Исследование экспрессии мрнк маммаглобина у пациенток с различной патологией молочных желез
На правах рукописи
Васкевич Елена Федоровна
ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ мРНК МАММАГЛОБИНА У ПАЦИЕНТОК С РАЗЛИЧНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЕЗ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
14.01.12-онкология
Москва-2010
Работа выполнена в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий (директор - член–корреспондент РАМН, профессор, В.А.Солодкий.)
Научный руководитель
Доктор медицинских наук, профессор В.К. Боженко
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Н.С. Сергеева
Доктор медицинских наук, профессор М.Б. Бычков
Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф.Владимирского
Защита состоится «___»____________2010 года на заседании Диссертационного совета Д.001.017.01 при Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, д.24)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН.
Автореферат разослан «___»_______________2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета
Доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин
Актуальность проблемы.
Рак молочной железы (РМЖ) является одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей у женщин. Ежегодно в мире регистрируется 8 млн. новых случаев рака молочной железы. (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008).
В настоящее время до 30-50% вновь обнаруженных РМЖ имеют III-IV стадию заболевания. Сложности своевременной диагностики обусловлены неспецифичностью клинико – рентгено- сонографических проявлений как доброкачественных, так и злокачественных заболеваний молочной железы (Рожкова Н.И. и др., 2009). Актуальным является поиск новых дифференциально-диагностических критериев, позволяющих различать на дооперационном этапе начальные проявления рака, предраковых процессов и различных форм доброкачественных новообразований (Летягин В.П. и др., 2003, Семиглазов В.Ф. и др., 2008).
Наряду с развитием клинико-рентгено-сонографических методов диагностики РМЖ в настоящее время все больше научных работ посвящается молекулярно-генетической диагностике данного заболевания (Кушлинский Н.Е. и др., 2001). Определение молекулярно-генетических маркеров в ткани опухоли может давать дополнительную информацию о биологической характеристике опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам.
Одним из наиболее перспективных молекулярно-генетических маркеров РМЖ является маммаглобин, который принадлежит к семейству утероглобинов - эпителиальных секреторных белков (Bustin S.A. и др. 2002, Kopreski M.S. и др. 1999, Chen X.Q. и др. 2000, Wong S.C. и др. 2004). Впервые ген, продуктом экспрессии которого является маммаглобин (SCGB2A1), был идентифицирован Watson M.A и Flemind T.P в 1996 году. Экспрессия маммаглобина определяется в основном в эпителиальных клетках молочной железы. При этом мРНК маммаглобина в 10 раз интенсивней экспрессируется при злокачественных новообразованиях, чем при доброкачественных процессах (Watson M.A., 1996). Незначительную экспрессию маммаглобина можно наблюдать так же и в здоровой ткани молочной железы (Becker R.M.,1998; Watson M.A.,1999; O'Brien N.,2002), в нормальной и опухолевой ткани потовых желез, яичников, шейки матки и предстательной железы. (Grnewald K. 2002). В тоже время, остается не изученной связь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с основными клинико - морфологическими признаками доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.
Одним из направлений поиска новых методов диагностики является изучение молекулярных маркеров в сыворотке или плазме крови. Обнаружение белка маммаглобина (Zehentner B. K., и др. 2004, Bernstein J.L., 2005), и мРНК маммаглобина могут иметь высокое диагностическое значение при РМЖ. (Gilbey А.М, 2004, El-Sharkawi S. L. и др. 2007, Gargano G. и др. 2006). Полученные различными авторами результаты дают интервал информативности определения мРНК маммаглобина в крови от 11% до 97% (Suchy B, 2000, Gilbey А.М., 2004, Bernstein J.L.,2005, Cerveira N., 2004, Zehentner B. K. и др. 2004).
Цель работы
Исследование диагностической информативности экспрессии мРНК маммаглобина в ткани молочной железы, а так же в периферической крови пациентов с различной патологией молочных желез.
Задачи исследования
- Исследовать уровень экспрессии мРНК маммаглобина в нормальной и патологически измененной ткани молочной железы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
- Проанализировать взаимосвязь уровня экспрессии мРНК маммаглобина с клинико – морфологическими признаками опухоли.
