Фармакологические свойства и токсикологическая характеристика комплексного растительного препарата “селекартен”
На правах рукописи
ПЛЕТНЕВ Владимир Владимирович
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПЛЕКСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА “СЕЛЕКАРТЕН”
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2013
Работа выполнена в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ
Научный руководитель:
Доктор медицинских наук, профессор АРЗАМАСЦЕВ Евгений Вениаминович
Официальные оппоненты:
КИНЗИРСКИЙ Александр Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующий лабораторией фармакологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт физиологически активных веществ» РАН
МОРОЗОВА Татьяна Евгеньевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой клинической фармакологии и фармакотерапии ФППОВ ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава РФ
Ведущая организация:
ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава РФ
Защита диссертации состоится «____» ____________ 2013 г. на заседании Диссертационного совета Д 208.040.13 при ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченева» Минздрава РФ (119991, Москва, ул. М. Трубецкая, д. 8, стр. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченева Минздрава РФ (119991, Москва, Нахимовский проспект, 49).
Автореферат разослан «_____»_______________________ 2013 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д 208.040.13
Доктор медицинских наук АРХИПОВ Владимир Владимирович __________
Общая характеристика РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Характерной чертой конца XX и начала XXI века является существенный рост острых и хронических инфекционных заболеваний бактериальной, грибковой, протозойной и вирусной природы. Возвращаются заболевания, которые были широко распространены в XIX столетии и почти исчезли в XX веке, такие как, туберкулез, малярия, дифтерия и другие. Появились новые вирусные заболевания, типичным примером которых является, ВИЧ-инфекция. Наблюдается рост инфекционных заболеваний различной этиологии, возбудителями которых служат условно-патогенные или оппортунистические микробы, обладающие атипичными биологическими свойствами и множественной устойчивостью к антибиотикам. Возникновение этих заболеваний связано также со снижением иммунореактивности населения. На фоне ослабления функций иммунной системы применение даже высокоэффективных антибиотиков последнего поколения не всегда дает хороший клинический эффект.
Несмотря на сравнительно большой спектр используемых в клинической практике при лечении внутренних и инфекционных заболеваний индукторов интерферонов и препаратов, обладающих иммунотропным действием (амиксин, кагоцел, рибомунил, тактивин, тимактид, миелопид, альфа-глутамил-триптофан, пидотимод, стемокин, интерлейкин-1бета, интерлейкин-2, интерферон альфа, кипферон, интерферон альфа-2, интерферон бета-1а, аффинолейкин и т.д.), поиск лекарственных средств, обладающих одновременно иммунотропным, антимикробным и противовирусным действием, остается актуальной проблемой.
В последние годы пристальное внимание исследователей привлекает изучение роли микроэлементов и витаминов в функционировании иммунной системы. Установлено, что витамины А, С, В12, -каротин, фолиевая кислота, рибофлавин, а также микроэлементы селен, цинк и железо обладают иммуномодулирующими свойствами и их недостаточность приводит к ослаблению иммунитета и повышению инфекционной заболеваемости [Bhaskaram P., 2002; Chandra R.K., 2002].
Многие из этих веществ обладают антиоксидантными свойствами, что очень важно при лечении ряда таких тяжелых заболеваний человека, как атеросклероз, злокачественные новообразования, аутоиммунные заболевания, а также для профилактики преждевременного старения. К веществам с выраженными иммуномодулирующими и антиоксидантными свойствами относится микроэлемент селен и его производные. Селеносодержащие вещества повышают иммунологическую реактивность, следствием чего является снижение инфекционной заболеваемости [Huang K., Yang A., 2002; Langkamp-Henken B., Bender B.S., Gardner E.M., 2004].
При дефиците селена в организме и сниженной иммунореактивности слабопатогенный вирус Коксаки приобретает высокую вирулентность и приводит к серьезным нарушениям в работе сердечно-сосудистой системы; вирус гриппа вызывает более тяжелые повреждения легочной ткани; у ВИЧ-инфицированных людей начинается быстрое прогрессирование заболевания [Rayman M.P., 2002]. Регулярное потребление пищевых продуктов с высоким содержанием селена замедляет старение организма и снижает риск развития злокачественных новообразований [Langkamp-Henken B., Bender B.S., Gardner E.M., 2004; Wayland M., Gilchrist H.G., Marchant T., 2002; Whanger P.D., 2004].
В настоящее время активно разрабатываются лекарственные средства и биологически активные добавки, содержащие селен – незаменимый микроэлемент, обладающий широким спектром биологической активности и целым рядом фармакологических свойств, в том числе высокой антиоксидантной активностью [Dolph L. Hatfield, Marla J., Berry and Vadim N. Gladyshev, 2006; Gladyshev V. N., 2001; Tappel A., Caldwell K., 1966]. При этом принципиально важным остается создание новых комплексных лекарственных препаратов, усиливающих положительные эффекты селена и снижающих его нежелательное побочное действие, связанное с проявлением токсичности [Манаков А.М., 1968].
В связи с этим, актуальным является изучение нового комплексного растительного препарата – селекартен (СК), содержащего селен. В экспериментах на кроликах с острой ишемией сетчатки, вызванной лазерной коагуляцией было показано, что СК обладает антиоксидантным действием, ангио-, нейро- и ретинопротекторным свойствами. Под влиянием СК наблюдается усиление компенсаторных механизмов, направленных на восстановление кровообращения в поврежденных тканях при ишемии и дистрофии сетчатки [Швецова Н.Е., 2008].
Вместе с тем, экспериментальное изучение иммунотропных, антимикробных и противовирусных свойств СК, а также его безопасность подробно не изучались, а выявленные эффекты препарата свидетельствует о перспективности его применения в иммунологии, онкологии, реаниматологии, при лечении ряда внутренних, инфекционных и других заболеваний.
Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы являются исследование в эксперименте фармакологических свойств и токсичности препарата селекартен для обоснования его клинического изучения и последующего медицинского применения.
Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:
1. Изучить спектр иммунотропного действия препарата селекартен.
2. Исследовать антимикробные свойства селекартена против ряда возбудителей заболеваний человека – Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli.
3. Исследовать противовирусную активность селекартена в отношении вирусов гриппа А и В, герпеса простого, гепатита С, иммунодефицита человека.
4. Провести доклиническое токсикологическое изучение препарата селекартен.
