WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Тройной негативный рак молочной железы (клинико-биологические особенности).

На правах рукописи

Карселадзе

Дмитрий Аполлонович

ТРОЙНОЙ НЕГАТИВНЫЙ РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (КЛИНИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ).

14.01.12. – Онкология

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2010

Работа выполнена на кафедре онкологии ГОУ ДПО РМАПО и в НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Поддубная Ирина Владимировна.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор

Виктор Павлович Летягин;

Доктор медицинских наук, профессор

Евгения Александровна Коган.

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова Росздрава.

Защита диссертации состоится 2010 г. в на заседании специализированного совета Д001.017.01 при Российском Онкологическом Научном Центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « »_____________2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Шишкин Ю.В.

Актуальность темы Рак молочной железы является одной из самых распространенных злокачественных опухолей у женщин во всем мире. В структуре онкологической заболеваемости у женщин РМЖ занимает 1-е место и частота его неуклонно растет. В 2007 г. в России зарегистрированы 51865 новых больных раком молочной железы. По сравнению с 2002 г. прирост составил 13,1 % [Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2009].

Результаты лечения РМЖ зависят от множества разнообразных факторов и варьируют в широком диапазоне временных интервалов.

Исследования последних лет с применением достижений молекулярной биологии, в целом, и молекулярной патологии, в частности, значительно расширили спектр методических возможностей онкологов и позволили установить тесную связь между экспрессией большой группы генов и особенностями клинического течения РМЖ.

В конце девяностых годов прошлого века в группе раков молочной железы были выделены опухоли, в которых не обнаруживаются рецепторы эстрогенов, прогестерона и не наблюдается амплификация гена Her2/neu, - так называемый «тройной негативный» РМЖ (ТНРМЖ) [Parikh R.R. и соавт. 2008].

ТНРМЖ составляют примерно 15% всех инвазивных РМЖ, достигает больших размеров и имеет в целом плохой прогноз [Tischkowitz M. и соавт. 2007]. Больные ТНРМЖ мало чувствительны к химиотерапии, за исключением препаратов платины [Carey L.A. и соавт. 2007].

На практике введение в ежедневную клиническую жизнь понятия ТНРМЖ осложнилось тем обстоятельством, что в эту группу РМЖ оказались включенными раки разной традиционно принятой морфологии и иммунофенотипа. Значительную долю среди этих новообразования занимают так называемые базалоидные раки. Взаимоотношение трех отрицательных параметров и морфологии РМЖ является неясным фактором, требующим безотлагательного уточнения.

Вышеприведенные данные свидетельствуют о чрезвычайной актуальности изучения клинических особенностей и ряда других структурных и молекулярных параметров ТНРМЖ.

Цель работы: Установление клинико-морфологических и молекулярно-генетических особенностей ТНРМЖ.

Задачи исследования :

  1. Определить принадлежность опухолей к группе тройного негативного рака молочной железы с помощью иммуногистохимических и in situ флуоресцентных методов.
  2. Определить в опухолевой ткани ТНРМЖ частоту разных иммунофенотипов (базального и люминального).
  3. Изучить состояние рецепторов андрогенов в ТНРМЖ.
  4. Установить особенности экспрессии и геномных нарушений гена ПТЭН у больных ТНРМЖ.
  5. Изучить состояние генов рецептора эпидермального фактора роста и топоизомеразы 2А в клетках ТНРМЖ.
  6. Установить возможное прогностическое значение анеусомии хромосом 7,10 и 17 при ТНРМЖ.
  7. Выявить корреляции между указанными параметрами и особенностями клинического течение ТНРМЖ.

Научная новизна исследования: впервые в отечественной литературе дана детальная клинико-морфологическая и молекулярно-генетическая характеристика тройного негативного рака молочной железы. Вскрыта тенденция ТНРМЖ к выраженным семейно-наследственным опухолевым поражениям. Показано, что базалоидный фенотип ТНРМЖ во многом определяет особенности его клинического течения, но является количественно неоднородным, меняющимся в широком диапазоне иммунофенотипичесих характеристик. Впервые в мировой литературе показано, что отсутствие амплификации Her2/neu может возникнуть на разных этапах болезни, и не является результатом герминальной мутации; что дольковый рак молочной железы, в отличие от других гистогенетических вариантов, входящих в группу ТНРМЖ, экспрессирует продукт гена ПТЕН. В работе показано, что отсутствие экспрессии продукта гена ПТЕН в клетках ТНРМЖ не всегда ассоциировано с делецией в области расположения этого гена на длинном плече хромосомы 10. Наряду с амплификацией гена РЭФР в клетках ТНРМЖ наблюдаются явления делеции этого гена.

Практическая ценность работы: полученные автором данные являются важным подспорьем для правильной верификации диагноза РМЖ, для классификации РМЖ по определенному фенотипу, и установления прогноза, определяющими выбор правильной тактики лечения с использованием таргетной терапии. Обнаруженная выраженная тенденция к семейно-наследственному типу возникновения опухолей может быть использована для медико-генетических консультаций с целью раннего выявления разных злокачественных заболеваний в этой популяции больных.

Материал и методы исследования: в диссертации осуществлен анализ особенностей опухолевой ткани и течения болезни 88 больных ТНРМЖ, лечившихся в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период 1996-2008 гг., а также клинико-морфологического материала 30 больных другими вариантами РМЖ (в качестве контрольной группы).

Кроме традиционных клинико-морфологических методов исследования в работе использовались иммуногистохимические и молекулярно-генетические методы, в частности, методика флуоресцентной in situ гибридизации.

