WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами

На правах рукописи








АНТОНОВ МАКСИМ ВИКТОРОВИЧ




Значение молекулярно-биологических маркеров

при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами



14.01.12 – онкология

АВТОРЕФЕРАТ


диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Москва 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России





Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент Сабиров Ахат Халимович

Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Петерсон Сергей Борисович
доктор медицинских наук, Ананьев Виталий Сергеевич
Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий

Защита состоится « » __________ 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.001.17.01 РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

по адресу: 115478 г. Москва, Каширское шоссе, д. 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан «___»_______________ 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д.001.17.01

профессор, доктор медицинских наук Ю.В. Шишкин.



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актуальной проблемой современной онкологии является колоректальный рак, занимающий третье место в структуре онкологической патологии. Неуклонный рост числа больных колоректальным раком обусловливает актуальность исследований, связанных с поиском путей оптимизации алгоритмов хирургического и комбинированного лечения по­следних [Аксель Е.M., Давыдов М.И., 2005].

В России ежегодно регистрируется 40 тысяч случаев рака толстой кишки. Умирает 31 тысяча больных. Средний показатель заболеваемости колоректальным раком составляет примерно 13,1 на 100 тысяч населения. Прослеживается стойкая тенденция к росту частоты развития опухолей этой локализации во всех развитых станах, в том числе и России. При этом отмечается значительное число случаев с поздней стадией заболевания, когда существенно затрудняется возможность выполнения радикального хирургического вмешательства и оказания полноценной медицинской помощи. Ведущей причиной поздней диагностики новообразований кишечника является разнообразие клинических форм заболевания и скудность их появлений на ранних стадиях, а как следствие – несвоевременное обращение больных за медицинской помощью.

За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигнала и т.д. На сегодняшний день известно более 100 белков и/или генов, изменения которых находят в злокачественных клетка. Каждая опухоль является уникальной по набору нарушений, вовлеченных в процессы канцерогенеза.

Определение молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли может давать дополнительную информацию о биологическом поведении опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам [Степанова Е.В., 2009] Однако до сих пор не определены наиболее значимые молекулярно-биологические маркеры для прогнозирования течения заболевания и выбора обоснованной терапии.



В настоящее время большое внимание онкологов привлекают новые терапевтические подходы, базирующиеся на достижения молекулярной биологии. Разработаны препараты, направленные на блокирование различных белков-продуцентов онкогенов в опухолевых клетках (Герцептин, Лабатиниб, Цетуксимаб, Иресса, Тарцева, Гливек, Сутент, Авастин и др.). Результаты проведенных исследований демонстрируют существование принципиально нового этапа лечения злокачественных новообразований, основанного на определении мишени направленного действия препарата.

В настоящее время не изучено влияние таргетных препаратов на молекулярно-генетические маркеры опухолевых клеток, а также влияние молекулярно-генетических мутаций на чувствительность опухолевых клеток к таргетной терапии.

Цель исследования. Определить значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами.

Задачи исследования:

  1. Определить молекулярно-генетические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком до и в процессе лечения таргетными препаратами.

2. Определить клиническую значимость особенностей экспрессии молекулярно-генетических маркеров.

3. Оценить эффективность результатов лечения больных колоректальным раком с применением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб.

Научная новизна.


Впервые определены молекулярно-генетические маркеры в сыворотке крови больных колоректальным раком. Показано, что больные колоректальным раком имеют выраженные молекулярно-генетические нарушения. Наиболее часто встречаются мутации генов р53 в 6, 7 экзонах, APC, C-kit, E-cadherin. Впервые показано изменение некоторых молекулярно-генетических маркеров в процессе лечения больных таргетными препаратами. Добавление в лечение больных КРР таргетных препаратов улучшает молекулярно-генетический статус, увеличивает время до прогрессирования и общую выживаемость. Показано преимущество комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI. Обнаружена корреляция между степенью морфологической дифференцировки опухоли и экспрессией некоторых молекулярно-генетических маркеров. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяц больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI+ цетуксимаб

Практическая значимость. Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза больных КРР и выбора схемы лечения.

