WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Динамика молекулярно-генетических преобразований метастатического рака м о лочной железы до и в процессе лечения

На правах рукописи








ВАЖЕНИНА

Алена Александровна

Динамика молекулярно-генетических

преобразований метастатического рака

молочной железы до и в процессе лечения

14.01.12 - онкология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук



Москва - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменская государственная

медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развитию


Научные руководители:
кандидат медицинских наук Сабиров Ахат Халимович
доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки и техники РФ


Барышников Анатолий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий

Защита состоится « » 2011 г. в 14-00 час. на заседании диссертационного совета Д.001.017.01 при РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

по адресу: 115478 г. Москва, ул. Каширское шоссе, д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН.

Автореферат разослан «___»_______________ 2010 г

Учёный секретарь

диссертационного совета

профессор Ю.В.Шишкин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) является актуальной медико-социальной проблемой в большинстве развитых стран мира. Несмотря на значительные достижения последней четверти века в понимании биологии, клиники заболевания и значительных успехов в лечении больных проблема продолжает оставаться высоко актуальной [Барышников А.Ю., 2003].

В Тюменской области в 2008 году в структуре злокачественных заболеваний опухоли молочной железы находились на втором месте (11,4%), уступая лишь опухолям трахеи, бронхов, легкого (15,06%). По распространенности в женской популяции наиболее часто встречаются опухоли молочных желез (20,3%). При этом заболеваемость по сравнению с 2004 годом выросла на 5,21% (с 46,65% до 51,86% соответственно). Удельный вес больных с 1-2 стадиями процесса остался на прежнем уровне (67,19% в 2004 г, против 67,99% - в 2008 г). Также на прежнем уровне осталась смертность от РМЖ (20,98% - в 2004 г., против 20,06 в 2008 г.). Недостаточная активность программ раннего выявления рака молочной железы и низкая информированность населения приводят к тому, что в России часто заболевание диагностируется, когда процесс приобретает местно-распространенный или метастатический характер. К сожалению, на сегодняшний день метастатический рак молочной железы (МРМЖ) по-прежнему остается неизлечимым заболеванием. Средняя продолжительность жизни с момента выявления метастазов составляет 2-3,5 года, 25-35% пациенток живут более 5 лет и только 10% — свыше 10 лет. Поэтому основной задачей лечения диссеминированных форм рака молочной железы являются продление жизни и максимально длительное сохранение ее качества. Современные подходы к лечению позволили значительно продвинуться в сторону реализации этих целей. Высокая степень жизнеспособности опухолевых клеток при попадании их в другие органы и ткани является одной из причин невысокой эффективности лечения, что обосновывает необходимость дальнейшего изучения биологии опухоли с целью индивидуализации лечебной тактики [Spector N.L., 2009].

Достижения последних лет в области молекулярной биологии позволили выявить многие особенности фенотипа опухоли, механизмы канцерогенеза: индукцию опухолью сигналов роста, высокий уровень репликационного потенциала, резистентность к рост-ингибиторным сигналам, уклонение от апоптоза, ангиогенез, тканевую инвазию и метастазирование. Выявлены прогностические факторы рака молочной железы, которые способствуют опухолевой дифференцировке (НЕR-2/neu), апоптозу (р53, BCL-2, BAX, mTOR и др.), показатели пролиферативной активности (Ki-67), ангиогенеза (VEGF); [Tindon A.K., 1990; Mita A.C., 2008]. Разработаны и внедрены в практику новые эффективные цитостатики и новые режимы терапии. Все это дало возможность прогнозирования течения болезни и выбора обоснованной, индивидуализированной терапии рака молочной железы. Если еще 15 лет назад средняя продолжительность жизни при МРМЖ составляла 12-24 мес, то к 2005 г. она увеличилась до 24-32 мес. Широкий выбор цитостатиков и режимов химиотерапии позволил эффективно проводить не только I, но и II, III и т.д. линии лечения, что значительно увеличило период до появления симптомов заболевания, приводящих к ухудшению качества жизни.

К настоящему моменту сообщается более чем о ста факторах прогноза, дающих представление о биологическом поведении опухоли. Для предсказания клинического течения опухолевого процесса, ответа на лечение и исхода РМЖ большое значение придается маркерам, определяемыми иммуногистохимическими и иммуносорбентными методами. [Сабиров А.Х. 2010 г]. Одними из первых, вошедших в практику клеточных маркеров, были рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), роль которых в генезе гормонозависимых опухолей убедительно доказана большим числом исследований [Семиглазов В.Ф. и соавт., 1992]. Определение РЭ и РП в ткани опухоли сейчас рассматривается как обязательное условие для успешного гормонального лечения РМЖ [Allred D.C. et al., 1998; Бернштейн Л.М., 2000; Семиглазов В.Ф., 2001]. Степень эффективности гормональной терапии также существенно зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: ее эффективность составляет около 10% при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50% при РЭ-положительных опухолях и около 75 % при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП. Тем не менее, известны случаи резистентности к гормональной терапии больных с РЭ- и РП-положительными опухолями, поэтому гормонально-рецепторный статус опухоли оказывается не всегда достаточным показателем гормональной чувствительности РМЖ [Летягин В.П., 2004].

