Васкулогенная мимикрия при меланоме кожи
На правах рукописи
ГРИГОРЬЕВА Ирина Николаевна
ВАСКУЛОГЕННАЯ МИМИКРИЯ ПРИ МЕЛАНОМЕ КОЖИ
Специальность: 14.01.12 - Онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва
2011
Работа выполнена в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (директор – академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)
Научные руководители:
Доктор медицинских наук Степанова Евгения Владиславовна
Доктор медицинских наук Харатишвили Теймураз Кобаевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, Кадагидзе Заира Григорьевна
профессор
Доктор медицинских наук, Рогов Константин Аркадьевич
профессор
Ведущая организация
ФГУ Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Министерства здравоохранения и социального развития РФ
Защита диссертации состоится «__» _____ _______ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного Совета (Д.001.17.02) Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Автореферат разослан «___» ______________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Известно, что с ранних этапов развития новообразования необходим ангиогенез, однако, в ткани меланомы, наряду с ангиогенезом, запускаются альтернативные механизмы кровоснабжения, например, васкулогенная мимикрия.
Васкулогенная мимикрия (ВМ) – это способность опухолевых клеток формировать ограниченные базальной мембраной PAS-положительные сосудистоподобные каналы без участия эндотелиальных клеток и фибробластов. Полагают, что формирование опухолевыми клетками высокоструктурированных васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной, происходит при гипоксических условиях и недостатке питательных веществ.
В исследованиях было показано, что компоненты ВМ находят в 70-80% случаев меланомы кожи и глаза, 10-20% случаев рака молочной железы, яичников и астроцитом. Известно, что пациенты с меланомой, в опухолевой ткани которых есть структуры ВМ, могут иметь худший прогноз заболевания. Так, присутствие в ткани опухоли определенного типа PAS-положительных структур коррелирует с появлением отдаленных метастазов после удаления первичной опухоли.
Способность к ВМ может быть обусловлена особенностями фенотипа опухолевых клеток. Отмечено, что клетки, способные к ней, часто экспрессируют молекулярно-биологические маркеры, характерные для эндотелиальных клеток, такие как VE-кадхерин, EphA2, фактор Фон Виллебранда / фактор VIII.
В настоящее время существует трудности в исследовании ВМ, которые преимущественно связаны с методологическими проблемами. В мире есть только ограниченное количество охарактеризованных моделей для изучения ВМ.
В связи с вышеизложенным, разработка экспериментальной модели меланомы кожи для изучения ВМ является очень актуальной.
Не менее важна и своевременная клиническая оценка ВМ, поскольку предполагается ее участие в васкуляризации меланомы кожи человека.
Цель работы
Изучение феномена васкулогенной мимикрии при меланоме кожи.
Задачи исследования
- Изучение способности клеточных линий метастатической меланомы кожи человека к васкулогенной мимикрии in vitro.
- Изучение особенностей васкулогенной мимикрии in vivo.
- Создание экспериментальной модели меланомы кожи человека для исследования ваcкулогенной мимикрии in vitro и in vivo.
- Изучение васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека.
- Определение особенностей васкуляризации меланомы кожи человека с учетом васкулогенной мимикрии.
Научная новизна
Впервые в России разработаны методы изучения васкулогенной мимикрии in vitro и in vivo на примере клеточных линий метастатической меланомы кожи человека, которые охарактеризованы по их способности к васкулогенной мимикрии. Впервые разработана стандартизированная экспериментальная модель васкулогенной мимикрии для изучения формирования ВМ in vivo и in vitro, а также разработаны экспериментальные подходы к изучению васкулогенной мимикрии на гистологических срезах меланомы кожи человека. Впервые изучено значение васкулогенной мимикрии для васкуляризации меланомы кожи человека.
