека HL60 и NB4 с транслокацией t(15;17), способных к дифференцировке под действием ЦДА в гранулоциты, моноциты и макрофаги; 1 линия меланомы мышей В16 и 2 линии клеток меланомы человека MS и Mel5 с различной способностью к меланиногенезу. Клетки перевиваемых клеточных линий культивировали в соответствующих питательных средах, после чего рассевали в пластиковые флаконы фирмы Costar (25см2), добавляли тестируемые агенты, с которыми инкубировали клетки. Штаммы перевиваемых опухолей животных и человека (2-17-й пассажи): эритролейкоз Френд (ЭБФ), полученный из клеточной линии DS19, солидная пигментированная мышиная меланома B16, 2 штамма меланомы человека - слабо пигментированная дифференцирующаяся Mel6 и беспигментная Mel7. Опухоли трансплантировали мышам подкожно (п/к) по стандартным методикам.
Основные критерии оценки эффективности. Об эффективности индукторов дифференцировки in vitro судили по стандартным показателям дифференцировки: по динамике специфических маркеров CD11b, CD38, CD15, CD18, CD54, CD14, CD71, CD33, CD13, Ki67, по функциональной активности клеток, по уровню их пролиферативной активности, а также по распределению клеток по фазам клеточного цикла. О противоопухолевой эффективности препаратов in vivo судили по кинетическим показателям (Vt/Vt-1) и по торможению (ТРО%, Т/С%) роста опухолей в опытных и контрольных группах, а также по увеличению продолжительности жизни (УПЖ%) мышей, которые определяли стандартными способами [Барышников А.Ю, 2003 г.; Софьина З.П. и соавт., 1979 г.; Трещалина Е.М. и соавт., 2005 г.; B. Taicher et al., 2004].
Методы электронной и световой микроскопии. Использованы стандартные методы с окраской гистологических срезов гематоксилин-эозином и фиксацией материала для электронной микроскопии (ЭМИ) в глутаральдегиде. Для количественной оценки степени дифференцировки опухолевых клеток при ЭМИ подсчитывали общее количество клеток в нескольких ультратонких срезах с разных блоков (5 блоков, количество клеток до 500), количество содержащих меланосомы клеток и среднее число меланосом на одну такую клетку. Индекс интенсивности меланинообразования (ИИМ) определяли по формуле: ИИМ=КМхМК/500, где КМ - количество клеток, содержащих меланосомы, а МК – среднее количество меланосом на клетку [Райхлин Н.Т., 1979].
Иммунофлуоресцентный метод. Для проведения непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции клетки сначала инкубировали с МКА, а затем с FITC-меченной антисывороткой. Для проведения прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали МКА, напрямую меченные флуорохромами флуоресцеином (FITC) или фикоэритрином (PE). Реакцию анализировали на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, USA) [Docik G. et al., 1980].
ДНК-цитометрический анализ. ДНК-цитометрический анализ проводили в импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 (фирма «Фиве», ФРГ) с использованием флуоресцентных красителей этидиум-бромида и митрамицина. Уровень люминесценции окрашенных клеток (ядер) был пропорционален содержанию ДНК, стандарт - нормальные лимфоциты человека или спленоциты мыши. Расчет распределения клеток по фазам клеточного цикла (G0/G1, S, G2/M) выполняли по коэффициенту вариации индекса ДНК (ИДНК). При анализе структуры популяции значения плоидности пиков на ДНК-гистограммах выражали ИДНК, который вычисляли как отношение номера канала анеуплоидного пика к номеру канала пика нормальных диплоидных клеток (стандарту). Значимыми считали пики >5% от числа 20-100 и более тыс проанализированных клеток. Данные в автоматическом режиме вводились в ЭВМ РС-286 и обрабатывались с помощью специальных алгоритмов и программ.
Статистическая обработка данных. Конечные результаты всех опытов обрабатывали статистически, вычисляли средние значения с учетом «» или доверительного интервала средних сравниваемых величин. Достоверность оценивали по методу Стьюдента с 95% вероятностью [Гланц С, 1999 г.].
Результаты исследований и их обсуждение
Изучение дифференцирующих свойств индукторов на клетках ОПЛ человека
Показано (рис. 1, табл. 1, 4) уменьшение экспрессии маркера миелоидных предшественников CD33 в 2 раза относительно контроля под действием ПТРК с одновременным увеличением экспрессии маркеров зрелых клеток – CD15 в 2 раз и CD11b в 6 раз. Повышение адгезивных свойств, фагоцитарной активности и люминесценции клеток говорят о дифференцировке клеток NB4 в сторону гранулоцитарного ростка до зрелых терминально дифференцированных нейтрофилов, что согласуется с [Breitman T.R., 1980]. ПТРК оказывает значимый антипролиферативный эффект, как по уменьшению экспрессии маркера митотической активности Ki67 в 30 раз, так и по увеличению доли покоящихся (G0/G140%) и уменьшению доли синтезирующих (S44%) клеток.
ДМСО также вызывал уменьшение экспрессии CD33 в 2 раза и повышение СD11b в 3 раза относительно контроля, но уменьшал экспрессию CD15 в 1,5 раз, CD38 в 6 раз и молекул адгезии CD54 в 2,5 раза. Это показывает, что на уровне монобластов-промоноцитов утрачивается экспрессия маркера CD15. Таким образом, ДМСО, скорее всего, стимулирует как гранулоцитарную, так и макрофагальную дифференцировку клеток, причем эти процессы терминально не завершенные. Этим объясняется повышение фагоцитарной активности клеток в 2-3 раза и люминесценции 1,5-2 раза относительно контроля, которое не достигает уровня нормальных зрелых фагоцитов.
 |  |
| Рис. 1. Изменение экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках линии NB4 под влиянием Dcr, ПТРК и ДМСО. | Рис. 2. Изменение экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках линии NB4 под влиянием Dcr в различных концентрациях. |
| Таблица 1. Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии NB4 после применения различных индукторов дифференцировки | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Тем не менее, ДМСО оказывает выраженный антипролиферативный эффект, что проявляется в уменьшении экспрессии Ki67 в 22 раза, а также в уменьшении доли S=28% и повышении доли G0/G168%.
Действие Dcr на фенотипический профиль клеток отличается уменьшением экспрессии маркеров CD33 в 1,3-2,0 раза и CD38 в 2,0-5,5 раз относительно контроля. Экспрессия СD11b и CD15 в зависимости от концентрации либо колеблется на уровне контрольных значений, либо уменьшается в 2,5-2,0 раза, а экспрессия адгезивной молекулы CD54 остается на уровне контроля. Возможно, такое влияние на антигенный профиль клеток NB4 связано со сдвигом дифференцировки более ранних предшественников лимфоидного (CD38) и миелоидного (CD38, CD33) ростков без запуска терминальной дифференцировки. Уменьшение CD15 и CD11b при некоторых концентрациях Dcr, скорее всего, связано с гибелью клеток, что проявляется в резком уменьшении экспрессии CD71 (в 78 раз) и Ki67 (в 43 раз), а также в положительной тенденции распределения клеток по фазам клеточного цикла: небольшим накоплением покоящихся клеток в фазе G0/G143% и обеднением пролиферирующихся клеток в S-фазе до 55%.
