Состояние локального иммунитета и фосфорно-кальциевого обмена у детей с кариесом
На правах рукописи
Милехина Светлана Алексеевна
Состояние локального иммунитета
и фосфорно-кальциевого обмена у детей с кариесом
14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Владивосток – 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Маркелова Елена Владимировна
Официальные оппоненты:
Скляр Лидия Федоровна доктор медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Кузнецова Татьяна Алексеевна доктор медицинских наук, заведующая лабораторией иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» СО РАМН
Ведущая организация
Государственное бюджетное учреждение Высшего профессионального образования «Первый Московский медицинский университет им. И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита диссертации состоится 25 мая 2012 года в 10.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.007.02 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития РФ по адресу: 690002, г. Владивосток, проспект Острякова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Владивостокский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Автореферат разослан 22 апреля 2012 года
Ученый секретарь
диссертационного совета Шаркова Валентина Александровна
Общая характеристика работы
Актуальность исследования. Кариес зубов относится к числу наиболее распространенных болезней человечества, существенно влияющих на состояние здоровья. Как свидетельствуют материалы исследований, стоматологическая заболеваемость среди детского населения России на протяжении нескольких лет остается весьма высокой (Елизарова В.М., 2006; Виноградова Т.Ф., 2008; Кисельникова Л.П., 2009; Кузьмина Э.М., 2010). Многие исследователи считают, что развитие воспалительного процесса в пульпе связано с воздействием микроорганизмов (Леонтьев В.К. с соавт., 2007, Московский А.В., 2009). Клинико-экспериментальные исследования подтверждают зависимость между нарушениями факторов врожденного и/или адаптивного иммунитета и интенсивностью кариозного процесса (Елизарова В.М., 2006; Зырянов Б.М. с соавт., 2006; Китаева Е.В., 2009; Кисельникова Л.П., 2010).
Однако, ряд вопросов по разному трактуется авторами (Горбунова Л.И., 2006; Кузьмина Д.А. с соавт., 2009,2010; Гилязева В.В., 2010). Не изучен вопрос о взаимосвязи факторов местной резистентности полости рта с гуморальными факторами врожденного и адаптивного иммунитета, нарушениями фосфорно-кальциевого обмена.
Цель исследования: на основе мониторинга и анализа особенностей цитокинового спектра и фосфорно-кальциевого обмена дать клинико-иммунологическое обоснование комплексной терапии кариеса у детей.
Задачи исследования:
- Анализ динамики уровня провоспалительных (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО) и противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-13) цитокинов и растворимых рецепторов ФНО и ИЛ-6 в сыворотке крови и слюне детей.
- Определить содержание секреторного IgA в слюне детей разных групп.
- Исследовать уровень металлопротеиназы 9 (ММР-9) и ее комплекса с тканевым ингибитором (ММР-9/ТIМР-II) в слюне детей с кариесом.
- Определить содержание кальция, фосфора, ионизированного кальция в сыворотке крови и в слюне детей.
- Изучить содержание гормонов и биомаркеров регуляции фосфорно-кальциевого обмена в сыворотке крови детей разных групп.
- Провести клинико-иммунологическую оценку эффективности применения кальция, комбинированного с витамином Д3, при лечении кариеса.
Научная новизна. Проведен комплексный анализ локального и системного цитокинового статуса, локального уровня металлопротеиназы-9, ее комплекса с тканевым ингибитором II типа и состояния фосфорно-кальциевого обмена у детей с кариесом. Получены новые научные данные об иммунопатогенезе кариеса у детей.
Установлена сопряженность интенсивности кариеса с повышением локального коэффициента ИЛ-1/ИЛ-10, уровнем ионизированного кальция и недостаточностью витамина Д3.
Показано, что локальное повышение sIgA, комплекса матриксной металлопротеиназы-9 с ее тканевым ингибитором и остеокальцина крови имеет защитно-приспособительное значение, обеспечивая протективную роль и усиления активности остеобластов, что способствует повышению устойчивости к кариесу.
Практическая значимость работы. Уточнение патогенеза кариеса с выявлением сопряженности иммунного дисбаланса и нарушений фосфорно-кальциевого обмена позволило разработать дополнительные диагностические и прогностические критерии развития кариеса, оптимизировать терапию кариеса для предупреждения его прогрессирования.
Дано клинико-иммунологическое обоснование включения в схемы терапии кальция, комбинированного с витамином Д3, у детей с субкомпенсированным кариесом.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. У детей с кариесом установлены нарушения локального иммунитета, коррелирующие с интенсивностью процесса. Гиперпродукция противовоспалительных цитокинов, тканевого ингибитора металлопротеиназы II типа и sIgА выполняет защитно-приспособительную роль.
2. При кариесе, особенно субкомпенсированной форме, нарушения фосфорно-кальциевого обмена характеризуются одновременной активацией остеокластов и остеобластов, сопряжены с недостаточностью 25-гидроксивитамина Д3 и нарушениями локальной и системной иммунорегуляции.
3. Включение в программу терапии кальция, комбинированного с витамином Д3, обеспечивает нормализацию большинства показателей фосфорно-кальциевого обмена, способствует уменьшению дисбаланса оппозитных цитокинов и повышает эффективность терапии кариеса на 32,5%.
Апробация результатов исследования. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях, симпозиумах, олимпиадах, форумах международного, российского и регионального уровней.
