Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами
На правах рукописи
АНТОНОВ МАКСИМ ВИКТОРОВИЧ
Значение молекулярно-биологических маркеров
при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами
14.01.12 – онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата медицинских наук
Москва 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России
Научные руководители: | |
доктор медицинских наук, доцент | Сабиров Ахат Халимович |
Официальные оппоненты: | |
доктор медицинских наук, профессор | Петерсон Сергей Борисович |
доктор медицинских наук, | Ананьев Виталий Сергеевич |
Ведущая организация: | ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий |
Защита состоится « » __________ 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.001.17.01 РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН
по адресу: 115478 г. Москва, Каширское шоссе, д. 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Автореферат разослан «___»_______________ 2011 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета Д.001.17.01
профессор, доктор медицинских наук Ю.В. Шишкин.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Актуальной проблемой современной онкологии является колоректальный рак, занимающий третье место в структуре онкологической патологии. Неуклонный рост числа больных колоректальным раком обусловливает актуальность исследований, связанных с поиском путей оптимизации алгоритмов хирургического и комбинированного лечения последних [Аксель Е.M., Давыдов М.И., 2005].
В России ежегодно регистрируется 40 тысяч случаев рака толстой кишки. Умирает 31 тысяча больных. Средний показатель заболеваемости колоректальным раком составляет примерно 13,1 на 100 тысяч населения. Прослеживается стойкая тенденция к росту частоты развития опухолей этой локализации во всех развитых станах, в том числе и России. При этом отмечается значительное число случаев с поздней стадией заболевания, когда существенно затрудняется возможность выполнения радикального хирургического вмешательства и оказания полноценной медицинской помощи. Ведущей причиной поздней диагностики новообразований кишечника является разнообразие клинических форм заболевания и скудность их появлений на ранних стадиях, а как следствие – несвоевременное обращение больных за медицинской помощью.
За последние несколько десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, поддержания генетической стабильности, путей передачи сигнала и т.д. На сегодняшний день известно более 100 белков и/или генов, изменения которых находят в злокачественных клетка. Каждая опухоль является уникальной по набору нарушений, вовлеченных в процессы канцерогенеза.
Определение молекулярно-биологических маркеров в ткани опухоли может давать дополнительную информацию о биологическом поведении опухоли: о быстроте ее роста, способности к инвазии и метастазированию, устойчивости к химиопрепаратам [Степанова Е.В., 2009] Однако до сих пор не определены наиболее значимые молекулярно-биологические маркеры для прогнозирования течения заболевания и выбора обоснованной терапии.
В настоящее время большое внимание онкологов привлекают новые терапевтические подходы, базирующиеся на достижения молекулярной биологии. Разработаны препараты, направленные на блокирование различных белков-продуцентов онкогенов в опухолевых клетках (Герцептин, Лабатиниб, Цетуксимаб, Иресса, Тарцева, Гливек, Сутент, Авастин и др.). Результаты проведенных исследований демонстрируют существование принципиально нового этапа лечения злокачественных новообразований, основанного на определении мишени направленного действия препарата.
В настоящее время не изучено влияние таргетных препаратов на молекулярно-генетические маркеры опухолевых клеток, а также влияние молекулярно-генетических мутаций на чувствительность опухолевых клеток к таргетной терапии.
Цель исследования. Определить значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами.
Задачи исследования:
- Определить молекулярно-генетические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком до и в процессе лечения таргетными препаратами.
2. Определить клиническую значимость особенностей экспрессии молекулярно-генетических маркеров.
3. Оценить эффективность результатов лечения больных колоректальным раком с применением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб.
Научная новизна.
Впервые определены молекулярно-генетические маркеры в сыворотке крови больных колоректальным раком. Показано, что больные колоректальным раком имеют выраженные молекулярно-генетические нарушения. Наиболее часто встречаются мутации генов р53 в 6, 7 экзонах, APC, C-kit, E-cadherin. Впервые показано изменение некоторых молекулярно-генетических маркеров в процессе лечения больных таргетными препаратами. Добавление в лечение больных КРР таргетных препаратов улучшает молекулярно-генетический статус, увеличивает время до прогрессирования и общую выживаемость. Показано преимущество комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI. Обнаружена корреляция между степенью морфологической дифференцировки опухоли и экспрессией некоторых молекулярно-генетических маркеров. В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяц больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI+ цетуксимаб
Практическая значимость. Настоящая работа представляет практический интерес для оценки прогноза больных КРР и выбора схемы лечения.
