аскаров манарбек бапович трансплантация аутологичных клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка 14.00.41 – трансплантология и искусственные органы 14.00.16 – патологическая ...

На правах рукописи

Аскаров Манарбек Бапович

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЛИТЕЛЬНО НЕЗАЖИВАЮЩИХ ЯЗВ ЖЕЛУДКА

14.00.41 – трансплантология и искусственные органы

14.00.16 – патологическая физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва - 2009

Работа выполнена в ФГУ Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий

Научные консультанты:

Академик РАН и РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор Нина Андреевна Онищенко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Сергей Николаевич Шурыгин

доктор медицинских наук,

профессор Геннадий Николаевич Сушкевич

доктор медицинских наук,

профессор Игорь Михайлович Ильинский

Ведущее учреждение: ФГУ Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Росздрава

Защита состоится «___»____________ 2009 г. в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.055.01 при ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий.

Автореферат разослан: «___»_____________2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Ольга Павловна Шевченко

ВВЕДЕНИЕ

В последние 10-15 лет в связи с развитием клеточных технологий и пробудившимся в мире интересом к регенерационным свойствам стволовых клеток костного мозга, появилась возможность их легитимного применения у больных с тяжелой хронической патологией. Клеточные биотехнологии стали использовать для лечения острой и хронической сердечной недостаточности [Шумаков В.И и др., 2003, 2004; Assmus B. et al., 2002], ряда гнойно-септических и аутоиммунных заболеваний [Витязев Г.А., 1993; Шумаков В.И и др., 1995, 1998; Онищенко Н.А и др., 2006], острой и хронической печеночной недостаточности разного генеза [Parekkadan B. et al., 2007], длительно незаживающих язв, ран и ожогов [Колосов Н.Г и др., 2000; Расулов М.Ф., 2007; Badiavas E. et al., 2003] и др.

Для клеточной трансплантации используют гемопоэтическую или стромальную фракции клеток аутологичного костного мозга (КМ), которые содержат стволовые и прогениторные клетки [Kusmartsev S. et al., 1998; Terrazas L. et al., 2001; Caplan A. et al., 1997]. Эффективность гемопоэтических клеток КМ обусловлена иммунорегуляторной активностью, выделяемых ими биорегуляторных пептидов [Terrazas L. et al., 2001]. Эффективность стромальной фракции клеток КМ, обусловлена не только тем, что эти клетки секретируют широкий спектр цитокинов и ростстимулирующих факторов, но и тем, что являясь предшественниками мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), они способны активно пролиферировать в культуре, дифференцироваться в мезенхимальные клетки других фенотипов и непосредственно участвовать в процессах восстановительной регенерации поврежденных тканей [Потапов И.В и др., 2005; Amado L. et al., 2005; Parekkadan B. et al., 2007; Caplan A. et al., 2008]. Кроме того, известно, что ММСК КМ могут участвовать в регуляции дифференцировки Т-клеток, вызывают супрессию пролиферации эффекторных клеток (цитотоксических Т-лимфоцитов, натуральных киллеров), а также, ограничивают дифференцировку дендритных клеток [Fallarino F. et al., 2002; Aggarwal S., 2005], способствуя ингибированию системной воспалительной реакции. Именно благодаря регуляторным эффектам пептидов, продуцируемых клетками КМ, оказалось оправданным их применение при лечении многих хронических заболеваний, сопровождающихся угнетением репаративных процессов, иммунной дизрегуляцией и развитием вторичного иммунодефицита [Шумаков В.И и др., 2004; Расулов М.Ф., 2007; Parekkadan B. et al., 2007].

К таким заболеваниям относится и язвенная болезнь (ЯБ) желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК), поиск путей повышения эффективности лечения которой является по – прежнему актуальной задачей современной медицины, ибо ЯБ остается одним из самых распространенных и социально значимых хронических рецидивирующих заболеваний желудочно– кишечного тракта по срокам временной и стойкой нетрудоспособности больных [Ивашкин В.Т., 2004., Васильченков А.В., 2006; Захараш М.П и др., 2009].

При ЯБ желудка и ДПК имеет место местный иммунный дисбаланс, в результате чего начинает реализовываться патогенное действие Helicobacter pylori (Hp), которые часто (до 80-90%) бессимптомно инфицируют слизистую желудка и ДПК [Мансуров Х.Х., 2005; Васильченков А.В., 2006; Borody T., 2002], но в условиях иммунодефицита предопределяют хроническое течение заболевания [Логинов А.С., 1998; Циммерман Я.С., 2000].