Выбор препаратов для I линии химиотерапии МРМЖ является сложной задачей. Он зависит от множества факторов, к наиболее важным из которых следует отнести Her-2-статус опухоли, общее состояние больной (статус по ECOG), распространенность процесса. Не решенной до конца является и проблема выбора между монотерапией и комбинацией цитостатиков. Так, ряд исследователей демонстрируют преимущества комбинаций химиопрепаратов, в то время как другие показывают увеличение общей выживаемости при последовательном назначении химиопрепаратов в монотерапии. Наряду с этим остается неизвестным, какие механизмы оказывают влияние на метастазирование раннего рака молочной железы.

Изучение биологических особенностей метастатического рака молочной железы, несомненно, откроет новые возможности для повышения эффективности лечения, что позволит обеспечить лучший контроль над заболеванием и на ранних этапах предотвратить или замедлить дальнейшее метастазирование.

Цель исследования

Определение молекулярно-генетических характеристик метастатического РМЖ и оптимизация схемы индивидуального лечения больных. Разработка на основании молекулярно-генетического анализа оптимальной схемы лечения мРМЖ путем внедрения препарата на основе производного Индол-3-карбинола.

Задачи исследования:

  1. Определить молекулярно-генетический статус больных метастатическим РМЖ по плазме крови до и в процессе лечения.
  2. Определить концентрацию метаболитов эстрогенов (2-гидрокиэстрон, 16-гидроксиэстрон), и их соотношение, сывороточный уровень EGFR и hVEGFRs.

Новизна исследования. Впервые проведено комплексное изучение клинико-лабораторных характеристик метастического рака молочной железы: содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, онкобелка HER-2, антигена Ki-67, уровня EGFR, hVEGFRs.

Определена важная роль EGFR и hVEGFRs в канцерогенезе метастатического РМЖ. Внедрен и апробирован в стандартную схему лечения препарат ИНДИНОЛ.

Практическая значимость исследования. Предложена программа комплексного лабораторного иммуносорбентного и молекулярно-генетического исследования рака молочной железы, включающая определение содержания и уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона, онкобелка HER-2 и антигена Ki-67, определения уровня EGFR, VEGFR и мутационного статуса для формирования прогноза клинического течения рака молочной железы, оценки эффективности проводимого лечения и коррекции проводимой терапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Больные метастатическим РМЖ имеют выраженные молекулярно-генетические нарушения. Наиболее часто встречаются мутации генов р53 в 6, 7 экзонах, k-ras, c-kit.

2. У всех больных мРМЖ уровень EGFR и VEGFRs превышает дискретные пороговые значения. В связи с этим, всем больным мРМЖ показано назначение Авастина (Бевацизумаба) в стандартных схемах лечения.

3. Добавление в лечение препарата ингибитора эстрогена Индинола улучшает молекулярно-генетический и гормональный статус больных мРМЖ, увеличивает время до прогрессирования и общую выживаемость.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены: на Международном симпозиуме онкологов УРФО «Здоровье семьи 2006» (Амстердам-Страсбург, 2006); Всероссийской конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2007); Межрегиональной конференции ЯНАО «Актуальные вопросы хирургии и онкологии» (Салехард, 2008); Межрегиональной конференции онкологов УРФО «Рак молочной железы» (Екатеринбург, 2008); Межрегиональной научно-практической конференции онкологов Тюменской области (Тюмень 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Наноонкология 2010» (Тюмень, 2010); на Межрегиональной конференции с международным участием, на секции «онкология» «ЯНАО-65 лет, концепция развития здравоохранения округа» (Салехард, 2010); на совместной научной конференции кафедр онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, факультетской хирургии, кафедры госпитальной хирургии, клинической фармакологии и сотрудников отделений химиотерапии и хирургии молочных желёз Тюменского ООД (Тюмень, 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу патологоанатомического отделения Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедрах онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевого лечения, патологической анатомии, гистологии, кафедры хирургии ФПК и ППС Тюменской государственной медицинской академии, отделение общей онкологии Курганского ООД, ЦКБ №2 ОАО РЖД.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 116 страницах, включает введение, обзор литературы, материалов и методов, шести глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводы, практических рекомендаций и библиографический список использованной литературы. Работа иллюстрирована 35 рисунками и содержит 17 таблиц. В библиографическом списке приведено 93 источников (48 отечественных и 45 зарубежных авторов).