- Оценить взаимосвязь экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-рентгено-сонографическими характеристиками патологических образований молочных желез.
- Определить информативность определения мРНК маммаглобина в крови для дифференциальной диагностики заболеваний молочных желез.
Научная новизна
Количественно определена экспрессия мРНК маммаглобина в нормальной ткани молочной железы, в ткани фиброаденомы и рака молочной железы на различных стадиях заболевания. Изучена взаимосвязь относительного содержания мРНК маммаглобина в ткани опухоли молочной железы с основными клинико-морфологическими особенностями опухоли. Впервые оценена связь уровня экспрессии с определенными рентгенологическими признаками образований молочных желез. Показано, что если на маммографическом снимке контуры доброкачественного образования имеют полициклические контуры отличные от картины классического доброкачественного (ровные, четкие контуры и однородную структуру) образования уровень экспрессии мРНК маммаглобина выше, чем среднее содержание маммаглобина в группе с доброкачественными заболеваниями, что может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием. Разработана методика определения мРНК маммаглобина в периферической крови, установлена высокая специфичность метода (61%). Показано отсутствие ложноположительных результатов для опухолей других локализаций, что позволяет рекомендовать его для дифференциальной диагностики.
Научно-практическая значимость.
В результате проведенного исследования оценена клиническая значимость и информативность определения уровня экспрессии мРНК маммаглобина в ткани фиброаденомы молочной железы и ткани рака молочной железы в зависимости от клинико-морфологического состояния опухоли, а так же как дополнительного диагностического критерия в комплексе с рентгено - сонографическим методам исследования. Изучена чувствительность и специфичность определения мРНК маммаглобина в периферической крови пациентов с различными заболеваниями молочной железы. Показана практическая значимость метода для выявления первичной опухоли молочной железы, а так же для дифференциальной диагностики РМЖ с опухолями другой локализации.
Апробация материалов диссертации.
Материалы диссертации были доложены: на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва в 2006 году; на VI международной конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность", Москва - 2009 год; на научно-практической конференции с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник», Тверь - 2009 год.
Апробация работы прошла в ФГУ Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий 18 декабря 2009 года.
Публикации.
По теме работы опубликовано 8 работ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, глав: Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждения, а также Выводов и Списка литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 12 отечественных и 115 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 29 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Характеристика обследованных пациентов.
В настоящем исследовании проанализированы образцы ткани молочной железы 111 пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом из которых: рак молочной железы – 69 пациенток; фиброаденома молочной железы – 42 пациентки. В качестве контроля использовали участки ткани молочной железы этих же пациенток без признаков патологии. Всего было проанализировано 210 образцов ткани.
В группу с доброкачественными новообразованиями молочных желез вошли пациентки в возрасте от 19 до 59 лет, средний возраст составил 33±10,00 года.
В группу больных раком молочной железы (РМЖ) вошли женщины в возрасте от 36 до 87 лет, средний возраст составил 51±15,00 год.
Все пациентки были обследованы и прошли комплексное лечение в ФГУ Российском научном центре рентгенрадиологии в период с ноября 2008 по декабрь 2009 года.
Таблица 1. Количество обследованных больных в зависимости от вида патологии молочной железы.
| Количество проанализированных образцов, n | Доля от общего числа обследованных, % | |
| Образцы ткани молочной железы (n=210) | ||
| Рак молочной железы | 69 | 32,85 |
| Фиброаденома молочной железы | 42 | 20 |
| Неизмененная ткань молочной железы | 99 | 47,15 |
| Образцы крови (n=169) | ||
| Рак молочной железы | 95 | 56,21 |
| Доброкачественные заболевания молочной железы | 22 | 13,00 |
| Здоровые доноры | 24 | 14,20 |
| Опухоль другой локализации | 28 | 15,59 |
Так же было проанализировано 169 образцов цельной крови, среди которых: 95 образцов крови больных РМЖ, 22 пациентки с доброкачественными процессами молочной железы, 24 образца крови здоровых доноров и 28 образцов крови больных с другой локализацией опухолевого процесса.