Апробация диссертации проведена 22 июня 2010 года на совместной научной конференции кафедры онкологии ГОУ ДПО РМАПО, отделений опухолей молочных желез, хирургии женской репродуктивной системы, онкоурологии, клинической фармакологии, диагностики опухолей, лаборатории клинической цитогенетики, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и кафедр онкологии ММА им. И.М.Сеченова и Московского стоматологического медицинского института.

Внедрение результатов работы: результаты диссертации опубликованы в специальной литературе (3 журнальных публикации), включены в диагностический процесс отдела патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН и в учебный процесс кафедры онкологии РМАПО.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из 5 глав, изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы, 12 рисунков и 4 графика.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Раки молочной железы, клетки которых не экспрессируют рецепторы эстрогенов, прогестерона и не проявляют признаков амплификации гена Her2/neu, составляют группу так называемых тройных негативных раков этого органа (ТНРМЖ), и характеризуются рядом клинико-прогностичесих факторов, дающих основание выделения этой группы опухолей в качестве отдельного нозологического варианта РМЖ.

2. ТНРМЖ может встречаться среди разных гистологических вариантов этого рака и не зависит от традиционных структурных характеристик.

3. Базалоидный рак молочной железы понятие иммунофенотипическое и складывается из нескольких параметров, сочетающихся в каждой опухоли с индивидуальной частотой.

4. Амплификация генов РЭФР и ТОП2А в клетках ТНРМЖ - редкий феномен и не влияет существенно на прогноз заболевания.

5. Делеция гена ПТЭН обнаруживается с большой частотой в клетках ТНРМЖ, но практически отсутствует в дольковом раке этого органа. Одновременно в этих вариантах долькового рака отсутствуют маркеры базалоидной дифференцировки.

Содержание диссертационного исследования

Характеристика материала и методов исследования. Материал для исследования представлен данными о течении болезни 88 больных раком молочной железы (РМЖ), лечившихся в клиниках РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН за период 1990-2008 гг.

Критерием для включения в группу изучения служили отрицательные результаты иммуногистохимического определения рецепторов эстрогенов, прогестерона и Her2/neu.. Для учета результатов иммуногистохимических реакций на рецепторы эстрогенов и прогестерона применялась система Allred, которая предусматривает количественную характеристику двух параметров - число положительно окрашенных ядер и интенсивность окраски. В 12 случаях (13,6%) результаты иммуногистохимических реакций уточнялись с помощью реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH реакции).

Для изучения микроскопической структуры опухолей на светооптическом уровне использовались гистологические препараты, окрашенные гематоксилином и эозином по общепринятой традиционной методике.

Иммуногистохимическое исследование проводилось на срезах парафиновых препаратов толщиной 4 мкм.

Для иммуногистохимического исследования стандартным методом использовали следующие реактивы: рецепторы эстрогенов (Novocastra, клон 6F11, разведение 1:70), рецепторы прогестерона (Novocastra, клон 1А6, разведение 1:70), Her2/neu (Dako, HercepТest), ЦК 5/6, (DBS, клон D5/16 B4, разведение 1:140), ЦК 14, (DBS, клон LL002, разведение 1:70), ЦК 17 (клон E3, Ig G2b Sigma, разведение 1:40), р63 (DBS, клон 4A4, разведение 1:70), Е-кадхерин (BioGenex, клон 36, разведение 1:100), рецепторы андрогенов (BioGenex, клон F39.4.1, разведение 1:350).

В качестве вторичных антител использовали сверхчувствительную систему детекции фирмы BioGenex.

Рецепторы половых гормонов и продукт гена Her2|neu определялись во всех случаях. Для иммуногистохимического исследования других антигенов были отобраны 70 случаев, поскольку в ряде случаев в опухолевой ткани наблюдались выраженные посттерапевтические изменения или материал был нерепрезентативным.

Для изучения геномных нарушений использовалась методика флуоресцентной in situ гибридизации (FISH реакция).

Для установления состояния гена Her2/neu использовалась проба PathVysion HER-2 DNA Probe Kit фирмы Abbott-Vysis.

Для установления нарушений в области гена рецептора эпидермального фактора роста использовалась проба LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set фирмы Abbott-Vysis.

Состояние гена TOP2A оценивалось пробой LSI TOP2A SpectrumOrange/CEP 17 SpectrumGreen фирмы Abbott-Vysis.

Состояние гена PTEN оценивалось пробой LSI PTEN SpectrumOrange/CEP 10 SpectrumGreen фирмы Abbott-Vysis.

Оценка результатов проводилась с использованием флуоресцентного микроскопа Axioscop2Plus (Zeiss).

Для статистической обработки материала был составлен кодификатор, содержащий 240 признаков, которые состояли из нескольких градаций. Для оценки отдаленных результатов лечения по критерию выживаемости использовался интервальный метод построения таблиц дожития «Life table», рекомендованный для применения Международным противораковым Союзом (UICC). Для сравнения таблиц выживаемости использовались тесты Wilcoxon и Mantel-Cox. Достоверность выявленных различий рассчитывалась по критерию Стьюдента. Достоверными считались различия с вероятностью не менее 95%, т.е. р< 0,05.



В определении прогноза жизни использовались программы однофакторного и многофакторного анализа медико-биологической статистики «АСТА», разработанные в лаборатории медицинской кибернетики РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Для оценки выживаемости использовали моментный метод построения таблиц дожития по E.L. Kaplan и P. Meier.

Результаты собственных исследований

Возраст больных тройным негативным раком молочной железы (ТНРМЖ) колебался от 28 до 83 лет. Наибольшее число больных, 31 пациентка (32,5%), принадлежало к возрастному интервалу 41-50 лет; средний возраст 54 года.

В состоянии менопаузы находилось 34 (38,6%) больные. У большинства больных менархе наступили в возрасте 13-14 лет. Самые ранние менархе были у пациенток в 12 лет, самые поздние - в 15 лет.

