Гомеостатическая пролиферация в развитии аутоиммунной патологии, индуцированной хронической реакцией трансплантат против хозяина

На правах рукописи

ГОЙМАН

Елена Владимировна

ГОМЕОСТАТИЧЕСКАЯ ПРОЛИФЕРАЦИЯ

В РАЗВИТИИ АУТОИММУННОЙ ПАТОЛОГИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ХРОНИЧЕСКОЙ РЕАКЦИЕЙ «ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА»

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Новосибирск – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН Владимир Александрович Козлов

Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Валерий Степанович Ширинский

доктор медицинских наук, профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина

Ведущее учреждение:

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН (634028, г.Томск, пр. Ленина, 3).

Защита состоится «19» января 2012 г. года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при Научно-исследовательском институте клинической иммунологии СО PАМН по адресу:630099, г.Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН.

Автореферат разослан «29» ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Ольга Петровна Колесникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные заболевания возникают вследствие патологических иммунных реакций против собственных тканей организма и представляют собой разнородную по клиническим проявлениям группу, в на­стоящее время включающую более 80 различных аутоиммунных синдромов, которыми болеет по разным данным до 8% населения планеты [Diamond B., 2005; Fairweather D. et al.,2008; Kunz M. and Saleh I.,2009]. Патогенез развития аутоиммунных заболеваний очень сложен, во многом не ясен и может быть обу­словлен перекрёстной реакцией против собственных антигенов при ответе на инфекционные агенты, изменением антигенной структуры тканей так, что она становится иммуногенной для собственной иммунной системы, нарушением проницаемости гисто-гематических барьеров, иммунным дисбалансом с нару­шением функциональной активности регуляторных субпопуляций лимфоцитов, а также другими причинами [Paust S. and Canton H., 2005; Goodnow G. et al, 2007; Invernizzi P., 2007; Ercolini A. and Miller S., 2008].

Показано, что при лимфопении, вызванной самыми различными факторами (облучением, введением цитотоксических препаратов, различными заболева­ниями), для компенсаторного устранения количественного дефицита лимфоци­тов происходит включение их пролиферации на периферии. Этот процесс полу­чил название гомеостатической пролиферации (ГП), или «пролиферации, инду­цированной лимфопенией» [Khoruts A. et al., 2005]. Гомеостатическая пролифе­рация в ответ на снижение числа соответствующих клеток свойственна всем популяциям лимфоцитов (Т-, В- и NK-клеткам), но требует наличия различных сигналов. Так, необходимым условием гомеостатической пролиферации наив­ных CD4+ Т-клеток является высокая концентрация IL-7 и распознавание ком­плексов МНС с собственными пептидами, при этом интенсивность пролифера­ции находится в прямой зависимости от авидности взаимодействия. В то же время, считается, что гомеостатическая пролиферация CD4+ Т-клеток памяти поддерживается IL-7, IL-15 и менее зависит от распознавания аутопептидов [Goldrath A. W. et al., 2002; Woodland R.T. et al., 2005; Baccala R. et al., 2005; Lee S. et al., 2005].

Характерными признаками ГП являются: 1) наличие лимфопении; 2) присутствие IL-7; 3) дифференцировка наивных клеток в клетки памяти, сопровождающаяся соответствующей сменой фенотипа; 4) выраженная экспансия клеточных элементов [Fry T. and Mackall C., 2005].

Процесс ГП приводит к снижению разнообразия распо­знающих антигены рецепторов и появлению в значимом количестве аутореак­тивных эффекторных клеток, что подтверждается клиническими и эксперимен­тальными исследованиями. Показано, что при многих аутоиммунных заболева­ниях наблюдается лимфопения (ревматоидный артрит, СКВ, диабет I типа) [Schulze-Koops H,. 2004; Datta S. and Sarvetnick N., 2009]. Известно также, что летальное облучение, химиотера­пия, вирусная инфекция, иммуносупрессивная терапия сопровождаются лим­фопенией и параллельным увеличением частоты развития аутоиммунных рас­стройств [Theofilopoulos A.N. et al., 2001; King C. et. al., 2004; Kieper W.C. et al., 2005; Marleau A. et al., 2005]. Таким образом, в настоящее время гомеостатиче­ская пролиферация лимфоцитов рассматривается в качестве одного из возмож­ных механизмов возникновения аутоиммунных заболеваний [Ярилин А. А., 2004; Baccala R. et al., 2005; Marleau A.M. et al., 2005; Krupica T. et al., 2006].

Хроническая реакция трансплантат против хозяина (хРТПХ) является классической экспериментальной моделью аутоиммунных заболеваний человека, позволяющей изучать механизмы формирования иммунопатологических про­цессов и разрабатывать схемы корригирующей терапии [Козлов В.А. и др., 2002; Murphy W.J., 2000; Slayback D.L. et al., 2000]. Гомеостатическая пролифера­ция лимфоцитов может быть одним из факторов возникновения аутоиммунной патологии при хРТПХ.