Научная новизна. Впервые изучено иммунотропное действие селекартена. Установлено, что СК повышает устойчивость мышей к смертельной стафилококковой инфекции, стимулирует бактерицидную активность клеток перитонеального экссудата мышей, гуморальный и клеточный иммунные ответы. СК обладает антиоксидантными свойствами и под его влиянием наблюдается подавление зимозаниндуцированной хемилюминесценции лейкоцитов периферической крови и спленоцитов мышей, подавление люминол- и люцигенинзависимых спонтанных и зимозаниндуцированных хемилюминесценций лейкоцитов человека. При совместной инкубации СК с мононуклеарными клетками периферической крови человека наблюдается повышение клеточной гибели, подавление пролиферации лимфоцитов и повышение продукции ФНО- мононуклеарными клетками.
При изучении антимикробной активности селекартена впервые установлено, что препарат обладает ингибирующим действием на Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli.
Впервые также установлено, что селекартен обладает противовирусным действием в отношении вирусов гриппа А/Н5, A/H3 и В. Препарат оказывает защитное действие при экспериментальной гриппозной пневмонии у мышей, вызванной вирусом гриппа А/Н5. Впервые выявлена противовирусная активность СК при действии на вирусы простого герпеса 1-го типа, гепатита С и иммунодефицита человека.
При доклиническом токсикологическом изучении селекартена, установлено, что СК является малотоксичным препаратом и хорошо переносится при длительном назначении, не обладает мутагенностью, не оказывает аллергизирующего действия и иммунотоксичности, проявляет эмбриотоксичность, в связи, с чем беременность следует считать противопоказанием к назначению СК.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований обоснована перспективность клинического изучения селекартена в иммунологии, онкологии, реаниматологии, при лечении ряда внутренних и инфекционных заболеваний, в качестве лекарственного средства системного действия, обладающего иммуномодулирующим, антимикробными и противовирусными свойствами. Определены оптимальные дозы для назначения селекартена и доказана возможность его длительного применения в виде внутримышечных инъекций.
Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения использованного подхода для создания новых эффективных комплексных растительных препаратов на основе фармакопейных растений с добавлением биологически активных компонентов растительной или другой природы.
Апробация работы.
Основные положения диссертации были представлены и доложены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, апрель 2012 г.), на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздрава РФ (Протокол апробации №3 от 27 сентября 2012 г.), на заседании кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Протокол апробации №8 от 15 ноября 2012 г.).
Личный вклад автора.
Лично разработан комплексный растительный препарат селекартен, что подтверждается патентом РФ на изобретение № 2294209 от 27.02.2007 «Иммуномодулирующий препарат». Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, проведении анализа и обобщения полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от экспериментальных исследований оригинального комплексного растительного препарата селекартен до обсуждения и формулировки результатов в научных публикациях и докладах.
Полученные данные свидетельствуют о возможности рекомендовать разработанный комплексный растительный препарат селекартен для клинических испытаний и применения использованного подхода для создания новых эффективных комплексных растительных препаратов для медицины.
Научные публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ. Из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ, изданы 2 монографии, а также получен 1 патент РФ.
Положения, выносимые на защиту:
Селекартен является оригинальным комплексным растительным препаратом, обладающим иммуномодулирующим действием.
Препарат проявляет антимикробные свойства против ряда возбудителей заболеваний человека – Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli.
Селекартен повышает выживаемость животных, при заражении летальной дозой Staphylococcus pyogenes, и оказывает защитное действие при вирусной пневмонии.
Препарат проявляет противовирусную активность в отношении вирусов гриппа А и В, герпеса простого, гепатита С, иммунодефицита человека.
Селекартен является малотоксичным препаратом при однократном парентеральном введении лабораторным животным и хорошо переносится при длительном назначении крысам Wistar и собакам, не оказывает повреждающего действия на основные органы и системы организма подопытных животных, не проявляет местнораздражающего действия.
Селекартен не обладает мутагенностью и ДНК-повреждающим действием. Не оказывает аллергизирующего и иммунотоксического действия.
При назначении беременным крысам селекартен проявляет эмбриотоксичность, в связи с чем беременность является противопоказанием к назначению препарата.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 178 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав экспериментальных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций, списка литературы. Библиография включает 288 литературных источников, из которых 143 отечественных и 145 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 75 таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на 417 мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl6), 128 мышах линии BALB/c, 70 белых беспородных мышах, 263 крысах Wistar, 30 пестрых морских свинках и 8 беспородных собаках.
Для проведения исследований использовали комплексный растительный препарат селекартен, полученный на основе спиртового экстракта донника лекарственного – Melilotus officinalis L., семейство бобовые – Fabaceae, трава которого содержит: кумарин, кумаровую кислоту, дикумарол, мелилотин, мелилотовую кислоту, гликозид мелилотозид, производные пурина, жироподобные вещества, эфирное масло, витамин Р, флавоноиды и хлорофилл. Спиртовой экстракт фильтруют в соответствии с НД. Полученный отфильтрованный жидкий экстракт содержит: кумарин, дигидрокумарин, хлорофилл, флавоноиды и минимальные количества, перечисленных выше веществ.
К полученному экстракту добавляют селенит натрия, -каротин, фосфолипиды сои, перемешивают в течение регламентированного в НД времени. И вновь фильтруют посредством мембранной ультрафильтрации (размер пор 0,2 мкм), разливают в асептических условиях в стеклянные флаконы или ампулы. Проектом ФСП предусмотрена регламентация следующих компонентов в 1 мл препарата: натрия селенита 18,40 мкг (в пересчете на селен 8,402 мкг), фосфолипидов 0,310 мг, -каротина 5,210 мкг, 0,9 мл хлорофилла и флавоноиды.
В исследованиях испытываемые дозы (концентрации) селекартена расчитывали исходя из того, что в 1 мл препарата содержится 450 мкг активной субстанции.
Исследование иммунотропного действия селекартена.
Влияние СК на гуморальный иммунный ответ оценивали по накоплению АОК в селезенках мышей на 4-е сутки после иммунизации по методу Каннингейма. Показателем клеточного иммунного ответа служила реакция ГЗТ, величину которой определяли индексу ГЗТ.
Исследование влияния СК на устойчивость животных к стафилококковой инфекции проведено на мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl6), которых заражали летальной дозой (1010 клеток/мышь) Staphylococcus pyogenes.
При изучении влияния СК на макрофагальную активность клеток перитонеального экссудата мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl6) использовали Staphylococcus aureus меченный флюоресцеина изотиоцианатом. Исследование влияния СК на внутриклеточную бактерицидность проведено с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur (США).
Влияние СК на спонтанную, индуцированную зимозаном (Sigma), а также люминолзависимую и люцигенинзависимую хемилюминесценцию лейкоцитов оценивали на хемилюминометрах «Lum-5773» (Россия) и LUCY 1 (Австрия).
Влияние СК на жизнеспособность мононуклеаров периферической крови изучали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur (США).
Влияние СК на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови оценивали по включению радиоактивной метки.
Влияние СК на продукцию ФНО- мононуклеарами периферической крови оценивали методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Изучение антимикробного действия СК.