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материал и методы исследования. При выполнении настоящего исследования в обследуемую группу были включены 100 пациенток с метастатическим РМЖ, получавших специальное противоопухолевое лечение в Салехардской окружной больнице (гл. врач - Коган М.И). Данные пациентки были разделены на 2 группы, каждая из которых после установления прогрессирования, ранее леченного РМЖ, получала полихимиотерапию 1 линии. Первая группа, численностью 50 человек получала Паклитаксел+Авастин, вторая, в количестве 50 человек, помимо этих препаратов, дополнительно получала Индинол по 2 капсулы 2 раза в день на протяжении всего срока лечения. Предварительно на этапе лечения первичного РМЖ у всех больных проводилось молекулярно-генетическое исследование по парафиновым образцам и плазме крови. У всех больных установлена гиперэкспрессия VEGFR.

Всем пациенткам проводилось комплексное обследование в условиях вышеперечисленного лечебного учреждения: осмотр врача-онколога, выполнение рентгенографического и ультразвукового исследования молочных желез, УЗИ органов брюшной полости и забрюшинного пространства, УЗИ органов малого таза, КТ органов грудной клетки и органов брюшной полости, а также молекулярно-генетическое исследование по плазме крови. Средний возраст пациентов на момент постановки диагноза составил 55±7,6 лет.

Иммуногистохимическое определение экспрессии РЭ, РП, Ki-67 и HER-2 в ткани опухоли. Иммуногистохимическое определение РЭ, РП, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 проводилось в лаборатории морфологических исследований патологоанатомического отделения Тюменского ООД (гл. врач. к.м.н. Синяков А.Г.). Иммуногистохимическое выявление экспрессии рецепторов половых гормонов и c-erbB-2 проводили в срезах фиксированной в формалине и залитой в парафин ткани согласно стандартной методике. Использовали моноклональные антитела к антигену Ki-67 (клон RTU -Ki-67-ММ1, производство фирмы Novocastra), антитела к белку рецептора эстрогена (клон 1D5, производство фирмы DAKO), к белку рецептора прогестерона (клон PgR636, производство фирмы DAKO) и набор DAKO HerceptTest для детекции c-erbB-2/HER-2.

Подсчет результатов иммуногистохимического анализа проводился с использованием следующих критериев:

- для рецепторов половых гормонов определяли опухолевые клетки со слабо, умеренно и интенсивно окрашенными ядрами. Выраженность экспрессии оценивали в баллах от 0 до 300 по шкале H-счёта, используя следующую формулу: H = 3А + 2В + 1С,

где, А – доля сильноокрашенных ядер (в процентах), В – доля умеренно окрашенных ядер, С – доля слабоокрашенных ядер опухолевых клеток.

- для анализа гиперэкспрессии HER-2 использовались критерии разработанные компанией DAKO: 0 баллов – окрашивание отсутствует или окраска менее 10% опухолевых клеток; 1+ балл – неполное окрашивание клеточной мембраны, окрашено более 10% опухолевых клеток; 2+ балла – полное окрашивание мембраны, слабое или умеренно выраженное окрашивание более 10% опухолевых клеток; 3+ балла – полное сильное окрашивание мембраны опухолевых клеток.

- для анализа пролиферативной активности подсчитывали среднее количество K-67-положительных клеток в ткани опухоли.

Определение EGFR и hVEGFR-165 в сыворотке крови. Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич» метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.

Определение метаболитов эстрогена в моче больных РМЖ. Определение концентраций метаболитов эстрогена в моче проводилось иммуносорбентным анализом при помощи иммуноферментного набора ESTRAMET 2/16 ELISA.

Определение мутационного статуса онкогенов. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялось из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон ) 560 кодон, APC (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13кодон+17кодон, p53 (5 экзон) 175 кодон, p53 (6 экзон), p53 (7 экзон) 248 кодон, p53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных включал использование средних значений в группах (M±m), параметрических и непараметрических критериев достоверности различий p (критерий 2, точный метод Фишера, критерий Манна–Уитни), показателя корреляции r. В ряде случаев для сравнения нескольких показателей использовался регрессионный анализ. При проведении статистического исследования использованы лицензионные программы Microsoft Excel 2002, пакета Microsoft Office XP и STATISTICA 6,0. Различия считались значимыми при р<0,05, что соответствует 95%-ной вероятности безошибочного прогноза.


РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распределение больных РМЖ по стадиям представлено в табл. 1. Наиболее часто в нашем исследовании встретились больные РМЖ с III a, III б стадиями – 21 и 35% соответственно. У пациентов обследуемой группы встречался РМЖ различной степени злокачественности. Данные представлены в табл. 2. Преобладали низкодифференцированные типы опухоли (56%).