У двух больных выявлена патология щитовидной железы: гипотиреоз на фоне длительно протекающего (25 лет) хронического тиреоидита у пациентки 69 лет и узловой зоб у другой больной, по поводу которого она в течение 4 лет получала L –тироксин.

Из других заболеваний отметим по одному наблюдению наличия фибролипомы мягких тканей бедра, фибромы анальной области, удаленной за 5 лет до РМЖ; фиброаденомы, удаленной 26 лет тому назад из той же молочной железы; активный туберкулез и тревожно–депрессивный синдром (по одной пациентке). Из сочетанной опухолевой патологии злокачественного характера следует указать 2 наблюдения: одна больная в 1986г. была оперирована по поводу рака сигмовидной кишки, а в РОНЦ диагностирован РМЖ в 2006 году (клинических проявлений рака кишечника не было).

Изучение наследственности с точки зрения онкологических заболеваний дало следующие результаты. Случаи семейного рака молочной железы отмечались в 11 (12,5%) наблюдениях. У трех пациенток РМЖ болели матери, причем у одной пациентки мать страдала двусторонним РМЖ. У двух пациенток РМЖ документирован у бабушек по материнской стороны, причем у одной пациентки РМЖ болела и мать и бабушка; в трех случаях РМЖ был у родных сестер матери, а в 3 - у родных сестер отца (6 наблюдений).

Отягощен был и онкогинекологический анамнез. У двух пациенток матери страдали раком эндометрия, причем одна из них отмечена выше, поскольку страдала первично множественным раком – РМЖ и раком эндометрия. В трех наблюдениях раком эндометрия болели тети и двоюродная сестра больных.

Рак яичников отмечен у матери одной пациентки, и рак вульвы - у другой. Бабушки двух пациенток по материнской линии имели в анамнезе рак шейки матки.

Обращало на себя внимание наличие разнообразной опухолевой патологии по другим органам среди родственников больных, причем по женской линии явно наблюдалась тенденция к поражению желудочно-кишечного тракта: в 3 наблюдениях у матерей отмечались случаи рака желудка, поджелудочной железы и рака легкого (по одному наблюдению); два случая рака пищевода известны у бабушек по материнской линии, один случай рака сигмовидной кишки - у бабушки по отцовской линии и один случай первичного рака печени у родной сестры отца.

По мужской родственной линии выявлялись следующие злокачественные новообразования: рак предстательной железы у отцов 2-х пациенток; рак легкого - у отца одной пациентки и у деда по отцовской линии еще у одной больной. В семье одной больной онкологическая патология была у обоих дедушек - у одного -рак толстой кишки, у другого -рак пищевода.

Дяди одной пациентки (детализовать родственную линию не удалось), страдали раком гортани.

У одной пациентки сын болел лейкозом, вариант которого не уточнялся.

Первичная диагностика ТРМЖ проходила без каких-либо сложностей. Мало чем клинически отличался ТНРМЖ от обычной семиотики РМЖ, заставляющей больную обратиться к врачу. В преобладающем большинстве случаев (89,8%) больные сами обнаруживали узел в железе; некоторые отмечали быстрый рост образования. В отдельных случаях опухоль была случайной находкой при медицинском осмотре. На маммограмме обычно визуализировались узлы разнообразной формы, чаще с неровными краями. Микрокальцинаты встречались сравнительно редко - до 8% случаев. Нам не удалось идентифицировать на маммограммах отсутствие фоновых процессов в окружающей опухоль ткани молочной железы, что некоторые авторы расценивают патогномоничным признаком ТНРМЖ. На УЗИ опухоли имели вид гипоэхогенных структур с повышенной васкуляризацией, с кистами разного размера, с тяжами по переднему контуру, в отдельных наблюдениях с «дорожкой» к соску.

В половине случаев (44 пациентки, 50%) для первичной верификации диагноза применялся метод тонкоигольной пункции с последующим цитологическим исследованием материала. В 33 случаях (75%) диагноз РМЖ был поставлен по результатам первой же пункции. В 2 наблюдениях – после второй пункции. В 11 наблюдениях первичная верификация ТНРМЖ произведена по трепано биопсии, что позволило не только во всех случаях окончательно установить диагноз РМЖ, но и провести дополнительное иммуногистохимическое исследование материала с установлением тройного негативного характера новообразования.

В 58 случаях опухоль локализововалась в левой молочной железе, в 30 – правой молочной железе. Синхронное двустороннее поражений на нашем материале мы наблюдали только у двух больных (2,3%). Метахронные раки выявлены у 9 больных (10,2%). Интервал между поражением обеих молочных желез был равен 2, 2, 3, 4,7,8,10,10 и 19 лет. Интересно отметить, что по рецепторному статусу и по экспрессии Her2/neu опухоли у одной и той же больной были разнообразными: у четырех больных в обеих молочных железах опухоли были тройными негативными; у других пяти – первая опухоль была рецептороположительной, содержала очаги амплификации гена Her2/neu, а клетки опухоли с контролатеральной молочной железы были отрицательными по всем трем параметрам.

Окончательное стадирование процесса, проведенное после исследования операционного материала, показало, что преобладали начальные стадии – 53 больные (60,2 %) : T1N0M0(I стадия) - 18 больных, T2N0M0 (IIa стадия) - 19 больных, Т1N1М0 (IIa стадия) – 4 больных, T2N1M0 (IIb стадия) -10 больных, Т1N1М0 (IIa стадия) – 4 больных, Т3N0M0 (IIb стадия). Таким образом, на нашем материале не подтверждаются данные литературы об изначальном преобладании среди больных ТНРМЖ пациентов с далеко зашедшими стадиями процесса.