Исследование антимикробных свойств СК проведено на представителях 4 видов микроорганизмов: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Acinetobacter calcoaceticus и Escherichia coli. Ингибирующее действие СК оценивали на суспензиях указанных микроорганизмов стандартной мутности, в которые добавляли СК в различных концентрациях с последующим инкубированием в термостате, пересевом на чашки Петри с селективными средами и учетом выросших колоний.
Изучение противовирусного действия селекартена.
Влияние СК на вирусы гриппа А и В.
Для проведения данных исследований использовали эпидемические вирусы гриппа человека А/Н1N1, А/Н3N2 и В, а также штаммы вирусов А/Н5N2, А/Н5N3. Противовирусную активность СК учитывали по снижению инфекционного титра вируса в культуре клеток МДСК и снижению уровня подавления оптической плотности в тест-системе на основе ИФА.
Оценка вирулицидного действия CK проведена на интактных вирусах эпидемических штаммов вируса гриппа А, В и А/Н5.
Куриные эмбрионы инфицировали вирусом гриппа А/Н5. После инкубации определяли наличие вируса в РГА.
При изучении противовирусной активности СК на модели гриппозной пневмонии у мышей, подопытных животных заражали вирусом гриппа А/утка/Алтай/1285/91(Н5N3), выделенным от диких птиц, при интраназальном введении. Эффективность противовирусного действия СК оценивали по сравнительной летальности и средней продолжительности жизни мышей, получавших препарат и контрольной группы.
Влияние СК на вирус простого герпеса (ВПГ).
В исследованиях использовали клетки почек зеленой мартышки Vero-E6 с добавлением эмбриональной сыворотки телят – ЭТС и диплоидные фибробласты эмбриональной легочной ткани человека MRC-5.
Тестирование проведено на штамме вируса герпеса простого тип 1 штамм L2, а также на 3 вариантах вируса с лекарственной устойчивостью к ацикловиру, фосфономуравьиной кислоте и к их комбинации.
Оценку противовирусного действия CK проводили по ингибированию развития вирусиндуцированного патологического процесса.
Влияние СК на вирус гепатита С (ВГС).
При проведении исследований были использованы высоко чувствительные к патогенному действию ВГС культуры перевиваемых клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), а также патогенный штамм ВГС, выделенный из сыворотки крови больной хроническим гепатитом С, который относится к генотипу 1b инфекции. В качестве контролей служили инфицированные и нормальные неинфицированные культуры клеток СПЭВ. Вирулицидное действие СК оценивали по проценту ВГС инфицированных культур клеток, погибших в результате вирусной инфекции, и по остаточной инфекционной активности вируса, сохранившейся в результате воздействия СК.
Исследование противовирусной активности СК в отношении ВИЧ.
Исследования проведены на перевиваемых лимфобластных клетках человека МТ-4. В исследовании использован штамм вируса ВИЧ-1BRU. Степень цитодеструкции оценивали под микроскопом. Методом ИФА проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости. При исследовании вирулицидного действия СК на ВИЧ в культуре клеток учет результатов проводили с помощью световой микроскопии.
Токсикологические исследования.
Исследования проведены в соответствии современными требованиями Минздрава России к безопасности новых лекарственных препаратов (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М, 2005).
Изучение токсичности СК при однократном введении лабораторным животным.
Определение параметров токсичности СК при однократном парантеральном введении мышам линии BALB/с и крысам Wistar проведено с использованием пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону.
Изучение токсичности СК в условиях хронических экспериментов на крысах Wistar (3 месяца) и собаках (1 месяц).
На протяжении эксперимента отмечали общее состояние и поведение животных. Оценку функционального состояния сердечно-сосудистой системы у собак (ЭКГ-исследования во II стандартном отведении) проводили с помощью прибора «Биограф» (США). Подсчет форменных элементов крови животных производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Биохимические показатели и активность ферментов определяли на биохимическом полуавтоматическом анализаторе ФП-901 «Labsystems» (Финляндия).
После окончания хронических экспериментов проведена эвтаназия для проведения патоморфологического исследования внутренних органов и тканей животных.
Изучение мутагенности СК.
Применен чашечный метод учета мутаций, предложенный Ames et al (1972, 1984) с использованием индикаторных микроорганизмов ауксотрофных по гистидину Salmonella typhimurium ТА98, ТА100, ТА1537. О наличии мутагенного действия СК судили по индукции обратных мутаций от ауксотрофности по гистидину к прототрофности.
Исследование доминантных летальных мутаций проведено на мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl6) после внутримышечного введения СК в дозе 0,7 мл/кг (100-кратная суточная доза для человека).
Исследование цитогенетической активности СК методом учета хромосомных аберраций проводили на клетках костного мозга мышей F1(CBAxC57Bl6), подвергавшихся воздействию препарата в дозах 0,7 мл/кг однократно и 0,07 мл/кг ежедневно, на протяжении 4 дней. Метафазы анализировали на наличие в них хромосомных аберраций по рекомендации ВОЗ.
Изучение влияния СК на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте проведено на приборе «Биоскрин» («Лабсистемс», Финдляндия).
Исследование эмбриотоксичности и тератогенности СК.
После внутримышечного введения препарата в дозе 0,21 мл/кг беременным крысам линии Wistar с 1 по 19 день гестации, определяли показатели предимплантационной и постимплатационной гибели. Определяли массу плодов, проводили анализ их внешних аномалий и пороков развития. Изучали развитие костного скелета по Доусону. Исследовали внутренние органы на микроанатомических срезах по Вильсону-Дыбану.
Изучение влияния СК на репродуктивную функцию крыс.
Исследования проведены на половозрелых самках и самцах крыс Wistar после внутримышечного введения СК в дозе 0,21 мл/кг (30-кратная высшая суточная доза для человека).
При этом определяли показатели предимплантационной и постимплатационной гибели, а также индекс плодовитости и индекс беременности. При осмотре плодов регистрировали патологические изменения, на 21 день вычисляли процент выживаемости, отмечали массу тела и кранио-каудальный размер крысят.
Исследование аллергизирующих свойств СК.
При изучении анафилактогенной активности животных сенсибилизировали 5-кратным с интервалом в 1 день внутримышечным введением СК, разведенным 1:10 физиологическим раствором. Разрешающие дозы СК вводили внутрибрюшинно морским свинкам на 14 и 21 дни после последней сенсибилизации.
При изучении реакции гиперчувствительности замедленного типа морским свинкам подопытных групп на выстриженный участок кожи спины наносили СК. Реакцию кожи оценивали визуально по шкале кожных проб Суворова С.В.