Научно-практическая значимость
Разработаны подходы к изучению способности клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии, создана модель ВМ, которая используется в различных научно-исследовательских институтах при создании лекарственных препаратов, направленных на ингибирование ВМ. Разработанные подходы к изучению ВМ при меланоме кожи применяют при исследовании других злокачественных новообразований. Клиническое значение ВМ при меланоме кожи человека может служить основой для создания нового направления диагностики и лечения.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась на совместной научной конференции НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с участием: лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаборатории клеточного иммунитета, лаборатории иммунофармакологии, лаборатории биохимической фармакологии, лаборатории фармакологии и токсикологии, лаборатории лучевых методов лечения опухолей, лаборатории трансгенных препаратов, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории медицинской химии, отделения биотерапии опухолей и хирургического отделения общей онкологии НИИ Клинической Онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, состоявшейся 18 мая 2011 года.
Публикации
Материалы данной диссертации представлены на Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008), на Международном конгрессе 20thInternational Congress on Anti-Cancer Treatment (Париж, 2009), на II Всероссийской конференции c международным участием «Наноонкология» (Тюмень, 2010).
По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 статей, 1 патент на изобретение и 9 тезисов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 21 рисунок, 29 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов исследования», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 188 источников, из них 5 – отечественных, 183 - зарубежных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
В работе были использованы клеточные линии метастатической меланомы кожи человека (mel Cher, mel P, mel Mtp, mel Ibr, mel Ksen, mel Kor, mel Gus, mel R, mel Me, mel Ch, mel Il, mel Ml, mel Si, mel Bgf, mel RZ84), полученные в лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН из опухолевого материала прооперированных больных и клеточная линия метастатической меланомы кожи человека meWo (каталог ATCC). Культивирование клеточных линий in vitro проводили в полной среде RPMI-1640 в соответствии со стандартными условиями.
Формирование сосудистоподобных структур (СПС) in vitro проводили на матриксе базальных мембран Матригеле (BD Bioscience), клетки наносили в количестве 100 000 на дно лунки 48-луночного планшета в полной среде RPMI-1640.
Формирование тубулярных структур in vitro проводили на матриксе базальных мембран Матригеле (BD Bioscience) или фибронектине (BD Bioscience), клетки наносили в количестве 500 000 на покровное стекло размером 24х24мм.
Имплантация опухолевых клеток и учет динамики роста опухоли in vivo. Для экспериментов in vivo использовали бестимусных мышей. Для каждого опыта в соответствии со схемой эксперимента мышей разделяли на 3 группы по 5 особей в каждой. Для индукции опухолей проводили подкожную перевивку 1, 3 и 5х106 клеток линии mel Cher в 100 мкл клеточной суспензии. Формирующиеся опухоли измеряли раз в три дня.
Размеры опухоли определяли по формуле:
V опухоли = Ш х Ш х Д,
где Ш - ширина опухолевого подкожного узла, Д – длина опухолевого подкожного узла.
Исследование феномена васкулогенной мимикрии проводили в ткани подкожных ксенографтов и на парафиновых блоках от 36 больных с морфологически доказанным диагнозом меланомы кожи, проходивших лечение в Российском онкологическом научном центре с 1992 по 2008 год.
PAS-окрашивание на базальные мембраны проводили реактивом Шиффа. Использовали набор Accustain (Sigma Aldrich).
Иммуногистохимический анализ проводили по стандартной методике. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к VEGF (DAKO; клон VG1, разведение 1: 25), VEGFR1 ((Flt-1), Neomarkers; Rb-1527p, разведение 1:250), VEGFR-2((Flk-1/KDR), Neomarkers; Rb-1526p, разведение 1:250), CD34 (Dako, клон QBEnd10, разведение 1: 50) и СD31(DAKO, 7C70A, разведение 1:50). Оценивали количество окрашенных опухолевых клеток в процентах в поле зрения и по интенсивности окрашивания:
0 – отсутствие окрашивания,
1+ - окрашивание слабой интенсивности,
2+ - окрашивание средней интенсивности,
3+ - окрашивание высокой интенсивности.
Исследуемые случаи считали положительными по экспрессии VEGF в случае процента окрашенных клеток > 25% и средней интенсивности окрашивания (2+).