Обработка образцов ткани и цельной крови методом ПЦР.
Образцы ткани молочной железы.
Операционный материал предоставлялся патоморфологом сразу после поступления в лабораторию. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование на уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестеронов, онкобелка c-erbB2, а так же амплификации гена Her-2/neu (метод флуоресцентной гибридизации in situ(FISH) проводилось в плановом порядке по стандартной методике. Для молекулярного анализа у каждой пациентки было взято две пробы ткани (нормальной и патологической) которые собирались в 2 стерильные пробирки, содержащие раствор EverFresh RNA (Клоноген, Санкт-Петербург) для предотвращения деградации РНК в образце и хранились при -700С до проведения исследования.
Выделение общей РНК проводили набором RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу выделения «Purification of Total RNA from Animal Tissues». Выделенную РНК (35-55 мкл.) переводили в комплиментарую ДНК (кДНК) при помощи реакции обратной транскрипции (ОТ) с использованием набора QuantiTech Reverse Transcription (Qiagen, Германия) согласно протоколу «Reverse Transcription with Elimination of Genomic DNA for Quantitative, Real-Time PCR». Полученную кДНК хранили при температуре -200С.
Постановка ПЦР
Праймеры и зонды для ПЦР были подобраны с учетом структур экзонов и интронов таким образом, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК маммаглобина. Это позволило не применять дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой. Для оценки относительного содержания мРНК маммаглобина в образцах использовали анализ содержания мРНК референтного гена гипоксантин - гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT1) в том же образце, характеризующимся низким и стабильным уровнем экспрессии мРНК в клетке. Зонды для маммаглобина и HPRT1 метили Fam(dT). Соответственно реакции амплификации маммаглобина и HPRT1 ставили в разных пробирках.
Детекцию мРНК маммаглобина проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-технология», Россия). Для проведения одной реакции ПЦР использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси; 1 мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 7,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл. прямого праймера (10 pmol), 1 мкл. обратного праймера (10 pmol) («Syntol», Россия), 0,5 мкл праймера «проба» содержащего флуорофор «Tag man», 5 мкл. образца кДНК. В работе использовали следующие праймеры:
- для маммаглобина
Прямой 5,- GAACACCGACAGCAGCA-3,
Обратный 5,- TCTCCAATAAGGGGCAGCC-3,
Проба 5,-FAMTGGTCCTCATGCTGGCGGCC-3,
б) для HPRT1
Прямой 5,- AAGCCAGACTTTGTTGGATTTGA-3,
Обратный 5,- AACTTGAACTCTCATCTTAGGCTT-3,
Проба 5,-FAMAGCAGGAGATTGCCACCTACCGCA-3,
Критический цикл и исходное количество копий кДНК определяли с помощью компьютерной программы «ДТ-96», поставляемой вместе с прибором.
Рисунок 1. Пример графиков накопления продуктов амплификации. По оси Y – интенсивность флуоресценции, по оси Х- номер цикла амплификации.
Определение уровня экспрессии мРНК маммаглобина (МГА) относительно мРНК HPRT1 считали методом дельта- дельта Си-ти ( Сt) (Ребриков Д.Н., 2009 ).
[МГА]/[HPRT1] = E – (Ct1-Ct2), где
[МГА]/[HPRT1] – нормированное по HPRT1 значение экспрессии маммаглобина, измеряется в относительных единицах, показывает сколько копий мРНК маммаглобина приходится на 1 копию HPRT1;
Е – эффективность амплификации, показывает прирост матрицы на каждом цикле амплификации. Теоретически на каждом цикле происходит удвоение матрицы, поэтому Е=2;
Сt1 - значение порогового цикла в образце для МГА;
Сt2 - значение порогового цикла в образце для HPRT1.
Анализ образцов крови.
Для анализа венозную кровь пациентов собирали в пробирки содержащие 3,2% цитрат натрия объемом не менее 3 мл. Далее пробирки помещали в холодильник с температурой 4-60С на 30-60 минут, для разделения плазмы и форменных элементов крови.
Для выделения брали 1,5 мл образца на границе разделения плазмы и форменный элементов крови.