Исследование ЦДА на клетках HL60 по различным параметрам дифференцировки показало (рис. 2, табл. 2-4), что каждый из индукторов имеет своеобразный профиль активности. Так, ПТРК вызывает незначительное снижение маркера-предшественника миелоидного ряда CD33 и не влияет на экспрессию CD13, одновременно с этим повышая экспрессию CD38 в 5,5 раз относительно контроля. Это может быть связано с индукцией дифференцировки CD38 на более ранних этапах дифференцировки и пополнением популяции CD33 клеток.
Таблица 2.
Влияние ПТРК, ДМСО и Dcr на экспрессию дифференцировочных антигенов в клетках линии HL60
| Антигены | Среднее значение экспрессии в процентах (М+m) | |||
| Контроль | ПТРК 0,3 мкг/мл | ДМСО 1,3 мг/мл | Dcr 2,1 мкг/мл | |
| CD33 | 96,7+3,6 | 90,1+0,5 | 90,3+0,4 | 92,0+0,9 |
| CD13 | 98,4+0,9 | 94,0+4,9 | 95,6+6,0 | 97,6+1,8 |
| CD11b | 0,8+0,5 | 37,6+10,0* | 32,5+4,3* | 1,2+0,1 |
| CD38 | 11,3+13,3 | 60,9+0,3* | 35,4+10,4* | 1,1+0,9 |
| CD15 | 85,6+4,5 | 44,6+28,3* | 45,2+21,5* | 49,3+13,1* |
| CD18 | 7,5+8,9 | 16,6+10,2 | 37,7+45,6 | 17,6+23,6 |
| CD54 | 2,8+0,1 | 70,0+8,6* | 78,1+4,4* | 8,7+7,6 |
| CD14 | 0,4+0,4 | 9,5+2,7 | 71,2+1,3* | 3,6+2,0 |
| CD71 | 20,1+16,1 | 6,2+3,1 | 3,9+1,4 | 12,1+11,3 |
Примечание: *p0,05
ПТРК также вызывает увеличение экспрессии адгезивной молекулы CD54 в 25 раз, миелоидного антигена CD11b в 47 раз, специфического маркера промоноцитов и моноцитов СD14 в 24 раза с одновременным уменьшением гранулоцитарного маркера CD15 в 2 раза. Замещение популяции CD15 клеток популяцией CD14 клеток можно расценить как коммитирование миелоидных предшественников в сторону гранулоцитарного и моноцитарно/макрофагального рядов. Это отражается в повышении, как фагоцитарной активности, так и люминесценции, значения которых, однако, не позволяют говорить о терминальной дифференцировке до зрелых фагоцитов (табл. 3). Кроме того, ПТРК вызывает снижение CD71 в 3,2 раза, значительное увеличение фракции покоящихся клеток G0/G1-74,1% и обеднение фракции делящихся и синтезирующих клеток S - 18,0% и G2/M - 7,9%.
Под действием ДМСО фенотипический профиль клеток HL60 меняется аналогично ПТРК. Экспрессия CD33 и CD13 колеблется в пределах контроля, зато увеличивается в 3 раза экспрессия СD38, в 41 раз - CD11b и в 178 раз - CD14. Одновременно с этим происходит в 2 раза уменьшение экспрессии CD15. Все это говорит о сходстве экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках HL60 под действием ДМСО и ПТРК. Результатом может быть неполная гранулоцитарная и/или относительно более выраженная моноцитарная дифференцировка, о чем свидетельствует соотношение популяций CD14 и СD11b клеток. Процент фагоцитирующих клеток того же порядка, что и при действии ПТРК, хотя свечение при стимуляции зимозаном в случае ПТРК выше.
Таблица 3.
Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии HL60 после применения различных индукторов дифференцировки
| Агент | Концентрация, мкг/мл | Фагоцитирующие клетки, % | Люминесценция, % | ||
| Без сыворотки | С сывороткой | Без стимуляции | Зимозан | ||
| - | - | 1,6+0,7 | 4,2+0,8 | 0,741+0,2 | 0,883+0,2 |
| ПТРК | 0,3 | 17,8 | 68,5 | 1,802 | 80,0 |
| ДМСО | 13000 | 14,6+7,7 | 61,9+8,9 | 1,103+0,3 | 19,03+3,1 |
| Dcr | 2,1 | 2,9 | 8,5 | 0,750 | 5,478 |
| 0,2 | 2,3 | 12,5 | 0,665 | 3,740 | |
| 21,0 | 2,3 | 10,7 | 0,681 | 3,694 | |
| 142,8 | 3,0 | 14,4 | 1,022 | 2,918 | |
Действие Dcr на фенотип клеток HL60 отличается от ПТРК и ДМСО по отсутствию влияния на экспрессию гранулоцитарного маркера CD11b при подавлении экспрессии CD38 в 10 раз. Dcr также вызывает уменьшение экспрессии CD15 в 2 раза и увеличение экспрессии CD14 в 9 раз, а CD54 в 4 раза. Сдвиг дифференцировки ранних предшественников миелоидного и лимфоидного ростка CD38 клеток на несколько ступеней под действием Dcr способствует дифференцировке CD15 клеток, коммитированных в сторону моноцитарного/макрофагального ростка до промоноцитов, что сопровождается слабым повышением фагоцитарной активности клеток (табл. 4). Кроме того, Dcr снижает экспрессию маркера CD71 в 2 раза и приводит к накоплению G0/G1-клеток со снижением доли S-клеток и G2/M до 6,9 и 40,7%, соответственно.
Исследование фенотипического профиля и функциональную активность клеток ОПЛ человека линии NB4 и HL60 под влиянием индукторов дифференцировки позволяет заключить, что все агенты запускают дифференцировку клеток, причем терминальную – только ПТРК. Как и следовало ожидать, клетки NB4, в которых присутствует аберрантная форма рецептора ретиноевой кислоты RAR-, оказались наиболее чувствительными к действию ПТРК. Это объясняется механизмом действия ПТРК, который подробно описан в обзоре литературы. ДМСО в отличие от ПТРК только существенно сдвигает дифференцировку NB4 в сторону гранулоцитов и/или моноцитов. Dcr в широком диапазоне концентраций способен запускать дифференцировку на дискретном этапе ранних миелоидных предшественников. При этом модуляция экспрессии антигена CD33 в клетках лейкоза NB4 свидетельствует о том, что, скорее всего, происходит сдвиг блока дифференцировки на несколько ступеней.
Таблица 4.
Влияние ПТРК, ДМСО, Dcr на распределение клеток NB4 и HL60 по фазам клеточного цикла
| Агент | Концентрация, мкг/мл | Фазы клеточного цикла | |||||
| NB4 | HL60 | ||||||
| G0/G1 | G2/M | S | G0/G1 | G2/M | S | ||
| Без индуктора | - | 40,06% | 1,35% | 58,59% | 47,13% | 10,78% | 42,09% |
| ПТРК | 0,3 | 47,88% | 8,44% | 43,68% | 74,1% | 7,85% | 18,0% |
| ДМСО | 13000 | 68,37% | 3,56% | 28,04% | 92,79% | 2,32% | 4,89% |
| Dcr | 2,1 | 43,2% | 0,97% | 55,83% | 52,41% | 6,92% | 40,68% |
Отсутствие этого эффекта в клетках лейкоза HL60, в которых нет специфической хромосомной транслокации t(15;17), подтверждает, что Dcr способен ингибировать пролиферацию только тех клеток, в которых присутствует аберрантная форма рецептора. С другой стороны, эта неполная дифференцировка не сопряжена с модуляцией антигенов зрелых гранулоцитов, таких как CD15 и CD11b, и с изменением адгезионного профиля клеток CD54. В результате она является функционально незавершенной, так как не сопровождается изменением фагоцитарной активности и способности клеток к хемолюминесценции. Таким образом, дифференцировка гемопоэтических клеток, которая запускается препаратом Dcr, отличается от процессов, индуцируемых как ПТРК, так и ДМСО.