«Первой Всероссийской студенческой олимпиаде по дентальной имплантологии и профилактике стоматологических заболеваний» (Владивосток, 2004); «VIII Российской конференции иммунологов Урала» (Сыктывкар, 2010); «Аллергология и клиническая иммунология – практическому здравоохранению» (Москва, 2010); «Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», (Абакан, 2011); На межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); XII Дальневосточном международном симпозиуме стоматологов «Новые технологии в стоматологии» (Владивосток, 2005); VIII-XI Тихоокеанских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых с международным участием: «Актуальные проблемы экспериментальной, клинической и профилактической медицины» (Владивосток, 2008-2011); «Современные алгоритмы диагностики, терапии, наблюдения и профилактики аллергических заболеваний у детей» (Владивосток, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 2 методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах текста компьютерного набора, содержит введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследования, три главы собственных исследований, заключение, выводы, рекомендации практическому здравоохранению, иллюстрирована 23 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 352 источник, в том числе 245 отечественных и и 107 иностранных авторов. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО ВГМУ Минздравсоцразвития России, номер государственной регистрации 0120.0 950480.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
I этап: Проведено проспективное комплексное клинико-лабораторное обследование 300 практически здоровых детей в возрасте от 7 до 14 лет, обратившихся на амбулаторный прием в стоматологический кабинет клиники в период углубленного медицинского осмотра.
II этап: На основе критериев включения и исключения углубленно обследовано 104 человека с установленным диагнозом кариес в возрасте
7-14 лет, разного пола и 20 человек с интактными зубами (здоровые дети, группа контроля).
Критерии исключения: возраст до 7 и старше 14 лет; обострения хронических и острых заболеваний; системные иммунодефициты; прием антибиотиков в течение последнего месяца; иммунодепрессивная, иммуномодулирующая, гормональная, кислотoингибирующая, противосудорожная терапия; заболевания пародонта и слизистой оболочки ротовой полости; декомпенсированная форма кариеса; лечение ребенка брекет – системами; самопроизвольное прекращение препарата; отказ пациентов от дальнейшего обследования.
III этап: Проведена клинико-иммунологическая оценка лечебной тактики: дети с субкомпенсированным кариесом (42 человека).
Материалом исследования служили сыворотка крови и нестимулированная слюна. Большинство исследований проводились в динамике до и после лечения.
Направления исследования предоставлены на рис. 1.
Рис. 1. Материалы и направления исследований
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакетов прикладных программ «Statistica 6» и «SPSS v.16». Из числа основных характеристик для используемых групп после оценки характера распределения величины вычисляли: среднюю арифметическую (М), стандартное отклонение (), достоверность различий между двумя средними величинами определяли по таблице Стьюдента с учетом уровня значимости (р). При ненормальном распределении рассчитывали медиану, верхний и нижний квартиль, а статистическую достоверность различий оценивали по Манна-Уитни. Оценку эффективности терапии осуществляли с применением критерия Вилкоксона. Для определения направления и формы связи между признаками, измерению ее тесноты и оценки статистической значимости различий полученных результатов, использовали методы корреляционного анализа между количественным (r Пирсона) и качественными признаками – критерий 2, Спирмена.
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке цитокинового профиля смешанной слюны у детей с кариесом установлено, что в общей группе статистически значимо повышен уровень как провоспалительных (ФНО, ИЛ-1), так и противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-13) цитокинов по сравнению с контролем. Тогда как содержание ИЛ-6, растворимых рецепторов ФНО II типа, -субъединицы ИЛ-6 оказалось в пределах нормы. Не было выявлено существенных возрастных и половых различий большинства показателей локального цитокинового профиля. Исключение составили только
ИЛ-6 и ФНО RII. Содержание ИЛ-6 в слюне было выше у девочек обеих возрастных групп, а значения ФНО RII было статистически значимо низким у девочек в возрасте 11-14 лет по сравнению с контрольной группой. У детей, нуждающихся в санации полости рта, определено не только увеличение локального уровня ФНО, ИЛ-1, ИЛ-10, ИЛ-13, но и повышен уровень растворимого рецептора ИЛ-6 и снижение содержания ФНО RII. Содержание ИЛ-1 и ИЛ-10 в слюне детей основных подгрупп (санированных и нуждающихся в санации) в среднем мало отличалось, однако, при расчете индивидуальных коэффициентов соотношения этих цитокинов выявлено существенное увеличение ИЛ-1/ИЛ10 у детей, нуждающихся в лечении кариеса. Это подтверждает мнение большинства исследователей (Симбирцев А.С., 2004; Хаитов Р.М. с соавт., 2010) о необходимости определения соотношений уровня цитокинов с разными функциональными свойствами, что позволяет оценить относительный дефицит или гиперпродукцию изучаемых медиаторов. Соответственно, у детей, нуждающихся в санации ротовой полости, в слюне определена относительная гиперпродукция провоспалительного цитокина ИЛ-1. Патогенетически важным является его способность активировать остеокласты, что способствует усилению проницаемости и резорбции кости (Симбирцев А.С., 2011). В культуре клеток ИЛ-1 увеличивает продукцию ПГЕ2, ИЛ-6 и ИЛ-8 остеобластами и генерацию остеокластов в культуре клеток костного мозга (Назаров П.Г., 2000).
При анализе локального содержания противовоспалительных цитокинов у детей с разной интенсивностью кариеса выявлены существенные различия (табл.1).