Определение молекулярно-генетического статуса по образцам сыворотки крови больных (в отличие от образцов опухоли) позволяет проводить мониторинг изменений молекулярно-генетического статуса и прогнозировать течение заболевания.

Настоящее исследование показало преимущество терапии колоректального рака таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия» г. Москва, 2008.; Конференции онкологов Поволжья. Казань, 2008; на 3-ем Евразийском радиологическом форуме. Астана, 2009г., II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» г. Тюмень 26-28 сентября 2010 г. и на региональной онкологической конференции ЯНАО март 2011 г., совместной научной конференции кафедр: онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, хирургии ФПК и ППС, патанатомии, гистологии и эмбриологии, оперативной хирургии и топографической анатомии, социальной гигиены и организации здравоохранения ГОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития РФ 12 апреля 2011 года.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику ГУ Курганского областного онкологического диспансера, ГЛПУ Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедре хирургических болезней с курсами эндоскопии, урологии и рентгенологии ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, 2 из них – в рецензируемых ВАК журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 15 таблицами, 2 диаграммами и 31 рисунком (в том числе микрофотографиями). Библиографический список включает 64 отечественных и 101 зарубежных источников.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа основана на анализе клинических данных и результатов лабораторных методов диагностики 150 больных КРР, подвергшихся хирургическому лечению и получавших противоопухолевое лечение в Салехардской Окружной клинической больнице (главный врач Коган М.И).

Клиническая характеристика больных:

Средний возраст больных на момент постановки диагноза составил 56 ± 1,1 лет (от 29 до 75 лет), 71 мужчин и 79 женщины.

Общее состояние оценивалось по 5-ти балльной шкале ECOG. Соматический статус всех наблюдаемых на момент операции не превышал 2 баллов.

Во всех 150 наблюдениях диагноз злокачественного новообразования толстой кишки был верифицирован морфологическим способом, с использованием парафиновых блоков первичной опухоли данных больных.

В исследование были включены первичные больные, у которых в удаленной во время операции опухоли был определен «дикий» тип гена K-Ras, т.к. цетуксимаб не оказывает действия при мутации этого гена [Ahmed F.E. 2005].

У большинства больных – 93,3% (140 из 150) при морфологическом исследовании операционного материала была обнаружена аденокарцинома толстой кишки (АТК). Минимальное число больных – 6,7% (10 из 150) имело неоплазии кишечника со слизеобразованием. Опухоли по степени дифференцировки распределялись следующим образом: 23 – низко-, 115 – умеренно и 12 – высокодифференцированных новообразований.

Окончательная стадия заболевания и распространенность опухолевого процесса на зоны регионарного лимфооттока устанавливалась после патоморфологического анализа удаленного новообразования кишечника. При этом из общего числа рассматриваемых пациентов с КРР у 44% стадия заболевания согласно классификации Dukes соответствовала категории Dukes'C, а у 56% – Dukes'D.

Схемы лечения больных

Всем больным выполнен оперативный этап лечения – радикальная или циторедуктивная резекция ободочной или прямой кишки (правосторонняя гемиколэктомия, резекция поперечно-ободочной кишки, левосторонняя гемиколэктомия, резекция сигмовидной кишки, различные варианты резекции прямой кишки).

Больных разделили на 3 группы по 50 человек. В 1-й группе в послеоперационном периоде через 3-4 недели больные получали химиотерапию по схеме FOLFIRI (иринотекан  – 180 мг/м2 в/в, капельно в 1-й день. Фолинат кальция (лейковорин) – 200 мг/м2 в/в, в 1-й день. Фторурацил – 400 мг/м2 в/в, струйно в 1-й день, затем Фторурацил – 2,4-3,0 г/м2 24-часовая в/в инфузия). Повторные курсы через 2 недели. Все больные получили 6 курсов химиотерапии.

Во второй группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом цетуксимаб. Гуманизированные моноклональные антитела цетуксимаб (МЕРК-Сироно) в/в 400мг/м2 в первое введение, в последующем по 250 мг/м2 один раз в неделю.

В третьей группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом бевацизумаб. Гуманизированные моноклональные антитела бевацизумаб (Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд.) в/в, 5мг /кг 1 раз в 3 недели.