Изучение цитодифференцирующих свойств различных индукторов на экспериментальных гемобластозах in vivo
Изучение ЦДА и их комбинаций на модели дифференцирующегося развившегося п/к ЭБФ (рис. 3) показало (табл. 5), что в монорежиме ПТРК, Dcr и РФН кратковременно ингибируют рост лейкоза. Достоверный максимальный эффект наблюдается сразу после окончания лечения и затем в течение 6 с. ПТРК вызывает плохо воспроизводимый эффект, ТРО=50-71% (p0,05 только в одном опыте), а РФН и Dcr - воспроизводимый эффект, ТРО=64-66% (p0,05) и 73-78% (p0,05), соответственно. Эти данные подтверждают, что ПТРК и РФН в монотерапии не способны ингибировать опухоли больших размеров, что согласуется с данными литературы [Уоррел Р.П., 2002]. Dcr по характеру действия близок как обоим индукторам, но также как РФН оказывает хорошо воспроизводимое ингибирующее действие. При гистологическом изучении результатов цитодифференцирующей терапии Dcr, ПТРК и РФН в п/к ЭБФ показано (табл. 6), что при применении ЦДА в монорежиме наибольшие изменения по зоне некроза вызывал РФН, менее активным был Dcr, самым слабым – ПТРК. По степени ингибирования митоза в клетках ЭБФ более выраженное действие оказали РФН и Dcr. По индукции апоптоза все ЦДА оказались практически одинаковыми. Показано, что все агенты вызывали дифференцировку клеток ЭБФ (табл. 6), при чем Dcr и РФН индуцировали лимфоидную и миелоидную дифференцировку клеток, а ПТРК – только лимфоидную.
Таблица 5.
Эффективность монотерапии ПТРК, Dcr или РФН п/к трансплантированного ЭБФ в серии опытов
| Препарат | Разовая доза** | Суммарная доза | ТРО% на сутки после лечения | ||
| Контроль (физ. р-р) | 0,2 мл/мышь | 1,0 мл/мышь | 1-4 | 6-7 | 9-11 |
| ПТРК | 0,3 мг/кг | 1,5 мг/кг | 50-71* | 57 | 15-50 |
| Dcr | 4,5 мг/кг | 22,5 мг/кг | 61-78* | 73* | 40-53 |
| РФН | 10 тыс. МЕ/кг | 50 тыс. МЕ/кг | 58-66* | 64* | 39-68 |
Примечания: *различия с контролем достоверны, p<0,05; **введение на 2-6 сутки после трансплантации
Таблица 6.
Влияние монотерапии ПТРК, РФН и Dcr на морфологические показатели ЭБФ через сутки после лечения
| Показатели, % | Контроль | Dcr | ПТРК | РФН |
| Бластные | 95,0 | 85,0 | 90,0 | 85,0 |
| Лимфоидые | 3,0 | 10,0 | 8,0 | 10,0 |
| Гранулоциты | 2,0 | 5,0 | 2,0 | 5,0 |
| Клетки с фигурами митзов | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 |
| Клетки с признаками апоптоза | 0,5 | 1-1,5 | 1-1,5 | 1-1,5 |
| Площадь некрозов | 5-10 | 10-20 | 10-15 | 20-30 |
Примечание: *препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.
Комбинированное лечение п/к ЭБФ проводили по 2-м схемам с одновременным или последовательным введением препаратов. Дозы препаратов и режим их введения при этом не менялись (2-6 сутки). Результаты опытов с одновременным введением ПТРК, РФН и Dcr показали (табл. 7А), что самой эффективной комбинацией оказалась РФН+Dcr, причем эффект был устойчивым и стабильным в течение 9-18 суток после окончания терапии ТРО=77-85%. При сочетании Dcr+ПТРК ингибирующий эффект не превышал 69-71% и был менее длительным – 9 дней после отмены лечения. Увеличение суммарной дозы РФН+ПТРК при пролонгировании лечения было неэффективным. Отсутствие терапевтического выигрыша при одновременном введении Dcr и ПТРК было расценено как следствие возможной конкуренции 2-х миелоидных индукторов дифференцировки за мишень.
При введении Dcr первым (табл. 7Б) эффективность Dcr+ПТРК реализуется на уровне ТРО%=48-63% (p0,05). Отсутствие эффекта при введении ПТРК первой может быть следствием общей мишени на клетках. Эффективность комбинации реализуется за счет Dcr, РФН ничего не добавляет. При начале терапии с РФН введение Dcr пролонгирует эффект и удерживает его на достоверном уровне (ТРО%=61-67%, p0,05). Эффект гистологически верифицирован (табл. 8) и показано, что при сочетании Dcr с ПТРК или с РФН индуцируется выраженная лимфоидная и миелоидная дифференцировка с существенным перераспределением бластных клеток в сторону лимфоидного ростка.
Таблица 7.
Эффективность комбинированной терапии с использованием ПТРК, РФН и Dcr на ЭБФ
А.Одновременное введение препаратов в серии опытов
Из всех изученных сочетаний наиболее эффективной была комбинация РФН+Dcr (ТРО=67% с длительной стабилизацией роста опухоли). Гистологические изменения в опухоли полностью подтверждают терапевтическую эффективность указанных агентов и их сочетаний по основным показателям дифференцировки клеток, которые проявляются во взаимоусилении направления дифференцировки с перераспределением бластных клеток, а также в увеличении процессов некротической и апоптотической гибели клеток, например, увеличение зоны некроза до 40-50% и числа клеток с признаками апоптоза в 2-3 раза. Таблица 8. Влияние двойных комбинаций ПТРК, РФН и Dcr на морфологические показатели ЭБФ в зависимости от последовательности их введения (1 и 6 сутки после окончания лечения) Вид клеток, % | Контроль | Dcr+ПТРК | ПТРК+Dcr | Dcr+РФН | РФН+Dcr | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Бластные | 95,0 | 80,0 | 90,0 | 80,0 | 80,0 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Лимфоидые | 3,0 | 15,0 | 8,0 | 15,0 | 15,0 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Гранулоциты | 2,0 | 5,0 | 2,0 | 5,0 | 5,0 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Клетки с фигурами митозов | 1,5-2,5 | 0,5-1,0 | 2,0-2,5 | 0,5-1,5 | 0,5-1,5 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Клетки с признаками апоптоза | 0,5 | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 | 1-1,5 | 1-1,5 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Площадь некрозов | 15-20 | 20-25 | 15-20 | 20-30 | 5-10 | 20-30 | 30-40 | 30-40 | 40-50 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Примечание: *препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.