Определение молекулярно-генетического статуса по образцам сыворотки крови больных (в отличие от образцов опухоли) позволяет проводить мониторинг изменений молекулярно-генетического статуса и прогнозировать течение заболевания.
Настоящее исследование показало преимущество терапии колоректального рака таргетными препаратами по сравнению со схемой FOLFIRI.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия» г. Москва, 2008.; Конференции онкологов Поволжья. Казань, 2008; на 3-ем Евразийском радиологическом форуме. Астана, 2009г., II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» г. Тюмень 26-28 сентября 2010 г. и на региональной онкологической конференции ЯНАО март 2011 г., совместной научной конференции кафедр: онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевой терапии, хирургии ФПК и ППС, патанатомии, гистологии и эмбриологии, оперативной хирургии и топографической анатомии, социальной гигиены и организации здравоохранения ГОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития РФ 12 апреля 2011 года.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику ГУ Курганского областного онкологического диспансера, ГЛПУ Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедре хирургических болезней с курсами эндоскопии, урологии и рентгенологии ГОУ ВПО «Тюменской государственной медицинской академии» Минздравсоцразвития России.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, 2 из них – в рецензируемых ВАК журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Текст иллюстрирован 15 таблицами, 2 диаграммами и 31 рисунком (в том числе микрофотографиями). Библиографический список включает 64 отечественных и 101 зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Работа основана на анализе клинических данных и результатов лабораторных методов диагностики 150 больных КРР, подвергшихся хирургическому лечению и получавших противоопухолевое лечение в Салехардской Окружной клинической больнице (главный врач Коган М.И).
Клиническая характеристика больных:
Средний возраст больных на момент постановки диагноза составил 56 ± 1,1 лет (от 29 до 75 лет), 71 мужчин и 79 женщины.
Общее состояние оценивалось по 5-ти балльной шкале ECOG. Соматический статус всех наблюдаемых на момент операции не превышал 2 баллов.
Во всех 150 наблюдениях диагноз злокачественного новообразования толстой кишки был верифицирован морфологическим способом, с использованием парафиновых блоков первичной опухоли данных больных.
В исследование были включены первичные больные, у которых в удаленной во время операции опухоли был определен «дикий» тип гена K-Ras, т.к. цетуксимаб не оказывает действия при мутации этого гена [Ahmed F.E. 2005].
У большинства больных – 93,3% (140 из 150) при морфологическом исследовании операционного материала была обнаружена аденокарцинома толстой кишки (АТК). Минимальное число больных – 6,7% (10 из 150) имело неоплазии кишечника со слизеобразованием. Опухоли по степени дифференцировки распределялись следующим образом: 23 – низко-, 115 – умеренно и 12 – высокодифференцированных новообразований.
Окончательная стадия заболевания и распространенность опухолевого процесса на зоны регионарного лимфооттока устанавливалась после патоморфологического анализа удаленного новообразования кишечника. При этом из общего числа рассматриваемых пациентов с КРР у 44% стадия заболевания согласно классификации Dukes соответствовала категории Dukes'C, а у 56% – Dukes'D.
Схемы лечения больных
Всем больным выполнен оперативный этап лечения – радикальная или циторедуктивная резекция ободочной или прямой кишки (правосторонняя гемиколэктомия, резекция поперечно-ободочной кишки, левосторонняя гемиколэктомия, резекция сигмовидной кишки, различные варианты резекции прямой кишки).
Больных разделили на 3 группы по 50 человек. В 1-й группе в послеоперационном периоде через 3-4 недели больные получали химиотерапию по схеме FOLFIRI (иринотекан – 180 мг/м2 в/в, капельно в 1-й день. Фолинат кальция (лейковорин) – 200 мг/м2 в/в, в 1-й день. Фторурацил – 400 мг/м2 в/в, струйно в 1-й день, затем Фторурацил – 2,4-3,0 г/м2 24-часовая в/в инфузия). Повторные курсы через 2 недели. Все больные получили 6 курсов химиотерапии.
Во второй группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом цетуксимаб. Гуманизированные моноклональные антитела цетуксимаб (МЕРК-Сироно) в/в 400мг/м2 в первое введение, в последующем по 250 мг/м2 один раз в неделю.
В третьей группе 50 пациентов получали химиотерапию FOLFIRI с таргетным препаратом бевацизумаб. Гуманизированные моноклональные антитела бевацизумаб (Ф. Хоффманн-Ля Рош Лтд.) в/в, 5мг /кг 1 раз в 3 недели.
Все больные после хирургического лечения на протяжении 5 лет и более находились под тщательным наблюдением с периодическим контрольным обследованием.