После первичной верификации диагноза 24 пациентки как по месту жительства, так и в РОНЦ получили курсы неоадъювантной химиотерапии. Хирургическое лечение заключалось в выполнении радикальной мастэктомии с сохранением обеих грудных мышц у 58 больных, радикальной резекции с последующей адъювантной терапией у 24 пациенток; в 5 случаях произведена санационная мастэктомия и одной больной 83 лет по возрастным показаниям осуществлена секторальная резекция. С учетом исходной распространенности процесса преобладающее большинство больных (85 пациенток – 96,6%) получили комбинированное лечение с использованием различных схем лекарственной терапии (74 случая – 87%) или сочетания химио- и лучевой терапии (11 наблюдений – 13%). Лучевая терапия в СОД 40-50 Гр после радикальной резекции при Ia стадии осуществлена 3 больным (3,4%). Разнообразие лекарственной терапии затрудняет объективное сопоставление эффективности различных при ТНРМЖ.

Тем не менее, обращает на себя внимание низкая частота развития локо-региональных рецидивов при этой разновидности РМЖ: нами установлено развитие только 4 местных рецидивов (4,7%).

За период наблюдений за больными ТНРМЖ ( от 3 до 10 лет, в среднем 6 лет ) отдаленные метастазы развились у 24 больных (27,37%). МЕДИАНА!!!!!!!!!!! Медиана это параметр который характеризует случайную подборку. Не может быть медианы времени наблюдения.Время наблюдения это инвариантная величина в данном случае. Тут неправильно используется термин медиана. Повидимому имеется в виду средняя продолжительность.

Гематогенная диссеминация возникала преимущественно при больших размерах первичной опухоли с разной степенью вовлечения регионарного лимфатического аппарата (при Т4 в 45% случаях, при Т2-3 – в 36% наблюдениях).

Интервал между появлением отдаленных метастазов и первой клинической манифестации и лечения больных варьировал в широком диапазоне от одного до трех лет. Локализация метастазов была разной: кости скелета (5 больных - 22,7%), головной мозг, причем множественные (4 больных – 18,2%), печень (5 больных, у одной с развитием асцита – 22,7%), легкие (4 больных – 18,2%). Внутрикожные метастазы выявлены у одной больной и метастазы в надключичные и средостенные л/узлы также у одной пациентки. Причем указанные локализации обычно сочетались. У одной пациентки на вскрытии была обнаружена редкая локализация метастазов - в забрюшинных вегетативных ганглиях.

Лечение больных с отдаленными метастазами осуществлялось в соответствии с существующими стандартами и зависело от локализации основного метастатического очага.

Морфологическая и иммунофенотипическая характеристика тройного негативного рака молочной железы. Опухоли группы ТНРМЖ макроскопически не обладали какими-нибудь специфичными чертами. Размеры их колебались от 0,5 до 10-11см. Локализация опухоли по разным квадрантам молочных желез также совпадала с таковой типичных вариантов РМЖ.

По традиционной гистологической классификации опухолей молочной железы ВОЗ микроскопическая структура изученных новообразований соответствовала инфильтративному протоковому раку (67 наблюдений – 76,14%); следует подчеркнуть у 36 (53,7%) больных опухоли были 3 степени злокачественности, а у 18 больных (26,8%) 2 степени злокачественности

Дольковый рак также высокой степени злокачественности с преобладанием солидных структур выявлен у 8 больных (9,1%), у 3 (3,4%) больных диагностирован смешанный протоково-дольковый рак.

Встречались и редкие формы раков (11,36%): медуллярный рак с лимфоидной стромой - 5 больных, апокринный рак 1 больная, метапластический рак с эпидермизацией и хондроидной дифференецировкой 3 больных и одна больная – папиллярный рак.

Предраковые изменения в окружающей опухоль ткани обнаруживались сравнительно редко. В протоковых инфильтративных раках мы выявили картину внутрипротокового рака in situ у 12 больных, и долькового рака in situ у одной больной вокруг опухоли, имеющей строение медуллярного рака с лимфоидной стромой.

Чаще, почти в 70% случаев, протоковые раки были окружены структурами пролиферативного варианта фиброзно-кистозной болезни, внутрипротоковыми диспластическими изменениями.

Среди всех гистологических вариантов ТНРМЖ, практически в каждой группе, но с явным преобладанием среди протоковых раков, можно встретить недифференцированные формы новообразований, которые по своей микроскопической структуре соответствуют так называемым базалоидным ракам, специфический фенотип которых подтвержден при последующем иммуногистохимическом исследовании. Таких вариантов на нашем материале было 14. Наряду с типичными базалоидными формами ТНРМЖ выявлялись и новообразования аналогичного базалоидного иммунофенотипа, которые при традиционных методах окраски занимали как бы промежуточное место между базалоидными раками и медуллярным раком с лимфоидной стромой, а также с т.н. «лимфоэпителиомами» молочной железы. Для определения возможной общности разных гистологических вариантов, входящих в состав большой группы ТНРМЖ, обратимся к результатам иммуногистохимического исследования материала. В целом, они свидетельствуют о более широком распространении маркеров базальной дифференцировки в группах разных гистологических подтипов РМЖ. Например, их можно обнаружить и в легко идентифицирумых типичных протоковых раках.

Положительная реакция на виментин определялась в клетках ТНРМЖ у 24 больных. Обычно эта реакция интенсивная, выявляется по всей клеточной популяции опухоли. Практически все виментин-положительные опухоли имели третью степень гистологической злокачественности. Одна опухоль была апокринным раком.

Из определяемых нами кератинов базального типа чаще всего определялся цитокератин 14. Причем кератины этой разновидности выявлялись в широком качественном и количественном диапазоне. В целом, положительная реакция на ЦК 14 определена в опухолевых клетках 44 больных (62,8%).