Таблица 1
Показатели цитокинового профиля смешанной слюны у детей с различной интенсивностью кариеса
| Исследованные цитокины (М±, пг/мл) | Группы детей с кариесом | |||
| Санированные (n=33) | Нуждающиеся в санации (n=71) | |||
| Компенсирован-ный кариес (n=26), р1 | Субкомпенсиро-ванный кариес (n=7), р2 | Компенсированный кариес (n=29), р3 | Субкомпенсиро-ванный кариес (n=42), р4 | |
| ФНО | 4,28±1,06 | 18,64±10,15* | 20,64±9,64*** | 37,12±18,34*** р1-4<0,05 |
| ФНОRII | 110,46±24,50 | 90,82±21,16 | 97,64±30,61 | 70,52±24,15* р1-4<0,05 |
| ИЛ-1 | 53,50±9,58*** | 65,72±11,50* | 68,95±12,54** | 83,51±17,93** |
| ИЛ-6 | 11,26±2,16 | 13,42±3,54 | 20,84±6,84 | 38,18±7,06*** р1-4<0,05 р2-4<0,05 |
| ИЛ-6SR | 136,72±26,10 | 168,40±34,20 | 132,00±20,32 | 209,72±21,61*** р1-4<0,05 р3-4<0,01 |
| ИЛ-10 | 439,31±186,53** р1-2<0,05 | 166,82±63,33 р2-3<0,001 | 1011,91±258,85*** р1-3<0,05 р3-4<0,001 | 288,90±86,35* р1-4<0,05 р2-4<0,05 |
| ИЛ-13 | 115,34±93,64* | 58,11±40,65 р2-3<0,05 | 276,12±132,74** р1-3<0,05 р3-4<0,05 | 105,45±54,32* р2-4<0,05 |
Примечание: статистическая значимость различий с контрольной группой: р<0,05 - *, р<0,01 - **, р<0,001 - ***, р1, р2, р3, р4 – сравниваемые группы
При субкомпенсированном кариесе статистически значимо увеличено содержание в слюне ФНО (r=0,8; р<0,05) с недостаточностью его растворимого рецептора (r= -0,64; р<0,05) в группе детей, нуждающихся в санации. В этой группе детей также установлено повышение ИЛ-6 (r=0,76; р<0,76) и его растворимого рецептора (r= 0,81; р<0,02). Установлено, что уровень ИЛ-10 в слюне был выше при компенсированном кариесе, как в группе детей с санированной полостью рта, так и в группе, нуждающихся в лечении (r= -0,84; р<0,01). ИЛ-10 способен ингибировать синтез провоспалительных цитокинов и свободных радикалов кислорода и азота, представление антигенов макрофагами и дендритными клетками (Казимирчук В.Е. с соавт., 2009). ИЛ-10 ингибирует выброс различных хемокинов нейтрофильными гранулоцитами, синтез ими провоспалительных цитокинов, циклооксигеназы-2 и ПГЕ2 (Симбирцев А.С. с соавт., 2004). Показана так же активация им продукции иммуноглобулинов G4 и А (Хаитов Р.М. с соавт., 2011). Одним из механизмов супрессии клеточного иммунного ответа ИЛ-10 является его участие в генерации регуляторных Т-клеток (Т reg) и поддержании их функций. Для оценки сопряженности прогрессирующего течения кариеса и коэффициента соотношения ИЛ-1/ИЛ-10 был использован 2. Проведенный анализ позволил установить, что увеличение коэффициента более 1,6 может служить дополнительным иммунологическим критерием субкомпенсированного кариеса. Полученные данные свидетельствуют о важной защитной роли ИЛ-10 в предупреждении усиления активности кариеса.
При оценке уровня другого противовоспалительного цитокина – ИЛ-13 в слюне детей с кариесом установлено снижение его содержания при субкомпенсированной форме как у детей с санированной полостью рта, так и у нуждающихся в лечении. Это, вероятно, отражает активацию клеточно-опосредованного компонента иммунитета в ротовой полости детей с субкомпенсированным кариесом.
При анализе уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО, ИЛ-6) в сыворотке крови детей с кариесом по сравнению с аналогичными показателями у здоровых сверстников, установлено статистически значимое повышение только содержания ИЛ-1. Оценка содержания растворимых рецепторов ФНО II типа и ИЛ-6 позволила выявить разнонаправленную динамику: определено снижение (р<0,01) уровня ФНО RII и, напротив, практически двукратное увеличение уровня растворимых рецепторов ИЛ-6 (р<0,001). Снижение уровня ФНО RII при нормальных значениях самого цитокина может приводить к усилению биологической активности ФНО.
Функция же специфической для ИЛ-6 рецепторной субъединицы заключается не в ингибиции ИЛ-6, а, напротив, в его активации. Это явление получило название транссигналинга (Назаров П.Г., 2001). В связи, с чем увеличение количества растворимого рецептора ИЛ-6 в сыворотке крови свидетельствует об усилении активности ИЛ-6.
В группе детей с компенсированным кариесом, санированной полостью рта, цитокиновый профиль крови был сопоставим с контрольными значениями. За исключением уровней растворимого рецептора ИЛ-6, который был выше значений контрольной группы (р<0,001). При субкомпенсированном кариесе, но санированной полости рта, уровень цитокинов так же был в пределах нормы. Тогда как уровень исследованных растворимых рецепторов изменялся. Нарастало содержание растворимого рецептора ИЛ-6 и существенно снижалось содержание ФНО RII. Это, как уже отмечалось выше, отражает усиление провоспалительной активности ФНО и ИЛ-6, и может способствовать прогрессированию кариеса.