Более значительные гистологические изменения получены при монотерапии Dcr или ПТРК, а также при различных их сочетаниях независимо от последовательности введения. На основании данных терапевтических опытов (динамика показателей эффективности ТРО и Т/С) и гистологических исследований п/к ЭБФ после применения Dcr, ПТРК и РФН в монорежиме и в различных комбинациях следует считать перспективными для дальнейшего изучения комбинации Dcr и РФН в прямой и обратной последовательности введения, а также Dcr и ПТРК с введением первым Dcr. Неудачи при комбинации Dcr и ПТРК могут быть следствием общих мишеней для их цитодифференцирующего действия.
Изучение дифференцирующих свойств различных индукторов на клетках меланомы человека
Показано, что клетки MS без воздействия (контроль) растут в центре более компактно, чем на периферии. Цитоплазма большинства клеток, особенно на периферии, относительно светлая, ее насыщенность зернистыми гранулами выражена слабо реже умеренно. Видно, что на 100-200 клеток приходится ~50% клеток со слабой насыщенностью цитоплазмы мелкими зернами, 30% - с умеренной и 20% - с высокой.
Таблица 9.
Влияние ПТРК и Dcr на степень мелкогранулярной зернистости в цитоплазме клеток меланомы человека линии MS
| Группа | Концентрация | Процент клеток с мелкогранулярной зернистостью различной степени | ||
| Высокая | Умеренная | Слабая | ||
| Контроль | - | 20 | 30 | 50 |
| ПТРК | 1х10-6М | 60 | 30 | 10 |
| Dcr | 1х10-4М - 1х10-5М | 60 | 30 | 10 |
При добавлении ПТРК (табл. 9) в центре клетки лежат компактно. На периферии клетки образуют синцитий, соединяясь друг с другом с помощью отростков. Клетки полиморфные, преимущественно, удлиненной формы. Ядра округлые или овальные. Однако насыщенность цитоплазмы гранулярной зернистостью увеличивалась, о чем свидетельствует следующее перераспределение клеток: ~10% со слабой насыщенностью, 30% - с умеренной и 60% - с высокой. При добавлении Dcr (табл. 9) независимо от величины концентрации в клетках MS отмечали появления мелкозернистых гранул. В мазках видно, что на периферии клетки растут в виде синцития, в центре более компактно. Они преимущественно удлиненной формы, с отростками, которые соединяются друг с другом. Встречаются крупные клетки иногда с несколькими ядрами. Цитоплазма клеток во многих участках препарата насыщена мелкой зернистостью, при этом доля клеток со слабой насыщенностью зернистости не превышает 10%, с умеренной - 30%, а с высокой 60%. Контроль образования неспецифической зернистости в клетках MS показал, что после УФ-облучения только в чашках с клетками, обработанными ПТРК и Dcr, появилось потемнение ростовой среды. Таким образом, ПТРК в концентрации 1х10-6M и Dcr в концентрациях 1х10-4M и 1х10-5M способны вызвать 3-кратное увеличение фракции клеток меланомы человека MS с высокой степенью мелкогранулярной зернистости, что можно расценивать как запуск дифференцировки клеток по пути пигментообразования.
На клетках меланомы B16 и меланомы Mel5 изучено влияние Dcr и ИН-А отдельно и в комбинации. Dcr (табл. 10) в концентрациях 0,01-100,0 мкМ обнаружил дозозависимый возрастающий во времени значительный и устойчивый антипролиферативный эффект, который проявлялся замедлением роста клеток В16 в микроколониях в течение 72 ч. Максимальный эффект зарегистрирован при 100,0 мкМ, последовательное уменьшение клеток через 24-48-72 часа инкубации с препаратом снизилось до 33,7-17,7-16,9%, соответственно. После добавления в культуру 7 МЕ/мл ИН-А (табл. 14) содержание клеток в колониях сначала возросло до 112,1%, а затем по срокам снизилось до 38,6% и 33,1%, соответственно. При 70 МЕ/мл содержание клеток уменьшалось до 68,8-31,8-28,4%, соответственно, а при 700 МЕ/мл - до 36,9-24,3-22,6%, соответственно. Выживаемость клеток колебалась в пределах 89-103% и практически не отличалась от контроля. Таким образом, аналогично Dcr ИН-А в концентрации 7-700 МЕ/мл вызывал дозозависимый антипролиферативный эффект в клетка меланомы B16. При совместном добавлении в культуру клеток Dcr и ИН-А (табл. 15) антипролиферативный эффект усиливался. Сочетание 1,0 мкМ Dcr и 7,0 МЕ/мл ИН-А через 48 ч после инкубации приводило к уменьшению числа клеток до 26,1%, что было почти вдвое меньше, чем при добавлении препаратов отдельно в тех же концентрациях.
Таблица 10.
Влияние Dcr и/или ИН-А на пролиферацию клеток мышиной меланомы В16
| Группа | Концентрация в среде | Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата | |
| 24 ч | 48 ч | ||
| Контроль | - | 100,0 | 100,0 |
| Dcr | 1,0 мкМ | 44,6 | 43,6 |
| 10 мкМ | 36,5 | 31,4 | |
| РФН | 7,0 МЕ/мл | - | 50,2 |
| 70,0 МЕ/мл | - | 44,5 | |
| 700,0 МЕ/мл | 35,8 | 29,0 | |
| Dcr+РФН | 1,0 мкМ+7,0 МЕ/мл | - | 26,1 |
| 10,0 мкМ+70,0 МЕ/мл | - | 16,0 | |
| 1,0 мкМ+700,0 МЕ/мл | 21,5 | 18,3 | |
| 10,0 мкМ+700,0 МЕ/мл | 16,2 | 13,0 | |
Сочетание 10,0 мкМ Dcr и 70,0 МЕ/мл ИН-А уменьшало содержание клеток в колониях через 48 ч до 16%, что также было вдовое меньше, чем при каждом из препаратов в этих концентрациях в отдельности. Таким образом, сочетание Dcr и РФН в диапазоне изученных концентраций привело к повышению антипролиферативного эффекта каждого из комбинантов почти в 2,0 раза через 48 ч инкубации.
На клетках меланомы человека Mel5 показано (табл. 11), что при 0,01 мкМ Dcr в те же сроки количество клеток в микроколониях уменьшалось до 92,7-68,9-58,4%, соответственно. Максимальный эффект наблюдался при 100,0 мкМ Dcr, количество клеток уменьшалось до 43,8-29,7-25,9%, соответственно. Выживаемость микроколоний при всех использованных концентрациях Dcr оставалась на уровне контрольных значений 91-100% (табл. 16). При добавлении 7,0 МЕ/мл ИН-А в течение 72 ч после количество клеток снижалось от 86,2% до 49,3%. При добавлении 70,0 МЕ/мл число клеток уменьшалось до 54,5-40,1-37,4%, соответственно. После 700,0 МЕ/мл число клеток уменьшалось до 43,1-29,7-27,7%, соответственно срокам. Выживаемость колоний клеток Mel5 была на уровне интактных клеток 96-100% (табл. 16).
На клетках Mel5 комбинация 0,01 мкМ Dcr и 7,0 МЕ/мл ИН-А при одновременном добавлении в среду дала низкий эффект. При этом число клеток варьировало в пределах 47-50% в течение 72 ч. Улучшить эффект удавалось путем увеличения концентрации одного из препаратов. Максимальное ингибирование до 23,9-30,7% было только при высоких концентрациях обоих препаратов (табл. 11).
Таблица 11.