Исследуемые случаи считали положительными по экспрессии VEGFR1 и VEGFR2 при интенсивности окрашивания от 2+ и проценте положительных клеток > 10 %. Для оценки пролиферативной активности опухоли оценивали экспрессию Ki-67 в ядре клетки (клон MIB-1, разведение 1:100, DAKO).
Комбинированное CD34/СD31/PAS-окрашивание проводили следующим образом: сразу после иммуногистохимического окрашивания на маркеры CD31 и CD34 без докрашивания гематоксилином проводили PAS-окрашивание на базальные мембраны.
Определение сосудистой плотности опухоли. Подсчет сосудов в ткани опухоли проводили по протоколу Weidner в соответствии с международными рекомендациями.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием компьютерной программы SPSS v.17.0 для Windows.
Результаты исследований и их обсуждение
1. Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии
В качестве экспериментального подхода к исследованию способности клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии была предложена следующая схема:
1) исследование формирования сосудистоподобных структур (СПС) in vitro на внеклеточных матриксах в краткосрочном тесте до 16 часов,
2) последующее исследование способности клеточных линий сохранять СПС в краткосрочном тесте до 24 часов,
3) подтверждение способности к васкулогенной мимикрии в долгосрочных экспериментах по формированию тубулярных структур на внеклеточных матриксах,
4) иммуноцитохимическое исследование экспрессии белков.
Формирование сосудистоподобных структур на внеклеточном матриксе Матригеле
В исследовании было показано, что 81,3 % (13 из 16) изученных клеточных линий метастатической меланомы кожи обладали воспроизводимой способностью формировать сосудистоподобные структуры при инкубации на Матригеле in vitro. Культивирование клеток в низкой плотности (100 000 клеток на 1 лунку 48-луночного планшета) приводило к формированию СПС через 10-16 часов (табл. 1-3).
Следует отметить, что 37,5% исследуемых клеточных линий (mel Cher, mel Si, mel Bgf, mel P, mel Ch, mel R) образовывали стабильные СПС, структура которых была сохранена через 24 часов (таблица 1). В этом случае опухолевые клетки, посаженные на Матригель, образовывали длинные, соединенные друг с другом трубочки, отсутствовали незамкнутые трубочки, не ограниченные контактами с другими клетками.
Таблица 1.Клеточные линии, формирующие стабильные СПС
| Клеточная линия | формирование СПС в течение 16 часов | СПС через 24 часа |
| mel Cher | Формирование СПС | Cохранены |
| mel Ch | Формирование СПС | Cохранены |
| mel R | Формирование СПС | Cохранены |
| mel BGF | Формирование СПС | Сохранены |
| mel Si | Формирование СПС | Cохранены |
| mel P | Формирование СПС | Cохранены |
Формирование сосудистоподобных структур клеточной линией mel Cher представлено на рисунке 1А. Наблюдаемые СПС были похожи на структуры, формируемые клеточной линией эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (рисунок 1Б).
Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к формированию СПС различна. Так, 43,8% исследуемых клеточных линий (mel Kor, mel Il, mel Ml, mel Gus, mel Mtp, mel RZ84, me Wo) формировали СПС, которые через 20-24 часа инкубации клеток на Матригеле нестабильны (таблица 2). Формирование нестабильных СПС клеточной линией метастатической меланомы кожи человека mel Kor представлено на рисунке 2A, Б.
Таблица 2.Клеточные линии, формирующие нестабильные СПС
| Клеточная линия | Формирование СПС в течение 16 часов | СПС через 24 часа |
| mel Il | Формирование СПС | Не сохранены |
| mel Kor | Формирование СПС | Не сохранены |
| mel Mtp | Формирование СПС | Не сохранены |
| mel Gus | Формирование СПС | Не сохранены |
| mel Ml | Формирование СПС | Не сохранены |
| mel RZ84 | Формирование СПС | Не сохранены |
| me Wo | Формирование СПС | Не сохранены |
Клеточные линии mel Ksen, mel Ibr, mel Me (18,7%) обладали низкой способностью к формированию СПС (таблица 3). В этом случае формирование СПС не происходило от опыта к опыту, и часто зависело от наличия/отсутствия монослоя культуры клеток, взятых для эксперимента. При этом опухолевые клетки, не формирующие СПС, образовывали малые кластеры клеток с короткими прерывающимися трубочками.