Таблица 1.

Распределение больных по стадиям

Стадия Число больных (n=100)
T1N0M0 (I) 9 (9%)
T1N1M0 (II а) 11 (11%)
T2N0M0 (II а) 9 (9%)
T2N1M0 (II б) 15 (15%)
T1-3N2-3M0 (IIIа) 21 (21%)
T4NлюбаяM0 (III б) 35 (35%)

Всего 100 (100,0%)


Таблица 2

Частота встречаемости различных форм рака молочной железы

различной степени злокачественности

Степени злокачественности n %
1-ая степень 12 12
II-ая степень 32 32
III-я степень 56 56
Всего 100 100

Чтобы определить полный морфологический портрет больных мРМЖ и оценить метастатический потенциал, были изучены такие показатели, как уровень экспрессии HER-2/neu, среднее значение индекса пролиферативной активности Ki 67 первичной опухоли, молекулярно-генетические нарушения и их изменения в ходе лечения. Результаты приводим в таблицах 3 и 4.

Из данных табл. 3 видно, что различные HER-2 фенотипы опухолей встречались примерно с одинаковой частотой. Преобладали заранее неблагоприятные в прогностическом плане типы опухолей с гиперэкспрессией HER-2/neu.

Таблица 3

Частота встречаемости различных HER-2-фенотипов рака

молочной железы

Экспрессия онкобелка Показатель HER-2
0 баллов 1+ баллов 2+ баллов 3+баллов
n % n % n % n %
Количество пациентов n = 100 (100%) 19 19 21 21 30 30 30 30

Таблица 4

Среднее значение уровня экспрессии антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы с различными HER-2-фенотипами

Экспрессия HER-2
0 баллов 1+ баллов 2+баллов 3+ баллов
Среднее значение индекса Ki-67 (%) 33 29 49 56
Всего n = 27 n = 25 n =25 n = 23

Примечание: - статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).

Изучение уровня метаболитов эстрогена. Проведено изучение уровней метаболитов эстрогена 2 (ОНЕ-1) и 16 ( ОНЕ-1) и их соотношения, которое должно быть 1 / 2. Результаты приведены ниже (табл. 5 и 6).

Таблица5.

Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от степени

дифференцировки опухоли (М)

Степень дифференцировки Концентрация 2 (ОНЕ-1), Концентрация 16 ( ОНЕ-1), Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 ( ОНЕ-1)
Высокая степень дифференцировки 4,4 11,2 1 / 2,5
Средняя степень дифференцировки 6,9 21,9 1 / 3,2
Низкая степень дифференцировки 11,5 41,3 1 / 3,6

У всех больных РМЖ, независимо от степени дифференцировки опухоли, наблюдаются повышенные концентрации обоих метаболитов эстрогена и их дискордантное соотношение (преобладание «агрессивного» 16 ( ОНЕ-1) над физиологическим «хорошим» 2 (ОНЕ-1)). При этом, чем злокачественнее опухоль, тем выше концентрация метаболитов и сильнее дискордантность (p<0,05).

Таблица 6

Изучение уровня метаболитов эстрогена в зависимости

от экспрессии HER-2/neu

Степень экспрессии HER-2/neu Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 ( ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 ( ОНЕ-1)
1+ баллов 4,6 9,8 1 / 2,1
2+ баллов 7,8 22,1 1 / 2,8
3+ баллов 13,1 41,0 1 / 3,12

Из данных видно, что чем выраженнее экспрессия патологического онкобелка HER-2/neu, тем отчетливее нарушение гормонального статуса больных РМЖ, выше концентрации метаболитов эстрогена и выраженное преобладание «агрессивного» 16 ( ОНЕ-1) над физиологическим «хорошим» 2 (ОНЕ-1) (p<0,05). Поэтому, целью нашего исследования стало изучение влияния добавления в стандартные схемы лечения метастатического РМЖ Индинола – фитонутриента, содержащего высокоочищенный индол-3-карбинол. Индинол является противоопухолевым и противовирусным средством. Проведенные экспериментальные исследования [В.И. Киселёв, А.А. Ляшенко, 2005] показали, что препарат обладает следующими свойствами (рис. 1, 2):

- нормализирует метаболизм эстрадиола и ингибирует синтез 16-гидроксиэстрона, обладающего выраженными канцерогенными свойствами,

- ингибирует образование эстрогеновых рецепторов, снижая их количество на тканях-мишенях,

- индуцирует избирательный апоптоз опухолевых клеток,

- нейтрализует действие ростовых факторов, стимулирующих развитие опухолей молочных желез.