Оценка эффективности проводилась после каждого четного цикла цитостатической терапии, а также всего курса таргетной терапии в соответствии со стандартными критериями ВОЗ [Miller A. et al., 1981].
Иммуногистохимические следования
Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового иммунопероксидазного метода с моноклональными антителами, характеристика которых представлена в таблице 1. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).
Таблица 1
Характеристика использованных в исследовании антител
Антиген | Антитело, клон | Фирма | Рабочее разведение | Функция белка |
Ki-67 | Mouse mAb MIB-1 | Dako | RTU | Антиген клеточной пролиферации |
VEGF | Mouse mAb VG1 | Dako | 1:25 | Активатор ангиогенеза |
EGFR | Mouse mAb H11 | Dako | 1:200 | Рецепторная тирозинкиназа |
Оценку интенсивности иммуногистохимической реакции с рецепторами EGFR и VEGFR осуществляли согласно порядковой шкале:
0 – мембранное окрашивание отсутствует;
1+ – слабое окрашивание неполного периметра мембран выявляется более чем в 10% клеток;
2+ – окрашивание мембран средней интенсивности по всему периметру
выявляется более чем в 10% клеток;
3+ – интенсивное окрашивание мембран по всему периметру выявляется более чем в 10% клеток.
При иммуногистохимическом окрашивании с использованием моноклональных антител к антигену Ki-67 в опухолевых клетках наблюдался ядерный тип реакции в первичных и вторичных очагах опухолевого роста, частота выявления которого в исходной опухоли и ее метастазах различалась незначительно. Уровень экспрессии белка Кi-67 в различных опухолях варьировал в широких пределах. Пролиферативную активность оценивали как низкую, умеренную и высокую на основе следующих критериев:
- 0%-20% – низкая пролиферативная активность;
- 21%-50% – умеренная пролиферативная активность;
- 51%-100% – высокая пролиферативная активность.
Иммуноферментная диагностика сывороточных концентраций
EGFR и VEGFR.
Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич»-метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.
Определение мутационного статуса онкогенов в сыворотке крови. Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялась из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон) 560 кодон, APC (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13кодон+17кодон, p53 (5 экзон) 175 кодон, p53 (6 экзон), p53 (7 экзон) 248 кодон, p53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16.
Статистический анализ. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия X2 и непараметрического точного критерия Фишера для малых выборок. Различия между показателями считались статистически значимыми при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Иммуногистохимическое определение EGFR и VEGFR.
В большинстве случаев (146 из 150) у больных КРР в образцах опухоли обнаружили экспрессию EGFR. При высокой степени дифференцировки опухоли имелась низкая экспрессия антигена EGFR: 8 случаев с 1+, а у 4 пациентов отсутствовала полностью. При умеренной и низкой степени дифференцировки экспрессия антигена EGFR повышена.
В группе с низкодифференцированной АТК в 17 % экспрессия была 2+, в 83% экспрессия была 3+. Пациентов без экспрессии EGFR не было. Эти результаты статистически значимы (таблица 2).
Антиген VЕGFR также был экспрессирован у большинства больных (146 из 150). При этом, чем выше степень злокачественности, тем заметнее увеличение экспрессии сосудисто-эндотелиального факторов роста. При высокодифференцированной аденокарциноме в группе из 12 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 2+; у 9 – 1+; у 2 пациентов экспрессии не выявлено. При низко дифференцированной аденокарциноме в группе из 23 пациентов только у одного отмечалась экспрессия VEGFR 1+; у 3 – 2+; у 19 (что составляет 83%) – 3+. Больных без экспрессии VEGFR не выявлено
( таблица 3).
Таблица 2
Распределение больных КРР в зависимости
от степени дифференцировки опухоли и экспрессии EGFR в опухоли
Степень дифференцировки опухоли (n – кол-во пациентов) | Уровень экспрессии антигена EGFR | ||||
0 | 1+ | 2+ | 3+ | ||
Высокая (n=12) | n | *4 | *8 | 0 | 0 |
% | 33 | 67 | 0 | 0 | |
Умеренная (n=115) | n | 0 | 29 | *68 | 18 |
% | 0 | 25 | 59 | 16 | |
Низкая (n=23) | n | 0 | 0 | 4 | *19 |
% | 0 | 0 | 17 | 83 |
*– статистически достоверно, р<0,05
Таблица 3
Распределение больных КРР в зависимости
от степени дифференцировки опухоли и экспрессии VEGFR в опухоли
Степень дифференцировки опухоли (n – кол-во пациентов) | Уровень экспрессии антигена VEGFR | |||||
0 | 1+ | 2+ | 3+ | |||
Высокая (n=12) | n | 2 | 9 | 1 | 0 | |
% | 17 | 75 | 8 | 0 | ||
Умеренная (n=115) | n | 2 | * 25 | 64 | 24 | |
% | 1 | 22 | 56 | 21 | ||
Низкая (n=23) | n | 0 | * 1 | 3 | *19 | |
% | 0 | 4 | 13 | 83 |
*– статистически достоверно, р<0,05
Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67 в опухолевых клетках.