Таблица 3. Клеточные линии с низкой способностью к формированию СПС
| Клеточная линия | Формирование СПС в течение 16 часов | СПС через 24 часа |
| Mel Ksen | Формирование СПС или кластеров клеток | Не сохраняются |
| mel Ibr | Формирование СПС или кластеров клеток | Не сохраняются |
| mel Me | Формирование СПС или кластеров клеток | Не сохраняются |
Формирование сосудистоподобных структур клеточной линией mel Mе представлено на рисунке 3А,Б.
Таким образом, клеточные линии метастатической меланомы кожи человека обладают разной способностью к формированию сосудистоподобных структур.
2. Создание положительной модели васкулогенной мимикрии при меланоме кожи
Для создания положительной модели васкулогенной мимикрии исследовали способность к формированию тубулярных структур в долгосрочных экспериментах. При культивировании опухолевых клеток линии mel Cher в высокой плотности на Матригеле или фибронектине формирование тубулярных структур происходило спустя 3 дня, к концу 2 недели формирование тубулярных структур было завершено. При этом на монослое клеток были видны поверхностные, объемные петли, окружающие небольшие кластеры опухолевых клеток, и сети, состоящие из не менее 3 петель, соединенных вместе (рисунок 4А). Для данных структур характерна положительная PAS-реакция, что свидетельствует о присутствии белков базальных мембран. Стабильное формирование тубулярных структур клеточной линией mel Cher позволило использовать данную клеточную линию для дальнейших экспериментов по созданию положительной модели.
Проведенный иммуноцитохимический анализ экспрессии белков на клеточной линии mel Cher показал, что для данной клеточной линии метастатической меланомы кожи характерна экспрессия белков базальных мембран (ламинина общего, ламинина 52, коллагена IV типа), VEGF и его рецепторов (VEGFR-1, VEGFR-2), VE-кадхерина.
В работе in vivo было подтверждено, что при перевивке опухолевых клеток линии mel Cher бестимусным мышам происходит воспроизведение процесса ВМ. Динамика роста подкожных ксенографтов представлена на рисунке 5.
Рисунок 5. Динамика роста подкожных ксенографтов клеточной линии метастатической меланомы кожи человека mel Cher.
При гистологическом исследовании опухоль состояла из пласта средних, полиморфных клеток, разделенных узкими прослойками соединительной ткани (рисунок 6A). В некоторых опухолевых клетках наблюдалось наличие небольшого количества пигмента (меланина). Ядра опухолевых клеток были овально-округлой формы. Среднее количество CD34-положительных сосудов в опухоли было равно 8+2 (рисунок 6Б). Окрашивание срезов опухоли реактивом Шиффа на наличие базальных мембран показало, что в ткани опухоли присутствовали PAS-положительные структуры в виде параллельных и параллельных с пересечением каналов (рисунок 6 Б). Комбинированное окрашивание на маркер CD34 и наличие базальных мембран показало, что PAS-положительные структуры не окрашены антителами к CD34 и ограничены опухолевыми клетками, что является признаком васкулогенной мимикрии (Рисунок 6Г).
Таким образом, клеточную линию mel Cher можно рассматривать как модель для изучения ВМ in vitro и in vivo. К характеристикам данной модели относятся:
- стабильное воспроизведение СПС in vitro для получения точных результатов тестирования новых противоопухолевых веществ в краткосрочных тестах (до 24 часов),
- формирование тубулярных структур in vitro в долгосрочных тестах,
- формирование ВМ-структур in vivo, которые воспроизводимы в случае имплантации бестимусным мышам.