 Механизм апоптоза, индуцированного индол-3-карбинолом. -0

 Механизм апоптоза, индуцированного индол-3-карбинолом. -1

Рис. 1. Механизм апоптоза, индуцированного индол-3-карбинолом.

 Ингибирования пролиферации, опосредованной факторами роста, под-2

 Ингибирования пролиферации, опосредованной факторами роста, под-3

Рис. 2. Ингибирования пролиферации, опосредованной факторами роста, под действием индол-3-карбинола.


Изучение мутационного статуса больных РМЖ. Следующим этапом исследования стало изучение происходящих молекулярно-генетических изменений, происходящих при мРМЖ. Изучалась выраженность этих нарушений в зависимости от гистологического варианта опухоли, рецепторного статуса, пролиферативной активности (табл. 7).

Таблица 7.

Молекулярно-генетические изменения у больных

мРМЖ до лечения (n=100)

ДНК ВД1 (n=12) УД2 (n=32) НД3 (n=56) Кол-во мутаций
Парафиновые образцы р53 5 экзон 4 6 12 22
6 экзон 4 7 44 55
7 экзон 9 18 57 94
8 экзон 8 9 22 39
C-kit 12 кодон 0 3 12 15
B-raf 15 кодон 2 5 5 12
APC 2 4 8 14
K-ras 12,13 кодоны 0 5 32 37
E-кадхерин гиперметилирование 4 6 22 32
р16 гиперметилирование 0 6 16 22
Итого
33 69 230

Примечание: 1 – высокодифференцированный РМЖ; 2 – умереннодифференцированный РМЖ; 3 – низкодифференцированный РМЖ

Из данных таблицы видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных РМЖ с низкой степенью дифференцировки опухоли (230 мутаций). При этом преобладают мутации генов р 53 в 7 ех (57 случаев у больных с низкодифференцированным РМЖ) и K-ras (32 случая у больных с низкодифференцированным РМЖ).

Таблица 8

Молекулярно - генетический статус больных РМЖ в зависимости

от экспрессии ростовых факторов (EGFR, hVEGFR-165) (до лечения)

р53 5 экзон р53 6 экзон р53 7 экзон р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-cadherin р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки 4 4 16 8 - 2 2 - 4 - EGFR 10,8 hVEGFR-165 =130,0
Средняя степень дифференцировки 6 7 18 9 3 5 4 5 6 6 EGFR 15,4 hVEGFR-165 =145,7
Низкая степень дифференцировки 12 44 57 22 12 5 8 32 22 16 EGFR 36,7 hVEGFR-165= 168,0

Как видно из данных табл. 8, у больных с низкодифференцированными формами РМЖ чаще выявляются мутации генов р 53 7 ех, C-kit, K-ras, E-cadherin. У этих больных уровень EGFR, hVEGFR-165 значительно превышает нормативные пороговые значения (EGFR=36,7 fmol/ml, hVEGFR-165=168,0 pg/ml). Учитывая гиперэстрогенемию у больных РМЖ, гиперэкспрессию ростовых факторов, все больные были разделены на 2 группы, одна из которых получала дополнительно Индинол по 2 капсулы 2 раза в день на протяжении всего лечения.

Таблица 9

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 2-х курсов ПХТ) (n=100)

р53 5 экзон р53 6 экзон р53 7 экзон р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-cadherin р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки 2 3 14 6 - 1 1 - 3 - EGFR 9,8 hVEGFR-165 =128,0
Средняя степень дифференцировки 3 5 16 7 2 4 2 5 5 3 EGFR 13,8 hVEGFR-165 =143,9
Низкая степень дифференцировки 11 42 55 20 10 3 5 27 19 14 EGFR 34,9 hVEGFR-165= 165,0

Пациенты, как и больные контрольной группы, проходили контрольное обследование после каждых 2-х курсов ПХТ: осмотр онколога, маммолога, инструментальное обследование (рентген органов грудной полости, УЗИ органов брюшной полости и малого таза, КТ органов грудной, брюшной полостей, малого таза, остеосцинтиграфию). Определялся молекулярно-генетический статус через каждые 2 курса АПХТ. Результаты представлены в табл. № 9-14.

Таблица 10.

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 2-х курсов ПХТ+Индинол)




р53 5 экзон
р53 6 экзон
р53 7 экзон р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-cadherin р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки 2 2 12 5 - 1 1 - 3 - EGFR 9,3 hVEGFR-165 =125,9
Средняя степень дифференцировки 3 5 14 6 1 3 1 5 5 3 EGFR 13,3 hVEGFR-165 =139,2
Низкая степень дифференцировки 10 40 53 18 9 2 4 24 17 12 EGFR 34,3 hVEGFR-165= 161,3

Таблица 11.