Целью настоящего исследования являлось изучение процесса гомеостати­ческой пролиферации при развитии аутоиммунной патологии, в модели хро­нической РТПХ.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить морфо-функциональные параметры реципиентов для характери­стики аутоиммунной патологии, индуцированной хронической РТПХ.
2. Исследовать параметры иммунной системы, характерные для процесса го­меостатической пролиферации, в динамике хронической РТПХ, приводящей к аутоиммунной патологии.
3. Оценить влияние препаратов, изменяющих частоту развития аутоиммун­ной патологии при хронической РТПХ, на выраженность лимфопе­нии и гомеостатической пролиферации у реципиентов.
4. Исследовать возможность компенсации лимфопении после транспланта­ции сингенных лимфоцитов при аутоиммунной патологии в мо­дели хронической РТПХ.

Научная новизна работы

Обнаружено, что ранние этапы хронической РТПХ сопровождаются возрастанием концен­трации IL-7 в периферической крови реципиентов, которая остаётся на повы­шенном уровне у lupus-мышей с развившимся аутоиммунным гломерулонефри­том. На начальных стадиях развития хРТПХ также отмечается повышение аб­солютного содержания наивных клеток (CD45RBhigh) и клеток памяти (СD45RBlow) среди СD4+- и СD8+-лимфоцитов селезёнки, при этом несмотря на увеличение обеих субпопуляций соотношение сдвинуто в сторону клеток па­мяти, что является признаком гомеостатической пролиферации Т-лимфоцитов. Такое изменение субпопуляционного состава сохраняется у реципиентов после окончательного формирования клинических исходов; возрастание количества Т-лимфоцитов с фенотипом клеток памяти CD4+CD45RBlow и CD8+CD45RBlow в селезёнке более выражено у мышей с развившимся аутоиммунным гломеруло­нефритом.

Показано, что формирование аутоиммунного гломерулонефрита в данной модели связано с развитием лимфопении на ранних этапах хРТПХ. Введение дегидроэпиандростерона сульфата сокращает длительность лимфопении и сни­жает частоту возникновения аутоиммунного поражения почек по сравнению с введением мурамилдипептида, усиливающим развитие аутоиммунной патоло­гии при хронической РТПХ.

Морфологическое исследование почек экспериментальных животных с ин­дуцированной хРТПХ подтвердило наличие выраженного аутоиммунного гломерулонефрита в группе lupus-реципиентов и возможность её коррекции летальным облучением с последующим введением клеток сингенного костного мозга.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Процесс гомеостатической пролиферации впервые обнаружен при развитии аутоиммунной патологии, вызванной хронической реакцией «трансплантат про­тив хозяина». Индук­ция хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2(C57BL/6xDBA/2)F1 может служить экспериментальной моделью для изучения закономерностей гомеостатической пролиферации и возможности её регуляции.

Установленная сопряжённость развития лимфопении и гомеостатической пролиферации при хронической РТПХ является основой для разработки в дальнейшем новых критериев прогноза возникновения и развития аутоиммун­ной патологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Лимфопения на ранних стадиях хронической РТПХ в полуаллогенной сис­теме DBA/2(C57BL/6xDBA/2)F1 сопряжена с формированием аутоиммунного гломерулонефрита.

2. Гомеостатическая пролиферация Т-лимфоцитов является важным призна­ком развития аутоиммунной патологии, индуцированной хронической РТПХ.

Личный вклад автора в проведение исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на от­четных сессиях Института клинической иммунологии СО РАМН (2006 и 2011 г.г,); Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммуноло­гии в Сибири» (Омск 2007 г., Томск 2008 г., Красноярск 2010 г., Абакан 2011 г.); на II Объединенном иммунологическом форуме РААКИ и РНОИ (г. Санкт-Петербург 2008 г.). Апробация диссертации состоялась 21 апреля 2011г. на се­минаре Института клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК для публикации мате­риалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 121 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками и 10 табли­цами. Список литературы включает 228 источников (13 отечественных и 215 зарубежных).

Работа выполнена на базе лаборатории экспериментальной иммунотерапии отдела экспериментальной иммунологии Института клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В работе использовали мышей гибридов первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)F1 (B6D2F1), самок; мышей линий DBA/2 самок; полученных из лаборатории экспериментальных животных (моделей) НИИКИ СО РАМН (г. Новосибирск). В опытах использовались мыши в возрасте 2 - 8 месяцев. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Клетки и органы выделяли по стандартным методикам [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Индукцию хронической РТПХ у мышей осуществляли путём переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2. Клетки селе­зёнки, выделенных ex temporo, внутривенно вводили реципиентам в дозе 60-70x106 клеток двукратно с интервалом в 5 дней [Kimura M. et al., 1987]. В каче­стве контрольной группы использовали интактных животных того же генотипа, пола, возраста, что и в опыте.

Количество кроветворных клеток-предшественников определяли мето­дом экзогенного колониеобразования в селезёнках летально облученных син­генных реципиентов и с использованием 0,9% метилцеллюлозной культуры (MethoCult M3450 «Stem Cell Technologies»); для оценки числа клеток в S-фазе использовали цитозин-арабинозид [Гольдберг Е.Д. и др.,1992].

Для морфометрии применяли квадратную тестовую систему, совмещаемую на экране компьютера с изображением, полученным при помощи цифровой ви­деокамеры микроскопа. При использовании объектива с увеличением Х10 ко­нечная площадь тестового квадрата была равна 625 мкм2 (сторона квадрата 25 мкм), при использовании объектива с увеличением Х25 – 100 мкм2 (сторона квадрата 10 мкм), при использовании объектива с увеличением Х40 – 36 мкм2 (сторона квадрата 6 мкм).