Уровень пролиферативной активности раковых клеток является ключевым фактором, определяющим потенциал злокачественности опухоли и агрессивность течения заболевания. В данном исследовании проведен анализ пролиферативной активности первичных аденокарцином толстой кишки с помощью оценки индексов пролиферации Кi-67 и сопоставления полученных данных с клинико-морфологическими факторами прогноза и показателями выживаемости больных КРР.
У большинства больных КРР выявлен высокий уровень пролиферативной активности Кi-67, при этом большой процент Кi-67 – позитивных клеток (>50%) отмечен в 33 случаях, умеренные индексы пролиферации (21%-50%) – в 105 случаях и низкий уровень пролиферации (< 20%) – в 12 случаях.
Экспрессия маркера наблюдалась в опухолях с различной степенью гистологической дифференцировки и, как правило, в меньшей степени была выражена в участках с секреторной активностью (слизеобразованием). Средний уровень экспрессии антигена Ki-67 прямо пропорционально коррелировал со степенью злокачественности КРР. В опухолях с более высоким уровнем злокачественности индекс Ki-67 был выше, чем в опухолях с более низким уровнем злокачественности (таблица 4).
Таблица 4
Распределение больных КРР в зависимости
от степени дифференцировки опухоли и значения индекса Ki-67
Степень дифференцировки опухоли (n – кол-во пациентов) | Уровень экспрессии антигена Ki-67 | ||
низкая пролиферативная активность < 20% (n=12) | умеренная пролиферативная активность 21-50% (n=105) | высокая пролиферативная активность > 50% (n=33) | |
Высокая (n=12) | *12 (100%) | 0 | 0 |
Умеренная (n=115) | 0 | *105 (91,3%) | 10 (8,7%) |
Низкая (n=23) | 0 | 0 | *23 (100%) |
Примечание: * – р<0,05
Изучение мутационного статуса больных КРР по образцам сыворотки крови.
Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений по образцам сыворотки крови, взятых до лечения и после 6-ти курсов химиотерапии. В сыворотке крови у больных определяли экспрессию ростовых факторов, количество мутаций в генах Р53, АРС, B-raf,
C-kit, E-cadherin.
При анализе экспрессии рецепторов ростовых факторов не было выявлено корреляции между уровнем экспрессии EGFR и степенью морфологической дифференцировкой опухоли. Однако, при изучении hVEGFR-165, обнаружено статистически достоверное снижение уровня экспрессии в зависимости от морфологической дифференцировки опухоли (чем ниже дифференцировка опухоли, тем выше уровень экспрессии сосудисто-эндотелиального фактора от 130 pg/ml. при высокодифференцированных аденокарциномах и до 174,7 pg/ml. при низкодифференцированных).
На фоне лечения больных КРР не обнаружили изменений в уровне ростового фактора EGFR (таблица 5).
С другой стороны, ростовой фактор VEGVR статистически значимо снижался в группе низкодифференцированных опухолей при лечении FOLFIRI+бевацизумаб (таблица 6).
Таблица 5
Уровень экспрессии ростового фактора EGFR в сыворотке крови в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли
Степень дифференцировки опухоли | EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) до лечения | EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI | EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ цетуксимаб | EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) FOLFIRI+ бевацизумаб |
Высокая | 10,8 | 9,8 | 9,6 | 9,3 |
Умеренная | 36,7 | 34,9 | 34,6 | 34,3 |
Низкая | 15,4 | 13,8 | 13,7 | 13,3 |
Таблица 6
Уровень экспрессии ростового фактора VEGFR в сыворотке крови
в зависимости от морфологической дифференцировкой опухоли
Степень дифференцировки опухоли | hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) до лечения | hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI | hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI+ цетуксимаб | hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) FOLFIRI+ бевацизумаб |
Высокая | 130,0 | 129,0 | 128,0 | 125,9 |
Умеренная | 168,0 | 164,0 | 165,0 | 161,3 |
Низкая | 174,7 | 140,9 | 143,9 | 139,2 |
Анализ экспрессии других молекулярно-генетических маркеров показал тенденцию к снижению количества мутаций по сравнению с долечебным уровнем при комбинации схемы FOLFIRI с таргетными препаратами, которое было статистически не значимо. После лечения стандартной схемой химиотерапии FOLFIRI, количество молекулярно-генетических мутаций несколько повышалось. С применением таргетных препаратов картина меняется. Отмечается стойкая тенденция к снижению уровня мутации гена р53 в 6,7,8 экзонах, АРС, Е-кадхерина. Однако, эти изменения также статистически не значимы. Но при анализе общего количества мутаций обнаружили статистически значимые различия между группой больных получавших FOLFIRI+ бевацизумаб и другими группами (р<0,05). При анализе среднего количества мутаций на одного пациента отмечено снижение с 2,78 до 1,5 (таблица 7).