Все больные после хирургического лечения на протяжении 5 лет и более находились под тщательным наблюдением с периодическим контрольным обследованием.

Оценка эффективности проводилась после каждого четного цикла цитостатической терапии, а также всего курса таргетной терапии в соответствии со стандартными критериями ВОЗ [Miller A. et al., 1981].

Иммуногистохимические следования

Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового иммунопероксидазного метода с моноклональными антителами, характеристика которых представлена в таблице 1. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).

Таблица 1

Характеристика использованных в исследовании антител


Антиген Антитело, клон Фирма Рабочее разведение Функция белка
Ki-67 Mouse mAb MIB-1 Dako RTU Антиген клеточной пролиферации
VEGF Mouse mAb VG1 Dako 1:25 Активатор ангиогенеза
EGFR Mouse mAb H11 Dako 1:200 Рецепторная тирозинкиназа


Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и VEGFR осуществляли согласно порядковой шкале:

0 – мембранное окрашивание отсутствует;

1+ – слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более чем в 10% клеток;

2+ – окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру

выявляется более чем в 10% клеток;

3+ – интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток.


При иммуногистохимическом окрашивании с использованием моноклональных антител к антигену Ki-67 в опухолевых клетках наблюдался ядерный тип реакции в первичных и вторичных очагах опухолевого роста, частота выявления которого в исходной опухоли и ее метастазах различалась незначительно. Уровень экспрессии белка Кi-67 в различных опухолях варьировал в широких пределах. Пролиферативную активность оценивали как низкую, умеренную и высокую на основе следующих критериев:

  1. 0%-20% – низкая пролиферативная активность;
  2. 21%-50% – умеренная пролиферативная активность;
  3. 51%-100% – высокая пролиферативная активность.

Иммуноферментная диагностика сывороточных концентраций

EGFR и VEGFR.

Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич»-метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.


Определение мутационного статуса онкогенов в сыворотке крови. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялась из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон) 560 кодон, APC (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13кодон+17кодон, p53 (5 экзон) 175 кодон, p53 (6 экзон), p53 (7 экзон) 248 кодон, p53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16.


Статистический анализ. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия X2 и непараметрического точного критерия Фишера для малых выборок. Различия между показателями считались статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ


Иммуногистохимическое определение EGFR и VEGFR.

В большинстве случаев (146 из 150) у больных КРР в образцах опухоли обнаружили экспрессию EGFR. При высокой степени дифференцировки опухоли имелась низкая экспрессия антигена EGFR: 8 случаев с 1+, а у 4 пациентов отсутствовала полностью. При умеренной и низкой степени дифференцировки экспрессия антигена EGFR повышена.

В группе с низкодифференцированной АТК в 17 % экспрессия была 2+, в 83% экспрессия была 3+. Пациентов без экспрессии EGFR не было. Эти результаты статистически значимы (таблица 2).

Антиген VЕGFR также был экспрессирован у большинства больных (146 из 150). При этом, чем выше степень злокачественности, тем заметнее увеличение экспрессии сосудисто-эндотелиального факторов роста. При высокодифференцированной аденокарциноме в группе из 12 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 2+; у 9 – 1+; у 2 пациентов экспрессии не выявлено. При низко дифференцированной аденокарциноме в группе из 23 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 1+; у 3 – 2+; у 19 (что составляет 83%) – 3+. Больных без экспрессии VEGFR не выявлено

( таблица 3).

Таблица 2

Распределение больных КРР в зависимости

от степени дифференцировки опухоли и экспрессии EGFR в опухоли


Степень дифференцировки опухоли (n кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена EGFR
0 1+ 2+ 3+
Высокая (n=12) n *4 *8 0 0
% 33 67 0 0
Умеренная (n=115) n 0 29 *68 18
% 0 25 59 16
Низкая (n=23) n 0 0 4 *19
% 0 0 17 83




*– статистически достоверно, р<0,05


Таблица 3

Распределение больных КРР в зависимости

от степени дифференцировки опухоли и экспрессии VEGFR в опухоли

Степень дифференцировки опухоли (n кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена VEGFR
0 1+ 2+ 3+

Высокая (n=12) n 2 9 1 0

% 17 75 8 0

Умеренная (n=115) n 2 * 25 64 24

% 1 22 56 21

Низкая (n=23) n 0 * 1 3 *19

% 0 4 13 83

*– статистически достоверно, р<0,05

Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67 в опухолевых клетках.