Методом проточной цитофлуориметрии определяли содержание субпо­пуляций лимфоцитов в клеточной суспензии селезёнки определяли, используя антитела к поверхностным маркёрам мыши CD4, CD8, CD19, CD22 и CD45RBlow/high, конъюгированные с FITC и PE (Becton Dickinson, США), с по­мощью проточного цитометра FACSCalibur по программе CellQuest (Becton Dickinson, США).

Определение средней длины теломерных районов ДНК проводили методом гибридизации in situ Flow-FISH, с последующим анализом на проточном цитоф­луориметре. Мышиные спленоциты, отмытые забуференным физиологическим раствором, разносили в разные пробирки и метили биотинилированными анти­телами против CD19+. На клеточном сортере FACSAria (Becton Dickinson, США) при помощи бус (Accudrop, Becton Dickinson, США) выделяли отдельно CD4+- и CD8+ - субпопуляции, которые метили биотинилированными антите­лами против CD45RB. Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США), с помощью программного обеспечения Cell QuestPRO (Becton Dickinson, США). Сигнал флуоресценции теломер иссле­дуемых клеток определяли как средний уровень флуоресценции клеток, нахо­дящихся в G0/G1 фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресцен­ции.

Концентрацию IL-7, IL-15 в периферической крови определяли твёрдо­фазным вариантом метода иммуноферментного анализа (R&D Systems, Minne­apolis, MN).

Содержание антител к дцДНК определяли методом иммунофермент­ного анализа с помо­щью меченного пероксидазой хрена конъюгата и о-фенилендиамина в качестве субстрата [Кэтти Д. and Райкундалиа Ч., 1991]. Интенсивность реакции оценивали на многоканальном спектрофото­метре «Multiskan» при =492 nm. Результаты выражали в единицах оптической плотности (OD опытного образца - OD контроля).

Облучение животных проводили на аппарате РУМ-150/30-101 при мощ­ности дозы 0.5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10мА, фильтре А1-3.2.12.

Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Ку­масси бриллиантовый синий [Bradford M.M., 1976]. Калибровочную кривую строили по бычьему сывороточному альбумину (100-1000 мкг/мл), результаты (среднее двух измерений) выражали в мг/мл. О развитии гломерулонефрита су­дили по появлению стойкой протеинурии (не менее 3 мг/мл в двух последова­тельных измерениях).

Статистическую обработку результатов проводили методами непара­метрической статистики с использованием критериев U Вилкоксона-Манна-Уитни и -критерия для сравнения выборочных долей вариант [Гублер Е.В., 1978; Урбах В.Ю., 1963].

На рисунках и в таблицах результаты экспериментов представлены в виде средних значений измеряемых параметров (М); кроме специально оговоренных случаев, отмечены достоверные различия (p<0.05): * - между контрольной и опытной группой; # - между опытными группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфо-функциональная характеристика реципиентов с аутоиммун­ным заболеванием почек в модели хронической РТПХ

К одной из широко используемых в последние годы моделей относится хРТПХ в полуаллогенной системе DBA/2(C57Bl/6xDBA/2)F1 [Козлов В.А. и др., 2002; Gleichmann E. et al.,1984; Murphy W.J., 2000; Slayback D.L. et al., 2000], которая приводит к поликлональной активации В-лимфоцитов реципиента, продукции аутоантител разной специфичности, в том числе антител к ДНК, образованию иммунных комплексов, их отложению в капиллярной сети клубочков и, в конечном итоге, к развитию у реципиентов аутоиммунного гломерулонефрита, по ряду признаков аналогичного нефриту при системной красной волчанке [Kimura M. et al., 1987]. Детальное изучение хРТПХ, индуцированной в данной полуаллогенной системе, показало, что она может развиваться по двум альтернативным вариантам: Th1- и Th2-зависимому пути. Данные варианты включают различные иммунопатологические процессы и приводят к разным клиническим проявлениям. Так, при Th2-варианте развивается аутоиммунное поражение почек, протекающее по типу иммунокомплексного гломерулонефрита, тогда как Th1-ассоциированный вариант приводит к выраженному подавлению гуморального звена иммунитета и не сопровождается поражением почек [Козлов В. А., 2002].

Морфологическое изучение почек реципиентов в настоящей работе показало наличие у lupus-реципиентов значительных по размерам лейкоцитарных инфильтратов, в которых наряду с лимфоцитами и макрофагами представлены в значительном количестве плазматические клетки. Все патологические изменения у lupus-мышей свидетельствуют об остром активном гломерулонефрите, протекающем длительное время, о чём свидетельствуют различный клеточный состав лейкоцитарных инфильтратов, большое количество цилиндров, деструктивные изменения клубочков и отсутствие признаков снижения активности (преобладание лимфоцитов и макрофагов в цитограмме большинства инфильтратов) или перехода процесса в хронический (отсутствие признаков склероза). Подобная картина не характерна для nonlupus-мышей. Летальное облучение lupus-реципиентов с последующим введением животным клеток сингенного костного мозга уже через 1 месяц приводит к снижению концентрации белка в моче, уровень которого через 6 месяцев не отличается от контрольных значений (рис. 1). Коррекция клинических проявлений гломерулонефрита сопровождается исчезновением антител к ДНК класса IgG из периферической крови (рис. 2). Кроме того, наблюдается резкое снижение количества плазматических клеток в лейкоцитарных инфильтратах коркового вещества почки, в большом количестве присутствующих у lupus-мышей; после корригирующей терапии их количество практически не отличается от значений контрольной группы.