Таким образом, в группе детей, нуждающихся в санации зубов, при компенсированном течении кариеса было выявлено умеренное увеличение ИЛ-1 в крови, снижение растворимого рецептора ФНО II типа и высокое содержание растворимого рецептора ИЛ-6. Наиболее выраженное нарушение цитокинового профиля крови зарегистрировано у детей с субкомпенсированным кариесом и несанированной полостью рта. Установлена гиперпродукция ФНО, ИЛ-1, существенное увеличение растворимого рецептора ИЛ-6 и дефицит растворимого рецептора ФНО II типа. Корреляционный анализ выявил прямую зависимость интенсивности кариеса с уровнем в сыворотке крови ИЛ-1 (r= 0,44; р<0,05); растворимым рецептором ИЛ-6 (r= 0,63; р<0,05) и обратную – с содержанием растворимого рецептора ФНО II типа (r= -0,72; р<0,05).
Полученные данные демонстрируют системность нарушений иммунорегуляции у детей с кариесом. При компенсированном кариесе первоначально возникает перенапряжение регуляторных механизмов с дисбалансом уровня растворимых рецепторов (ФНО II типа и ИЛ-6), что способствует реализации провоспалительных свойств этих цитокинов. При субкомпенсированном кариесе системные нарушения усугубляются. В крови определяется абсолютное повышение провоспалительных цитокинов на фоне еще более выраженного дисбаланса их растворимых рецепторов.
Нами не найдено работ, в которых исследовался уровень ММР-9 и ее ингибитора при кариесе. Проведенное исследование ММР-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором II типа показало, что уровень металлопротеиназы повышен при субкомпенсированном кариесе, особенно у детей, нуждающихся в санации полости рта (рис. 2).
Рис. 2. Локальный уровень ММР-9 и ее комплекса с тканевым ингибитором II типа в зависимости от интенсивности кариеса
При этом активация продукции тканевого ингибитора с образованием комплекса с ММР-9 внутри группы выше (р<0,05-0,001) при компенсированном кариесе. У детей с субкомпенсированным кариесом количество этого комплекса, хотя и превышало значения контроля, относительно снижено. Расчет коэффициента соотношения количества матриксной металлопротеиназы к ее комплексу с тканевым ингибитором зафиксировал максимально высокие (р<0,01) значения у обследованных с активным, несанированным субкомпенсированным кариесом. Установлена прямая корреляция значений этого комплекса и интенсивности при несанированном кариесе (r=0,76; р<0,05), что свидетельствует о значительном повышении продукции ММР-9 по сравнению с уровнем ее тканевого ингибитора. Полученные результаты демонстрируют важную роль нарушений межклеточного матрикса в патогенезе кариеса у детей.
При оценке содержания секреторного IgA в слюне детей было выявлено его повышение в группе детей с кариесом по сравнению с контрольной группой. Более высокие показатели sIgA были в слюне детей старшей возрастной группы (р<0,01). Эта закономерность не зависела от пола. Его уровень был статистически значимо выше при компенсированном кариесе. Выявлена обратная корреляция sIgА и интенсивности кариеса (r= - 0,58; р<0,05), что свидетельствует об его относительной недостаточности при субкомпенсированном кариесе. Это, на наш взгляд, подтверждает мнение авторов (Агаева Н.А. с соавт., 2004) об активации продукции sIgA микробной флорой ротовой полости и защитно-приспособительном значении повышения этих иммуноглобулинов.
Устойчивость зубов к кариесу определяется в первую очередь составом и свойствами эмали. По результатам количественного анализа слюны установлено, что концентрация кальция в ней у детей с кариесом всех исследуемых групп по сравнению с контрольными величинами возрастала. Однако по уровню Са общего различия не достигали статистически значимых величин. Тогда как количество ионизированного Са2+ существенно (р<0,05) повышено у детей, нуждающихся в санации зубов. Увеличение его содержания свидетельствует об активном кариесе, который сопровождается выходом Са2+ из зубов, то есть деминерализации. Локальная концентрация фосфора мало менялась у детей исследованных групп. У детей с кариесом, нуждающихся в санации, зафиксировано значительное изменение соотношения кальция к фосфору (1:1,2 против 1:1,52 в группе контроля, р<0,01), что по мнению В.К. Леонтьева (2007) является неблагоприятным фактором, так как процессы реминерализации не находятся на оптимальном уровне. При субкомпенсированном кариесе увеличено содержание ионизированного кальция, что отражает выраженные процессы потери кальция из тканей зубов при множественном активном кариесе.
Результаты наших исследований могут, в известной степени, объясняться межфракционным перераспределением Са в связи с подкислением зубного налета и смешанной слюны, что резко уменьшает количество белково-связанного Са и соответственно увеличивает в них уровень Са2+,, что подтверждает мнение Ю.А. Петрович (1977). Не исключен и другой механизм – выпадение гидроксиапатита в осадок (Скрипкина Г.И., 2011), что приводит к снижению концентрации фосфатов и увеличению уровня кальция.
Современный уровень лабораторных исследований позволяет изучить тонкие механизмы нарушений фосфорно-кальциевого обмена и костного метаболизма.