Таблица 7
Изменения молекулярно-генетических маркеров у больных КРР
на фоне лечения по разным схемам
Количество мутаций | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | ||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 кодон | B-raf 15 кодон | APC | E-cad-herin | р16 | ||
до лечения (n-150) % | *42 | 68 | 109 | 59 | 21 | 1 | 35 | 47 | 35 | ***417 ****2,78 |
**28 | 45,3 | 72,7 | 39,3 | 14 | 0,7 | 23,3 | 31,3 | 23,3 | ||
FOLFIRI (n-50) % | 15 | 26 | 43 | 21 | 7 | 1 | 13 | 18 | 14 | 158 3,16 |
30 | 52 | 86 | 42 | 14 | 2 | 26 | 36 | 28 | ||
FOLFIRI + цетуксимаб (n-50) % | 11 | 19 | 24 | 17 | 6 | - | 8 | 12 | 9 | 106 2,12 |
22 | 38 | 48 | 34 | 12 | - | 16 | 24 | 18 | ||
FOLFIRI + бевацизумаб (n-50) % | 7 | 12 | 21 | 13 | 3 | - | 6 | 9 | 5 | 76 1,5 |
14 | 24 | 42 | 26 | 6 | - | 12 | 18 | 10 |
* – количество больных с данной мутацией;
** – процент больных с данной мутацией;
*** – общее количество мутаций;
**** – количество мутаций на 1 больного.
Анализ генетических мутаций в зависимости от степени дифференцировки опухоли.
Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений в зависимости от гистологической дифференцировки опухоли.
В группе больных, обследованных до лечения видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных КРР с умеренной и низкой степенью дифференцировки опухоли. При этом преобладает мутация гена р53 в 7ех. Количество мутаций на 1 больного в группе с низкодифференцированной АТК составляет 4, тогда, как при умеренно-дифференцированной и высокодифференцированной АТК 2,9 и 2,5 соответственно (таблица 8).
Таблица 8
Молекулярно-генетический статус больных КРР
в зависимости от дифференцировки опухоли до лечения (n=150)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 кодо-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n-12) | 4 *33 | 4 33 | 9 75 | 8 67 | 2 17 | 0 | 3 25 | 0 | 4 33 | 1 8 | 35 **2,9 |
Умеренная (n-115) | 27 24 | 54 47 | 79 69 | 42 37 | 12 10 | 0 | 18 16 | 0 | 32 28 | 26 23 | 290 2,5 |
Низкая (n-23) | 11 48 | 10 44 | 21 91 | 9 39 | 7 30 | 1 4 | 14 61 | 0 | 11 48 | 8 35 | 92 4 |
* – процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
Далее мы провели анализ изменения молекулярно-генетических маркеров до лечения и после лечения по группам.
Было обнаружено, что у 50 больных, подвергшихся в последствии терапии FOLFIRI, в процессе лечения, произошли изменения. Общее количество мутации на 1 пациента увеличилось (таблицы 9, 10), особенно в группе низкодифференцированных опухолей.
Таблица 9
Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения
группа FOLFIRI (n=50)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12, 13 ко- до-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 1 *25 | 1 25 | 3 75 | 3 75 | 1 25 | 0 | 1 25 | 0 | 2 50 | 0 | 12 **3 |
Умеренная (n=38) | 9 24 | 18 47 | 26 68 | 14 37 | 4 11 | 0 | 6 16 | 0 | 10 26 | 9 24 | 96 2,5 |
Низкая (n=8) | 4 50 | 3 38 | 7 88 | 3 38 | 2 25 | 1 13 | 5 63 | 0 | 4 50 | 2 25 | 31 3,9 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
Таблица 10
Молекулярно-генетический статус больных КРР
после 6-ти курсов FOLFIRI (n=50)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – колво пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 ко до-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 1 *25 | 1 25 | 3 75 | 2 50 | 0 | 0 | 1 25 | 0 | 2 50 | 0 | 10 **2,5 |
Умеренная (n=38) | 9 ***24 | 21 55 | 32 84 | 15 40 | 4 11 | 0 | 8 21 | 0 | 12 32 | 10 26 | 111 2,9 |
Низкая (n=8) | 5 63 | 4 50 | 8 100 | 4 50 | 3 38 | 1 13 | 4 50 | 0 | 4 50 | 4 50 | 37 4,6 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного;
***– статистически достоверно, р<0,05.
В группе больных, получавших FOLFIRI + цетуксимаб, общее количество мутации на 1 пациента снизилось: 2,8 до 2 в группе высокодифференцированных; с 2,6 и 2,1 в группе умеренно-дифференцированных; с 3,9 до 2,3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 11, 12).