Выделяли РНК при помощи набора QIAmp RNA Blood Mini Kit (Qiagen, Германия) с использованием протокола выделения «Purification of Total Cellular RNA from Human Whole blood». Полученную РНК хранили при температуре -700С или проводили реакцию обратной транскрипции при помощи набора QuantiTest Reverse Transcription (Qiagen, Германия) с использованием протокола «Reverse Transcription with Elimination of Genomic DNA for Quantitative, Real-Time PCR».
Полученную кДНК хранили при температуре -200С.
Детекцию мРНК маммаглобина проводили методом двухступенчатой ПЦР (Nested-PCR) в режиме реального времени на амплификаторе «ДТ-96» («ДНК-технология», Россия), с применением интеркалирующего красителя SYBRGreen. В качестве матрицы использовали полученную ранее кДНК.
Для проведения одной реакции первого шага Nested-PCR использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси, содержащей КСl, TрисHCl (pH 8,8), 6,25 mM MgCl2, Тaq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, 1 мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия), 8,5 мкл деионизованной воды, 1 мкл. прямого(N1) олигонуклотида (10 pmol), 1 мкл. обратного(N2) олигонуклеотида (10 pmol) («Syntol», Россия), 4 мкл. образца кДНК.
На первом этапе использовались праймеры:
МАМ (N1) – 5’ GAA GTT GCT GAT GGT CCT CAT GCT GGC 3’
MAM (N2) – 5’ CTC ACC ATA CCC TGC AGT TCT GTG AGC 3’
Для проведения одной реакции второго шага Nested-PCR использовали 10 мкл. 2,5Х реакционной смеси, содержащей КСl, TрисHCl (pH 8,8), 6,25 mM MgCl2, Тaq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Tween 20, краситель SybrGreen;1 мкл. MgCl2 (25 мМ) («Syntol», Россия); 11,5 мкл. деионизованной воды, 1 мкл. прямого(N3) олигонуклотида (10 pmol), 1 мкл. обратного(N4) олигонуклеотида (10 pmol) («Syntol», Россия), 1 мкл. образца полученного при первом этапе Nested-PCR.
Для второго этапа использовали праймеры:
MAM (N3) – 5’ CTC CCA GCA CTG CTA CGC AGG CTC 3’
MAM (N4) – 5’ CAC CTC AAC ATT GCT CAG AGT TTC ATC CG 3’
Условия проведения реакции в обоих этапах постановки были следующие: в течении 5 минут смесь прогревали при 950С, затем было 45 циклов – 15 сек при 950С, 20 сек при 600С, 15 сек при 72 0С; по окончании смесь охлаждалась до 100С.
Детекция продукта ПЦР
Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектировали электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном геле. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждали ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Если полоса электрофореза продукта определялась на уровне 200 н.п. маркерного фрагмента результат оценивался как положительный.
Специфичность также была подтверждена при секвенировании полученных продуктов.
Статистический анализ
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программного пакета STATISTICA 6,0 фирмы (StatSoft Inc.).
Для выявления различий между количественными данными для независимых групп использовали метод ANOVA по Краскелу-Уолису (для трех и более независимых групп).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Анализ связи экспрессии мРНК маммаглобина с клинико-морфологическими особенностями патологии молочных желез.
Морфологическая дифференциальная диагностика гиперпластических, предраковых процессов и рака молочной железы нередко бывает затруднительной. Поэтому современные молекулярно-генетические методы диагностики могут стать вспомогательным критерием дифференциальной диагностики патологических процессов. Мы исследовали уровень экспрессии мРНК маммаглобина при различных патологических процессах в ткани молочной железы.
На рисунке 2 показана экспрессия мРНК маммаглобина в неизмененной ткани молочной железы, при фиброаденоме и раке молочной железы.
Показано, что средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в неизмененной ткани молочной железы равен 59,6 отн.ед, при фиброаденоме молочной железе уровень экспрессии мРНК увеличен и равен 80,6 отн.ед, а при раке молочной железы – 161,0 отн.ед. Различия в группах были достоверными для групп «норма - РМЖ» (р=0,0057), при анализе групп «фиброаденома -РМЖ» достоверность составила - (р=0,061), в группе «норма-фиброаденома» достоверность ставила – (р=0,13).