Уровень пролиферативной активности раковых клеток является ключевым фактором, определяющим потенциал злокачественности опухоли и агрессивность течения заболевания. В данном исследовании проведен анализ пролиферативной активности первичных аденокарцином толстой кишки с помощью оценки индексов пролиферации Кi-67 и сопоставления полученных данных с клинико-морфологическими факторами прогноза и показателями выживаемости больных КРР.

У большинства больных КРР выявлен высокий уровень пролиферативной активности Кi-67, при этом большой процент Кi-67 – позитивных клеток (>50%) отмечен в 33 случаях, умеренные индексы пролиферации (21%-50%) – в 105 случаях и низкий уровень пролиферации (< 20%) – в 12 случаях.

Экспрессия маркера наблюдалась в опухолях с различной степенью гистологической дифференцировки и, как правило, в меньшей степени была выражена в участках с секреторной активностью (слизеобразованием). Средний уровень экспрессии антигена Ki-67 прямо пропорционально коррелировал со степенью злокачественности КРР. В опухолях с более высоким уровнем злокачественности индекс Ki-67 был выше, чем в опухолях с более низким уровнем злокачественности (таблица 4).

Таблица 4

Распределение больных КРР в зависимости

от степени дифференцировки опухоли и значения индекса Ki-67



Степень дифференцировки опухоли (n кол-во пациентов)
Уровень экспрессии антигена Ki-67
низкая пролиферативная активность < 20% (n=12) умеренная пролиферативная активность 21-50% (n=105) высокая пролиферативная активность > 50% (n=33)
Высокая (n=12) *12 (100%) 0 0
Умеренная (n=115) 0 *105 (91,3%) 10 (8,7%)
Низкая (n=23) 0 0 *23 (100%)

Примечание: * – р<0,05


Изучение мутационного статуса больных КРР по образцам сыворотки крови.

Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений по образцам сыворотки крови, взятых до лечения и после 6-ти курсов химиотерапии. В сыворотке крови у больных определяли экспрессию ростовых факторов, количество мутаций в генах Р53, АРС, B-raf,

C-kit, E-cadherin.

При анализе экспрессии рецепторов ростовых факторов не было выявлено корреляции между уровнем экспрессии EGFR и степенью морфологической дифференцировкой опухоли. Однако, при изучении hVEGFR-165, обнаружено статистически достоверное снижение уровня экспрессии в зависимости от морфологической дифференцировки опухоли (чем ниже дифференцировка опухоли, тем выше уровень экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора от 130 pg/ml. при высокодифференцированных аденокарциномах и до 174,7 pg/ml. при низкодифференцированных).

На фоне лечения больных КРР не обнаружили изменений в уровне ростового фактора EGFR (таблица 5).

С другой стороны, ростовой фактор VEGVR статистически значимо снижался в группе низкодифференцированных опухолей при лечении FOLFIRI+бевацизумаб (таблица 6).

Таблица 5

Уровень экспрессии ростового фактора EGFR в сыворотке крови в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли

Степень дифференцировки опухоли EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) до лечения EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI
EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ цетуксимаб
EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ бевацизумаб
Высокая 10,8 9,8 9,6 9,3
Умеренная 36,7 34,9 34,6 34,3
Низкая 15,4 13,8 13,7 13,3

Таблица 6

Уровень экспрессии ростового фактора VEGFR в сыворотке крови

в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли

Степень дифференцировки опухоли hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) до лечения hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
FOLFIRI


hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
FOLFIRI+ цетуксимаб
hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
FOLFIRI+ бевацизумаб
Высокая 130,0 129,0 128,0 125,9
Умеренная 168,0 164,0 165,0 161,3
Низкая 174,7 140,9 143,9 139,2