В результате нашего исследования не было выявлено статистически значимых различий содержания минеральных веществ в крови в зависимости от пола и возраста детей с кариесом за исключением нарушения соотношения Са2+/Р в крови мальчиков 7-10 лет по сравнению со здоровыми сверстниками, что свидетельствует в пользу относительной недостаточности ионизированного кальция в сыворотке крови у этой категории детей с кариесом. Важно было оценить уровень гормонов и медиаторов, регулирующих фосфорно-кальциевый обмен. Существенных различий содержания в сыворотке крови обследованных детей паратгормона и кальцитонина не обнаружено, но при сравнении с контрольной группой установлено, что уровень паратгормона относительно повышен у детей в возрасте 11-14 лет независимо от пола.
Анализ уровня 25-гидроксивитамина Д3 позволил констатировать его снижение в крови большинства детей с кариесом по сравнению с контрольной группой. При этом у детей, нуждающихся в санации, выявлены наиболее низкие значения, в 21,1% – ниже границ референсных величин, что в целом позволяет говорить об относительном дефиците этого биологически активного вещества у детей с активным кариесом. Не исключено, что это один из механизмов гиперактивации продукции цитокинов Т-клетками этих пациентов (Казимирчук В.Е. с соавт., 2009). Показатели 25-гидроксивитамина Д3 ниже у мальчиков обеих возрастных групп (р<0,01). Выявлена прямая корреляционная связь средней силы между уровнем кальцитонина и 25-гидроксивитамина Д3 у детей с кариесом (r=0,6; р<0,05).
При субкомпенсированном кариесе установлено умеренное снижение содержания кальция в крови на фоне относительной недостаточности витамина Д3 и компенсаторного увеличения паратгормона. Это можно объяснить функцией паратгормона активировать в костной ткани остеокласты, стимулируя резорбцию кости и выход кальция во внеклеточную жидкость с целью регуляции его системного уровня. Считаем, что недостаточность витамина Д3 является важным патогенетическим фактором, инициирующим нарушения цитокинового профиля и фосфорно-кальциевого обмена.
Нами зафиксировано статистически значимое повышение секреции остеокальцина (маркера остеосинтеза) у детей с кариесом всех групп детей. У детей с кариесом, нуждающихся в санации, содержание остеокальцина также было высоким по сравнению с контролем, но статистически значимо ниже, чем у детей с санированной полостью рта (115,5±1,8 нг/мл против 129,3±1,2 нг/мл, р<0,001), что свидетельствует о процессах перенапряжения механизмов, обеспечивающих реминерализацию зубов и костной ткани. При этом у пациентов множественным кариесом определено относительное снижение его продукции, что в совокупности с другими метаболическими нарушениями свидетельствует об истощении защитно-компенсаторных механизмов и способствует преобладанию процессов резорбции костной ткани. Результаты корреляционного анализа цитокинового статуса и фосфорно-кальциевого обмена представлены на рисунке 3.
Рис.3. Корреляция цитокинового спектра и показателей фосфорно-кальциевого обмена
Полученные данные свидетельствуют о нарушении остеосинтеза у детей с кариесом. Это опосредовано влиянием цитокинового дисбаланса и нарушением локальной и системной иммунорегуляции. Провоспалительные цитокины стимулируют продукцию металлапротеиназы-9, обезвреживание которой ее тканевым ингибитором недостаточно. Это приводит к поддержанию порочного круга иммуно-метаболических нарушений и деструкции тканей зуба. Проведя анализ собственных данных и результатов, опубликованных другими авторами, считаем, что у детей при кариесе, независимо от степени его интенсивности, наблюдается снижение минеральной плотности костей и изменение биохимических показателей минерального и костного обмена, что свидетельствует о системном характере поражения костной ткани у этих пациентов. Степень выраженности этих изменений возрастает пропорционально степени интенсивности кариеса.
На III этапе исследования детей, с субкомпенсированным кариесом, нуждающихся в санации, распределили на 2 подгруппы. Детям обеих групп проводили санацию полости рта с применением современных композитных материалов и глубокое фторирование зубов. Детям первой подгруппы (основной – 21 человек), в схему терапии был включен кальций, комбинированный с витамином Д3 в суточной дозе 1000 мг (Кальций Д3, Никомед). Особенность его заключается в том, что он содержит карбонат кальция, который по усвояемости в 10 раз превышает глюконат кальция и содержит витамин Д3, способствующий усвоению кальция (Древаль А.В., 2008). Его применяли по 2 таблетки 1 раз в сутки (после 16 часов) в течение двух месяцев. Повторно детей обследовали через 6 месяцев. Эффективность результатов лечения оценивали по клиническим (прирост интенсивности кариеса, редукция кариеса) и лабораторным данным (всем исследованным показателям фосфорно-кальциевого обмена и локального цитокинового профиля).
Прирост кариеса в контрольной группе (Мк), получавших санацию зубов и их глубокое фторирование составил Мк=37. Прирост кариеса в основной группе (М), составил М=12. Редукция прироста кариеса достигла 67,5%. Проведенный анализ позволил установить, что в основной группе клиническая эффективность терапии была выше на 32,5%, по сравнению с группой детей, не получивших терапию кальцием, комбинированным с витамином Д3.