Влияние Dcr и/или ИН-А на пролиферацию клеток меланомы человека Mel5
| Группа | Концентрация препаратов в среде | Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата | ||
| 24 ч. | 48 ч. | 72 ч. | ||
| Контроль | - | 100 | 100 | 100,0 |
| Dcr | 0,01 мкМ | 84,2 | 73,6 | 70,2 |
| 1,0 мкМ | 69,0 | 50,0 | 49,1 | |
| ИН-А | 7,0 МЕ/мл | 111,3 | 94,8 | 73,0 |
| 70,0 МЕ/мл | 53,7 | 51,9 | 48,8 | |
| Dcr+ИН-А | 0,01 мкМ+7 МЕ/мл | 79,1 | 49,1 | 46,9 |
| 0,01 мкМ+70 МЕ/мл | 40,5 | 34,9 | 31,7 | |
| 1,0 мкМ+7 МЕ/мл | 54,7 | 36,9 | 33,3 | |
| 1,0 мкМ+70 МЕ/мл | 30,7 | 24,5 | 23,9 | |
Примечание: критерий оценки – задержка роста микроколоний.
Таким образом, опыты по изучению дифференцирующего действия Dcr, ИН-А и ПТРК на клетки различных вариантов меланомы показали, что Dcr и ИН-А в относительно высоких концентрациях дозозависимо замедляют пролиферацию клеток, не влияя на их выживаемость. Сочетание Dcr и ИН-А усиливает ингибирующий эффект. ПТРК и Dcr в относительно низких концентрациях индуцируют образование мелкогранулярной зернистости в клетках меланомы MS. Замедление скорости пролиферации и запуск меланинсинтезирующей функции клеток отдельных видов меланомы животных и человека, которые проявляются при достижимых концентрациях всех 3-х указанных агентов, свидетельствуют о неспецифическом цитодифференцирующем действии. Анализ полученных результатов показал, что Dcr и ИН-А близки по уровню антипролиферативной активности и относительно высоким ингибирующим концентрациям, но, возможно, имеют разные мишени на клетке, т.к. их сочетание приводит к существенному усилению ингибирования пролиферации. Аналогично для Dcr и ПТРК получено восстановление меланинсинтезирующей функции в клетках меланомы, но без существенного влияния на интенсивность роста клеток и их морфологию. Результаты опытов in vitro не однозначны, т.к. не всегда действие агентов сопровождается замедлением пролиферации или остановкой роста клеток. Поскольку указанные эффекты реализуются при достижимых in vivo концентрациях, была проведена серия опытов с изучением эффективности всех 3-х ЦДА на перевиваемых меланомах животных и человека.
Изучение эффективности комбинированной терапии меланомы животных и человека под влиянием цитодифференцирующих агентов
Изучение эффективности комбинаций проведено на перевиваемых меланомах В16, Mel7 и Mel6. Для химиотерапии использованы ЦП и DTIC, входящие с основные схемы лечения диссеминированной меланомы [Носов Д.А., 2001 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. В качестве ЦДА использованы РФН, который используется в схемах адъювантной химиотерапии меланомы, а также Dcr в разовых доз от 0,5 до 4,5 мг/кг при разных схемах лечения. Показано (табл. 12), что меланома В16 чувствительна к Dcr (ТРО=69-93%, p0,05) при всех изученных дозах. Прослежена зависимость ингибирующего действия от величины разовой дозы при 5-кратном курсе: при увеличении дозы от 1,5 до 4,5 мг/кг ТРО возрастало от 69 до 93%. При 30-кратном введении увеличение разовой дозы также сопровождалось возрастанием ТРО с достоверным УПЖ=41% (p0,05). Аналогичные результаты получены при 15-кратном введении Dcr в разовой дозе 4,5 мг/кг.
Таблица 12.
Оптимальные дозы и схемы введения Dcr на меланоме В16
| Разовая доза, число введений | Максимальный противоопухолевый эффект | |||
| Суммарная доза, мг/кг | УПЖ% | ТРО% | Сохранение эффекта | |
| 0,5 мг/кг x 10 | 5,0 | 1 | 29 | - |
| 1,5 мг/кг x 5 | 7,5 | - | 69* | +* |
| 4,5 мг/кг x 5 | 22,5 | - | 93* | +++ |
| 4,5 мг/кг x 13 | 58,5 | - | 93* | +++ |
| 0,5 мг/кг x 30 | 15,0 | 19 | 78* | + |
| 1,5 мг/кг x 30 | 4,5 | 13 | 61* | + |
| 4,5 мг/кг x 30 | 13,5 | 41* | 91* | +++ |
Примечания: *p0,05; (+) - 7 дней.
В серии экспериментов с различными схемами применения Dcr установлено (табл. 12), что хорошо воспроизводимые от опыта к опыту результаты можно получить при применении разовых доз Dcr 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневных курсов введения (диапазон курсовых доз 22,5-58,5 мг/кг). При этом следует ожидать наступления максимального ответа опухоли на 10-13 сутки от начала лечения с сохранением достоверного эффекта в случае продолжения лечения. Эти схемы и были использованы в комбинированной терапии. Гистологическое и ДНК-цитометрическое исследования показали (табл. 13), что под влиянием Dcr в п/к трансплантированной меланомы В16 происходит существенное снижение доли пролиферирующих клеток в срезах в 1,2-2,0 раза и в популяции в 1,8 раз. Гибель клеток путем апоптоза и некроза возросла в 2 раза относительно контроля. Указанные изменения плюс накопление клеток в стационарной G0/G1 фазе клеточного цикла (90% против 82% в контроле) возрастали при продолжении введения препарата. На эти же сроки наблюдалось снижение доли пролиферирующих клеток в S- и G2/M-фазах почти в 2 раза. Полученные результаты свидетельствовали о том, что Dcr реализует лечебный патоморфоз в меланоме В16 путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, которое проявляется в снижении их митотической активности, усилении процесса апоптоза и увеличении зоны некроза.
Таблица 13.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели и популяционный состав клеток
меланомы B16
| Показатели (%) | Контроль | Dcr | ||||
| Сутки после трансплантации опухоли | ||||||
| 10 | 15 | 20 | 10(4)* | 15(2)* | 20(7)* | |
| Площадь некроза | 10,0-15,0 | 20,0-30,0 | 25,0-30,0 | 15,0-20,0 | 50,0-60,0 | |
| Митозы | 2,0-3,0 | 2,0-3,5 | 1,5-2,0 | 1,0-1,5 | ||
| Апоптоз | 0,1-0,2 | 0,2-0,4 | ||||
| G0/G1 | 86,0±8,0 | 87,0±7,3 | 82,0±7,1 | 88,0±9,0 | 89,0±9,1 | 90,0±9,2 |
| S | 7,0±1,1 | 7,0±0,9 | 9,0±0,8 | 6,0±0,7 | 6,0±0,5 | 5,0±0,7 |
| G2/M | 7,0±0,9 | 6,0±1,0 | 9,0±1,0 | 6,0±0,6 | 5,0±0,6 | 5,0±0,4 |
Примечание: *(4) – через 4 суток после 1 курса; (2) и (7) – через 2 и 7 суток после 2 курса лечения, соответственно.