Анализ экспрессии других молекулярно-генетических маркеров показал тенденцию к снижению количества мутаций по сравнению с долечебным уровнем при комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами, которое было статистически не значимо. После лечения стандартной схемой химиотерапии FOLFIRI, количество молекулярно-генетических мутаций несколько повышалось. С применением таргетных препаратов картина меняется. Отмечается стойкая тенденция к снижению уровня мутации гена р53 в 6,7,8 экзонах, АРС, Е-кадхерина. Однако, эти изменения также статистически не значимы. Но при анализе общего количества мутаций обнаружили статистически значимые различия между группой больных получавших FOLFIRI+ бевацизумаб и другими группами (р<0,05). При анализе среднего количества мутаций на одного пациента отмечено снижение с 2,78 до 1,5 (таблица 7).

Таблица 7

Изменения молекулярно-генетических маркеров у больных КРР

на фоне лечения по разным схемам

Количество мутаций Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit
12 кодон
B-raf
15 кодон
APC E-cad-herin р16
до лечения (n-150) % *42 68 109 59 21 1 35 47 35 ***417 ****2,78
**28 45,3 72,7 39,3 14 0,7 23,3 31,3 23,3
FOLFIRI (n-50) % 15 26 43 21 7 1 13 18 14 158 3,16
30 52 86 42 14 2 26 36 28
FOLFIRI + цетуксимаб (n-50) % 11 19 24 17 6 - 8 12 9 106 2,12
22 38 48 34 12 - 16 24 18
FOLFIRI + бевацизумаб (n-50) % 7 12 21 13 3 - 6 9 5 76 1,5
14 24 42 26 6 - 12 18 10

* – количество больных с данной мутацией;

** – процент больных с данной мутацией;

*** – общее количество мутаций;

**** – количество мутаций на 1 больного.

Анализ генетических мутаций в зависимости от степени дифференцировки опухоли.

Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений в зависимости от гистологической дифференцировки опухоли.

В группе больных, обследованных до лечения видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных КРР с умеренной и низкой степенью дифференцировки опухоли. При этом преобладает мутация гена р53 в 7ех. Количество мутаций на 1 больного в группе с низкодифференцированной АТК составляет 4, тогда, как при умеренно-дифференцированной и высокодифференцированной АТК 2,9 и 2,5 соответственно (таблица 8).

Таблица 8

Молекулярно-генетический статус больных КРР

в зависимости от дифференцировки опухоли до лечения (n=150)


Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit 12 ко-дон B-raf 15 ко-дон APC K-ras
12,13 кодо-ны
E-cad-herin р16
Высокая (n-12) 4 *33 4 33 9 75 8 67 2 17 0 3 25 0 4 33 1 8 35 **2,9
Умеренная (n-115) 27 24 54 47 79 69 42 37 12 10 0 18 16 0 32 28 26 23 290 2,5
Низкая (n-23) 11 48 10 44 21 91 9 39 7 30 1 4 14 61 0 11 48 8 35 92 4

* – процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

Далее мы провели анализ изменения молекулярно-генетических маркеров до лечения и после лечения по группам.

Было обнаружено, что у 50 больных, подвергшихся в последствии терапии FOLFIRI, в процессе лечения, произошли изменения. Общее количество мутации на 1 пациента увеличилось (таблицы 9, 10), особенно в группе низкодифференцированных опухолей.

Таблица 9

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения

группа FOLFIRI (n=50)


Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53

5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit
12 ко-дон
B-raf
15 ко-дон
APC K-ras
12, 13 ко- до-ны
E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 1 *25 1 25 3 75 3 75 1 25 0 1 25 0 2 50 0 12 **3
Умеренная (n=38) 9 24 18 47 26 68 14 37 4 11 0 6 16 0 10 26 9 24 96 2,5
Низкая (n=8) 4 50 3 38 7 88 3 38 2 25 1 13 5 63 0 4 50 2 25 31 3,9

*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

Таблица 10

Молекулярно-генетический статус больных КРР

после 6-ти курсов FOLFIRI (n=50)

Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n колво пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit
12 ко-дон
B-raf 15 ко-дон APC K-ras 12,13 ко до-ны E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 1 *25 1 25 3 75 2 50 0 0 1 25 0 2 50 0 10 **2,5
Умеренная (n=38) 9 ***24 21 55 32 84 15 40 4 11 0 8 21 0 12 32 10 26 111 2,9
Низкая (n=8) 5 63 4 50 8 100 4 50 3 38 1 13 4 50 0 4 50 4 50 37 4,6

*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного;

***– статистически достоверно, р<0,05.

В группе больных, получавших FOLFIRI + цетуксимаб, общее количество мутации на 1 пациента снизилось: 2,8 до 2 в группе высокодифференцированных; с 2,6 и 2,1 в группе умеренно-дифференцированных; с 3,9 до 2,3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 11, 12).

Таблица 11

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения

FOLFIRI + цетуксимаб (n=50)


Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit
12 ко-дон
B-raf
15 ко-дон
APC K-ras
12,13 кодо-ны
E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 1 *25 2 50 3 75 2 50 1 25 0 1 25 0 1 25 0 11 **2,8
Умеренная (n=38) 9 24 18 47 26 68 14 37 4 11 0 6 16 0 11 29 9 24 97 2,6
Низкая (n=8) 4 50 3 36 7 88 3 36 3 36 0 4 50 0 4 50 3 36 31 3,9


*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

Таблица 12

Молекулярно-генетический статус больных КРР

после 6-ти курсов FOLFIRI + цетуксимаб (n=50)


Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit 12 ко-дон B-raf
15 ко-дон
APC K-ras 12,13 кодо-ны E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 1 *25 0 3 75 2 50 0 0 1 25 0 1 25 0 8 **2
Умеренная (n=38) 7 18 16 42 20 53 12 32 3 8 0 4 11 0 9 24 7 18 78 2,1
Низкая (n=8) 3 38 3 38 5 63 3 38 3 38 0 4 50 0 3 38 2 25 26 2,3


*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

В группе больных, получавших FOLFIRI + бевацизумаб, общее количество мутации на 1 пациента также снизилось: с 2,7 до 1,5 в группе высокодифференцированных; с 2,5 до 1,8 в группе умеренно-дифференцированных; с 4,3 до 3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 13, 14).

Таблица 13

Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения

группа FOLFIRI + бевацизумаб (n=50)


Степень дифферен- цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мута-ций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit
12 ко-дон
B-raf
15 ко-дон
APC K-ras 12,13 кодо-ны E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 2 *50 1 25 3 75 3 75 0 0 1 25 0 1 25 0 11 **2,7
Умеренная (n=39) 9 23 18 46 27 69 14 36 4 10 0 6 15 0 11 28 8 21 97 2,5
Низкая (n=7) 3 43 4 57 7 100 3 43 2 29 0 5 71 0 3 43 3 43 30 4,3

*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

Таблица 14

Молекулярно-генетический статус больных КРР

после 6-ти курсов FOLFIRI + бевацизумаб (n=50)


Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n кол-во пациентов) Исследуемые гены ДНК

Общее коли-чество мутаций
р53
5 эк-зон
р53
6 эк-зон
р53
7 эк-зон
р53
8 эк-зон
C-kit 12 ко-дон B-raf 15 ко-дон APC K-ras 12,13 кодоны E-cad-herin р16
Высокая (n=4) 0 0 3 75 2 50 0 0 0 0 1 25 0 6 **1,5
Умеренная (n=39) 6 *15 12 31 19 49 11 28 2 5 0 5 13 0 8 21 7 18 70 1,8
Низкая (n=7) 3 43 3 43 6 86 3 43 2 29 0 3 43 0 2 29 3 43 22 3

*– процент мутации в группе;

** – количество мутаций на 1 больного.

Снижение общего числа мутаций в группе больных получавших FOLFIRI + бевацизумаб при низкодифференцированных опухолях было статистически значимым по сравнению с получавшими FOLFIRI и до лечения.

Анализ выживаемости больных


В группе пациентов, получавших химиотерапию (ХТР) по схеме FOLFIRI, частота объективных ответов составила 54%, время до прогрессирования – 10,9 месяцев и продолжительность жизни – 20,6 месяцев.