Анализ лабораторных данных позволил констатировать, что через 6 месяцев от начала лечения у детей основной подгруппы, получавших кальций, комбинированный с витамином Д3, статистически значимо увеличилось содержание в крови кальция (общего и ионизированного) и 25-гидроксивитамина Д3 (р<0,05). Важно также отметить, что у них несколько снижался уровень паратгормона, достигая значений контрольной группы детей (табл. 2).
Не зафиксировано статистически значимых изменений фосфора и кальцитонина в крови детей этой подгруппы после комплексного лечения.
Таблица 2.
Показатели фосфорно-кальциевого обмена у детей с субкомпенсированным кариесом после терапии кальцием, комбинированным с витамином Д3
| № | Исследуемые показатели (М±m) | Группы детей | |||
| 1 (основная) группа (n=21) | 2 (сравнения) группа(n=21) | ||||
| до лечения | через 6 месяцев | до лечения | через 6 месяцев | ||
| Содержание в сыворотке крови | |||||
| 1 | Кальций общий ммоль/л | 2,0±0,06* | 2,26±0,05# | 2,20±0,10 | 2,15±0,15 |
| 2 | Са2+ ммоль/л | 1,10±0,05** | 1,27±0,04 # | 1,20±0,04 | 1,20±0,05 |
| 3 | Фосфор неорганический ммоль/л | 1,79±0,20 | 1,52±0,08 | 1,64±0,08 | 1,72±0,10 |
| 4 | Паратгормон пг/мл | 50,20±3,24* | 42,30±1,40• | 46,10±2,10* | 52,30±3,60** |
| 5 | Кальцитонин пг/мл | 5,23±1,60 | 5,0±0,80 | 5,50±1,80 | 5,20±1,20 |
| 6 | Остеокальцин нг/мл | 110,40±12,50* | 120,30±2,60*• | 120,50±7,6* | 106,40±4,2* |
| 7 | 25-гидрокси- витамина Д3 ммоль/л | 26,0±2,62* | 38,20±1,60 # • | 29,40±2,38* | 27,0±0,60* |
| Содержание в слюне | |||||
| 1 | Кальций общий ммоль/л | 1,52±0,15* | 1,20±0,06# • | 1,41±0,16 | 1,48±0,080* |
| 2 | Са2+ ммоль/л | 1,0±0,12* | 0,62±0,05# | 0,90±0,14* | 0,96±0,11* |
| 3 | Фосфор неорганический ммоль/л | 1,40±0,10* | 1,67±0,06 | 1,45±0,15 | 1,50±0,10 |
Примечание: статистическая значимость различий (p) с контрольной группой: * - p<0,05;
# – значимость различий в группах после терапии (р<0,05), • – значимость различий между сравниваемыми группами (р<0,05)
Содержание остеокальцина сохранялось на высоком уровне, превышающем контрольные значения (р<0,05) и было выше, чем в подгруппе сравнения (р<0,05). Оценка локального уровня минералов позволила установить нормализацию этих показателей у пациентов, получавших комплексную терапию. У них уменьшалось содержание в слюне кальция (как общего, так и ионизированного) до уровня контрольной группы, что свидетельствует о восстановлении процессов реминерализации зубов. Во второй подгруппе детей, прошедших только санацию полости рта (местное лечение кариеса с их глубоким фторированием), через 6 месяцев показатели системного кальций-фосфорного обмена изменялись мало. В то же время при сравнении двух подгрупп выявлено усугубление недостаточности
25-гидроксивитамина Д3, нарушений продукции паратгормона и остеокальцина (табл. 1).
Исследование локального цитокинового статуса до и после терапии кариеса с включением в его схему кальция, комбинированного с витамином Д3, позволило выявить статистически значимое снижение уровня ФНО и повышение его растворимого рецептора II типа в слюне детей. Оба этих показателя достигали значений контрольной группы. Важным также является снижение до уровня контроля ИЛ-6 и его растворимого рецептора. Не установлено статистически значимых изменений количества ИЛ-1, ИЛ-10 и ИЛ-13 в слюне детей, через 6 месяцев (табл. 3).
Таблица 3
Динамика цитокинового профиля слюны после применения кальция, комбинированного с витамином Д3
| № п/п | Исследованные показатели (М±), пг/мл | Группы детей | |||
| 1 (основная), (n= 21) | 2 (сравнения), (n=21) | ||||
| До лечения | Через 6 месяцев | До лечения | Через 6 месяцев | ||
| 1 | ФНО | 42,16±23,50* | 4,20±2,31 рw<0,02 ; р1<0,05 | 36,54±17,24* р2>0,05 | 30,00±10,80* рw>0,05 |
| 2 | ФНОRII | 62,82±30,46* | 98,34±20,86 рw <0,048; р1<0,05 | 74,37±28,41* р2>0,05 | 62,86±37,52* рw>0,05 |
| 3 | ИЛ-1 | 96,27±28,15* | 56,34±30,26* рw >0,05; р1<0,05 | 84,15±27,82* р2>0,05 | 102,34±30,24* рw>0,05 |
| 4 | ИЛ-6 | 34,72±10,22* | 20,84±12,16 рw >0,05; р1<0,05 | 40,64±8,56* р2>0,05 | 48,25±14,68* рw>0,05 |
| 5 | ИЛ-6SR | 228,80±43,12* | 154,20±36,22 рw <0,048; р1<0,05 | 200,64±30,84* р2>0,05 | 266,15±40,24* рw>0,05 |
| 6 | ИЛ-10 | 270,22±106,33* | 180,38±40,64 рw>0,05; р1>0,05 | 320,71±120,43* р2>0,05 | 200,86±86,15 рw<0,02 |
| 7 | ИЛ-13 | 98,62±60,84* | 80,42±26,14* рw >0,05; р1>0,05 | 154,80±71,26* р2>0,05 | 106,34±42,24* рw>0,05 |
Примечание: статистическая достоверность различий с контрольной группой - р<0,05-*;
рw - статистическая достоверность различий в группе после терапии; р1 - статистическая достоверность различий после лечения между группами; р2 - статистическая достоверность различий до лечения между группами
В группе сравнения не выявлено статистически значимых изменений локального цитокинового статуса, за исключением уровня ИЛ-10, содержание которого снижалось (р<0,02).