Рис.1. Концентрация белка в моче экспериментальных животных

Число животных в группах – 10. Группа lupus до лечения – 3 месяца после индукции хРТПХ; группа lupus после лечения – 6 месяцев после летального облучения и введение сингенного костного мозга. * - по сравнению контролем и lupus до лечения; # - по сравнению lupus до лечения и lupus после лечения.

Рис.2. Уровень анти-ДНК антител в крови экспериментальных животных

Число животных в группах – 10. Группа lupus до лечения – 3 месяца после индукции хРТПХ; группа lupus после лечения – 6 месяцев после летального облучения и введение сингенного костного мозга. * - по сравнению с контролем и lupus до лечения; # - по сравнению lupus до лечения и lupus после лечения.

Летальное облучение lupus-реципиентов и последующее введение им клеток сингенного костного мозга приводит к ослаблению выраженности морфологических признаков поражения почечной ткани и исчезновению клинических проявлений гломерулонефрита – протеинурии.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение, что проведённая процедура останавливает развитие хронической РТПХ и подавляет индуцированный ею аутоиммунный процесс в почках.

Изучение параметров иммунной системы, характерных для процесса гомеостатической пролиферации, у реципиентов в динамике хронической РТПХ

Количественные параметры содержания лимфоцитов в периферической крови у мышей при хронической РТПХ

Процесс гомеостатической пролиферации лимфоцитов запускается снижением их количества на периферии [Ярилин А.А., 2004; Khoruts A. et al., 2005; Krupica T. J. et al., 2006; Baccala R. and Theofilopous A.N., 2006]. В связи с этим определяли количество и субпопуляционный состав лимфоцитов у реципиентов в динамике хРТПХ. Так как в ранние сроки после индукции невозможно определить, по какому варианту будет развиваться реакция, поэтому анализ формирования окончательных исходов хРТПХ проводили в суммарной группе реципиентов.

Рис.3. Содержание лимфоцитов в периферической крови у мышей после индукции хронической РТПХ

Данные представлены относительно значений контроля, принятых за 1.

* - различия между опытной и контрольной группами достоверны, p<0,05, n=24.

Оценка содержания лимфоцитов в периферической крови реципиентов после переноса полуаллогенных лимфоидных клеток в динамике выявила резкое падение их количества на раннем этапе развития хРТПХ (рис.3). Это снижение держится в течение четырех недель и затем сменяется нормализацией до уровня контрольных животных на фоне развивающейся спленомегалии. Механизм возникновения лимфопении при хРТПХ не ясен. Учитывая, что она сопровождается возрастанием количества клеток в костном мозге, можно предположить, что падение числа клеток в периферическом русле связано со снижением их выхода из костного мозга на периферию.

Таким образом, ранние стадии развития хронической РТПХ характеризуются лимфопенией, что может предполагать последующее включение гомеостатической пролиферации лимфоцитов.

Определение уровня цитокинов в периферической крови реципиентов с хронической РТПХ

Поскольку известно, что основными цитокинами в реализации процесса гомеостатической пролиферации являются IL-7 и IL-15 [Lee S. et al., 2005; Sandau M. et al., 2007; Calzascia T. et al., 2009; Guimond M. et al.,2009; Jacobs S. et al., 2010], мы определяли уровень IL-7 и IL-15 в динамике хронической РТПХ - на начальных этапах реакции и при окончательном формировании клинических исходов.

Оценка уровня IL-7 выявила его резкое возрастание в периферической крови реципиентов в ранние сроки, сопровождающиеся лимфопенией.

Рис.4. Концентрация IL-7 в периферической крови у экспериментальных животных после индукции хронической РТПХ

По оси ординат - концентрация IL-7 в пг/мл. По оси абсцисс - группы экспериментальных животных. 1-контроль (n=8), 2- через 2 недели после индукции хронической РТПХ (n=8), 3- через 3 месяца после индукции хронической РТПХ nonlupus (n=8), 4- через 3 месяца после индукции хронической РТПХ lupus (n=8).

*- по сравнению с контролем; # - по сравнению lupus- и nonlupus-реципиентов, p<0,05.

У lupus-реципиентов в отличие от nonlupus-реципиентов повышенное содержание IL-7 в периферической крови сохраняется и через 3 месяца, что говорит о наличии факторов, необходимых для поддержания процесса ГП в этой группе. Уровень IL-7 в контроле и у nonlupus-реципиентов оказался ниже порога чувствительности использованного метода (рис.4). Уровень IL-15 в нашем исследовании оказался ниже порога чувствительности использованного метода (100 pg/ml). В последнее время появились новые литературные данные о сложности определения цитокина-невидимки IL-15 в биологических жидкостях [Van Belle T. and Grooten J., 2005]. Причина трудностей определения IL-15 связана со своеобразным механизмом его действия, который заключается в непосредственном клеточно-контактном взаимодействии IL-15 и его рецептора с клеткой-мишенью. Отсутствие подъёма концентрации IL-15 в периферической крови не может свидетельствовать против его участия в процессе ГП.