В группе пациентов, получавших ХТР по схеме FOLFIRI + цетуксимаб, частота объективных ответов составила 57%, время до прогрессирования – 11,4 месяцев и продолжительность жизни – 26,1 месяцев.

В группе пациентов, получавших ХТР по схеме FOLFIRI + бевацизумаб, частота объективных ответов – 57,9%, время до прогрессирования – 13,5 месяцев и продолжительность жизни – 27,7 месяцев (таблица 15).

Таблица 15

Показатели общей выживаемости (ОВ)

и выживаемости без прогрессирования (ВБП)


Показатели выживаемости FOLFIRI (n=50) FOLFIRI + цетуксимаб (n=50) FOLFIRI + бевацизумаб (n=50)
ОВ, месяцы 20,6 26,1 27,7
ВБП, месяцы 10,9 11,4 13,5

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).

При анализе данных по ОВ и ВБП выявлено, что схемы лечения больных КРР FOLFIRI + цетуксимаб и FOLFIRI + бевацизумаб увеличивают медиану времени до прогрессирования с 10,9 до 11,4 месяцев и с 10,9 до 13,5 месяцев; медиану ОВ – с 20,6 до 26,1 месяцев и с 20,6 до 27,7 месяцев по сравнению со схемой FOLFIRI без добавления таргетных препаратов (см. диаграммы 1, 2).

Диаграмма 1

Общая выживаемость больных КРР

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

Диаграмма 2

Выживаемость больных КРР без прогрессирования

Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

Добавление бевацизумаба, цетуксимаба к химиотерапии достоверно улучшает время до прогрессирования, и продолжительность жизни больных. Терапия моноклональными антителами должна проводиться максимально долго, до прогрессирования.

Анализ выживаемости показал, что лечение больных по схеме FOLFIRI менее эффективно, чем лечение с таргетными препаратами. Эффективность схемы FOLFIRI + бевацизумаб оказалась выше, чем FOLFIRI + цетуксимаб. Среди исследованных молекулярно-генетических маркеров, информативную значимость имеет Ki-67, EGFR и VEGFR, которые коррелируют с морфологической дифференцировкой опухоли, а также с общим количеством мутаций, выявленных по сыворотке крови.


При высокой пролиферативной активности опухоли, определенной по экспрессии Ki-67, отмечается уменьшение ОВ с 27,7 месяцев, до 21,8 месяцев в отличие от низкой степени пролиферативной активности и ВБП с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев соответственно (таблица 16).

Таблица 16

Показатели общей выживаемости (ОВ) и выживаемости без прогрессирования (ВБП) в зависимости от значения индекса Ki-67


Показатели выживаемости Низкая пролиферативная активность < 20% (n=12) Умеренная пролиферативная активность 21-50% (n=105) Высокая пролиферативная активность > 50% (n=33)
ОВ, месяцы 27,7 24,9 21,8
ВБП, месяцы 13,3 11,8 10,7

Анализ ОВ и ВБП в зависимости от степени дифференцировки опухоли показал, что при более низкой степени дифференцировки опухоли ОВ уменьшается с 27,8 месяцев при высокой степени дифференцировки до 21,9 месяцев при низкой степени дифференцировки и ВБП с 13,1 месяцев до 10,8 месяцев соответственно (таблица 17).

Таблица 17

Показатели общей выживаемости (ОВ) и выживаемости без прогрессирования (ВБП) в зависимости

от степени дифференцировки опухоли


Показатели выживаемости Высокая (n=12) Умеренная (n=115) Низкая (n=23)
ОВ, месяцы 27,8 24,7 21,9
ВБП, месяцы 13,1 11,9 10,8


ОВ при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 27,6 месяцев до 20,6 месяцев при отсутствии экспрессии EGFR. ВБП при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев, соответственно (таблица 18).

Таблица 18


Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования в зависимости от экспрессии EGFR


Показатели выживаемости экспрессия EGFR
0 1+ 2+ 3+
ОВ, месяцы 27,6 25,1 24,5 20,6
ВБП, месяцы 13,3 11,8 11,1 10,7


ОВ при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 27,8 месяцев до 20,4 месяцев при отсутствии экспрессии VEGFR. ВБП при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 13,4 месяцев до 10,6 месяцев, соответственно (таблица 19).