Гораздо реже (в 37,1%) встречались опухоли, клетки которых экспрессировали другой характерный для базальной дифференцировки тип кератинов - ЦК5/6. В целом, экспрессия ЦК 5/6 имеет мало интенсивный характер, гнездное распространение и только в 25% случаев сочетается с положительной экспрессией виментина.

Все раки, клетки которых дают положительную иммуногистохимическую реакцию на ЦК5/6, также являются опухолями низкой степени дифференцировки (G3), лишь только в двух случаях мы видели нерезко положительную реакцию в опухолях умеренной (G2) степени гистологической злокачественности.

Наконец, последний общепризнанный маркер базалоидной (миоэпителиальной) дифференцировки р63 оказался мало информативным по ряду причин. Во-первых, он экспрессируется значительно реже других маркеров. Мы наблюдали положительную иммуногистохимическую реакцию на р63 всего лишь у 10 больных (14,2%). Во-вторых, число клеток, дающих эту реакцию, не превышает 1-2%. Только у одной больной мы насчитали около 3% положительно окрашенных ядер. И, наконец, сама окраска по интенсивности низкая.

Мы попытались сгруппировать больных ТНРМЖ по разным фенотипам и получили следующие результаты:

Фенотип Вим+, р63+, ЦК5/6 +, ЦК14+ оказался у четырех больных, и то р63+, ЦК5/6+ клетки определялись в небольшом количестве.

Шесть пациенток вошли в группу, представленную фенотипом р63+, ЦК5/6+, ЦК14+. У одной больной из этой группы был медуллярный рак с лимфоидной стромой, у остальных - протоковый инфильтративный рак 2-3 степени злокачественности.

Шесть больных имели фенотип Вим+, ЦК5/6+, ЦК14+. Гистологически две опухоли этой группы соответствовали метапластическому раку с плоскоклеточной, хондроидной метаплазией, а остальные - протоковому инфильтративному раку 2-3 степени злокачественности.

Пять больных характеризовались фенотипом ЦК5/6+ и ЦК14+. Микроскопическая структура опухолей с указанным фенотипом более всего напоминала базалоидные раки молочной железы.

Наиболее многочисленной была группа больных, представленных иммунофенотипом ЦК14+ (23 больных). При этом следует заметить, что интенсивность самой реакции и ее распространенность часто не выходила за пределы 1+ (у 7 больных) и иногда сочеталась с фокально положительной реакцией на виментин (11 больных). Микроскопическое строение опухолей этой группы соответствовало протоковым ракам 2-3 степени злокачественности. Лишь у одной больной выявлена опухоль комбинированного строения - протоково/дольковый рак.

Всего лишь у 5 больных опухоль имели фенотип ЦК 5/6 +, также в сочетании с мелкими фокусами Вим+ у трех из них. Все пять опухолей имели строение протоковых раков высокой гистологической степени злокачественности, представленных солидными структурами.

У 21 больной мы не смогли обнаружить ни одной положительной реакции на маркеры базального фенотипа. Микроскопически эти опухоли представляли собой гетерогенную группу. Большинство из них имело строение протоковых раков, однако встречались и опухоли с микроскопическими структурами дольковых и даже медуллярных раков с лимфоидной стромой.

График 1. Общая выживаемость больных в зависимости от экспрессии базального фенотипа.

При изучении прогноза отмечается незначительное увеличение общей 5-летней выживаемости в группе больных без базального фенотипа (78,5% против 70,6% у больных с базальным фенотипом).

Рецепторы андрогенов с помощью иммуногистохимического исследования мы обнаружили у 27 больных (38,5%). Реакция носила очаговый характер, хотя в 3+ группе окраска была диффузно распространенной.

По своей микроскопической структуре опухоли обеих групп РА+ и РА- не отличались друг от друга. В группе РА+ опухолей различной степени гистологической злокачественности были представлены почти поровну: G3 - 11 больных и G2 - 12 больных. Среди них было также по 2 медуллярных и 1 дольковому раку. В двух случаях опухоли были исследованны после лечения. По своему клиническому течению АР+ опухоли мало чем отличались от АР- опухолей. Отмечена лишь некоторая тенденция к увеличению общей выживаемости в группе больных с отрицательными рецепторами андрогенов (82,9% против 70,9%).

График 2. Общая выживаемость больных в зависимости от экспрессии рецепторов андрогенов.

.

Состояние генов рецептора эпидермального фактора роста, топоизомеразы 2А и ПТЕН и хромосом 7, 10 и 17 в ТНРМЖ. Исследование состояния генов рецептора эпидериального фактора роста (РЭФР) и топоизомеразы 2А (ТОП2А) с помощью флуоресцентной реакции in situ гибридизации было проведено у 60 больных по общепринятой методике. Результаты гибридизации пробы на ген РЭФР имеют вид 2 зеленых сигналов (исходящих от центромеры хромосомы 7) и 2 красных сигналов, связанных с последовательностями нуклеотидов в области гена рецептора эпидермального фактора роста. Изучалась опухолевая ткань не только у нелеченных больных, но и после предоперационной терапии.

Абсолютно нормальный характер результатов FISH реакции мы наблюдали у десяти больных.

Частота амплификации гена РЭФР на нашем материале невысокая. Если принять за амплификацию наличие более 4 лишних сигналов гена по сравнению с числом центромерных, то таких больных было трое (все они ранее не лечились). Микроскопическая структура этих опухолей соответствовала солидному недифференцированному раку с выраженным полиморфизмом опухолевых клеток.

Наряду с больными, имеющими такое резкое преобладание копий гена РЭФР, встречались и больные, в опухоли которых определялись клетки содержащие до трех лишних копий этого гена (4 пациенток). Две больные из них получили предоперационную химиотерапию со слабо выраженными признаками терапевтического патоморфоза. У всех больных этой группы опухоли имели строение протоковых раков, у двух больных со слабо положительными маркерами базалоидного иммунофенотипа.