В результате иммуногистохимического анализа опухолевой ткани подкожных ксенографтов была выявлена высокая экспрессия VEGF и его рецепторов VEGFR-1 и VEGFR-2. Для VEGF характерно цитоплазматическое окрашивание средней интенсивности, для VEGFR-1 и VEGFR-2 – цитоплазматическое и мембранное окрашивание высокой интенсивности. Ядерная экспрессия Ki-67 была характерна для 30-40% клеток опухоли.
3. Изучение особенностей васкуляризации меланомы кожи человека с учетом васкулогенной мимикрии на парафиновых блоках опухоли
Проанализированы парафиновые блоки опухолей 36 больных меланомой кожи с разными стадиями болезни (I - III ст.) Средний возраст больных составил 45 лет (21-68). Локализация меланомы кожи: на туловище – 47%, на конечностях – 50%, на коже головы – 3%. В 36 % случаев анализировали ткань метастазов в региональные лимфоузлы или мягкие ткани, в 64% случаев - опухолевую ткань первичного очага меланомы кожи.
В опухолевой ткани больных меланомой кожи выявлены 7 типов PAS-положительных структур (таблица 4): прямые каналы, распределенные случайным образом, без ответвлений и не соединенные между собой; параллельные каналы, представляющие собой структуры, идущие параллельно друг другу без ответвлений и пересечений; параллельные с пересечением каналы, связанные между собой; арки, представляющие собой не полностью замкнутые петли; арки с ветвлением, по типу ветвления деревьев; петли, представляющие собой полностью замкнутые структуры; сети, которые представляют собой как минимум три замкнутые петли, прилегающие одна к другой.
Поскольку в ткани одной опухоли могут присутствовать несколько типов PAS-положительных структур, был проведен анализ их корреляции. Наличие прямых каналов коррелировало с присутствием в ткани опухоли арок с ветвлением (X2 = 4,213, p = 0,04) и сетей (X2 = 7,204, p = 0,007), в свою очередь наличие арок с ветвлением коррелировало с присутствием в ткани меланомы кожи петель (X2= 11,638, p = 0,001).
Таблица 4. Частота различных типов PAS-структур в опухолевой ткани меланомы кожи человека
| Тип PAS-структур | Количество больных | |
| Абсолютное кол-во(n) | % | |
| Прямые каналы | 21(36) | 58,3 |
| Параллельные каналы | 14(36) | 38,9 |
| Параллельные с пересечением каналы | 5(36) | 13,9 |
| Арки | 29(36) | 80,6 |
| Арки с ветвлением | 26(36) | 72,2 |
| Замкнутые петли | 20(36) | 55,6 |
| Сети | 9(36) | 25 |
Статистически значимой зависимости между присутствием в ткани опухоли определенных типов PAS-положительных структур и такими показателями, как локализация, стадия заболевания и возраст пациента, не отмечено. Однако, нами было показано, что для всех метастатических очагов характерно присутствие в ткани опухоли арок (100%) по сравнению с первичным очагом (61,1%) (p=0,008) (таблица 5).
Таблица 5. Наличие PAS-структур и исследуемый очаг
| Тип PAS-структур | Первичный очаг (%) | Метастат. очаг (%) | X2(коэффициент корреляции) Пирсона | p |
| Прямые каналы | 58,8 | 71,4 | 0,533 | 0,465 |
| Параллельные каналы | 33,3 | 42,9 | 0,305 | 0,581 |
| Параллельные с пересечением каналы | 16,7 | 14,3 | 0,034 | 0,854 |
| Арки | 61,1 | 100 | 6,969 | 0,008* |
| Арки с ветвлением | 77,7 | 64,3 | 0,709 | 0,400 |
| Петли | 56,3 | 57,1 | 0,008 | 0,928 |
| Сети | 44,4 | 7,1 | 5,420 | 0,020* |
* - данные статистически значимы, p < 0,05
Также продемонстрировано, что сети присутствуют чаще в первичном очаге – 44,4% по сравнению с метастатическим - 7,2 % (p=0,02).