Изучение комбинации Dcr+ЦП показало (табл. 14) более высокий эффект в сравнении с монохимиотерапией ЦП, как по ингибированию первичного узла меланомы В16 с длительным снижением скорости роста опухоли, ТРО%=85-88% против ТРО%=29-48%, так и по выживаемости мышей, УПЖ%=38% против УПЖ%=15%. Dcr реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. Все эффекты достоверны по отношению к контролю, p<0,05.
На п/к ксенографтах Mel6 Dcr был изучен в монорежиме в диапазоне разовых доз от 1,0 м/кг до 4,5 мг/кг при длительном (5-10 дней) пероральном введении. Первый вариант меланомы представляет собой гистологически слой полиморфных активно пролиферирующих (частота митозов 3-5%) и слабо пигментированных клеток (1-3-%). В течение 48 ч наблюдается незначительное увеличение пигментации клеток с ИИМ=5,1 и до ИИМ=8,2. Опухоль имеет слабо развитую строму, низкую долю апоптотирующих клеток (0,1-0,2%), площадь некрозов небольшая (1-5%). Показано (рис. 4), что 5-дневный курс Dcr в разовой дозе 1 мг/кг оказывает слабое кратковременное рост-ингибирующее действие (T/C%=80-96%). При гистологическом исследовании установлено (табл. 15), что уже через 12 ч после отмены препарата площадь некроза в опухоли увеличивается в 3-6 раз по сравнению с контролем, и в течение следующих 48 часов гибель клеток от некроза продолжается, и площадь некроза достигает 8-10%. Однако при этом не меняется митотическая активность клеток (частота митозов 3-5%) и лишь незначительно увеличивается доля апоптотических клеток до 2-3% только к концу наблюдения.
Таблица 14.
Эффективность терапии Dcr, ЦП и их комбинации на мышиной меланоме B16
| Препарат | Разовая доза | Суммар- ная доза | Vt/Vt-1% на сутки после трансплантации опухоли | ТРО, % На сутки после лечения | УПЖ% | ||||||
| 14 | 17 | 21 | 4 | 9 | 12 | 16 | |||||
| Контрольфиз. р-р | 0,2 мл | 1 мл | 8,3 | 1,9 | 1,9 | ||||||
| Dcr | 1,5 мг/кг | 15 мг/кг | 6,1 | 1,9 | 1,9 | 3 | 29 | 29 | 26 | 1 | |
| ЦП | 3 мг/кг | 9 мг/кг | 8,4 | 2,1 | 1,7 | 49* | 48 | 41 | 48 | 15* | |
| Dcr + ЦП | 1,5 мг/кг + 3 мг/кг | 15 мг/кг + 9 мг/кг | 6,8 | 2,3 | 2,5 | 85* | 88* | 85* | 81* | 38* | |
 Рис. 4. Динамика роста п/к ксенографта меланомы человека Mel6 под действием Dcr | |||||||||||
После отмены Dcr достоверно увеличивается количество опухолевых клеток содержащих меланосомы, по сравнению с контролем (табл. 15): в 1,4 раза - через 12 ч, в 1,3 раза - через 24 ч и в 1,4 раза – через 48 ч препарата. Кроме того, увеличивается и содержание меланосом в клетках: в 1,4 раза - через 12 ч, в 1,6 раз – через 24 и 48 ч. ИИМ=19,0.
Таким образом, Dcr в течение 48 ч после окончания 5-дневного курса увеличивает в 2,2 раза по показателю ИИМ степень дифференцировки опухолевых клеток меланомы Mеl6 и в 1,3 раза количество меланосом в клетках и число содержащих меланосомы клеток.
Цитодифференцирующая активность Dcr, показателем которой является усиление меланинсинтезирующей функции клеток меланомы человека Mel6, была также подтверждена цитологическими исследованиями. Было показано, что Dcr в дозе 4,5 мг/кг вызывает статистически достоверное увеличение доли меланинсодержащих клеток в 3 раза по сравнению с контролем при 21-дневном курсе введения. Цитометрический анализ популяционного состава клеток показал (табл. 15), что Dcr в разовой дозе 1 мг/кг при 5-кратном курсе вызывает достоверное накопление опухолевых клеток в стационарной фазе клеточного цикла G0/G1. После прекращения введения Dcr задержка клеток в фазе G0/G1 прослеживается, по крайней мере, в течение 48 ч. Слабые изменения в пролиферирующей S-популяции опухолевых клеток были статистически не достоверны.
Таблица 15.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели, популяционный состав и
интенсивность меланиногенеза в клетках меланомы человека Mel6
| Показатели | Срок после курса Dcr | |||||
| 12 ч | 24 ч | 48 ч | ||||
| Контроль | Dcr | Контроль | Dcr | Контроль | Dcr | |
| Площадь некроза, % | 1-2 | 6-7 | 2-3 | 7-9 | 3-5 | 8-10 |
| Митоз, % | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 |
| Апоптоз, % | 0,1-0,2 | 0,1-0,2 | 0,1-0,2 | 0,2-0,3 | 0,1-0,2 | 0,2-0,3 |
| Клетки с пигментом, % | 1-2 | 2-3 | 1-2 | 2-4 | 2-3 | 3-5 |
| G0/G1 | 27,3±2,5 | 35,9*±2,9 | 30,4±2,2 | 39*±2,3 | 27,1±2,8 | 35,1*±4,5 |
| S+G2/M | 15,6±1,6 | 18,2*±2,3 | 16,4±2,0 | 18*±1,9 | 15,1±3,5 | 16,4±3,1 |
| Число клеток с меланосомами (на 500 клеток) | 135,0 | 175,0 | 144,0 | 210,0 | 159,0 | 227,0 |
| Среднее число меланосом на одну клетку | 19,0 | 28,0 | 21,0 | 35,0 | 26,0 | 42,0 |
| ИИМ | 5,1 | 9,8 | 6,0 | 14,7 | 8,2 | 19,0 |
Примечание:*p0,05
Анализ эффективности комбинации 1,5 мг/кг Dcr + 100 тыс. МЕ/кг РФН показал (табл. 16), что для достижения воспроизводимого ингибирующего эффекта (T/C=57-66%) минимально достаточно 5-дневного курса лечения. Продолжение лечения не приводит к усилению эффекта. Терапевтический выигрыш комбинации по сравнению с монотерапией каждым из препаратов отсутствует.
Применение 4,5 мг/кг Dcr при длительном курсе лечения п/к ксенографтов меланомы человека Mel7 (рис. 5) дало высокий ингибирующий эффект T/C=51% (p0,05), верифицированный по увеличению некротической (в 1,5-2 раза) и апоптотической (в 2-5 раз) гибели клеток при гистологическом исследовании.
Таблица 16.
Эффективность терапии Dcr, РФН и их комбинации на меланоме человека Mel6
| Препарат | Разовая доза | Суммар- ная доза | Vt/Vt-1 на сутки после трансплантации опухоли | T/C%* на сутки после лечения | |||||||
| 19(II) | 23(III) | 28(IV) | 32 (V) | I | II | III | IV | V | |||
| Контроль | 0,2 мл | 4,2 мл | 2,7 | 2,1 | 1,6 | 1,4 | |||||
| Dcr | 1,5 мг/кг | 31,5 мг/кг | 4,7 | 2,1 | 2,1 | 1,4 | 57 | 97 | 100 | 133 | 131 |
| РФН | 100 тыс МЕ/кг | 500 тыс. МЕ/кг | 3,9 | 1,8 | 2,4 | 1,4 | - | 57 | 50 | 74 | 76 |
| Dcr + РФН | 1,5 мг/кг + 100 тыс. МЕ/кг | 31,5 мг/кг + 500 тыс. МЕ/кг | 2,7 | 1,6 | 1,8 | 1,5 | 66 | 64 | 49 | 57 | 60 |
Примечание: *I- 5 сутки введения Dcr, II - 8 сутки введения Dcr и 5 сутки – РФН; III – 12 сутки введения Dcr и 4 сутки после курса РФН; IV – 17 сутки введения Dcr и 9 сутки после курса РФН; V – 21 сутки введения Dcr и 13 сутки после курса РФН.