Отдельно учитывались клетки с полисомными ядрами, т.е. с сочетанным увеличением и копий гена РЭФР, и числа самой хромосомы 7. Это явление полисомии, довольно частый феномен (15 наблюдений). Опухоли с полисомией большей частью выявлены у леченных больных, и почти поровну были представлены базалоидным и небазалоидным фенотипом. Особого внимания заслуживают феномен потери хромосомы 7 и/или трисомия этой же хромосомы. В изолированном виде подобного рода патология встречается редко, однако, как преобладающий компонент общей анеусомии явление довольно распространенное.

Больные с трисомией хромосомы 7 также представляли собой в некотором виде гетерогенную группу. Только 4 из 15 больных получили предоперационную терапию. Микроскопическая структура опухолей двух больных соответствовала дольковому раку, еще у двух - метапластическому, а у оставшихся (11 больных) - недифференцированному протоковому раку, с преобладанием (8 случаев) базалоидного иммунофенотипа.

В группе больных с моносомией хромосомы 7 (7 пациенток) леченных до оперативного вмешательства пациенток не было. Опухоли преимущественно были представлены новообразованиями протокового гистотипа. Исключение составляет один случай опухоли со структурой долькового рака. Базальный фенотип отсутствовал у двух больных.

В норме результаты гибридизации in situ при изучении гена TOП2А с помощью пробы фирмы Abbott-Vysis имеет вид четырех раздельных сигналов: по 2 красного и 2 зеленого, источником которых является центромера хромосомы 17 (зеленый сигнал) и нуклеотидные последовательности в области гена TOП2А (красный сигнал) соответственно на длинном плече этой хромосомы.

Характер и число сигналов как центромеры хромосомы 17, так и гена TOП2А на нашем материале был следующим: нормальный набор сигналов - по 2 зеленых и 2 красных- мы обнаружили у 11 больных. Сравнение этих результатов с группой больных, демонстрирующих нормальную картину распределения сигналов при изучении гена EGFR, показывает, что общими в указанных группах являются только три больные.

Указанная группа представлена больными, не получившими предоперационной терапии, за исключением одной пациентки, прошедшей курс лучевой терапии с патоморфозом второй степени. Только у одной пациентки опухоль имела строение долькового рака. Остальные опухоли по структуре соответствовали протоковому раку разной степени дифференцировки. Все опухоли, за исключением одной, имели базалоидный иммунофенотип.

Частота амплификации гена TOП2А, как и РЭФР в изучаемой группе больных невысокая. Резкое увеличение числа сигнала, почти в два раза, мы нашли у двух больных, на 3-4 сигнала больше центромерного – у шести больных.

Клинически больные со значительной степенью амплификации были пациентами, получившими предоперационные курсы химиотерапии. Опухоли имели строение раков низкой степени дифференцировки, небазалоидного иммунофенотипа. У одной больной отсутствовали нарушения в области гена РЭФР, у другой- найдена полисомия хромосомы 7.

Больные, у которых выявлена амплификация гена TOП2А на небольшое ( 3-4) число копий, составили группу, наоборот, нелеченных до операции ( за исключением одной пациентки) больных. Опухоли имели строение низкодифференцированных солидных раков (в одном случае метапластического). В двух случаях опухоли имели базальный иммунофенотип, и у всех больных выявлена полисомия хромосомы 7 с соответствующим увеличением число гена РЭФР, вплоть до 6 копий.

Другой вид зарегистрированного нарушения – это делеция гена TOП2А, проявляющаяся уменьшением числа красных сигналов. Мы регистрировали два подобных случая. У одной больной 25% ядер были лишены одной копии гена, в то время как у другой больной процесс носил более распространенный характер с вовлечением до 80% клеточной популяции. Одна из больных получила курс предоперационной химиотерапии. У обеих больных опухоли имели строение протоковых раков, не обладающих базалоидным иммунофенотипом.

Хромосома 17, на которой локализован ген TOП2А, как и хромосома 7 у больных с ТНРМЖ подвержена количественным изменениям в сторону уменьшения, моносомии и увеличения, полисомии.

Четко выраженная и убедительная моносомия более в чем 20% ядер выявлялась у 10 больных. Две опухоли имели структуру долькового рака, остальные - низкодифференцированного протокового рака. Опухолевые клетки 4 больных имели базалоидный иммунофенотип.

Трисомия хромосомы 17 встретилась в 5 случаях, с частотой 10-80% анеусомных ядер. Эти больные также формировали гетерогенную группу. Две из них получали предоперационную химиотерапию. Одна имела метапластический рак, другая - дольковый. У остальных трех был низкодифференцированный протоковый рак. Клетки всех опухолей давали той или иной интенсивности и диапазона положительные реакции на базалоидные маркеры. Ген РЭФР не был изменен, однако полисомия хромосомы 7 встречалась у 4 больных, а в одном наблюдении долькового рака определялась моносомия этой же хромосомы.

Полисомные ядра до 4-6 центромерных сигналов мы наблюдали только у трех больных. В целом, этот феномен встречается реже, чем аналогичные изменения с центромерой хромосомы 7. Важно отметить, что при этом все трое больных не получали до операции никакого лечения

При наличии опухоли с амплификацией гена РЭФР больные умерли в период от 1 до 3 лет, при отсутствии исходно далеко зашедших стадий (процесс характеризовался ка Т2N1M0, Т2N2M0, Т2N0M0) однако число больных для окончательных выводов недостаточно.

Полисомия, в том числе и трисомия хромосомы 7 встречалась среди больных с разными клиническими параметрами, в том числе и стадии. Обращает на себя внимание факт отсутствия в этой группе больных с малыми размерами опухоли (2см). В прогностическом плане больные этой группы несопоставимы.