Исследование влияния СК на массу и клеточность подколенного лимфоузла проведено на мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl6), которым в подушечки задних лап вводили СК или стерильный физиологический раствор (контроль). Через 7 дней у мышей определяли массу и клеточность подколенных лимфоузлов и вычисляли относительный индекс.
Статистическая обработка данных всех экспериментов проведена на компьютере ASUS A6000 Notebook PC с использованием программы Excel для Windows XP. Все результаты представлены в виде значений средних величин ± стандартных отклонений. Полученные в ходе экспериментов данные распределялись по нормальному закону, поэтому для оценки достоверности различий между контролем и опытом применяли критерий «t» Стьюдента и вычисляли коэффициент достоверности. Различия средних показателей считалось достоверным, если величина коэффициента достоверности соответствовала уровню значимости Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследование иммунотропного действия селекартена.
Проведенные исследования показали, что при различных схемах введения селекартен в диапазоне испытанных доз 10-100 мкг/кг стимулирует гуморальный иммунный ответ, регистрируемый по образованию АОК в селезенке иммунизированных эритроцитами барана мышей. В диапазоне указанных доз селекартен также стимулирует клеточный иммунитет, который наблюдался по усилению развития у мышей реакции гиперчувствительности замедленного типа. Следует отметить, что стимуляция селекартеном гуморального и клеточного иммунитета проявляет отчетливую дозовую зависимость. Результаты экспериментов представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Влияние селекартена на показатели гуморального иммунного ответа у мышей.
| Группы животных | Доза препарата, мкг/кг | Количество АОК на селезенку | Количество кариоцитов в селезенке, х108 | Количество АОК на 106 спленоцитов |
| 1 – контроль | 107кл/мышь | 6000±1672 | 1,2±0,26 | 50±13,5 |
| 2 – СК | 1 | 5650±788 | 1,48±0,53 | 38,17±5,34 |
| 3 – СК | 10 | 13000±1138* | 1,28±0,3 | 101,56±8,9* |
| 4 – СК | 100 | 11000±1068* | 1,18±0,43 | 93,22±8,3* |
* – здесь и во всех последующих таблицах обозначает статистически достоверные различия с контролем при Р<0,05.
Таблица 2. Влияние селекартена на показатели клеточного иммунного ответа у мышей.
| Группы животных | Доза препарата, мкг/кг | Толщина опытной лапки (мм) | Толщина контрольной лапки (мм) | Индекс ГЗТ |
| 1 – контроль | 0 | 3,3±0,3 | 2,2±0,23 | 1,5 |
| 2 – СК | 1 | 3,3±0,3 | 2,2±0,22 | 1,5 |
| 3 – СК | 10 | 3,8±0,3 | 2,3±0,23 | 1,68* |
| 4 – СК | 100 | 4,0±0,4 | 2,0±0,2 | 2* |
При профилактическом подкожном введении за 24 часа до заражения мышей летальной дозой Staphylococcus pyogenes селекартен предотвращает развитие смертельной стафилококковой инфекции у животных. В оптимальной дозе 1 мкг/кг СК повышает выживаемость мышей до 75 % при 84 % гибели в контроле. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
Таблица 3. Показатели устойчивости мышей-гибридов F1(CBAxC57Bl6) к стафилококковой инфекции.
| Группы животных | Доза препарата, мкг/кг | Количество погибших мышей | % выживших мышей | Продол-жительность жизни, сутки | Кратность увеличения продолжи-тельности жизни |
| 1 – контроль | - | 10 | 16,0 | 1,4±1,1 | - |
| 2 – СК | 1 | 3 | 74,9 | 6,9±0,7 | 4,9 |
| 3 – СК | 10 | 4 | 66,6 | 4,8±1,2 | 3,4 |
| 4 – СК | 100 | 6 | 50 | 3,2±1,5 | 2,3 |
В дозах 1 и 10 мкг/кг селекартен повышает, а в дозе 100 мкг/кг снижает фагоцитарную активность перитонеальных клеток мышей. При исследовании влияния селекартена в опытах in vivo на функциональную активность фагоцитарных клеток селезенки и периферической крови мышей было установлено, что препарат в дозах 10 и 100 мкг/кг подавляет образование перекиси водорода, регистрируемой с помощью индуцируемой люминолзависимой хемилюминесценции.
В опытах in vitro наиболее выраженное ингибирующее действие на образование перекиси водорода и супероксидного аниона СК проявляет в концентрации 100 мкг/мл. Указанные эффекты были зарегистрированы с помощью спонтанной люминолзависимой и зимозаниндуцируемой видов хемилюминесценции. Это свидетельствует о том, что СК проявляет антиоксидантную активность.
В экспериментах in vitro СК в концентрации 1 мкг/мл умеренно повышает пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека, в концентрациях 1 и 10 мкг/мл повышает продукцию ФНО- мононуклеарными клетками человека. В более высокой концентрации – 100 мкг/мл под влиянием СК наблюдается обратная реакция и отмечается подавление пролиферативной активности лимфоцитов, а также угнетение продукции этого цитокина.
2. Изучение антимикробного действия селекартена.
При изучении антимикробного действия установлено, что в разведении 1:5 СК полностью угнетает рост Pseudomonas aeruginosa (РА). В разведениях 1:10 и 1:15 СК частично ингибирует; в разведении 1:20 СК не влияет на рост РА.
СК в испытанных разведениях от 1:5 до 1:20 полностью подавляет рост золотистого стафилококка.
СК в разведении 1:5 полностью ингибирует рост Acinetobacter calcoaceticus. В больших разведениях СК не проявляет антимикробного действия в отношении Acinetobacter calcoaceticus.
СК в испытанных разведениях 1:5-1:20 ингибирует рост Escherichia coli.
3. Изучение противовирусного действия селекартена.
3.1. Исследование действия селекартена на вирусы гриппа А и В.
На первом этапе исследования противовирусной активности СК было установлено, что цитотоксическая концентрация препарата для вирусов гриппа А и В в культуре перевиваемых клеток почки спаниеля (МДСК) составляет 120 мкг/мл.
СК в низкой концентрации 1,5 мкг/мл обладает противовирусной активностью в культуре клеток МДСК в отношении вируса гриппа человека А (А/Калифорния/7/04(H3N2)) при внесении препарата за 2 ч до инфицирования клеток.
СК в концентрациях 30 и 48 мкг/мл проявляет противовирусную активность в культуре клеток МДСК в отношении вируса гриппа человека А (А/Калифорния/7/04(H3N2)) при внесении препарата одновременно с инфицированием клеток и при добавлении препарата в культуру клеток через 30 мин после их инфицирования.
СК в концентрации 60 мкг/мл обладает противовирусной активностью в культуре клеток МДСК в отношении вируса гриппа человека В (В/Гонконг/330/01), причем СК более эффективен при его внесении за 2 часа до инфицирования клеток.