Таким образом, развитие хронической РТПХ приводит к подъёму концентрации IL-7 на ранних этапах, сопровождающихся лимфопенией, и сохраняется на высоком уровне у lupus-реципиентов.

Субпопуляционный состав лимфоцитов в селезёнке реципиентов в динамике развития хронической РТПХ

Так как процесс ГП сопровождаются изменением соотношения субпопуляций лимфоцитов и, в первую очередь, непропорциональным увеличением количества клеток памяти, мы оценивали количество наивных клеток и клеток памяти среди CD4+- и CD8+-лимфоцитов селезёнки в разные периоды хронической РТПХ.

Рис.5. Абсолютное содержание субпопуляций Т-клеток на ранних

этапах развития хронической РТПХ

А. Неделя после индукции хРПТХ. Б. Месяц после индукции хРТПХ.

По оси ординат – количество клеток, х106. По оси абсцисс - субпопуляции Т- клеток.

1 - CD4+ CD45RBhi, 2 - CD4+ CD45RBlow, 3 – CD8+ CD45RBhi, 4 - CD8+ CD45RBlow.

Белые столбики – контрольная группа (n=16), черные столбики – опытная группа (n=16).*- по сравнению с контролем, p<0,05.

На начальных стадиях развития реакции обнаружено возрастание абсолютного количества СD4+- и СD8+-субпопуляций в селезёнке, причём увеличивается число как наивных клеток CD4+ и CD8+, так и клеток памяти CD4+ и CD8+. В дальнейшем содержание клеток памяти CD4+ и CD8+ остаётся повышенным, тогда как количество наивных Т-клеток CD4+ и CD8+ после подъема начинает снижаться (рис 5).

Изменение количества субпопуляций в этот период может быть связано с несколькими возможными причинами: трансплантацией большого количества клеток при индукции хРТПХ, с пролиферацией антиген-реактивных лимфоцитов донора, а также с гомеостатической пролиферацией клеток реципиента.

Рис.6. Абсолютное содержание субпопуляций Т-клеток при хронической РТПХ (3 месяца после индукции хРТПХ)

По оси ординат – количество клеток, х106. По оси абсцисс - субпопуляции Т- клеток.

1 - CD4+ CD45RBhigh, 2 - CD4+ CD45RBlow, 3 – CD8+ CD45RBhigh, 4 - CD8+ CD45RBlow

Белые столбики – контрольная группа (n=8), серые столбики – nonlupus (n=8),

черные столбики – lupus (n=8).

*- по сравнению с контролем; # - по сравнению lupus- и nonlupus-реципиентов, p<0,05.

У lupus-реципиентов через 3 месяца сохраняется повышенное содержание CD4+- и CD8+-субпопуляций с фенотипом клеток памяти в селезёнке по сравнению с контрольными животными и nonlupus-реципиентами (рис 6). У lupus-реципиентов также возрастает число наивных CD4+- и CD8+-клеток в селезёнке, что может быть вызвано активацией процессов миграции из тимуса, который остаётся достаточно сохранным при хронической форме РТПХ.

Возрастание доли клеток памяти в этот период не может быть объяснено антигенной стимуляцией Т-лимфоцитов донора, так как на поздних стадиях развития хРТПХ Т-клеточный химеризм у реципиентов в изучаемой модели составляет всего 2% и, следовательно, CD4+CD45RBlow- и CD8+CD45RBlow-клетки в селезёнке lupus-мышей представляют собой, в основном, клетки реципиента [Via C.S. and Shearer G.M., 1988].

Таким образом, в отличие от nonlupus-реципиентов у lupus-мышей в селезёнке возрастает количество Т-клеток с фенотипом клеток памяти (CD4+CD45RBlow и CD8+CD45RBlow), что является характерным признаком процесса гомеостатической пролиферации лимфоцитов.

Определение средней длины теломерных районов ДНК при хронической РТПХ

Длина теломерных районов ДНК является значимым показателем пролиферативного потенциала клетки. Предполагается, что в условиях гомеостатической пролиферации происходит укорочение теломерных районов ДНК [Goronzy J. et al., 2006]. Показано, что при некоторых аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка, атопический дерматит и другие) отмечается укорочение теломерных районов ДНК [Weng N., 2008; Calado R. and Young N., 2009; Oeseburg H. et al., 2009].

Первоначально длину теломерных районов ДНК определяли в общей популяции лимфоцитов селезенки. Результаты проведенных исследований показывают, что на начальных этапах развития хРТПХ отмечается тенденция к увеличению длины теломерных районов ДНК в общей популяции спленоцитов у реципиентов относительно контрольной группы животных, хотя изменения недостоверны (табл.1).

Таблица 1

Длина теломерных районов ДНК в спленоцитах при хронической РТПХ, (М, min-max)

Показатель	2 недели после индукции хРТПХ		месяц после индукции хРТПХ
	контроль (n=16)	опыт (n=16)	контроль (n=6)	опыт (n=9)
Длина (пар нуклеотидов)	44970 32335 - 55405	46970 38348 - 56407	47029 36967 - 50532	51523 44420 - 57104

При окончательном формировании аутоиммунного процесса длина теломерных районов ДНК у lupus-реципиентов также значимо не отличается от контрольной группы животных и nonlupus-реципиентов (табл.2).