Пациенты с моносомией хромосомы 7, за исключением одной больной имели небольшие опухоли без поражения регионарных лимфатических узлов.

Группа больных с отсутствием нарушений в области гена TOП2A и анеусомии хромосомы 17 более гетерогенна по составу, чем группа пациентов с отсутствием нарушений в области гена РЭФР и анеусомии хромосомы 17. В целом, преобладали больные с наличием крупных опухолевых узлов и метастазами в регионарные лимфатические узлы. Отдаленных метастазов в этой группе больных изначально не было. Трое больных имели двухсторонний процесс. Через год после начала лечения умерла только одна больная.

У больных с моносомией хромосомы 17 выделялись разнообразные клинические стадии и, видимо, имеют если не хороший прогноз, то, по крайней мере, не отягощенный потерей этой хромосомы. В этой группе пациенток только две больные умерли: одна со стадией T4N3M0 через год, а другая T1N0M0 - через четыре года после начала терапии.

Делеция гена TOП2A зарегистрирована в двух случаях с определением в опухолевой ткани разной частоты ядер с нарушениями: 20% и 80 %. Амплификация TOП2A встречалась при разных стадиях болезни и, насколько можно судить по данной небольшой группе, явно связана с хорошей чувствительностью к схеме FAC, с длительным безрецидивным периодом.

Результаты иммуногистохиимического изучения продукта гена ПТЭН в ТНРМЖ. Положительная реакция на продукт гена ПТЭН имела вид темно-коричневой окраски ядер клеток. Цитоплазматической окраски на нашем материале ни в опухолевых, ни в нормальных клетках молочной железы мы не наблюдали.

Из 80 исследованных больных с ТНРМЖ методом иммуногистохимии продукт гена ПТЭН полностью отсутствовал в опухолевой ткани у 56 пациенток (70%); у 24 пациенток (30%) реакция, в основном, была слабо положительной, очаговой, иногда определялась в высокодифференцированных тубулярных структурах.

В этой группе распространенная положительная реакция с вовлечением всей популяции опухолевых клеток наблюдалась у 13 больных. Анализ клинико-морфологических данных этой группы пациенток показал, что больные были представлены двумя подгруппами. В одну подгруппу входили 7 больных: опухолевые клетки у этих больных давали четкую, повторяющуюся положительную реакцию на ПТЭН и имели строение дольковых раков. Сравнение с больными контрольной группы показало, что и в контрольной группе, среди больных без фенотипических признаков ТНРМЖ, дольковые раки тоже содержат продукт гена ПТЭН. Микроскопически в обеих группах опухоли содержали все структурные варианты долькового рака. Остальные больные, составляющие другую подгруппу, получали предоперационную терапию, что несколько затрудняло установление гистологического варианта рака. Совокупный анализ с другими иммуногистохимическими параметрами и данными FISH реакации показал, что у больных с положительной реакцией на ПТЭН дольковые раки не содержат базалоидных маркеров, отрицательны по андрогеновым рецепторам и характеризуются моносомией как хромосомы 7, так и хромосомы 17.

В остальных случаях, когда опухоли содержали продукт гена ПТЭН, также очень слабо выражены признаки базалоидного иммунофенотипа. Лишь у двух больных выявлены рецепторы андрогенов и в трех случаях клетки рака положительны по виментину.

Сопоставляя результаты иммуногистохимического определения продукта гена ПТЭН с общей выживаемостью больных ТНРМЖ, мы установили, что все 16 случаев, с убедительной положительной реакцией объеденяет одна определенная черта: в частности, при положительной реакции ПТЭН 5-летняя выживаемость больных значительно выше, чем в группе больных с отрицательной реакцией (85,4% против 68,2%). В этом смысле отсутствие признаков дисрегуляции гена ПТЭН видимо ассоциируется с комплексом благоприятных прогностических параметров.

График 3. Общая выживаемость больных в зависимости от экспрессии продукта гена ПТЭН.

В контрольной группе лишь у двух больных отсутствовал продукт гена ПТЭН. У остальных больных при всех вариантах РМЖ положительная иммуногистохимическая реакция имела достаточно распространенный и убедительный характер

Результаты FISH реакции на ген ПТЭН. В нормальных структурах как в строме опухоли, так и в окружающих железах, в эпидермальном покрове, а также в очагах фиброзно-кистозной болезни и фиброаденомы нам никогда не удавалось регистрировать статистически значимое число делеций. В норме в каждом ядре сочетание зеленого (центромерного) и красного (от гена ПТЕН) сигналов равняется 2:2.

В опухолевых клетках 34 больных из 50 исследованных с применением этого метода (68%) содержатся очаги делеции в области q23 на хромосоме 10, причем внутриопухолевая распространенность этого феномена неоднородна. Есть опухоли, содержащие небольшое число ядер с делецией, наряду с новообразованиями, в которых регистрируется не менее 60% таких ядер. В основном, делеция выявляется в ядрах с двумя центромерными сигналами, т.е. встречаются в виде двух зеленых и одного красного сигналов.

На нашем материале мы встретили и редкий тип нарушений – лишний сигнал гена ПТЕН. Причем, если обычно, это один сигнал в сочетаниях типа 1:3; 2:3; 3;4,то в отдельных наблюдениях число копий гена ПТЕН (красный сигнал) превышает число центромерных сигналов на 4,5 и более, что дает основание говорить о феномене амплификации этого гена. Эта тенденция к амплификации особенно явственно видна среди больных, получивших неоадъювантную терапию.

Отдельно следует отметить случаи с трисомией хромосомы 10, которая встречается в сочетании с соответствующей лишней копией гена ПТЕН (3:3) примерно в 10% случаев. Клиническое значение этого феномена пока неясно, равно как и неясно значение моносомии хромосомы 10 - редко, но все же встречающейся аномалии в ТНРМЖ.