В результате проведенного анализа было определено, что существует обратная зависимость между экспрессией VEGF и присутствием в опухолевой ткани PAS-положительных прямых каналов (таблица 6).
Таблица 6. Наличие PAS-структур и экспрессия VEGF
| Тип PAS-структур | Экспрессия VEGF (%) | X2 (коэффициент корреляции) Пирсона | p |
| Прямые каналы + - | 27,8 64,3 | 4,265 | 0,039* |
| Парал. каналы + - | 50 42,9 | 0,157 | 0,692 |
| Парал. с перес. + - | 40 46,4 | 0,071 | 0,790 |
| Арки + - | 48,1 33,3 | 0,435 | 0,510 |
| Арки с ветвлением + - | 41,7 55,6 | 0,509 | 0,373 |
| Петли + - | 38,9 53,3 | 0,689 | 0,407 |
| Сети + - | 50 44 | 0,088 | 0,767 |
* - данные статистически значимы, p < 0,05
Выявлена обратная корреляция между цитоплазматической экспрессией VEGFR-1 и присутствием в опухолевой ткани PAS-положительных параллельных с пересечением каналов (таблица 7).
Выявлена обратная корреляция между присутствием в ткани опухоли прямых каналов и экспрессией VEGFR-2 (таблица 8). Следует отметить, что PAS-окрашивание выявляет базальные мембраны сосудов, состоящих из эндотелиальных клеток, базальные мембраны каналов, состоящих из клеток опухоли (ВМ-структуры), а также соединительную ткань.
Таблица 7. Наличие PAS-структур и экспрессия VEGFR-1
| Тип PAS-структур | Экспрессия VEGFR-1цито (%) | X2 (коэффициент корреляции) Пирсона | p |
| Прямые каналы + - | 41,2 57,1 | 0,784 | 0,376 |
| Парал. каналы + - | 41,7 50 | 0,209 | 0,647 |
| Парал. с перес. + - | 0 55,6 | 5,229 | 0,022* |
| Арки + - | 44 57,1 | 0,379 | 0,538 |
| Арки с ветвлением + - | 41,7 62,5 | 1,046 | 0,306 |
| Петли + - | 47,4 46,2 | 0,005 | 0,948 |
| Сети + - | 55,6 34,8 | 0,379 | 0,411 |
* - данные статистически значимы, p < 0,05
Таблица 8. Наличие PAS-структур и экспрессия VEGFR-2
| Тип PAS-структур | Экспрессия VEGFR2 (%) | X2 (коэффициент корреляции) Пирсона | p |
| Прямые каналы + - | 25 71,4 | 6,467 | 0,011* |
| Парал. каналы + - | 36,4 50 | 0,533 | 0,465 |
| Парал. с перес. + - | 20 50 | 2,355 | 0,125 |
| Арки + - | 44 50 | 0,070 | 0,791 |
| Арки с ветвлением + - | 50 28,6 | 1,005 | 0,316 |
| Петли + - | 44,4 46,2 | 0,009 | 0,925 |
| Сети + - | 62,5 39,1 | 1,309 | 0,253 |
* - данные статистически значимы, p < 0,05
Проведено изучение сосудистой плотности меланомы кожи человека. Области с высокой степенью васкуляризации определяли путем сканирования среза опухоли при низком увеличении (х40 и х100), выбирали 3 области опухоли, содержащие максимальное количество СD31+/CD34+ микрососудов. Отдельные микрососуды подсчитывали при увеличении х200 после фотографирования. Любые видимые эндотелиальные клетки, отделенные от окружающих сосудов, подсчитывали как отдельные микрососуды. Максимальную плотность микрососудов (МПМ) определяли как среднее значение количества сосудов в 3 полях зрения.
Анализ микрососудов, окрашенных антителами к маркерам эндотелиальных клеток, показал, что МПМ меланомы кожи человека составила 35+4 сосуда в поле зрения (этот показатель варьировался от 13 от 65). 50% опухолей были отнесены к опухолям с высокой МПМ, а 50% - к опухолям с низкой МПМ.