Показано также, что СК в концентрации 80 мкг/мл ингибирует репликацию вирусов гриппа А/Н5 (A/утка/Приморье/2633/01(H5N3), А/утка/Приморье/2621/01(H5N2) и A/утка/Алтай/1285/91(H5N3)) в культуре клеток МДCK, снижая инфекционный титр вируса на 2,0-3,0 lg ТЦИД50/мл.
При этом 50 % ингибирующая концентрация (ИК50) СК для данных вирусов гриппа соответственно составляет 12,0 14,1, 17,5 мкг/мл соответственно. В то время как для стандартного лабораторного штамма вируса гриппа A/Aichi/68(H3N2) ИК50 СК установлена на уровне 9,8 мкг/мл.
Противовирусное действие CК в концентрациях 15, 30 и 60 мкг/мл на вирусы гриппа A/(H5N3) и А/(H5N2) в культуре клеток МДСК проявляется при внесении препарата за 2 и 0,5 ч до инфицирования, одновременно с инфицированием и через 0,5 ч после инфицирования. Наибольший противовирусный эффект регистрируется при внесении СК за 2 часа до инфицирования и снижается в зависимости от уменьшения времени контакта препарата с клетками МДСК.
Эксперименты на куриных эмбрионах, зараженных вирусом гриппа А/(H5N3), подтвердили выраженное противовирусное действие селекартена. Препарат в концентрации 120 мкг/мл оказывает существенное влияние на репликацию данного штамма вируса гриппа и проявляет вирулицидное действие.
Инфекционный титр вируса при одновременном введении препарата в концентрации 120 мкг/мл и вируса в куриные эмбрионы под влиянием СК снижается на 3,5 lg ЭИД50/0,1 мл.
При других схемах применения СК в концентрации 100 мкг/мл отмечалось снижение инфекционного титра вируса гриппа А/(H5N3) в куриных эмбрионах на 4,0-6,25 lg ЭИД50/0,1 мл. При увеличении концентрации СК до 120 мкг/мл отмечалось более выраженное снижение инфекционного титра вируса гриппа А/(H5N3) в куриных эмбрионах на 6,25 lg ЭИД50/0,1 мл.
Установлено также, что СК в концентрации 120 мкг/мл оказывает вирулицидное действие в отношении вирусов гриппа А/(H3N2) и В/Гонконг/330/01 при инкубировании в течение 1 ч и 24 ч в культуре клеток МДСК. Инкубирование в течение 1 ч сопровождается снижением титра вируса на 4,5 lg и 5,2 lg соответственно, в то время как после 24 часового инкубирования ВГ А инактивируется полностью, а вирус гриппа В инактивируется на 4,5 lg.
В экспериментах на мышах при профилактической схеме введения селекартена в дозах 1,6, 16,6 и 33 мкг/кг за 72, 48, 24, 1 час до инфицирования препарат оказывает выраженное защитное действие при экспериментальной пневмонии, вызванной вирусом гриппа А/Н5. В условиях опыта в испытанных дозах СК увеличивал выживаемость инфицированных мышей до 60-100 %. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.
Таблица 4. Профилактическое действие СК и на модели гриппозной пневмонии мышей, вызванной вирусом гриппа птиц А/Н5.
| Группы животных | Дозы препарата, мкг/кг | Количество животных | Выживаемость, % | Средняя продолжительность жизни, дни (М+m) |
| 1 – контроль | - | 10 | 30 | 6,3±1,1 |
| 2 – СК | 1,6 | 10 | 60 | 11,8±1,5 |
| 3 – СК | 16,6 | 10 | 100 | 14 |
| 4 – СК | 33,3 | 10 | 90 | 13±0,7 |
При лечебной схеме применения СК в дозах 16,6 и 33 мкг/кг при однократном пероральном назначении через 24, 48, 72 часа после инфицирования мышей вирусом гриппа А/Н5 для моделирования гриппозной пневмонии у мышей выживаемость животных в среднем составляла 60 % при 100 % гибели в контроле. Следует отметить, что при назначении СК с лечебной целью в испытанных дозах 16,6 и 33 мкг/кг у выживших после гриппозной пневмонии мышей в легких отмечались лишь единичные мелкоочаговые пораженные участки. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.
Таблица 5. Лечебное действие CК на модели гриппозной пневмонии мышей, вызванной вирусом гриппа птиц А/Н5.
| Группа животных | Дозы препарата, мкг/кг | Количество животных | Выживаемость, % | Средняя продолжительность жизни, дни (М+m) |
| 1 – контроль | - | 10 | 30 | 6,3±1,1 |
| 2 – СК | 16,6 | 10 | 60 | 11,1±1,1 |
| 3 – СК | 33,3 | 10 | 60 | 11,1±1,2 |
3.2. Исследование действия селекартена на вирус простого герпеса.
При изучении действия СК на вирус простого герпеса-1 установлено, что величине 50 % цитотоксической дозы (ЦД50) селекартена для культуры клеток Vero соответствует разведение препарата 1:80. Последующие разведения СК практически не оказывали влияния на вирус при визуальной оценке состояния клеточного монослоя. Чувствительность вируса к селекартену в культуре клеток MRC-5 оказалась выше. Видимые под микроскопом изменения клеточного монослоя выявлялись при использовании препарата в разведениях 1:320-1:640. Нибольшее из разведений 1:640 оказалось для вируса максимально переносимым.
При изучении прямого противогерпетического эффекта селекартена установлено, что максимальное подавление вирусного ЦПЭ (ИД95) достигается в разведениях вплоть до 1:800-1:1024. Средне-эффективное противовирусное действие (ИД50) СК сохранялось при разведении препарата 1:1600.
Установлено также, что под влиянием СК снижается инфекционный титр вируса в разведениях, не обладающих цитотоксическим эффектом. При использовании СК в разведении 1:640 величина инфекционного титра составляет 3,85±0,15 lg ТЦД50/мл, в контроле – 8,77±0,20 lg ТЦД50/мл. Снижение инфекционного титра на 4,92 lg ТЦД50/мл говорит о выраженной способности СК ингибировать репликацию вируса герпеса.
Это свидетельствует о том, что СК обладает способностью непосредственно инактивировать внеклеточный вирус герпеса простого, то есть препарат обладает выраженным вирулицидным действием. При контакте внеклеточного вируса с СК в разведениях от 1:200 до 1:1600 в течение 15, 30 и 60 минут наблюдается выраженное вирулицидное действие на вирус простого герпеса-1 – чувствительный (АЦВ-S) и резистентный (АЦВ-R) к ацикловиру.
3.3. Исследование действия селекартена на вирус гепатита С.