Исследование содержания матриксной металлопротеиназы-9 в слюне детей двух подгрупп позволило зафиксировать снижение (р<0,02) ее уровня только в I (основной) подгруппе. Не выявлено статистически значимых различий комплекса ММР-9/МIМР-II в обеих группах. Однако, при оценке соотношения ММР-9 к ее комплексу с тканевым ингибитором II типа выявлена разнонаправленная динамика: в 1 подгруппе этот показатель статистически значимо снижался, а во второй, напротив, возрастал.
Анализ динамики sIgА в слюне детей на фоне терапии кариеса позволил зарегистрировать нарастание его содержания только в слюне детей, получавших кальций, комбинированный с витамином Д3 (рис. 4).
Рис. 4. Динамика уровня иммуноглобулина А в слюне детей с кариесом до и после применения кальция, комбинированного с витамином Д3
Таким образом, проведенные исследования показали, что при применении комплексной терапии прирост интенсивности кариеса был меньше на 67,5% по сравнению с подгруппой сравнения. Включение в терапию детей с субкомпенсированным кариесом кальция комбинированного с витамином Д3, приводит к статистически значимому увеличению в крови (до уровня контроля) кальция (общего и ионизированного) и 25-гидроксивитамина Д3, а также снижению содержания паратгормона. Это обеспечило нормализацию локального содержания кальция (общего и ионизированного) и фосфора у детей на фоне терапии кальцием, комбинированным с витамином Д3. Выявлено смещение баланса цитокинов в пользу противовоспалительных медиаторов, что активировало гуморальный иммунитет с увеличением продукции sIg A.
ВЫВОДЫ
1. У детей с кариесом выявлен дисбаланс цитокинового профиля сыворотки крови с превалированием провоспалительных медиаторов. При субкомпенсированном кариесе определена гиперпродукция ФНО, ИЛ-1, увеличение растворимых рецепторов ИЛ-6 и дефицит растворимых рецепторов ФНО II типа.
2. Локальный цитокиновый профиль при компенсированном кариесе характеризуется активацией противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ИЛ-13), которые индуцируют выработку секреторного IgА (r=0,82; 0,81; р<0,05). При субкомпенсированном кариесе определено истощение продукции противовоспалительных цитокинов, увеличение ФНО, ИЛ-6, его растворимого рецептора и дефицит растворимого рецептора ФНО II типа.
3. Установлено увеличение sIgА в слюне детей с кариесом, особенно в возрастной группе 11-14 лет. Выявлена относительная недостаточность sIgА у детей с субкомпенсированным кариесом.
4. Провоспалительные цитокины индуцируют избыточную продукцию матриксной металлопротеиназы-9, недостаточно контролируемую ее тканевым ингибитором II типа, что способствует усилению проницаемости и нарушению структур зуба.
5. В сыворотке крови детей с кариесом, нуждающихся в санации, определена относительная недостаточность кальция общего и статистически значимое снижение соотношения ионизированного кальция к неорганическому фосфору. Локально (в слюне) установлено увеличение содержания ионизированного кальция и снижение кальций фосфорного соотношения. Наиболее выраженные локальные нарушения выявлены у детей с субкомпенсированным кариесом, нуждающихся в санации ротовой полости.
6. При субкомпенсированном кариесе в сыворотке крови выявлено умеренное снижение содержания кальция на фоне относительной недостаточности витамина Д3 и компенсаторного увеличения паратгормона. Показатели 25-гидроксивитамина Д3 ниже у мальчиков обеих возрастных групп (р<0,01). Выявлена прямая корреляционная связь средней силы между уровнем кальцитонина
и 25-гидроксивитамина Д3 у детей с кариесом (r=0,6; р<0,05). Определено повышение секреции остеокальцина у детей с кариесом всех групп.
7. Включение в терапию детей с субкомпенсированным кариесом кальция комбинированного с витамином Д3, приводит к статистически значимому увеличению в крови (до уровня контроля) кальция (общего и ионизированного) и 25-гидроксивитамина Д3, а также к нормализации локального содержания кальция (общего и ионизированного) и его соотношения с фосфором, смещению баланса цитокинов в пользу противовоспалительных медиаторов и увеличению sIgА. Клиническая эффективность возросла на 32,5%.
Рекомендации для внедрения в медицинскую науку и практику
1. Нарушения фосфорно-кальциевого обмена у детей с кариесом сопряжены с дисфункцией системы цитокинов, активацией продукции матриксной металлопротеиназы и относительной недостаточностью секреторного IgА.