Для исследования областей ВМ было проведено комбинированное CD34/СD34/PAS-окрашивание опухолевых срезов меланомы кожи. CD34+/СD31+/PAS+cтруктуры представляют собой кровеносные сосуды, состоящие из эндотелиальных клеток, которые характерны для всех исследуемых опухолей, а CD31-/CD34-/PAS+структуры – каналы, состоящие из опухолевых клеток (ВМ).
Комбинированное CD34/CD31/PAS-окрашивание меланомы кожи показало, что для 77 % случаев характерны ВМ-структуры.
Проанализирована плотность микрососудов в зоне ВМ на срезах опухоли при комбинированном окрашивании. Среднее значение плотности микрососудов составило 10+2 сосуда в поле зрения (от 0 до 27). 46% исследуемых опухолей характеризовалось относительно высокой плотностью сосудов в зоне ВМ (количество сосудов в поле зрения > 10). 31% исследуемых образцов характеризовались низкой сосудистой плотностью в зоне ВМ (количество сосудов в поле зрения <10).
При сравнении участков с ВМ и без нее для каждой отдельной опухоли нами было показано, что в зонах с ВМ-структурами количество кровеносных микрососудов было ниже, чем в тех зонах опухоли, где ВМ-структуры отсутствовали (рисунок 7).
Средний показатель уменьшения сосудистой плотности составил 23+14 сосуда в поле зрения (от 0 до 53).
Также было показано, что ВМ-структуры соединяются с ангиогенными сосудами (рисунок 8).
Уменьшение плотности ангиогенных сосудов в зоне васкулогенной мимикрии и отсутствие некрозов в этой области может косвенно свидетельствовать об участии ВМ-структур в васкуляризации опухоли.
Таким образом, PAS-окрашивание срезов с парафиновых блоков и комбинированное CD31/СD34/PAS-окрашивание выявило присутствие компонента васкулогенной мимикрии в ткани меланомы кожи человека. Обнаружено снижение количества сосудов, состоящих из эндотелиальных клеток, в областях васкулогенной мимикрии исследуемых опухолей.
Выводы
- Показано, что клеточные линии метастатической меланомы кожи обладают разной способностью к васкулогенной мимикрии и формированию СПС: 37,5% формируют стабильные СПС, 43,8 % формируют нестабильные СПС, 18,7% обладают низкой способностью к формированию СПС.
- Создана экспериментальная модель для изучения васкулогенной мимикрии in vitro с использованием методов формирования сосудистоподобных структур в краткосрочных тестах и тубулярных структур в долгосрочных тестах.
- Разработана модель для изучения васкулогенной мимикрии in vivo на бестимусных мышах.
- Изучены особенности васкулогенной мимикрии при меланоме кожи человека. В ткани опухоли присутствуют 7 типов PAS-положительных структур: прямые каналы, параллельные каналы, параллельные с пересечением каналы, арки, арки с ветвлением, петли и сети.
- Показано, что структуры васкулогенной мимикрии (СD31-/СD34-/PAS+-структуры) в ткани меланомы кожи присутствуют в 77% случаев.
- Показано уменьшение плотности микрососудов (СD34+/CD31+/PAS+-структур) в зоне васкулогенной мимикрии (p<0,05). Максимальная плотность микрососудов в ткани меланомы кожи составила 35+4 сосуда в поле зрения. Плотность микрососудов в зоне ВМ составила 10+2 сосуда в поле зрения.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- A.Vartanian, E.Stapanova, A.Baryshnikov, S.Gutorov, M.Lichinitser, I.Grigorieva, I.Sokolova, E.Solomko. Prognostic significance of Periodic Acid-Shiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma // The Canadian journal of urology. – 2009. - V.16 (4). - P.4726 – 31.
- Vartanian, Amalia; Stepanova, Eugenia; Grigorieva, Irina; Solomko, Elico; Baryshnikov, Anatoly; Lichinitser, Mikhail. VEGFR1 and PKC signaling control melanoma vasculogenic mimicry in a VEGFR2 kinase-independent manner // Melanoma Res. - 2011. - V.21 (2). - P. 91-98.