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 4-х курсов ПХТ)




р53 5 экзон
р53 6 экзон
р53 7 экзон
р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-кадхерин р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) VEGFR (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки 2 2 11 5 - 1 1 - 3 - EGFR 9,4 hVEGFR-165 =123,0
Средняя степень дифференцировки 2 5 12 6 1 3 1 5 5 2 EGFR 11,9 hVEGFR-165 =140,2
Низкая степень дифференцировки 10 39 51 18 9 2 3 24 15 11 EGFR 31,9 hVEGFR-165= 163,7

Таблица 12

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 4-х курсов АПХТ+Индинол)




р53 5 экзон
р53 6 экзон
р53 7 экзон
р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-кадхерин р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) VEGFR (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки 1 2 10 3 - 1 - - 1 - EGFR 7,6 hVEGFR-165 =121,1
Средняя степень дифференцировки 2 4 11 4 1 1 - 3 3 1 EGFR 10,1 hVEGFR-165 =137,1
Низкая степень дифференцировки 6 32 47 11 5 1 1 19 12 8 EGFR 31,1 hVEGFR-165= 159,4

Таблица 13

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 6-и курсов ПХТ)




р53 5 экзон
р53 6 экзон
р53 7 экзон
р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-кадхерин р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) VEGFR (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки - 2 10 3 - 1 - - 1 - EGFR 9,4 hVEGFR-165 =123,0
Средняя степень дифференцировки 2 4 11 4 1 1 - 3 3 1 EGFR 11,9 hVEGFR-165 =140,2
Низкая степень дифференцировки 6 32 47 11 5 1 1 19 12 8 EGFR 31,9 hVEGFR-165= 163,7

Таблица 14

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ

(после 6-и курсов АПХТ+Индинол)




р53 5 экзон
р53 6 экзон
р53 7 экзон р53 8 экзон C-kit B-raf APC K-ras E-кадхерин р16 EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) VEGFR (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки - 1 10 3 - 1 - - 1 - EGFR 7,6 hVEGFR-165 =119,1
Средняя степень дифференцировки 1 3 10 4 1 - - 3 3 1 EGFR 10,1 hVEGFR-165 =130,1
Низкая степень дифференцировки 5 30 45 10 5 1 1 19 12 8 EGFR 31,1 hVEGFR-165= 157,4

Таким образом, после проведения 2-х курсов ПХТ наблюдается улучшение мутационного статуса больных мРМЖ, снижение концентраций EGFR и VEGFRs, причем более выраженные изменения происходят у больных с высокодифференцированными опухолями. У группы больных, получающих помимо стандартной схемы ПХТ, Индинол, данные изменения в среднем на 9,2% лучше, чем у контрольной группы. При анализе изменений, произошедших после проведения 4-х и 6-и курсов ПХТ, наблюдается уменьшение количества мутаций в генах, а также снижение уровня EGFR, hVEGFR-165, даже у больных с низкодифференцированными опухолями.

В связи с тем, что в настоящее время нет достоверных маркеров оценки эффективности адъювантной терапии, исследование молекулярно-генетического статуса (мутации в онкогенах, Ki-67, EGFR, VEGFR, метаболитов эстрогена – 2(ОНЕ-1), 16 (ОНЕ-1), РЭ, РП, HER-2/neu и гистологического типа опухоли) могут рассматриваться как маркеры оценки эффективности проводимого специального лечения, а также маркерами полноты излеченности. А в необходимых случаях – маркерами коррекции проводимой терапии.

При анализе молекулярно-генетического статуса больных РМЖ, которые с адъювантной полихимиотерапией получали Индинол, выявлено, что выраженность его изменений (нарушений) меньше, чем у больных, получавших просто ПХТ. При этом наблюдается не только качественно-количественное улучшение молекулярно-генетического статуса (в виде уменьшения числа мутаций), но и снижение уровня ростовых факторов в крови больных, что также является признаком улучшения состояния клеток.

Изучение содержания метаболитов эстрогена и их соотношения

У всех больных РМЖ, независимо от степени дифференцировки опухоли, наблюдаются повышенные концентрации обоих метаболитов эстрогена и их дискордантное соотношение (преобладание «агрессивного» 16 ( ОНЕ-1) над физиологическим «хорошим» 2 (ОНЕ-1)(табл. 15). При этом, чем злокачественнее опухоль, тем выше концентрация метаболитов и сильнее дискордантность (p<0,05).