Рисунок 2. Средний уровень экспрессии мРНК в нормальной ткани молочной железы и при различной ее патологии.
В таблице 2 представлены результаты исследования зависимости уровня экспрессии мРНК маммаглобина от гистологического варианта рака молочной железы. Нам не удалось обнаружить статистически значимых различий в уровне экспрессии мРНК маммаглобина между наиболее часто встречающимися гистологическими вариантами РМЖ.
| Среднее значение, МАМ/HPRT, отн.ед | Стандарная ошибка | Достоверность отличия с ИД, р | Достоверность отличия с ИП, р | Достоверность отличия с прочими формами рака, р | |
| Инфильтративный дольковый рак | 73,85 | 93,16 | - | ||
| Инфильтративный протоковый рак | 161,58 | 50,63 | 0,41 | - | |
| Прочие формы | 133,94 | 118,75 | 0,69 | 0,83 | - |
| Слизистый рак | 492,60 | 167,95 | 0,32 | 0,06 | 0,08 |
Таблица 2. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина от гистологического строения рака молочной железы.
Также не выявлено статистически значимых отличий экспрессии мРНК маммаглобина от гистологической формы фиброаденомы молочной железы.
Результаты предоставлены в таблице 3.
| Среднее значение, МАМ/HPRT, отн.ед | Стандартная ошибка | Достоверность отличия со смешанной фиброаденомой, р | Достоверность отличия с интракана-ликулярной фиброаденомой, р | Достоверность отличия с листовидной фиброаденомой, р | |
| Смешанная фиброаденома (n-28) | 58,37 | 30,01 | - | ||
| Интракана-ликулярная фиброаденома (n-7) | 183,06 | 60,03 | 0,07 | - | |
| Листовдная фиброаденом (n-3) | 125,51 | 91,70 | 0,49 | 0,60 | - |
| Перикана-ликулярная фиброаденома (n-3) | 4,16 | 91,70 | 0,57 | 0,1 1 | 0,12 |
Таблица 3. Сравнение уровня экспрессии мРНК маммаглобина при различном гистологическом строении фиброаденомы молочной железы.
Анализ зависимости экспрессии мРНК мамаглобина от показателя Т опухоли (по классификации TNM) для рака молочной железы. (рис.4) обнаруживает тенденцию снижения уровня экспрессии мРНК маммаглобина при увеличении показателя опухоли Т.
Рисунок 4. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина и показателя Т по классификации TNM.
Всего было проанализировано 69 образцов ткани опухоли. Достоверные различия были выявлены для групп Т2-Т4 (р=0,013).
Достоверных отличий содержания мРНК маммаглобина в опухоли в от числа пораженных метастазами лимфоузлов не выявлено, однако имеется тенденция снижения уровня экспрессии при увеличение N.
Результаты исследования содержания мРНК маммаглобина в ткани опухоли в зависимости от степени злокачественности опухоли (G) представлены на рисунке 5. Обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии мРНК мамаглобина в опухоли между группами с низкой степенью злокачественности G1 и высокой степенью злокачественности G3 (р=0,0019), а так же между группами G2 (умеренная степень злокачественности) и G3 (р=0,059). Достоверных различий межу G1 и G2 степенями злокачественности обнаружено не было (р=0,40). Интересно отметить, что чем выше степень злокачественности (ниже степень дифференцировки клеток) тем, меньше уровень экспрессии мРНК маммаглобина. Так при G1- уровень экспрессии мРНК маммаглобина - 333,7 отн.ед, при G2- 204,4 отн.ед, при G3 – 38,48 отн.ед., т.е. уровень экспрессии уменьшается в 10 раз.
Рисунок 5. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от степени злокачественности опухоли (G).
Мы также проанализировали связь экспрессии мРНК маммаглобина с рецепторным статусом опухоли. Было установлено, что статистически значимых различий между уровнем экспрессии мРНК маммаглобина опухоли и уровнем рецепторов эстрогенов и прогестерона в опухоли не нет.
Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина и рецептора c-erbB2.
Зависимость экспрессии онкобелка c-erbB2, определеямого методом ИГХ и мРНК маммаглобина представлена на рисунке 6. В 30 случаях (43,47%) реакция на белок с-erbB2 обнаружена не была, при этом, среднее значение экспрессии мРНК маммаглобина составило 195,2 отн.ед, слабоположительная реакция была обнаружена в 28 (42,0%) случаях, среднее значение маммаглобина – 81,1 отн.ед, положительная реакция на онкобелок с-erbB2 была обнаружена в 10 образцах (14,5%) в этой группе образцов средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина равен 290,1 отн.ед. Достоверность отличий между группами составила - (р=0,13; р=0,10).
Рисунок 6. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от уровня экспрессии рецептора c-erbB2.
Мы также проанализировали амплификацию гена Her-2/neu исследованную методом FISH гибридизации у 34 женщин с диагнозом рак молочной железы. У 28 (73,68%) пациенток амплификации гена Her-2/neu не было обнаружено. Уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этой группе составил – 51,98 отн.ед. У 10 (26,32%) пациенток была обнаружена амплификация гена Her-2/neu, и уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этих образцах составил 346,92 отн.ед. Отличия в группах достоверны (р=0,017). (Рис. 7). Из приведенных данных следует, что амплификация гена Her-2/neu в образцах опухоли молочной железы сопровождается высоким уровнем экспрессии мРНК маммаглобина.
Рисунок 7. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина амплификации гена Her-2/neu (метод флуоресцентной гибридизации in situ(FISH)).
Интеграция радиологических и молекулярно-биологических методов в дифференциальной диагностике заболеваний молочной железы.
Все пациентки, вошедшие в анализ, были обследованы при помощи современного комплекса клинико – рентгено - сонографических методов. Одним из ведущих методов диагностики различных форм рака молочной железы является рентгенологическое исследование – маммография. При изучении маммографического снимка оценивали такие показатели как : наличие диффузных изменений ( развитая железистая ткань, фиброзно-кистозная мастопатия), узловых образований (доброкачественного или злокачественного характера) в молочной железе, а также наличие кальцинатов (микро- или макрокальцинаты).
На рисунке 8 представлены результаты зависимости обнаруженных на маммограмме фоновых изменений в молочной железе с уровнем экспрессии мРНК маммаглобина в ткани молочной железы при фиброаденоме.
Рисунок 8. Зависимость уровня экспрессии мРНК от наличия диффузных изменений в ткани молочной железы при фиброаденоме молочной железы.
Среднее значение экспрессии мРНК маммаглобина при отсутствии диффузных изменений составляет – 22,26 отн.ед, при фиброзно-жировой инволюции – 118,93 отн.ед, а при фиброзно-кистозной мастопатии – 50,83 отн.ед. Результаты между группами «без диффузных изменений» и «фиброзно-жировая инволюция» статистически высоко достоверны (р= 0,00039).
В группу с фиброзно-кистозной мастопатией вошли 23 пациентки с мастопатией различной степени выраженности (от слабовыраженной до выраженной). Результаты представлены на рисунке 9.
Рисунок 9. Зависимость экспрессии мРНК маммаглобина от степени выраженности фиброзно-кистозной мастопатии (ФКМ).
Из представленных результатов видно, что увеличение выраженности фиброзно-кистозной мастопатии сопровождается увеличением уровня экспрессии мРНК маммаглобина.
Другими признаками, оцениваемым по маммографическому снимку при анализе маммограмм, является форма и структура патологического образования. Как правило, доброкачественные узловые образования имеют четкие контуры и однородную структуру. Из проанализированных нами маммограм 41 пациентки с фиброаденомой молочной железы характерные для доброкачественного образования контуры имели 36 (87,8 %) пациенток, средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в этой группе составил 63,1 отн.ед.. На маммограммах 5 (12,2 %) пациенток узловые образования имели нечеткие, полициклические контуры. В этой группе уровень экспрессии составляет 206,4 отн.ед. (р=0,062) (рис.10).