- Vartanian A, Stepanova E, Grigorieva I, Solomko E, Belkin V, Baryshnikov A, Lichinitser M. Melanoma vasculogenic mimicry capillary-like structure formation depends on integrin and calcium signaling // Microcirculation. – 2011. - V.18 (5). – P. 390-399.
- И.Н.Григорьева, О.С.Бурова, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников. Способность клеточных линий метастатической меланомы кожи к васкулогенной мимикрии // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. -, Т.9, №4. - С. 97-102.
- И.Н.Григорьева, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников. Васкулогенная мимикрия – альтернативный механизм кровоснабжения опухоли? // Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - Т.3. – c.25-29.
- И.Н.Григорьева, Я.В. Вишневская, М.Е.Абрамов, Т.К.Харатишвили, А.Ю. Барышников, Е.В.Степанова. Особенности васкуляризации меланомы кожи человека //Забайкальский медицинский вестник. – 2011. - Т.2 – с. 12-18.
- Е.В.Степанова, Э.Ш.Соломко, И.Н.Григорьева, А.Ю.Барышников. Механизмы опухолевой васкуляризации in vitro // Российский биотерапевтический журнал. - 2008 – Т.7, №1 – С. 32.
- I.N.Grigorieva, E.V.Stepanova, O.S.Burova, T.K.Kharatishvili, E.Sh.Solomko, A.Y.Baryshnikov. The evaluation of highly aggressive cutaneous melanoma cells ability to vasculogenic mimicry // Материалы конференции «Молекулярная онкология», Новосибирск – 2008 - С.27.
- И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили, О.С.Бурова, Э.Ш.Соломко, А.А.Вартанян, А.Ю.Барышников. Клеточная линия меланомы кожи mel Cher как положительная модель васкулогенной мимикрии // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, №2 - С.7
- Э.Ш.Соломко, Е.В.Степанова, И.Н.Григорьева, А.Ю.Барышников. Оценка антиангиогенной активности экстрактов растений и их фракций, произрастающих на территории России // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т.8, №2 – С. 56.
- I.N.Grigorieva, E.V.Stepanova, O.S.Burova, T.K.Kharatishvili, E.Sh.Solomko, A.A.Vartanian, A.Y.Baryshnikov. Positive tumour model of vasculogenic mimicry among cutaneous melanoma cell lines // 20thInternational Congress on Anti-Cancer Treatment, abstract book. – 2009. - P.442.
- E.V.Stepanova, I.N.Grigorieva, A.Y.Baryshnikov, M.R.Lichinitser. The evaluation of antiangiogenic activity of Russian native medicinal plants // 20thInternational Congress on Anti-Cancer Treatment, abstract book. - 2009. - P.435.
- И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, А.Ю.Барышников. Клиническое значение васкулогенной мимикрии для больных меланомой кожи // Российский биотерапевтический журнал – 2011. - Т.10, №1 – С.20.
- A.Vartanian, Eugenia Stepanova, Galina Gatsina, Irina Grigorieva, Anatoly Baryshnikov, Michail Lichinitser. VEGFR1/PKC signaling controls melanoma vasculogenic mimicry and is not dependent on VEGFR2 kinase- manner // NCRI, poster session. – 2010. - A137.
- И.Н.Григорьева, Э.Ш.Соломко, Е.В.Степанова, Т.К.Харатишвили Ингибирование васкулогенной мимикрии – новый подход к противоопухолевой антиагниогенной терапии с использованием нанопрепаратов // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, №3. – С.9.
Патент на изобретение
- И.Н.Григорьева, Е.В.Степанова, И.Н.Михайлова, А.А.Вартанян, Л.Ф.Морозова, О.С.Бурова, А.Ю.Барышников. Применение клеточной линии меланомы кожи человека mel Cher в качестве положительной модели васкулогенной мимикрии // Патент на изобретение № 2404243.