Таблица 2

Длина теломерных районов ДНК в спленоцитах у nonlupus- и lupus-реципиентов, (М, min-max)

Показатель	контроль n=8	nonlupus n=8	lupus n=8
Длина (пар нуклеотидов)	39323 28531- 42392	39074 33412 - 50196	40359 26841- 46516

Так как разные субпопуляции клеток принимают разное участие в развитии хронической РТПХ и формировании аутоиммунной патологии и, следовательно, проявляют разную пролиферативную активность, в дальнейшем мы оценивали длину теломерных районов ДНК в отдельных субпопуляциях лимфоцитов. Анализ длины теломерных повторов ДНК в наивных клетках и клетках памяти среди CD4+- и CD8+-лимфоцитов селезёнки не выявил значимых изменений этого параметра у lupus-реципиентов; длина теломерных районов ДНК достоверно увеличена в CD8+- клетках памяти у nonlupus-реципиентов по сравнению с контрольной группой животных. CD19+-лимфоцитах селезёнки изменений в длине теломерных повторов отмечено не было (табл.3). Возможно, причиной этого является активация теломеразы в лимфоидных клетках реципиентов. Так, показано, что IL-7, уровень которого повышался при полуаллогенном переносе в нашей работе, вызывает активацию теломеразы [Beier F.et al.,2007; Tarhan F.et al., 2008].

Однако в отношении системной красной волчанки данные противоречивы; некоторые авторы находят, напротив, увеличение длины теломер при СКВ [Andrews N.P. et al,.2009].

Таблица 3

Длина теломерных районов ДНК в CD4+-, CD8+ и CD19+-спленоцитах у nonlupus- и lupus-реципиентов, (М, min-max)

Показатели	контроль n=5	nonlupus n=5	lupus n=5
CD4+CD45RBhigh в п. н.	26441 24350 - 29962	27013 24151 - 28183	26877 24202 - 28818
CD4+ CD45RBlow в п. н.	25523 22338 - 27412	27077 24112- 28221	26776 24398 - 29318
CD8+CD45RBhigh в п. н.	27455 26576 - 29027	28553 26251 - 31586	27501 25622 - 28665
CD8+CD45RBlow в п. н.	26165 24821- 27512	28695* 26644- 31606	27954 25956 - 31292
CD19+ в п. н.	30807 26884 - 33561	31886 28910 - 33333	31688 29348 - 34322

*- по сравнению с контролем, p<0,05.

Таким образом, анализ длины теломерных районов ДНК не выявил их укорочения у lupus-реципиентов по сравнению с контролем.

Исследование связи между уровнем лимфопении и частотой развития аутоиммунной патологии

Влияние препаратов, меняющих частоту развития аутоиммунной патологии, на выраженность лимфопении и ГП у реципиентов

Ранее нами было установлено, что дегидроэпиандростерон сульфат (DHEA-S) и мурамилдипептид (MDP), обладая способностью направлять хРТПХ по Th1-пути и Th2-пути развития, соответственно, снижают или увеличивают частоту формирования аутоиммунного поражения почек [Кудаева О.Т. с соавт., 2005].

Представляло интерес оценить выраженность лимфопении на ранних стадиях развития хРТПХ в условии модуляции ее течения с помощью этих препаратов (DHEA-S и MDP) исходя из следующего предположения. Так как на ранних стадиях хРТПХ мы не можем отдельно характеризовать lupus- и nonlupus-мышей, а вынуждены оценивать всех реципиентов в целом, то мы с помощью препаратов максимально сдвигаем соотношение lupus/nonlupus в одну или в другую сторону и, оценивая всю опытную группу целиком, считаем, что характеризуем в каждом случае преимущественно lupus- (группа с введением MDP) или nonlupus-реципиентов (группа с введением DНEA-S).

DHEA-S считается стимулятором Th1-клеток [Stam W.B. et al., 1993; Rook G.A. et al., 1994; Sudo N. еt al., 2001]. Мурамилдипептид, дериват клеточной стенки бактерий, обладая адъювантным действием, вызывает поликлональную активацию В-клеток и усиливает стимулирующее влияние IL-4 на активированные В-лимфоциты [Souvannavong V. et al., 1990]. Контрольной группой в данной серии экспериментов служили реципиенты с индукцией хРТПХ без каких-либо дополнительных воздействий.

В экспериментальной группе, которой наряду с индукцией хРТПХ вводили DHEA-S, отмечается снижение частоты развития аутоиммунного гломерулонефрита; введение MDP, напротив, приводит к увеличению доли реципиентов с аутоиммунной патологией (рис. 7).

Рис. 7. Частота развития аутоиммунного гломерулонефрита при

индукции хронической РТПХ в разных экспериментальных группах

По оси ординат: количество животных с уровнем протеинурии > 3мг/мл, % от

общего числа.*- по сравнению с хРТПХ, # - по сравнению с хРТПХ+DHEA-S, p<0,05.

Таким образом, определение количества лимфоцитов в периферической крови реципиентов в динамике развития хРТПХ показало, что введение DHEA-S приводит к менее продолжительной и слабее выраженной лимфопении по сравнению с контрольной группой и реципиентами, которым вводили MDP: число лимфоцитов периферической крови у реципиентов, которым вводили DHEA-S, нормализуется уже ко второй неделе после индукции реакции (табл.4).