 Рис. 5. Влияние Dcr на динамику роста ксенографтов меланомы человека Mel7 |
При этом активность митоза достоверно снижалась в 1,5-2,5 раз во время лечения и в 4-6 раз после его окончания. После 5-ого введения препарата получено накопление клеток в стационарной фазе G0/G1 со снижением доли G2/M-клеток; ИП также ниже, чем в контроле почти в 2 раза.
Таблица 17.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели и популяционный состав меланомы человека Mel7
| Показатели | Контроль | Dcr | ||||
| Сутки после трансплантации опухоли | Сутки после лечения* | |||||
| 15(I) | 20(II) | 22(III) | I | II | III | |
| Площадь некроза, % | 8-10 | 15-20 | 20-25 | 15-20 | 20-30 | 25-35 |
| Митоз, % | 1,5-2,0 | 1,5-2,5 | 3,0-4,0 | 1,0-1,5 | 0,5-1,0 | 0,5-1,0 |
| Апоптоз, % | 0,2-0,3 | 0,2-0,3 | 0,2-0,3 | 0,3-0,5 | 0,5-1,0 | 1,0-1,5 |
| G0/G1, % | 65,3±4,5 | 84,0±3,6 | 84,0±3,0 | 81,3±1,1 | 78,0±4,5 | 85,3±1,5 |
| S, % | 10,6±0,6 | 11,0±3,6 | 7,7±1,5 | 10,3±1,5 | 11,3±2,1 | 7,7±1,1 |
| G2/M, % | 24,0±4,0 | 8,3±0,6 | 8,3±1,5 | 9,0±0,6 | 14,0±3,6 | 7,0±1,0 |
| ИП | 35,0±4,5 | 18,7±3,2 | 16,0±3,0 | 18,7±1,1 | 25,3±1,5 | 14,7±1,5 |
Примечание: *I – через 1 суток после 5-кратного введения; II и III – через 1 и 3 сутки после 10-кратного введения, соответственно.
Результаты лечения п/к ксенографтов Mel7 с использованием DTIC 200 мг/кг с 10 по 12 сутки и Dcr 4,5 мг/кг с 10 по 14 сутки после трансплантации показали (табл. 18) достоверно более высокое ингибирование опухоли, чем монохимиотерапия, (Т/С=3% против 5%, p<0,05) с достижением регрессии опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей (УПЖ=29%). Важно, что Mel7 отвечала на монотерапию каждым комбинантом, но была высоко чувствительной к одному из наиболее высокоэффективных противомеланомных средств DTIC. Однако его применение без Dcr было достоверно менее эффективно по всем использованным показателям, т.к. привело к достоверно более слабому ТРО, более низкому УПЖ=21% и не вызвало регрессии опухоли.
Таким образом, на различных моделях меланомы животных и человека выявлена эффективность индукторов дифференцировки: известного препарата РФН и нового - Dcr и установлены оптимальные дозы и режимы применения. Показано, что терапевтический эффект РФН в отношении пигментированной меланомы человека Mel6 реализуется при разовой дозе 100 тыс. МЕ/кг при 5-дневном курсе лечения и проявляется в незначительном и кратковременном ингибировании роста опухоли.
Таблица 18.
Эффективность DTIC и/или Dcr при лечении мышей Balb/c nude с п/к ксенографтами меланомы человека Mel7
| Группа | Разовая доза, мг/кг | Суммар ная доза, мг/кг | Т/C% | Vt/Vt-1 | УПЖ, % | |||||||
| на сутки после окончания лечения | ||||||||||||
| I | II | III | IV | I | II | III | IV | |||||
| Контроль | - | - | - | - | - | - | 9,8 | 4,1 | 5,1 | 2,0 | ||
| DTIC | 200 | 600 | 33* | 23* | 13* | 5* | 3,2 | 2,7 | 2,8 | 0,8 | 21 | |
| Dcr | 4,5 | 22,5 | 66* | 60* | 62* | 79 | 6,4 | 3,7 | 5,2 | 2,6 | 5 | |
| DTIC+Dcr | 200+4,5 | 600+22,5 | 37* | 13** | 9* | 3** | 3,6 | 1,5 | 3,4 | 0,6 | 29* | |
Примечание: DTIC вводили ежедневно на 10-12 сутки после трансплантации опухоли; Dcr - ежедневно на 10-14 сутки отдельно или в комбинации с DTIC на 13-17 сутки после трансплантации опухоли;
I – 1 сутки после окончания лечения DTIC, II – 1 сутки после окончания лечения Dcr, III – 1 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr, IV – 4 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr;
*отличие достоверно относительно контроля, p0,05;
**отличие достоверно относительно группы DTIC, p0,05.
Терапевтический эффект Dcr реализуется при пероральном применении в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневного курса и характеризуется ингибированием роста подкожных узлов на 51-93%, в ряде случаев с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%. Для мышей с меланомой В16 оптимальной является схема применения Dcr в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг с введением в течение 15-30 дней. Эффективные суммарные дозы должны быть более 22,5 мг/кг. Для мышей с ксенографтами меланомы человека оптимальной схемой является длительное (не менее 5-10 дней) введение в разовой дозе 4,5 мг/кг. Более высокую чувствительность мышиной меланомы В16 к действию Dcr можно объяснить отсутствием иммунологического компонента эффекта препарата у иммунодефицитны мышей. Во всех экспериментах с моделями меланомы терапия РФН или Dcr не вызывала каких-либо побочных или токсических эффектов. Механизм ингибирующего противомеланомного действия изучен только для нового препарата Dcr. Его действие иллюстрирует распределение клеток по фазам клеточного цикла и их функциональное состояние (способность к меланиногенезу, активность митозов и апоптоза). Для всех 3-х использованных моделей меланомы показано, что Dcr реализует своей ингибирующий эффект путем усиления в 1,5-6,0 раз некротической гибели опухолевых клеток и в 1,5-5,0 раз активности апоптоза. Комбинированная химиотерапия ЦП в сочетании с последующим введением цитодифференцирующего препарата Dcr в разовой дозе 1,5 мг/кг при лечении пигментированной метастазирующей мышиной меланомы В16 оказалась достоверно более эффективной в сравнении с монохимиотерапией как по торможению роста опухоли на 63-76%, так и в 2 раза по выживаемости мышей. Примененный в субтерапевтической разовой дозе Dcr реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. При комбинированном лечении пигментированной меланомы человека Mel6 одновременное использование 2-х цитодифференцирующих агентов Dcr в разовой дозе 1,5 мг/кг и РФН в сравнении с монотерапией каждым из препаратов, хотя и не позволило добиться высокого противоопухолевого эффекта, но способствовало уменьшению прогрессии опухоли за счет длительной стабилизации роста в течение по меньшей мере 2-х недель после окончания терапии. Dcr и РФН проявили синергизм при лечении меланомы. Комбинированная химиотерапия DTIC беспигментной метастазирующей меланомы человека Mel7 в сочетании с последующим введением Dcr в разовой дозе 4,5 мг/кг достоверно более эффективна, чем монохимиотерапия. Это выражалось в усилении ингибирования роста опухоли в 1,5 раза, частичной регрессии опухоли и увеличении продолжительности жизни мышей на 29%.