Таблица 15

Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от степени

дифференцировки опухоли на фоне применения Индинола

Степень дифференцировки Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение (исходное) Концентрация 16 ( ОНЕ-1), среднее значение (исходное) Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 ( ОНЕ-1) (исходное) Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение (после лечения) Концентрация 16 ( ОНЕ-1), среднее значение (после лечения) Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 ( ОНЕ-1) (после лечения)
Высокая степень дифференцировки 5,6 14,6 1 / 2.6 4,8 12,1 1 / 2,5
Средняя степень дифференцировки 9,2 27,3 1 / 3,0 7,5 21,2 1 / 2,8
Низкая степень дифференцировки 12,5 48,7 1 / 4,0 10,1 39,4 1 / 3,9

При изучении результатов исследования мы выявили, что наибольшее количество мутаций наблюдается у больных РМЖ с низкодифференцированными, активно пролиферирующими (индекс Ki-67) и HER-2/neu+++ опухолями. При этом преобладают мутации гена р 53 в 7 экзоне (что свидетельствует о резистентности опухоли к антрациклинам, препаратам платины и ингибиторам топоизомеразы I, II типа), k-ras, E-cadherin. Существенной зависимости от гистологической формы опухоли и возраста больных выявлено не было.

Учитывая вариабельность, как в количественном так и в качественном составе мутаций, была предпринята попытка проследить изменения в молекулярно-генетическом статусе больных при проведении стандартной полихимиотерапии и с добавлением Индинола. При этом изменения исследовались по плазме крови. Установлено, что на фоне специального лечения количество мутаций уменьшается, а некоторые мутации исчезают полностью. При добавлении Индинола, количественно-качественные изменения мутационного статуса в среднем на 9,2% лучше, чем в контрольной группе. При этом наблюдается и большее нивелирование гиперэстрогенемического синдрома.

При анализе выявлено, что добавление Индинола к стандартным схемам лечения МРМЖ повышает общий эффект практически в 1,25 раза, медиана времени до прогрессирования увеличилась с 11,7 до 16,2 месяцев (р=0,001), медиана общей выживаемости с 31,1 до 36,5 месяцев (р=0,03) (рис. 3, 4).

 Время до прогрессирования. Общая выживаемость. ВЫВОДЫ -5

Рис. 3. Время до прогрессирования.

 Общая выживаемость. ВЫВОДЫ Больные метастатическим РМЖ имеют-7

Рис. 4. Общая выживаемость.

ВЫВОДЫ


  1. Больные метастатическим РМЖ имеют выраженные молекулярно-генетические изменения: в большинстве наблюдений встречаются мутации р53 в 6,7 экзонах, k-ras, c-kit, E-cadherin. У всех больных выявлено превышение нормальных значений EGFR и VEGFRs, а также нарушение гормонального статуса в виде гиперэстрогенемии и преобладании 16 (ОНЕ-1).
  2. На фоне проводимого комплексного лечения в группах больных наблюдалась положительная динамика изменения молекулярно-генетического статуса: уменьшилось число мутаций у больных с заранее благоприятным фенотипом, или оставалось на прежнем уровне у больных с неблагоприятными фенотипическими признаками. Уровень EGFR и VEGFRs на фоне применения Авастина (Бевацизумаба) достоверно снижался.
  3. У группы больных, получавших дополнительно к химиотерапевтическому лечению Индинол, наблюдается достоверное улучшение молекулярно-генетического статуса (число мутаций сократилось).
  4. У данной группы больных продолжительность безрецидивного периода дольше на 5,1 месяцев по сравнению с группой, не получавших Индинол.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ


  1. Для определения прогноза клинического течения рака молочной железы наряду с комплексным иммуногистохимическим определением уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона в сочетании с выявлением уровня экспрессии онкобелка HER-2 и антигена Ki-67 в клетках первичной опухоли, необходимо определение молекулярно-генетического статуса больных РМЖ по парафинированным образцам и по плазме крови.
  2. До начала лечения метастатического РМЖ, целесообразно определение молекулярно-генетического статуса больных, с целью определения эффективности проводимого специального лечения, полноты излеченности больных РМЖ, коррекции проводимого спецлечения.
  3. В схемах лечения метастатического РМЖ необходимо использовать таргетный, молекулярно-нацеленный препарат, ингибитор VEGFR Бевацизумаб (Авастин). Патогенетически обоснованно добавление в стандартные схемы лечения мРМЖ ингибитора эстрогенов – препарата на основе индол-3-карбинолов – Индинол.