Таблица 11
Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения
FOLFIRI + цетуксимаб (n=50)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 кодо-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 1 *25 | 2 50 | 3 75 | 2 50 | 1 25 | 0 | 1 25 | 0 | 1 25 | 0 | 11 **2,8 |
Умеренная (n=38) | 9 24 | 18 47 | 26 68 | 14 37 | 4 11 | 0 | 6 16 | 0 | 11 29 | 9 24 | 97 2,6 |
Низкая (n=8) | 4 50 | 3 36 | 7 88 | 3 36 | 3 36 | 0 | 4 50 | 0 | 4 50 | 3 36 | 31 3,9 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
Таблица 12
Молекулярно-генетический статус больных КРР
после 6-ти курсов FOLFIRI + цетуксимаб (n=50)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 кодо-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 1 *25 | 0 | 3 75 | 2 50 | 0 | 0 | 1 25 | 0 | 1 25 | 0 | 8 **2 |
Умеренная (n=38) | 7 18 | 16 42 | 20 53 | 12 32 | 3 8 | 0 | 4 11 | 0 | 9 24 | 7 18 | 78 2,1 |
Низкая (n=8) | 3 38 | 3 38 | 5 63 | 3 38 | 3 38 | 0 | 4 50 | 0 | 3 38 | 2 25 | 26 2,3 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
В группе больных, получавших FOLFIRI + бевацизумаб, общее количество мутации на 1 пациента также снизилось: с 2,7 до 1,5 в группе высокодифференцированных; с 2,5 до 1,8 в группе умеренно-дифференцированных; с 4,3 до 3 в группе низкодифференцированных АТК (таблицы 13, 14).
Таблица 13
Молекулярно-генетический статус больных КРР до лечения
группа FOLFIRI + бевацизумаб (n=50)
Степень дифферен- цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мута-ций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 кодо-ны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 2 *50 | 1 25 | 3 75 | 3 75 | 0 | 0 | 1 25 | 0 | 1 25 | 0 | 11 **2,7 |
Умеренная (n=39) | 9 23 | 18 46 | 27 69 | 14 36 | 4 10 | 0 | 6 15 | 0 | 11 28 | 8 21 | 97 2,5 |
Низкая (n=7) | 3 43 | 4 57 | 7 100 | 3 43 | 2 29 | 0 | 5 71 | 0 | 3 43 | 3 43 | 30 4,3 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
Таблица 14
Молекулярно-генетический статус больных КРР
после 6-ти курсов FOLFIRI + бевацизумаб (n=50)
Степень дифферен-цировки опухолевых клеток (n – кол-во пациентов) | Исследуемые гены ДНК | Общее коли-чество мутаций | |||||||||
р53 5 эк-зон | р53 6 эк-зон | р53 7 эк-зон | р53 8 эк-зон | C-kit 12 ко-дон | B-raf 15 ко-дон | APC | K-ras 12,13 кодоны | E-cad-herin | р16 | ||
Высокая (n=4) | 0 | 0 | 3 75 | 2 50 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 25 | 0 | 6 **1,5 |
Умеренная (n=39) | 6 *15 | 12 31 | 19 49 | 11 28 | 2 5 | 0 | 5 13 | 0 | 8 21 | 7 18 | 70 1,8 |
Низкая (n=7) | 3 43 | 3 43 | 6 86 | 3 43 | 2 29 | 0 | 3 43 | 0 | 2 29 | 3 43 | 22 3 |
*– процент мутации в группе;
** – количество мутаций на 1 больного.
Снижение общего числа мутаций в группе больных получавших FOLFIRI + бевацизумаб при низкодифференцированных опухолях было статистически значимым по сравнению с получавшими FOLFIRI и до лечения.
Анализ выживаемости больных
В группе пациентов, получавших химиотерапию (ХТР) по схеме FOLFIRI, частота объективных ответов составила 54%, время до прогрессирования – 10,9 месяцев и продолжительность жизни – 20,6 месяцев.