2. Дополнительным критерием субкомпенсированного кариеса у детей является повышение соотношения ИЛ-1/ИЛ-10 в слюне выше 1,6.
3. Рекомендуется включение в программу терапии детей с субкомпенсированным кариесом кальция, комбинированного с витамином Д3, по 1000 мг 1 раз в день в течение 2 месяцев. Его применение уменьшает иммуно-метаболические нарушения и повышает эффективность терапии на 32,5%.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Маркелова Е.В., Милехина С.А., Шушанян Л.С. Роль локального цитокинового дисбаланса в патогенезе кариеса у детей // Фундаментальные исследования. - 2011. - №5. – С. 104-108
2. Милехина С.А. Кариес зубов у детей: значение локальных нарушений кальций-фосфорного обмена // Фундаментальные исследования. -2011. - №10. – С. 314-318
3. Милехина С.А. Состояние местного иммунитета у детей с кариесом // Российский аллергологоческий журнал, 2009. - №3. – С. 157
4. Милехина С.А. Состояние фосфорно-кальциевого обмена у детей с кариесом // Сборник статей. Актуальные вопросы аллергологии в педиатрии и терапии. Владивосток: ИПК МГУ, 2009. - С.51-57
5. Милехина С.А., Цатурова Е.Г. Оценка локального содержания ИЛ-6 и его растворимого рецептора в слюне детей с кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Владивосток: Медицина ДВ, 2009. – С. 54-55
6. Ончукова Е.А., Стариковская Ю.С., Милехина С.А. Оценка уровня кальция и фосфора в слюне детей с кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Владивосток: Медицина ДВ,
2009. – С. 57
7. Милехина С.А., Мордвинцева А.А., Осадчая Н.Ю. Провоспалительные цитокины и sIgA в слюне детей разных групп здоровья // Российский аллергологический журн. – 2010. - №1, вып. 1. – С. 121-122
8. Мордвинцева А.А, Милехина С.А. Оценка содержания цитокинов во взаимосвязи с уровнем кальция и фосфора в слюне детей с кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. – Владивосток: Медицина ДВ, 2010. – С. 245-246
9. Осадчая Н.Ю., Милехина С.А. Определение состояния кальций-фосфорного обмена у детей с кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. – Владивосток: Медицина ДВ, 2010. – С. 245-246
10. Милехина С.А. Провоспалительные цитокины и sIgA в слюне детей c кариесом // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2010. - №2/1 - С.172
11. Милехина С.А. Оценка провоспалительных цитокинов и sIgA в слюне детей с кариесом // Российский аллергологический журн. - 2010. - №5, вып. 1 –
С. 186-187
12. Шушанян Л.С., Милехина С.А. Цитокиновый профиль в слюны детей с субкомпенсированным кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Владивосток: Медицина ДВ,
2011. – С 69
13 Мартышко О.О., Милехина С.А. Исследование показателей фосфорно-кальциевого обмена в ротовой жидкости у детей с кариесом // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Владивосток: Медицина ДВ, 2011. – С. 357-358
14. Василенко И.А., Милехина С.А. Роль продукции TNF и его растворимых рецепторов TNF-RI и TNF-RII в патогенезе кариеса у детей // Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины. Владивосток: Медицина ДВ, 2011. – С. 356
15. Подшивалова А.В., Милехина С.А. Дополнительные критерии оценки течения кариеса у детей // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международ. участием «Дни иммунологии в Сибири» Абакан. - 2011. - С.27-28.
16. Милехина С.А., Русакова Е.Ю., Маркелова Е.В. Патогенетическая терапия нарушений кальций-фосфорного обмена у детей с кариесом зубов (методические рекомендации). - Владивосток: ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского,
2011. – 16 с.
17. Маркелова Е.В., Милехина С.А., Русакова Е.Ю. Оценка локального цитокинового профиля детей для дополнительной диагностики субкомпенсированного кариеса (методические рекомендации). - Владивосток: ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского, 2011. – 12 с.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИДС — иммунодефицитное состояние
ИМ — иммуномодуляторы
ИФН — индукторы интерферона
ИФА — иммуноферментный анализ
КПУ – коэффициент интенсивности кариеса (кариес, пломба, удаленные)
CTL — цитотоксические Т-лимфоциты
Ig — иммуноглобулин
IL (ИЛ) — интерлейкин
IL-6 SR — растворимый рецептор к интерлейкину-6
IRF (interferon regulatory factor) — фактор регуляции активности интерферона
ММР-9 — матриксная металлопротеиназа-9
ММР-9/TIMP-II — комплекс матриксной металлопротеиназы-9 с тканевым ингибитором II типа
NK — натуральные киллеры
sTNF RII — растворимый рецептор фактора некроза опухоли
TGF — трансформирующий фактор роста
Th1 — Т-хелперы первого типа
Th2 — Т-хелперы второго типа
TNF — фактор некроза опухоли
МИЛЕХИНА
Светлана Алексеевна
СОСТОЯНИЕ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА
И ФОСФОРНО-КАЛЬЦИЕВОГО ОБМЕНА
У ДЕТЕЙ С КАРИЕСОМ
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Подписано в печать 21.03.2012. Формат 60х84/16.
Бумага писчая. Уч.- изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ №343
Отпечатано в типографии ИПК МГУ им. адм. Г.И. Невельского
690059 г. Владивосток, ул. Верхнепортовая, 50а