Рисунок 10. Зависимость уровня экспрессии мРНК от формы доброкачественного узлового образования
Таким образом, можно сделать вывод, что высокая экспрессия мРНК маммаглобина в ткани фиброаденомы молочной железы сочетается с неблагоприятными факторами прогноза развития злокачественных образований молочных желез - выраженной фиброзно-кистозной мастопатией, а так же с неровными, полициклическими контурами узлового образования выявляемого при маммографии.
Нами была проанализирована связь экспрессии мРНК маммаглобина в ткани опухоли и наличия на маммографических снимках микро- и макрокальцинатов, что является одним из дополнительных признаков злокачественного процесса. Из 69 проанализированных маммограмм кальцинаты были обнаружены на 22 снимках. Микрокальцинаты были обнаружены на 15 (21,7 %) маммограммах, а макрокальцинаты на 7 (10,1 %). Средний уровень экспрессии мРНК маммаглобина в ткани опухоли у пациенток с микрокальцинатами был равен 97,45 отн.ед, у пациенток с макрокальцинатами - 425,08 отн.ед. (р=0,041) (Рис.11).
Рисунок 11. Зависимость уровня экспрессии мРНК маммаглобина от вида кальцинатов в ткани молочной железы при РМЖ.
Таким образом, наличие более неблагоприятного маммографического признака –микрокальцинатов сочетается со сниженным уровнем экспрессии мРНК маммаглобина. Эти результаты хорошо согласуются с нашими данными (Рисунок 5), показывающими снижение уровня экспрессии маммаглобина при росте степени злокачественности опухоли.
Исследование экспрессии мРНК маммаглобина в крови.
Исследовались образцы периферической крови здоровых доноров, пациенток больных раком молочной железы, пациенток с фиброаденомой молочной железы и пациентов с опухолями другой локализации. (Табл.4).
Таблица 4. Частота обнаружения мРНК маммаглобина методом «Nested» ПЦР в цельной крови у различных групп пациентов.
| Количество наблюдений | Положи-тельный результат | Процент, положительных случаев. | ||
| Рак молочной железы | 95 | 58 | 61% | |
| Доброкачественные образования молочной железы | Фиброзно-кистозная мастопатия | 4 | 1 | 25% |
| Фиброаденома | 16 | 4 | 25% | |
| Фибросклероз | 2 | 0 | 0 | |
| Опухоль другой локализации | Опухоли ЖКТ | 8 | 0 | 0 |
| Опухоли органов дыхания | 5 | 1 | 20% | |
| Рак почки и предстательной железы | 3 | 0 | 0 | |
| Рак матки, эндометрия | 12 | 0 | 0 | |
| Здоровые доноры | 24 | 0 | 0 |
В группе больных РМЖ мРНК маммаглобина была обнаружена в 61 % случаев.
У пациенток с доброкачественными образованиями молочной железы экспрессия мРНК маммаглобина была обнаружена в 22,7% случаев. В образцах крови пациентов с другой локализацией опухолевого процесса мРНК маммаглобина была обнаружена лишь в одном случае, у пациентки больной раком легкого. Среди образцов крови здоровых доноров мРНК маммаглобина не обнаружена.
Стоит отметить, что процент обнаружения мРНК маммаглобина в крови уменьшается с увеличением размера опухолевого узла (Рис.12).
Чувствительность метода составила 61%, а специфичность – 93%. Прогностическая ценность положительного результата равна 85%.. Для сравнения - используемый как сывороточный маркер рака молочной железы показатель CA15-3 имеет чувствительность 14,0%, а специфичность 92,3%. Прогностическая ценность положительного результата 66,7%. (М.Keyhani, 2005).
Рисунок 12. Распределение больных РМЖ по показателю Т (по классификации TNM) и колличество пациентов у которых в периферической крови выявлена мРНК маммаглобина.
Таким образом, полученные результаты оценки информативности обнаружения мРНК маммаглобина в крови как метода диагностики РМЖ позволяют говорить о перспективности его использования не только для мониторинга опухолевого процесса, но и как возможного диагностического маркера РМЖ.