При изучении противовирусного действия СК в отношении вируса гепатита С в предварительных экспериментах установлено, что препарат обладает умеренной токсичностью на культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) и ЦД50 соответствует разведению СК 1:50.
Внесенный в культуру СПЭВ за 24 часа до ее инфецирования вирусом гепатита С селекартен в разведениях 1:50 и 1:100 защищает 100 % инфицированных клеток от цитопатогенного действия вируса при 100 % гибели клеток в необработанных препаратом инфицированных клеток. В этих условиях продукция вируса инфицированными клетками снижается на 6,1 и 4,1 lg соответственно.
СК в разведении 1:50 защищает 100 % клеток при внесении сразу же после их заражения вирусом гепатита С при 100 % гибели в контроле. При этом продукция вируса снижается на 3,0 lg.
СК в разведении 1:25 защищает 85 % клеток при внесении через 24 ч после заражения клеток при 100 % гибели в контроле и снижает продукцию инфекционного вируса на 3,3 lg. Результаты экспериментов представлены в таблицах 6 и 7.
Таблица 6. Жизнеспособность инфицированных культур клеток СПЭВ в условиях обработки селекартеном.
| Препарат | Время обработки культур клеток | Выживаемость ВГС инфицированных клеток (в %) при воздействии СК в разведениях: | ||||||
| 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | ||||
| СК | За 24 ч до заражения клеток | н.и. | 100 | 100 | 100 | 90 | ||
| Контроль | - | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| СК | В момент заражения клеток | н.и. | 100 | 25 | 25 | 5 | ||
| Контроль | - | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| СК | Через 24 ч после заражения клеток | 85 | 15 | 15 | 15 | 10 | ||
| Контроль | - | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Примечание: | н.и. – не исследовали. | |||||||
Таблица 7. Противовирусный эффект нетоксических доз СК, выявленного в условиях инфекции культур клеток СПЭВ, зараженных ВГС.
| Препарат | Время обработки культур клеток | Титр ВГС в среде инфицированных клеток (в lg ТЦД50/мл) при воздействии СК в разведениях: | ||||||
| 1:25 | 1:50 | 1:100 | 1:200 | 1:400 | ||||
| СК | За 24 ч до заражения клеток | н.и. | 3,0 | 5,0 | 8,0 | 8,5 | ||
| Контроль | - | 9,1 | 9,1 | 9,1 | 9,1 | 9,1 | ||
| СК | В момент заражения клеток | н.и. | 6,0 | 8,5 | 8,0 | 9,0 | ||
| Контроль | - | 9,0 | 9,0 | 9,0 | 9,0 | 9,0 | ||
| СК | Через 24 ч после заражения клеток | 6,0 | 8,0 | 9,0 | 8,0 | 8,0 | ||
| Контроль | - | 9,3 | 9,3 | 9,3 | 9,3 | 9,3 | ||
| Примечание: | н.и. – не исследовали. | |||||||
Установлено также, что СК обладает выраженными вирулицидными свойствами. СК в разведениях 1:50 и 1:100 полностью инактивирует активность вируса гепатита С в течение 15-, 30- и 45-минутной экспозиции. СК в разведении 1:200 полностью инактивирует активность данного вируса через 45 минут. Результаты экспериментов представлены в таблицах 8 и 9.
Таблица 8. Вирусиндуцированная гибель культур клеток СПЭВ (в %), зараженных ВГС после экспозиции в СК разных концентраций. (5-е сутки после заражения).
| Препарат | Разведения | Время экспозиции вируса в СК, мин | ||
| 15 | 30 | 45 | ||
| 1:50 | 0 | 0 | 0 | |
| СК | 1:100 | 0 | 0 | 0 |
| 1:200 | 50 | 25 | 0 | |
| Контроль | 0 | 100 | 100 | 100 |
Таблица 9. Способность продуцировать вирус клетками, зараженными ВГС после экспозиции в СК.
| Препарат | Разведения | Время экспозиции вируса в СК, мин | |||
| 15 | 30 | 45 | |||
| 1:50 | 0* | 0* | 0* | ||
| СК | 1:100 | 0* | 0* | 0* | |
| 1:200 | 2,5* | 1,0* | 0* | ||
| Контроль вируса | 0 | 5,7* | 5,0* | 5,3* | |
| Примечание: | * – титры ВГС в lg ТЦД50/мл в пробах среды культур клеток СПЭВ, зараженных вирусом гепатита С после экспозиции СК. | ||||
3.4. Исследование действия селекартена на вирус иммунодефицита человека.
В результате проведенных исследований установлено, что СК в дипазоне испытанных разведений 1:10-1:100 оказывает выраженное цитотоксическое действие на зараженные вирусом лимфобластные Т-клетки в культуре, вызывая их гибель. Эффект заметно снижается начиная с разведений 1:200. 50 %-ингибирующая концентрация (ИК50) препарата составляет 1:280.
СК в разведениях 1:200, 1:400, 1:800 и 1:1600 обладает противовирусным действием при всех схемах его введения: профилактической – за 24 ч до инфицирования, при одновременном введении СК и вируса, а также при внесении СК в культуру клеток через 24 ч после их заражения.
При профилактическом введении СК снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости более выражено и 90 %-эффективная концентрация соответствует разведению препарата 1:400 при его внесении за 24 часа до инфицирования клеток и при одновременном внесении с вирусом иммунодефицита человека. При внесении препарата после инфицирования клеток 50 %-ингибирующая концентрация СК соответствует его разведению 1:280.
Результаты исследования противовирусного действия СК в отношении вируса иммунодефицита человека представлены в таблицах 10 и 11.
Таблица 10. Исследование противовирусной активности СК на модели лимфобластных клеток человека МТ-4, инфиированных ВИЧ-1.
| Условия опыта | Жизнеспособность клеток, % | Количество клеток х 103/мл | ЦПЭ/синцитии, (+) | ||
| Внесение СК за 24 ч до инфицирования клеток | |||||
| Контроль клеток | 95 | 1500 | 0 | ||
| Контроль вируса | 28 | <300 | 4,0 | ||
| СК 1:200 | 65 | 699 | 0 | ||
| Внесение СК одновременно с инфицированием клеток | |||||
| Контроль клеток | 95 | 1500 | 0 | ||
| Контроль вируса | 33 | <300 | 4,0 | ||
| СК 1:200 | 67 | 733 | 0 | ||
| Внесение СК через 24 ч после инфицирования клеток | |||||
| Контроль клеток | 95 | 1500 | 0 | ||
| Контроль вируса | 21 | <300 | 4,0 | ||
| СК 1:200 | 67 | 699 | 0 | ||
Таблица 11. Исследование противовирусной активности СК на модели лимфобластных клеток человека МТ-4, инфиированных ВИЧ-1.