Таблица 4

Количество лейкоцитов и лимфоцитов в периферической крови

животных различных экспериментальных групп, (М, min-max)

Параметр	контроль n=10	хРТПХ n=10	хРТПХ+DHEA-S n=10	хРТПХ+MDP n=10
1 неделя после индукции хРПТХ
Лейкоциты (х 106/мл)	19,9 14,7-21,2	8,6* 6,9-10,5	11,8* # 10,0-14,5	10,4* 8,0-13,0
Лимфоциты (х 106/мл)	14,6 12,2-16,1	6,7* 4,4-9,7	9,2* 7,0-10,5	7,3* 6,4-10,0
2 недели после индукции хРТПХ
Лейкоциты (х 106/мл)	18,3 14,0-20,5	12,1* 8,5-16,75	13,9 14,5-17,0	11,1* 7,5-13,5
Лимфоциты (х 106/мл)	14,5 8,7-15,2	7,9* 6,4-11,7	10,0 8,3-11,5	8,5* 5,8-12,2
4 недели после индукции хРПТХ
Лейкоциты (х 106/мл)	16,9 14,0-19,0	18,9 12,0-17,5	17,8 11,2-21,5	15,8 14,5-17,0
Лимфоциты (х 106/мл)	14,9 10,7-15,6	13,9 10,3-15,7	14,7 8,4-16,5	13,7 12,5-14,3

*- по сравнению с контролем, #- по сравнению с хРТПХ, p<0,05.

Влияние трансфузии сингенных клеток на частоту развития аутоиммунной патологии, индуцированной хронической РТПХ

Существует предположение, что трансплантация сингенных лимфоцитов в ситуации их выраженного снижения, восполняя лимфоцитарный пул в организме, может обрывать процесс ГП и тем самым не допускать срыва толерантности и развития аутоиммунного расстройства [Jang E. et al, 2006]. На основании результатов данной работы и сделанного предположения о важной патогенетической роли ГП в развитии аутоиммунного процесса у lupus-реципиентов мышам после индукции хРТПХ для предупреждения ГП и формирования аутоиммунного гломерулонефрита дополнительно вводили сингенные спленоциты еженедельно трехкратно в дозе 40.106. Однако такой сингенный перенос привёл к неожиданному результату: сингенная трансфузия не купировала лимфопению, а частота развития lupus-нефрита возросла с 54% до 75% (n=25; р<0,01). Для выяснения возможных причин такого эффекта исследовали влияние введения сингенных спленоцитов интактным животным. Оказалось, что трансфузия сингенных спленоцитов хотя не вызывает таких резких колебаний уровня лейкоцитов, как трансплантация полуаллогенных клеток, но также приводит к выраженной лимфопении: наблюдается снижение числа лимфоцитов на 36% от уровня интактных животных (по сравнению со снижением на 65% - после индукции хРТПХ).

Рис. 8. Пролиферативная активность клеток костного мозга у мышей после трансплантации сингенных клеток

Данные представлены относительно значений контроля, принятых за 1.

* - различия между опытной и контрольной группами достоверны, контрольная группа - n=20; в группе с сингенным переносом каждая точка представлена средними значениями n=4, p<0,05.

Поскольку перенос сингенных лимфоцитов интактным животным приводит к снижению пролиферативной активности клеток-предшественников в костном мозге (рис. 8), можно предположить, что подобный эффект сингенного переноса лимфоцитов при хРТПХ может способствовать гомеостатической пролиферации клеток и обусловливать увеличение частоты развития аутоиммунного поражения почек.

Таким образом, дополнительное введение сингенных клеток на ранних стадиях хРТПХ не нормализует лимфопению, но вызывает изменения кроветворения, способствующие её поддержанию и, таким образом, может усугублять и/или пролонгировать лимфопению и усиливать гомеостатическую пролиферацию.

Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что процесс гомеостатической пролиферации Т-лимфоцитов, обнаруженный нами при хРТПХ, тесно связан с патогенезом аутоиммунного гломерулонефрита, возникающего при развитии этой реакции по Th2-зависимому варианту.

ВЫВОДЫ

1. Хроническая реакция «трансплантат против хозяина», индуцированная в полуаллогенной системе DBA/2(C57BL/6xDBA/2)F1 и приводящая к аутоиммунному поражению почек, на ранних этапах сопровождается снижением количества лимфоцитов - необходимым условием включения процесса гомеостатической пролиферации.

2. Ранние этапы развития хронической РТПХ сопровождаются возрастанием концентрации IL-7 в периферической крови реципиентов, который остается на повышенном уровне у lupus-мышей с развившимся аутоиммунным гломеруло­нефритом.

3.У реципиентов с аутоиммунным гломерулонефритом, индуцированным хро­нической РТПХ, наблюдается увеличение в селезёнке количества Т-клеток с фенотипом клеток памяти CD4+CD45RBlow и CD8+CD45RBlow, что характерно для гомеостатической пролиферации лимфоцитов. Анализ длины теломерных районов ДНК не выявил их укорочения у lupus-реципиентов по сравнению с контролем.