ВЫВОДЫ
- Выявлены достоверные отличия между уровнем экспрессии мРНК маммаглобина в ткани рака молочной железы, фиброаденомы и неизмененной ткани молочной железы, который составил: в неизмененной ткани – 59,6 отн.ед., в ткани фиброаденомы – 80,6 отн.ед и в ткани РМЖ – 161,0 отн.ед.
- Уровень экспрессии мРНК маммаглобина не зависит от гистологического варианта рака молочной железы и статуса рецепторов эстрогена и прогестерона.
- Отмечается статистически достоверное снижение уровня экспрессии мРНК маммаглобина при снижении степени дифференцировки опухоли, а также определен высокий уровень экспрессии мРНК маммаглобина в опухолях с амплификацией гена Her-2/neu 345,9 отн.ед) по с равнению с группой, где амплификация гена Her-2/neu не обнаружена (51,9 отн.ед.) (р=0,017).
- Отрицательные клинико-рентгенологические признаки, сочетаются с повышенным уровнем экспрессии мРНК маммаглобина у больных с выраженной фиброзно-кистозной мастопатией и доброкачественными узловыми образованиями молочной железы, что может являться дополнительным фактором прогноза развития злокачественного процесса в молочной железе.
- Исследована информативность обнаружения мРНК маммаглобина в периферической крови как метода диагностики РМЖ. Установлено, что чувствительность метода обнаружения мРНК маммаглобина в крови составила – 61,0%, специфичность – 93,0%. Прогностическая ценность положительного результата равна 85%. Определение мРНК маммаглобина в крови может применяться, как для диагностики, так и для мониторинга РМЖ. Не обнаружена экспрессия мРНК маммаглобина в крови при другой локализации опухолевого процесса (рак шейки матки, эндометрия, предстательной железы.)
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Боженко В.К. Васкевич Е.Ф. Рой Ю.И. Использование м-РНК для диагностики в онкологии. Тезисы. XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».-М.-2006.С.128
- Васкевич Е.Ф., Боженко В.К. «Исследование уровня мРНК маммаглобина в крови больных раком молочной железы». Тезисы. XV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». –М.- 2007. С.218
- Васкевич Е.Ф., Кудинова Е.А., Джикия Е.Л., Буйнова Д.А., Боженко В.К. Исследование экспрессии мРНК Маммаглобина у пациенток с различной патологии молочной железы. Тезисы. VI международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность".-М.-2009. С.53
- Васкевич Е.Ф., Меских Е.В., Боженко В.К. " мРНК маммаглобина в периферической крови как диагностический маркер рака молочной железы". Мини-статья. Научно-практическая конференция с международным участием «Инновации и информационные технологии в диагностической, лечебно-профилактической и учебной работе клиник».-Тверь-2009. С. 295
- Боженко В.К., Рожкова Н.И., Тащян А.А., Кудинова Е.А., Васкевич Е.Ф. «Использование определения экспрессии тканеспецифической мРНК для диагностики метастазов рака». Тезисы. VII съезд онкологов России. - М.- 2009. С. 57.
- Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Чазова Н.Л., Мельникова Н.В., Кудинова Е.А., Джикия Е.Л., Буйнова Д.С. «Исследование экспрессии мРНК маммаглобина А при различной патологии молочных желез». Вестник РНЦРР. – 2009. Выпуск 9. Доступно по URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v9/papers/bozhenko_v9.htm
- Н.И. Рожкова, В.К. Боженко, Д.К. Фомин, А.И. Плошница, А.А. Тащан, Е.А. Кудинова, Е.Ф. Васкевич, М.Л. Мазо. «Молекулярно-биологические и радиологические технологии в комплексной диагностике патологии аксиллярной области». Опухоли женской репродуктивной системы. - М.- 2009. №3-4.С.25-28
- Боженко В.К., Васкевич Е.Ф., Кудинова Е.А., Чазова Н.Л., Берщанская А.М., Мельникова Н.В. Возможности оценки экспрессии маммаглобина при различной патологии молочной железы. Литературный обзор. Вестник РНЦРР. - 2010. Выпуск 10. Доступно по URL http://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v10/papers/bozhe_v10.htm