| Условия опыта | Жизнеспособ-ность клеток, % | Количество клеток х 103/мл | ЦПЭ/син-цитии, (+) | ИФА, (снижение уровня антигена), % | |||||
| Внесение СК за 24 ч до инфицирования клеток | |||||||||
| Контроль клеток | 91 | 2600 | 0 | - | |||||
| Контроль вируса | 39 | 833 | 4,0 | - | |||||
| СК 1:400 | 56 | 1339 | 1,0 | 85,4 | |||||
| СК 1:800 | 53 | 1199 | 1,5 | 42,2 | |||||
| СК 1:1600 | 51 | 2000 | 1,5 | 29,2 | |||||
| Внесение СК одновременно с инфицированием клеток | |||||||||
| Контроль клеток | 91 | 2600 | 0 | - | |||||
| Контроль вируса | 35 | 533 | 4,0 | - | |||||
| СК 1:400 | 59 | 2000 | 1,5 | 93,9 | |||||
| СК 1:800 | 51 | 1166 | 1,5 | 37,6 | |||||
| СК 1:1600 | 58 | 2366 | 2,0 | 20,4 | |||||
| Внесение СК через 24 ч после инфицирования клеток | |||||||||
| Контроль клеток | 91 | 2600 | 0 | - | |||||
| Контроль вируса | 31 | <300 | 4,0 | - | |||||
| СК 1:400 | 45 | 1066 | 3,0 | 67,5 | |||||
| СК 1:800 | 40 | 900 | 3,0 | 21,2 | |||||
| СК 1:1600 | 34 | 599 | 4,0 | 8,3 | |||||
Экспозиция исходного раствора СК с ВИЧ в течение 60 минут приводит к снижению инфекционного титра вируса на 5,0 lg ТЦД50, что соответствует инактивации вируса на 99,999 %. При 24-часовой экспозиции СК в разведениях 1:200, 1:400 и 1:800 с вирусом снижается инфекционный титр вируса на 7,0 lg ТЦД50. Результаты эксперимента представлены в таблице 12.
Таблица 12. Исследование вирулицидной активности СК (контакт препарата с внеклеточным, а затем инфицирование клеток).
| Препарат | Разведение | Степень ингибирования, log10 ТЦД50 | |
| 15-минутный контакт | |||
| 1:200 | 0 | ||
| 1:400 | 0 | ||
| СК | 1:800 | 0 | |
| 1:1600 | 0 | ||
| 1:3200 | 0 | ||
| 60-минутный контакт | |||
| 1:200 | 5,0 | ||
| СК | 1:400 | 1,0 | |
| 1:800 | 1,0 | ||
| 24-часовой контакт | |||
| 1:200 | 7,0 | ||
| СК | 1:400 | 7,0 | |
| 1:800 | 7,0 | ||
4. Токсикологические исследования.
4.1. Изучение токсичности СК при однократном введении лабораторным животным.
При доклиническом токсикологическом изучении установлено, что при однократном внутримышечном введении мышам линии BALB/c и крысам Wistar селекартен является малотоксичным препаратом. Показатели ЛД50 СК при разведении 1:5 физиологическим раствором составляют 51-66 мл/кг.
При этом не выявлено существенных видовых и половых различий в чувствительности указанных видов животных к токсическому действию препарата.
4.2. Изучение токсичности СК в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах.
При изучении токсичности СК при 3-месячном хроническом эксперименте, установлено, что ежедневное внутримышечное введение СК крысам Wistar в дозах 0,07 и 0,21 мл/кг (10- и 30-кратные высшие суточные терапевтические дозы, рекомендуемые для человека) в разведении 1:10 стерильным физиологическим раствором не влияет на общее состояние и поведение крыс, а также на гематологические и биохимические показатели. Полученные данные свидетельствуют о хорошей переносимости СК и об отсутствии его повреждающего действия (по данным биохимических тестов) на функциональное состояние важнейших органов и систем организма подопытных животных при длительном внутримышечном введении СК в испытанных дозах 0,07 и 0,21 мл/кг.
Длительное введение СК в дозах 0,07 и 0,21 мл/кг в разведении 1:10 физиологическим раствором в условиях 3-месячного хронического эксперимента в мышцы бедра животных не оказывало местно-раздражающего действия. При макро- и микроскопическом исследованиях внутренних органов и тканей крыс, получавших препарат в испытанных дозах 0,07 и 0,21 мл/кг, не выявлено токсических повреждений.
4.3. Исследование токсичности СК в условиях 1-месячного хронического эксперимента на собаках.
При изучении токсичности СК при 1-месячном хроническом эксперименте, установлено, что внутримышечное введение собакам СК ежедневно в дозе 0,07 мл/кг (10-кратная высшая суточная доза для человека) в разведении 1:10 стерильным физиологическим раствором не влияло на общее состояние и поведение животных, не изменяло функционального состояния важнейших органов и систем организма животных. Длительное введение СК в дозе 0,07 мл/кг в разведении 1:10 в мышцы бедра животных не оказывало местно-раздражающего действия. При макро- и микроскопическом исследованиях внутренних органов и тканей подопытных животных не выявлено изменений, связанных с токсическим действием препарата.
4.4. Изучение мутагенности СК.
При исследовании мутагенности СК устаановлено, что при изучении мутагенности СК на микроорганизмах в тесте Эймса препарат в испытанных концентрациях 0,1-1000 мкг/чашку и его метаболиты, образовавшиеся под влиянием микросомальной фракции S9, не обладают мутагенным действием.
Изучение влияния СК на индукцию доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей показало, что уровень постимлантационных потерь животных, подвергавшихся воздействию препарата, однократно, внутримышечно, в дозе 0,7 мл/кг, равной 100-кратной высшей суточной терапевтической для человека (0,007 мл/кг), не превышает показателей у контрольных животных.
Исследование цитогенетической активности СК методом учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей показало, что статистически достоверных различий в уровне хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, подвергавшихся воздействию препарата в испытанных дозах, по сравнению с контролем не установлено. По примененному тесту учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих СК не обладает мутагенной активностью.
При изучении влияния СК на систему репарации ДНК в SOS-хромотесте установлено, что препарат ни в одной из исследованных концентраций в диапазоне от 0,01 до 5 мг/мл не вызывал активацию репарации ДНК у E. coli PQ37, то есть не обладает ДНК-повреждающим действием. СК не обладает мутагенным действием, а также не является потенциальным канцерогеном.
4.5. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств СК.