Сопоставление результатов FISH реакции с данными иммуногистохимического исследования показывает, что, в основном, они совпадают, т.е. отсутствие продукта гена ПТЕН сочетается с делецией участка 10q23. Однако, на нашем материале в 7 наблюдениях мы видели отсутствие продукта гена ПТЕН в клетках ТНРМЖ, в которых при FISH реакции признаки делеции этого гена не выявлялись. Логичным является предположение, что у этих больных отсутствие экспрессии гена было вызвано иными геномными или эпигенетическими нарушениями.

Отдельно следует отметить то обстоятельство, что как и в случаях с Her2/neu в опухолях с выраженной полисомией и с кратным увеличением копии гена ПТЕН, продукт этого гена или не определялся, или регистрировался в минимальных количествах.

Подводя итог вышеприведенным данным мы можем утверждать,что тройной негативный рак молочной железы является самостоятельным вариантом этого новообразования, характеризуется не только определенным статусом рецепторов стероидных половых гормонов и Her2/neu, но и специфическим иммунофенотипом с экспрессией широкого спектра базалоидных цитокератинов. В опухолевых клетках тройного негативного рака молочной железы наблюдается ряд хромосомных абераций и нарушение экспрессии генов рецептора эпидермального фактора роста и топоизомеразы, а также делеция в области гена ПТЭН. Традиционные схемы терапии рака молочной железы мало эффективны для его тройного негативного варианта. Предстоит серьезное мультидисциплинарное изучение проблемы для выработки рациональных способов терапии и улучшения прогноза таких больных.

Выводы

1. ТНРМЖ встречается в возрастном интервале 41-60 лет, клинически характеризуется преймущественным наличием I-II стадией (60,2%) и склонностью к раннему обширному гематогенному метастазированию, в том числе и в головной мозг (4,6%).

2. Больные ТНРМЖ имеют более отягощенный семейно-наследственный онкологический анамнез как по материнской, так и по отцовской линиям: в раковых семьях встречается много случаев семейного РМЖ (12,5%). Рак яичника в этой популяции выявляется редко.

3. При ТНРМЖ у 12,5% больных развивается двусторонний РМЖ, чаще метахронный. Тройной негативный фенотип выявляется во всех вторых опухолях, как синхронных, так и метахронных, развивающихся через 10-16 лет после удаления первого новообразования.

4. С позиций традиционных гистологических классификационных схем ТНРМЖ гетерогенная группа опухолей и представлена самыми разнообразными микроскопическими структурами от протокового до медуллярного рака с лимфоидной стромой. Большинство этих опухолей имеет высокую гистологическую степень злокачественности (75,7%).

5. Базалоидный рак молочной железы - понятие иммунофенотипическое и выявляется у 30% больных ТНРМЖ. Удельная частота экспрессии разных иммуногистохимических маркеров базалоидности при этом варьирует в широком диапазоне (от 62,8% до 7,1% ) и носит индивидуальный характер.

6. Рецепторы андрогенов в клетках ТНРМЖ экспрессируются в 38,5% случаев. Умеренно и резко положительные реакции встречаются у 51,8% больных ТНРМЖ и не сопряжены с определенной гистологической структурой рака.

7. Амплификация генов РЭФР и ТОП2А у больных ТНРМЖ явление редкое. Частота не превышает 10% и 11%, соответственно, и отмечается преимущественно в популляции больных, получавших неоадьювантную химиотерапию. Делеция этих генов феномен еще более редкий и наблюдается в единичных случаях. Анеусомия хромосом 7 и 17 более распространенное явление (15,9%) и проявляется, в основном, моно- и трисомией и не имеет прогностического значения.

8. В клетках ТНРМЖ за исключением опухолей, имеющих строение дольковых раков, обнаруживается мутация гена ПТЕН. За редкими исключениями этот феномен подтверждается делецией этого гена в области 10q23. ТНРМЖ с мутацией гена ПТЕН не относятся к опухолям с базалоидным иммунофенотипом.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Поскольку феномен амплификации гена Her2/neu не являетеся постоянным, то необходимо повторное определенеие статуса этого гена при каждом рецидиве опухоли в процессе прогрессирования РМЖ

2. Кроме установления факта «тройного негативного» характера РМЖ желательно проведение иммуногистохимического исследования с целью выявления базалоидного и иммунофенотипа опухоли, во многом определяющего прогноз заболевания.

3. Для установления комплекса параметров, свидетельствующих о возможной чувствительности ТНРМЖ к химиотерапии, рекомендуется проведение FISH реакции для выявления амплификации генов РЭФР и ТОП2А в опухолевых клетках.

4. Учитывая отягощенный наследственно-семейный анамнез у больных ТНРМЖ необходим тщательный медико-генетический контроль для выявления опухолевых заболеваний среди родственников и членов семьи пациенток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

  1. «Тройной негативный» рак молочной железы / И.В.Поддубная, Д.А.Карселадзе // Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН,2009. -т.20.-№ 3. -С12-19.
  2. Морфология тройного негативного рака молочной железы / Поддубная И.В., Карселадзе А.И., Кулевич Е.Е.// Архив патологии, 2010.- т.72, № 2.- С. 8-12.
  3. Клиническая характеристика тройного негативного рака молочной железы. / Поддубная И.В.// Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.- 2010.- Т 22, № 1.-С.71-76.

КАРСЕЛАДЗЕ

Дмитрий Аполлонович

ТРОЙНОЙ НЕГАТИВНЫЙ РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

(КЛИНИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ)

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Подписано в печать. Бумага

Тираж экз. Зак.

Издано

Отпечатано в типографии

Москва



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.