Таблица 19

Показатели общей выживаемости

и выживаемости без прогрессирования в зависимости

от экспрессии VEGFR

Показатели выживаемости экспрессия VEGFR
0 1+ 2+ 3+
ОВ, месяцы 27,8 25,2 24,4 20,4
ВБП, месяцы 13,4 11,7 11,2 10,6






ВЫВОДЫ

  1. Экспрессия в образцах опухоли рецепторов эпидермального (EGFR) и сосудисто-эндотелиального (VEGFR) фактора роста в опухоли коррелировала со степенью морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия рецепторов ростовых факторов. Высокая степень экспрессии EGFR отсутствовала у больных с высокой степенью дифференцировки опухоли.
  2. Медиана жизни у больных колоректальным раком с высокой степенью экспрессии рецепторов ростовых факторов EGFR и VEGFR была короче, чем у больных с низкой экспрессией.
  3. Экспрессия маркера пролиферации антигена Ki-67 зависит от степени морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия антигена Ki-67. Экспрессия антигена Ki-67 коррелирует с экспрессией рецепторов ростовых факторов. Высокая пролиферативная активность клеток аденокарциномы толстого кишечника, исследованная с помощью Ki-67, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости.
  4. В сыворотке крови больных колоректальным раком до лечения и в процессе лечения обнаружены мутации в генах Р53, АРС, B-raf, C-kit, E-cadherin. При терапии таргетными препаратами общее количество мутаций снижается, а при схеме FOLFIRI – увеличивается.
  5. У групп больных проходивших лечение с добавлением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб наблюдалось увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования.
  6. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяца больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI + цетуксимаб.















Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Барышников А.Ю., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий и методы их коррекции // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия», М., 2008. – С. 56-57.
  2. Шайн А.А., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Антонов М. В. О возможности молекулярно-генетического тестирования онкологических больных // Восьмой съезд онкологов Армении. Ереван, 2008. – С.85-87.
  3. Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн А.А., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетический статус больных с фиброзно-кистозными мастопатиями. Стратегические подходы превентивной онкологии. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции по интервенционной маммологии. М.: «Сан-пресс», 2008. – С.121-125.
  4. Бычков В.Г., Шайн А.А., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Крылов Г.Г., Гадевич В.В., Антонов М. В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий на фоне описторхоза в процессе лечения индинолом // Тюменский медицинский журнал. – 2008. – №4. – С.39-41.
  5. Сабиров А.Х., Шайн А.А., Федоров Н.М., Антонов М. В., Важенина А.А.

Об использовании препарата «Промисан» в таргетной терапии онкологических больных. // Конференция онкологов Поволжья. Сборник тезисов. Казань, 2008. – С. 76-78.

  1. Сабиров А.Х., Шаназаров Н.А., Федоров Н.М., Шайн А.А., Гадевич В.В., Важенина А.А., Барышников А.Ю., Бычков В.Г., Нечай Е.Н., Барышников А.П., Кислый Д.Г., Антонов М.В. Стратегические подходы превентивной онкологии // Радиология – наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана, 2009. – С.33-37.
  2. Сабиров А.Х., Шаназаров Н.А., Антонов М. В. Нанотехнологии в медицине. // Радиология – наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана, 2009. – С.51-59.
  3. Сабиров А.Х., Налетов А.А., Важенина А.А., Антонов М.В., Симонов А.В., Велижанина О.С., Сироткина С.М. Современные методы диагностики злокачественной трансформации клетки // Вопросы онкологии. М., 2010. Т.56. –С.35
  4. Антонов М.В., Сабиров А.Х. Таргетная терапия колоректального рака. // Медицинская наука и образование Урала. 2011. №2. – С.44-47.
  5. Антонов М.В., Сабиров А.Х., Сабиров Т.М., Уткин К.В., Решетникова В.В., Барышников А.Ю. Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами. // Российский Биотерапевтический Журнал. 2011. №3. – С.24-30.














 





<


 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.