В группе пациентов, получавших ХТР по схеме FOLFIRI + цетуксимаб, частота объективных ответов составила 57%, время до прогрессирования – 11,4 месяцев и продолжительность жизни – 26,1 месяцев.
В группе пациентов, получавших ХТР по схеме FOLFIRI + бевацизумаб, частота объективных ответов – 57,9%, время до прогрессирования – 13,5 месяцев и продолжительность жизни – 27,7 месяцев (таблица 15).
Таблица 15
Показатели общей выживаемости (ОВ)
и выживаемости без прогрессирования (ВБП)
Показатели выживаемости | FOLFIRI (n=50) | FOLFIRI + цетуксимаб (n=50) | FOLFIRI + бевацизумаб (n=50) |
ОВ, месяцы | 20,6 | 26,1 | 27,7 |
ВБП, месяцы | 10,9 | 11,4 | 13,5 |
Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).
При анализе данных по ОВ и ВБП выявлено, что схемы лечения больных КРР FOLFIRI + цетуксимаб и FOLFIRI + бевацизумаб увеличивают медиану времени до прогрессирования с 10,9 до 11,4 месяцев и с 10,9 до 13,5 месяцев; медиану ОВ – с 20,6 до 26,1 месяцев и с 20,6 до 27,7 месяцев по сравнению со схемой FOLFIRI без добавления таргетных препаратов (см. диаграммы 1, 2).
Диаграмма 1
Общая выживаемость больных КРР
Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)
Диаграмма 2
Выживаемость больных КРР без прогрессирования
Примечание: статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)
Добавление бевацизумаба, цетуксимаба к химиотерапии достоверно улучшает время до прогрессирования, и продолжительность жизни больных. Терапия моноклональными антителами должна проводиться максимально долго, до прогрессирования.
Анализ выживаемости показал, что лечение больных по схеме FOLFIRI менее эффективно, чем лечение с таргетными препаратами. Эффективность схемы FOLFIRI + бевацизумаб оказалась выше, чем FOLFIRI + цетуксимаб. Среди исследованных молекулярно-генетических маркеров, информативную значимость имеет Ki-67, EGFR и VEGFR, которые коррелируют с морфологической дифференцировкой опухоли, а также с общим количеством мутаций, выявленных по сыворотке крови.
При высокой пролиферативной активности опухоли, определенной по экспрессии Ki-67, отмечается уменьшение ОВ с 27,7 месяцев, до 21,8 месяцев в отличие от низкой степени пролиферативной активности и ВБП с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев соответственно (таблица 16).
Таблица 16
Показатели общей выживаемости (ОВ) и выживаемости без прогрессирования (ВБП) в зависимости от значения индекса Ki-67
Показатели выживаемости | Низкая пролиферативная активность < 20% (n=12) | Умеренная пролиферативная активность 21-50% (n=105) | Высокая пролиферативная активность > 50% (n=33) |
ОВ, месяцы | 27,7 | 24,9 | 21,8 |
ВБП, месяцы | 13,3 | 11,8 | 10,7 |
Анализ ОВ и ВБП в зависимости от степени дифференцировки опухоли показал, что при более низкой степени дифференцировки опухоли ОВ уменьшается с 27,8 месяцев при высокой степени дифференцировки до 21,9 месяцев при низкой степени дифференцировки и ВБП с 13,1 месяцев до 10,8 месяцев соответственно (таблица 17).
Таблица 17
Показатели общей выживаемости (ОВ) и выживаемости без прогрессирования (ВБП) в зависимости
от степени дифференцировки опухоли
Показатели выживаемости | Высокая (n=12) | Умеренная (n=115) | Низкая (n=23) |
ОВ, месяцы | 27,8 | 24,7 | 21,9 |
ВБП, месяцы | 13,1 | 11,9 | 10,8 |
ОВ при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 27,6 месяцев до 20,6 месяцев при отсутствии экспрессии EGFR. ВБП при гиперэкспрессии EGFR уменьшается с 13,3 месяцев до 10,7 месяцев, соответственно (таблица 18).
Таблица 18
Показатели общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования в зависимости от экспрессии EGFR
Показатели выживаемости | экспрессия EGFR | |||
0 | 1+ | 2+ | 3+ | |
ОВ, месяцы | 27,6 | 25,1 | 24,5 | 20,6 |
ВБП, месяцы | 13,3 | 11,8 | 11,1 | 10,7 |
ОВ при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 27,8 месяцев до 20,4 месяцев при отсутствии экспрессии VEGFR. ВБП при гиперэкспрессии VEGFR уменьшается с 13,4 месяцев до 10,6 месяцев, соответственно (таблица 19).