При внутримышечном введении беременным крысам СК (в разведении физиологическим раствором 1:5) в дозе 0,21 мл/кг (30-кратная высшая суточная доза для человека) с 1 по 19 день гестации наблюдалось достоверное по сравнению с контролем замедление прибавки массы тела, уменьшение количество живых плодов, мест имплантации, желтых тел и массы тела эмбрионов, увеличение показателей предимплатационной гибели, задержка оссификации скелета плодов и уменьшение количества родившихся крысят. В связи с этим беременность следует считать противопоказанием для назначения препарата.
4.6. Изучение влияния СК на репродуктивную функцию крыс.
Внутримышечное введение СК в дозе 0,21 мл/кг в разведении 1:10 физиологическим раствором, что составило 30-ти кратную максимальную суточную терапевтическую дозу, рекомендованную для человека, не влияло на половую активность животных и на репродуктивные показатели, а также на постнатальное развитие крысят. Не выявлено влияния СК в исследуемой дозе на репродуктивную функцию здоровых половозрелых крыс.
4.7. Исследование аллергизирующих свойств СК.
Исследование анафилактогенной активности СК показало, что препарат в испытанных дозах при внутримышечном введении морским свинкам не вызывает анафилактического шока.
Как показали результаты проведенных исследований, реакция гиперчувствительности замедленного типа в испытанных дозах СК у морских свинок была отрицательна.
При оценке влияния СК на массу и клеточность подколенных лимфоузлов мышей установлено, что препарат не обладает аллергизирующими свойствами.
Полученные данные при исследовании иммунотропного действия селекартена на гуморальный и клеточный иммунитет свидетельствуют о иммуностимулирующем действии препарата и об отсутствии у него иммунотоксичности.
ВЫВОДЫ
1. Комплексный растительный препарат селекартен обладает иммуномодулирующими свойствами, в диапазоне испытанных доз 10-100 мкг/кг стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, повышает фагоцитарную активность, пролиферацию лимфоцитов и продукцию ФНО- мононуклеарными клетками человека.
2. В экспериментах in vitro селекартен в разведениях 1:5-1:20 ингибирует рост Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter calcoaceticus.
При профилактическом введении в дозе 1 мкг/кг за 24 часа до заражения мышей летальной дозой Staphylococcus pyogenes селекартен повышает выживаемость животных до 75 % при 84 % гибели в контроле.
3. Селекартен при различных схемах введения (до, во время и после заражения клеточных культур) проявляет выраженную противовирусную активность в отношении патогенных для человека и животных вирусов: гриппа А и В, вирусов птиц A/H5, вирус простого герпеса-1 (включая его чувствительный и резистентный к ацикловиру штаммы), вирусы гепатита С и иммунодефицита человека.
4. В опытах in vitro эффективные цитотоксические концентрации и разведения селекартена зависят от вида вируса и составляют 80-120 мкг/мл для вирусов гриппа А и В, 1:800-1:1024 для вируса простого герпеса-1, 1:50-1:100 для вируса гепатита С и 1:200-1:800 для вируса иммунодефицита человека-1. В испытанных в дозах 1,6, 16,6 и 33 мкг/кг селекартен при вирусной пневмонии увеличивает выживаемость мышей до 60-100 % при 100% гибели в контроле.
5. Селекартен является малотоксичным препаратом при однократном парентеральном введении лабораторным животным и хорошо переносится при длительном внутримышечном введении крысам Wistar (3 месяца) и собакам (1 месяц), не оказывает повреждающего действия на основные органы и системы организма подопытных животных и не проявляет местнораздражающего действия.
Селекартен не обладает мутагенностью и ДНК-повреждающим действием, не является потенциальным канцерогеном. В испытанных дозах и схемах введения препарат не проявляет аллергизирующих и иммунотоксических свойств.
При назначении беременным крысам селекартен обладает эмбриотоксичностью, в связи с чем беременность является противопоказанием к назначению препарата.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Результаты проведенных экспериментальных исследований комплексного растительного препарата селекартен, показавшие его выраженное иммуностимулирующее действие на гуморальный и клеточный иммунитет, антимикробные и противовирусные эффекты на ряд возбудителей заболеваний человека и животных, свидетельствуют о важности и целесообразности проведения клинических испытаний препарата при некоторых бактериальных и вирусных инфекциях, а также для коррекции патологических нарушений в системе иммунитета.
2. Полученные данные свидетельствуют о перспективности применения использованного подхода для создания новых эффективных комплексных растительных препаратов на основе фармакопейных растений с добавлением биологически активных компонентов растительной или другой природы.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Гундорова Р.А., Иванов А.Н., Плетнев В.В. Медикаментозная терапия сосудистых заболеваний глаза. (Монография).// – М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2009. – 200 с.
2. Плетнев В.В., Пинегин Б.В., Мастернак Т.Б., Елкина С.И., Никонова М.Ф., Харченко Т.Ю. Изучение иммуномодулирующего действия селекартена.// Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 1. – с. 53-59.
3. Плетнев В.В. Фармакологическая активность комплексного растительного препарата селекартен. (Монография).// – М.: «ЛЕНАНД», 2012. – 258 с.
4. Плетнев В.В., Рязанцев И.А., Дудина Н.В. Иммуномодулирующий препарат. (Патент РФ на изобретение).// – 27.02.2007. – № 2294209.
5. Носик Д.Н., Плетнев В.В., Калнина Л.Б., Кисилева И.А. Исследование влияния селекартена на вирус иммунодефицита человека.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012 – с. 544.
6. Пинегин Б.В., Плетнев В.В., Мастернак Т.Б., Никонова М.Ф. Влияние селекартена на гуморальный и клеточный иммунитет у мышей.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – с. 553.
7. Плетнев В.В., Галегов Г.А., Андронова В.Л. Изучение действия селекартена на вирус герпеса простого.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – с. 554.
8. Плетнев В.В., Дерябин П.Г. Исследование противовирусной активности селекартена в отношении вируса гепатита С.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – с. 554.
9. Хорошилова-Маслова И.П., Плетнев В.В., Иванов А.Н. Антимикробное действие селекартена на Pseudomonas Aeruginosa.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – с. 594.
10. Ямникова С.С., Плетнев В.В., Федякина И.Т., Ломакина Н.Ф., Бурцева Е.И., Шевченко Е.С. Противовирусная активность селекартена на модели гриппозной пневмонии мышей.// Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2012. – с. 603.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
| АОК | антителобразующие клетки |
| МДСК | перевиваемые клетки почки спаниеля |
| МНК | мононуклеарные клетки |
| ТЦД50 | 50 %-тканевая цитопатическая доза |
| ЦПД | цитопатическое действие |
| ЦПЭ | цитопатический эффект |
| Подписано в печать 14.01.2013 г. Заказ № 3972 Тираж 100 шт. Отпечатано в типографии «АллА-принт» г. Москва, Лубянский пр-д., д. 21, стр. 5 www.allaprint.ru |