Список работ, опубликованных
по теме диссертации


  1. Важенина А.А., Сабиров А.Х., Старцев С.А., Торопыгин П.Ю. Восстановительное лечение онкологических больных после получения специализированного лечения в онкодиспансере // Мат. юбилейной конфер., посвященной 55-летию онкологической службы Тюменской области. – Тюмень, 2001. – С. 148-150.
  2. Важенина А.А., Сабиров А.Х., Кормина О.С., Алехин И.Е., Белохвостов А.С., Мустаев О.З. О возможности ДНК-диагностики в онкологии // Онкология: теория и практика. – 2004. - № 4. – С. 46-47.
  3. Важенина А.А., Кормина О.С., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Мустаев О.З., Изгейм В.П., Нямцу А.М., Барышников А.Ю., Бычков В.Г. Корреляция некоторых иммунологических, иммуноферментных и молекулярно-генетических маркеров в диагностике опухолевого роста./Всероссийская конференция «Новые отечественные противоопухолевые препараты» 23-24 февраля 2005г. //Российский биотерапевтический журнал - М., 2005 №2. –С. 37-41.
  4. Важенина А.А., Бычков В.Г., Сабиров А.Х. Экологическая онкология: стратегия профилактики опухолевых болезней в нефтегазовом регионе (Западная Сибирь)/ Международный форум по проблемам науки, техники и образования. 5-9 декабря 2005г. М., 2005.-Том 3. -С. 119-126.
  5. Важенина А.А., Сабиров А.Х., Нямцу А.М., Нямцу Е.Л., Велижанина О.С. Скрининговые исследования в онкологии. // Сайт РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Вместе против рака» март 2006г. www.wpr.ru.
  6. Важенина А.А., Грибоедов М.Н., Нямцу А.М., Нямцу Е.Л., Сабиров А.Х. Экстренная онкология. // Сайт РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН «Вместе против рака» июнь 2006г. www.wpr.ru.
  7. Важенина А.А., Григоренко Т. Б., Шайн А. А., Сабиров А.Х., Симонов А. В., Федоров П. М., Алехин И. Е., Хасанова Г. Р., Антонов М. В.Новые подходы к лечению рака молочной железы, осложненного ВПЧ 16, 18 типов./ Тез. Международного симпозиума. «Новые отечественные противоопухолевые препараты» 24-26 март 2007г. М., 2007.- С. 31-32.
  8. Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн А.А., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетический статус больных с фиброзно-кистозными мастопатиями. Стратегические подходы превентивной онкологии. /Материалы Всероссийской научно-практической конференции по интервенционной маммологии. М.: «Сан-пресс», 2008.- С.121-125.
  9. Сабиров А.Х., А.Ю. Барышников, Федоров Н.М., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий и методы их коррекции / Сборник тезисов всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия», М., 2008. -С. 56-57.
  10. Сабиров А.Х., Шайн А.А., Федоров Н.М., Важенина А.А. О возможности молекулярно-генетического тестирования онкологических больных //VIII съезд онкологов Армении. Ереван, 2008.-С.85-87.
  11. Сабиров А.Х., Шайн А.А., Федоров Н.М., Важенина А.А. Об использовании препарата «Промисан» в таргетной терапии онкологических больных. / Конференция онкологов Поволжья. Сборник тезисов. Казань, 2008. -С. 76-78.
  12. *Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн А.А., Важенина А.А., Бычков В.Г. Подходы к превентивной маммологии.// Российский биотерапевтический журнал, 2009. -№1.- Т.8.- С. 94-97.
  13. Сабиров А.Х., Шаназаров Н.А., Федоров Н.М., Шайн А.А., Гадевич В.В., Важенина А.А., Барышников А.Ю., Бычков В.Г., Нечай Е.Н., Барышников А.П., Кислый Д.Г., Антонов М.В. Стратегические подходы превентивной онкологии./ Радиология – наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана, 2009. -С. 33-37.
  14. *Важенина А.А., Сабиров А.Х., Антонов М.В. Изменения молекулярно-генетического статуса больных мРМЖ в процессе комплексного лечения.// Медицинская наука и образование Урала. -2010. -№4. - С. 11-14.

* - публикации в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ


























СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РМЖ рак молочной железы

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

мтДНК митохондриальная ДНК

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ТР53 супрессор опухоли

П.о. пар оснований

ИГХ иммуногистохимия

Ki 67 индекс пролиферативной активности клеток

РП рецептор прогестерона

РЭ рецептор эстрогена

EGFR рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР)

VEGFR рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста

2 (ОНЕ-1) функциональный метаболит эстрогена

16 (ОНЕ-1) агрессивный метаболит эстрогена

Her-2/neu продукт онкогена сеrbВ-2 семейства рецепторных тирозинкиназ

n объем выборки

р уровень значимости статистического критерия

АПХТ адъювантная полихимиотерапия

ИСА иммуносорбентный анализ

РЭФР рецептор эпидермального фактора роста

ЭФР эпидермальный фактор роста

FISH флюоресцентная гибридизация in situ

ДАБ диаминобензидин

ВАЖЕНИНА

Алена Александровна




Динамика молекулярно-генетических

преобразований метастатического

рака молочной железы

до и в процессе лечения



14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Подписано в печать. 2010
Формат 60х84/16. Печ. л. 1,0. Печать ризограф.
Тираж 100. Зак. №.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.