Таблица 19
Показатели общей выживаемости
и выживаемости без прогрессирования в зависимости
от экспрессии VEGFR
Показатели выживаемости | экспрессия VEGFR | |||
0 | 1+ | 2+ | 3+ | |
ОВ, месяцы | 27,8 | 25,2 | 24,4 | 20,4 |
ВБП, месяцы | 13,4 | 11,7 | 11,2 | 10,6 |
ВЫВОДЫ
- Экспрессия в образцах опухоли рецепторов эпидермального (EGFR) и сосудисто-эндотелиального (VEGFR) фактора роста в опухоли коррелировала со степенью морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия рецепторов ростовых факторов. Высокая степень экспрессии EGFR отсутствовала у больных с высокой степенью дифференцировки опухоли.
- Медиана жизни у больных колоректальным раком с высокой степенью экспрессии рецепторов ростовых факторов EGFR и VEGFR была короче, чем у больных с низкой экспрессией.
- Экспрессия маркера пролиферации антигена Ki-67 зависит от степени морфологической дифференцировки опухоли. Чем ниже была степень дифференцировки опухоли, тем выше экспрессия антигена Ki-67. Экспрессия антигена Ki-67 коррелирует с экспрессией рецепторов ростовых факторов. Высокая пролиферативная активность клеток аденокарциномы толстого кишечника, исследованная с помощью Ki-67, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости.
- В сыворотке крови больных колоректальным раком до лечения и в процессе лечения обнаружены мутации в генах Р53, АРС, B-raf, C-kit, E-cadherin. При терапии таргетными препаратами общее количество мутаций снижается, а при схеме FOLFIRI – увеличивается.
- У групп больных проходивших лечение с добавлением таргетных препаратов бевацизумаб и цетуксимаб наблюдалось увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования.
- В процессе исследования, схема химиотерапии FOLFIRI + бевацизумаб показала себя более эффективной по сравнению с FOLFIRI + цетуксимаб. При сравнении этих схем медиана выживаемости на 1,7 месяца больше при применении FOLFIRI + бевацизумаб, чем при FOLFIRI + цетуксимаб.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Барышников А.Ю., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий и методы их коррекции // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия», М., 2008. – С. 56-57.
- Шайн А.А., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Антонов М. В. О возможности молекулярно-генетического тестирования онкологических больных // Восьмой съезд онкологов Армении. Ереван, 2008. – С.85-87.
- Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн А.А., Важенина А.А., Антонов М.В. Молекулярно-генетический статус больных с фиброзно-кистозными мастопатиями. Стратегические подходы превентивной онкологии. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции по интервенционной маммологии. М.: «Сан-пресс», 2008. – С.121-125.
- Бычков В.Г., Шайн А.А., Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Крылов Г.Г., Гадевич В.В., Антонов М. В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий на фоне описторхоза в процессе лечения индинолом // Тюменский медицинский журнал. – 2008. – №4. – С.39-41.
- Сабиров А.Х., Шайн А.А., Федоров Н.М., Антонов М. В., Важенина А.А.
Об использовании препарата «Промисан» в таргетной терапии онкологических больных. // Конференция онкологов Поволжья. Сборник тезисов. Казань, 2008. – С. 76-78.
- Сабиров А.Х., Шаназаров Н.А., Федоров Н.М., Шайн А.А., Гадевич В.В., Важенина А.А., Барышников А.Ю., Бычков В.Г., Нечай Е.Н., Барышников А.П., Кислый Д.Г., Антонов М.В. Стратегические подходы превентивной онкологии // Радиология – наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана, 2009. – С.33-37.
- Сабиров А.Х., Шаназаров Н.А., Антонов М. В. Нанотехнологии в медицине. // Радиология – наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического форума. Астана, 2009. – С.51-59.
- Сабиров А.Х., Налетов А.А., Важенина А.А., Антонов М.В., Симонов А.В., Велижанина О.С., Сироткина С.М. Современные методы диагностики злокачественной трансформации клетки // Вопросы онкологии. М., 2010. Т.56. –С.35
- Антонов М.В., Сабиров А.Х. Таргетная терапия колоректального рака. // Медицинская наука и образование Урала. 2011. №2. – С.44-47.
- Антонов М.В., Сабиров А.Х., Сабиров Т.М., Уткин К.В., Решетникова В.В., Барышников А.Ю. Значение молекулярно-биологических маркеров при лечении больных колоректальным раком таргетными препаратами. // Российский Биотерапевтический Журнал. 2011. №3. – С.24-30.