Эти данные свидетельствуют о том, что цитодифференцирующая терапия меланомы с использованием РФН или Dcr эффективна в отношение РФН моделей животных и/или человека. РФН проявляет синергизм с Dcr при лечении меланомы. Dcr оказывает противомеланомное действие в широком диапазоне доз при длительном пероральном применении путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения их митотической активности, усиления процесса апоптоза и увеличения зоны некроза а также увеличения степени дифференцировки клеток путем интенсификации меланиногенеза. Поскольку Dcr прошел клинические испытания по 1 фазе, выявленная его противомеланомная активность дает основания для клинического испытания препарата в монорежиме по 2 фазе в качестве средства поддержания ремиссии у пациентов исчерпанными возможностями лечения. Для повышения эффективности интерферонотерапии может быть рекомендована комбинация с одновременным применением РФН и Dcr. Эффективность комбинированной химиотерапии ЦП или DTIC в сочетании с Dcr (применение между курсами химиотерапии) может служить основанием для клинических испытаний в качестве средства повышения эффективности лечения у пациентов с диссеминированной меланомой.
Выводы
- Цитодифференцирующие агенты дикарбамин и диметилсульфоксид в отличие от полностью трансретиноевой кислоты модифицируют фенотип клеток линий NB4 и HL60 острого промиелоцитарного лейкоза человека на промежуточных этапах дифференцировки, сдвигая её в сторону гранулоцитов и/или моноцитов, статистически значимо уменьшая экспрессию маркеров CD33, CD38, и CD54 и увеличивая экспрессию маркеров CD11b, CD15 и CD18 без запуска терминальной миелоидной дифференцировки.
- Антипролиферативное действие дифференцировочных агентов на клетки линий NB4 и HL60 проявляется снижением их митотической активности с уменьшением экспрессии пролиферативного антигена Ki67, а также 2-3-кратным перераспределением клеток из пролиферативной S-фазы в стационарную G0/G1-фазу клеточного цикла. Антипролиферативная активность препаратов убывает в ряду: полностью трансретиноевая кислота>диметилсульфоксид>дикарбамин.
- В монорежиме дифференцировочные агенты статистически значимо ингибируют рост эритробластоза Френд при 2-3-кратном уменьшении активности митоза и увеличении активности апоптоза и зоны некроза; воспроизводимость и уровень эффекта убывают в ряду реаферон>дикарбамин>полностью трансретиноевая кислота.
- Комбинированная терапия эритробластоза Френд при одновременном введении реаферона и полностью трансретиноевой кислоты неэффективна, но эффективна при последовательным введении реаферона и дикарбамина (цитокин - первый) или двух индукторов дикарбамин и полностью трансретиноевая кислота (терминальный индуктор – последний). Терапевтический выигрыш проявляется синергическим усилением торможения роста опухоли с длительной стабилизацией процесса при 1,5-2-кратном уменьшении числа клеток с митозами и 2-4-кратном увеличении числа клеток с признаками апоптоза и зоны некроза.
- Инитрон-А и дикарбамин статистически значимо и дозозависимо уменьшают пролиферативную фракцию клеток меланом В16 и Mel5 в 2-2,7 раза; Интрон-А проявляет синергизм с Dcr при 3-5-кратном усилении антипролиферативного действия.
- Дикарбамин в диапазоне доз 1,5-4,5 мг/кг статистически значимо ингибирует рост меланомы мышей В16 и меланом человека Mel6 и Mel7 на 51-93% с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%; эффективность реализуется путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения митотической активности в 1,2-2,5 раза, с 1,5-5-кратным увеличением клеток с признаками апоптоза и зоны некроза, а также интенсификации меланиногенеза в меланинсинтезирующих клетках (ИИМ=19,0).
- Одновременное комбинированное применение цисплатина c цитодифференцирующим агентом Dcr приводит к достоверному повышению эффективности лечения мышей с меланомой В16; терапевтический выигрыш проявляется увеличением торможения роста опухоли и продолжительности жизни.
- Последовательное комбинированное применение DTIC с цитодифференцирующим агентом Dcr (1-2 курса) приводит к достоверному повышению эффективности лечения ксенографтов беспигментной метастазирующей в легкие меланомы человека Mel7; терапевтический выигрыш проявляется усилением ингибирующего действия на рост опухоли с частичной регрессией опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей.
- Одновременная комбинированная длительная терапия ксенографтов пигментированной меланомы человека Mel6 РФН на фоне Dcr приводит к синергическому усилению эффективности и длительным ингибированием роста опухоли.
- Схемы комбинированного лечения с использованием цитодифференцирующих агентов ПТРК, РФН или Dcr не сопровождаются лимитирующими побочными эффектами.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Гаджиева С.Ш., Полосухина Е.Р., Седакова Л.А., Трещалина Е.М., Барышников А.Ю., Небольсин В.Е. Сравнительная эффективность комбинированной терапии с использованием дикарбамина и других индукторов дифференцировки//РБЖ.-т.4.-№3.-2005 г.-с.106-111.
- Гаджиева С.Ш., Полосухина Е.Р., Николаева Т.Г., Барышников А.Ю., Небольсин В.Е., Антонов В.Г. Цитодифференцирующие агенты в онкологии//Вопросы онкологии.-2006 г.-т. 52.-№ 3.-с.267-274.
- Райхлин Н.Т., Андронова Н.В., Седакова Л.А., Гаджиева С.Ш., Смирнова Е.А., Трещалина Е.М., Небольсин В.Е. Действие препарата дикарбамин на дифференцировку опухолевых гемопоэтических клеток эритробластоза Френд (гистологическое и электронно-микроскопическое исследование)//Вопросы онкологии.-2004 г.-т.50.-№2.-с.228-233.
- Райхлин Н.Т., Андронова Н.В., Седакова Л.А., Гаджиева С.Ш., Смирнова Е.А., Власенкова Н.К., Трещалина Е.М., Небольсин В.Е. Препарат дикарбамин вызывает дифференцировку опухолевых клеток эритробластоза Френд с образованием элементов лимфоидного миелоидного и эритроидного ряда//РБЖ.-т.4.-№3.-2005 г.-с.80-86.
- Райхлин Н.Т., Букаева И.А, Каршиева С.Ш., Небольсин В.Е.Влияние дикарбамина на экспрессию Ag-белков, регулирующих скорость клеточной пролиферации.// VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008 г./ РБЖ.-т.7.-№1.-2008 г.-с. 50-51.
- Каршиева С.Ш., Николаева Т.Г., Райхлин Н.Т., Трещалина Е.М., Барышников А.Ю., Небольсин В.Е.//Особенности роста различных моделей меланомы животных и человека при цитодифференцирующей терапии дикарбамином. VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» Москва, 17-19 марта 2008 г./ - РБЖ.-т.7.-№1.-2008 г.-с. 42.