4. Введение дегидроэпиандростерона сульфата и мурамилдипептида, действую­щих оппозитно на формирование аутоиммунной патологии, по-разному влияет на уровень лимфопении у реципиентов: мурамилдипептид, увеличивающий час­тоту возникновения гломерулонефрита, усиливает лимфопению по сравнению с дегидроэпиандростерон сульфатом, снижающим частоту развития поражения почек. Трансфузия сингенных спленоцитов на ранних стадиях развития хрони­ческой РПТХ приводит к усилению лимфопении и увеличе­нию частоты развития аутоиммунной патологии.

5. Характер изменения иммунных параметров у реципиентов с аутоиммунным поражением почек - лимфопения на ранних стадиях, возрастание уровня IL-7 и количества Т-клеток с фенотипом клеток памяти – свидетельствует о том, что гомеостатическая пролиферация является одной из характеристик аутоиммун­ного процесса, индуцированного хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2(C57BL/6xDBA/2)F1.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1.Кудаева О.Т., Гойман Е.В., Лыков А.П., Колесникова О.П., Козлов В.А. Влия­ние препаратов, изменяющих соотношение Th1/Th2, на частоту разви­тия клинических вариантов хронической реакции трансплантат против хо­зяина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. – №9(140). – С.325-327.

2. Ненашева Е.В., Гойман Е.В. Роль антител к ДНК в формировании гломеруло­нефрита при хронической реакции трансплантат против хозяина у мышей. // Цитокины и воспаление.-2005.-Т.4.-№3.-С.141.

3.Ткачев В.О., Ненашева Е.В., Гойман Е.В., Вольский Н.Н., Кудаева О.Т., Ко­лесникова О.П. Уровень аутоантител к ДНК и метаболическая активность полиморфно-ядерных лейкоцитов в динамике хронической реакции транс­плантат против хозяина. // Иммунология. – 2006. – Т. 27, №2. – С. 98-101.

4.Ткачев В.О., Гойман Е. В., Лыков А. П., Кудаева О. Т., Колесникова О. П. Показатели гемопоэза в динамике развития хронической реакции транс­плантат против хозяина. // Иммунология. – 2006. – Т.26, №3. – С. 168-171.

5.Гойман Е.В., Ненашева Е.В., Майбородин И.В., Кудаева О.Т., Колесникова О.П., Козлов В.А. Коррекция аутоиммунной патологии переносом клеток сингенного костного мозга в экспериментальной модели. // Омский научный вестник. - 2007. - №3(61). - С.20-22.

6.Гойман Е.В., Кудаева О.Т., Ильина Н.А., Кожевников В.С., Колесникова О.П., Козлов В.А. Гомеостатическая пролиферация как механизм развития аутоиммунного процесса при хронической РТПХ. // Российский иммуноло­гический журнал.-2008.-Т.2(11).-№2-3.-С.231.

7. Гойман Е.В., Кудаева О.Т., Ильина Н.А., Кожевников В.С., Колесникова О.П., Козлов В.А. Процессы гомеостатической пролиферации в патогенезе хронической РТПХ.// Сибирский медицинский журнал.- 2008.-№.3.-С.91.

8.Гойман Е.В., Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Уровень IgE в динамике развития разных вариантов хронической реакции трансплантат против хозяина. // Вестник уральской медицинской академической науки.- 2009.- №2/1.-С.27-28.

9.Гойман Е.В., Кудаева О.Т., Ильина Н.А., Борисов В.И., Кожевников В.С., Колесникова О.П., Козлов В.А. Процессы  гомеостатической пролиферации в патогенезе аутоиммунного гломерулонефрита, индуцированного хрониче­ской реакцией трансплантат против хозяина. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- 2010.-Т.149.-№ 1.-С. 60-63.

10.Гойман Е.В.,Ткачев В.О., Кудаева О.Т., Колесникова О.П., Козлов В.А. Связь лимфопении с развитием аутоиммунного процесса при хронической РТПХ. //Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дни им­мунологии в Сибири».-2010.-С.16-18.

11.Кудаева О.Т., Гойман Е.В., Ненашева Е.В., Майбородин И.В., Колесни­кова О.П., Козлова В.А. Коррекция аутоиммунного гломерулонефрита у экспериментальных животных летальным облучением и переносом клеток сингенного костного мозга. // Медицинская иммунология.-2010.-12(3).-С.191-198.

12.Гойман Е.В., Борисов В.И., Кудаева О.Т., Козлов В.А. Анализ длины тело­мерных районов ДНК у мышей при хронической РТПХ. // Материалы Все­российской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Си­бири».-2011.-С.47-49.

13.Гойман Е.В., Борисов В.И., Кудаева О.Т., Козлов В.А. Оценка длины тело­мерных районов ДНК у мышей при хронической РТПХ. // Вестник ураль­ской медицинской академической науки.- 2011.- №2/1.-С.27-28.

14.Kudaeva O.T., Kolesnikova O.P., Goiman E.V., Tkachev V.O., Volsky N.N., Perminova O.M., Gavrilova E.D., Kozlov V.A. The Experimental Model of the Autoimmune Glomerulonephritis Induced by the Chronic Graft versus Host Reaction. // An Update on Glomerulopathies - Etiology and Pathogenesis. Ed. Sharma Prabhakar. ISBN: 978-953-307-388-0. Rijeka: InTech.- 2011. - Р.49-86.