Пораженная ткань в области язвенного дефекта настолько изменяет индивидуальную биологическую принадлежность, что приобретает свойства аутоантигена [Чернин В.В., 2000], а в условиях иммунодефицита становится фактором активизации и прогрессирования аутоиммунных процессов, отягощающих течение заболевания и развитие осложнений [Кириченко Б.Б., 1990]. Дизрегуляция иммунной системы поддерживает деструктивно-воспалительные изменения в зоне язвенного дефекта и ингибирует пролиферативно-репаративную фазу регенераторного процесса, что связано с нарушением не только синтеза структурных белков, но и синтеза молекул межклеточного взаимодействия (пептиды) [Потапова В.Б., 2004]. В этой связи, для улучшения результатов лечения через устранение дизрегуляции иммунной системы при ЯБ стали использовать пептиды селезенки, доставляемые в организм больного путем экстракорпорального подключения донорской свиной селезенки (ЭКПДС) или в виде нативных пептидов из селезенки свиньи (Спленопид) [Васильченков А.В., 2006] и клеток КМ (Миелопид) [Михайлова Л.П., 1998]. Однако экстракорпоральное подключение донорской селезенки свиньи связано с организационными трудностями заготовки донорского материала, а также с иммунологическими проблемами и опасностью переноса трудно диагностируемых инфекций у животных. Применение нативных пептидов (Спленопид, Миелопид) ограничивается их ксенногенным происхождением, а также необходимостью курсового применения препаратов, производство которых имеет ограниченные масштабы и пока не может обеспечить потребности всех больных. Кроме того, все еще присутствует опасность переноса трудно диагностируемых инфекций.

Для клеточной терапии ЯБ желудка и ДПК использовали также трансплантацию фетальных клеток печени, селезенки и тимуса [Стрункин Д.Н. и др. 2000]. Однако применение фетальных клеток остается нелегитимным в связи с нерешенностью этических и юридических проблем забора и использования этого материала.

Выше изложенные ограничения побудили нас для стимуляции устойчивого заживления хронических язв желудка через регуляцию местных и системных иммунных механизмов репаративного морфогенеза – использовать регенерационные возможности стволовых клеток, и прежде всего, ММСК КМ, из-за возможности их легитимного и аутологичного применения.

Однако, приступая к этим исследованиям, мы не обнаружили работ, касающихся применения клеток аутологичного костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка. Кроме того, мы не только не обнаружили сведений о влиянии клеток костного мозга на состояние показателей иммунного (цитокинового) статуса организма и на связь иммунного (цитокинового) дисбаланса с состоянием регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка, но и не обнаружили адекватной модели аутоиммунных длительно незаживающих язв желудка для изучения этих вопросов.

Отсутствие в литературе выше указанных сведений и важность учета их для разработки эффективной терапии длительно незаживающих язв желудка позволили нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Цели и задачи исследования

Цель исследования – изучить и обосновать целесообразность трансплантации в слизистую оболочку желудка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и фракции мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга для обеспечения устойчивой регенерации длительно незаживающих язв желудка

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создать модель длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка и изучить иммунопатологические механизмы развития язвенной болезни, а также выбрать наиболее информативные показатели для контроля эффективности клеточной терапии длительно незаживающих язв желудка.

2. Отработать технологию выделения клеток из аутологичного костного мозга, идентифицировать в культуре получение мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и показать целесообразность их предварительного культивирования у животных с хроническими язвами желудка для восстановления функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.

3. Изучить особенности процессов репаративной регенерации длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка (ДНЯЖ) при трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных и мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного костного мозга.

4. Показать на моделях ДНЯЖ взаимосвязь активизации регенераторных процессов в язве желудка с присутствием в ней трансплантированных клеток. 5. Изучить влияние ММСК костного мозга на состояние микроциркуляторного русла, содержание биологически активных веществ (ПГЕ2) и циклических нуклеотидов, а также на апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка при ДНЯЖ и клеточной терапии.

6. Установить влияние клеток аутологичного костного мозга на коррекцию иммунного (цитокинового) статуса и восстановление морфофункциональных компартментов органов иммуногенеза (тимуса и селезенки) у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами при клеточной терапии.

7. Установить предпочтительность использования прекультивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток перед мононуклеарными клетками аутологичного костного мозга в качестве более эффективного средства патогенетической терапии у больных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами желудка и двенадцатиперстной кишки.

Научная новизна

В настоящей работе, выполнявшейся в рамках программы «Клеточные технологии – медицине» по заданию Росздрава (регистрационный номер – 01.2.00 305442) впервые представлены патогенетически обоснованные результаты применения прекультивированных клеток аутологичного костного мозга для эффективного лечения длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка.

Впервые разработана модель аутоиммунной длительно незаживающей язвы желудка, позволяющая изучить иммунопатологические механизмы развития хронической язвы в слизистой оболочке желудка и влияние на них клеточной терапии.

Впервые в эксперименте для ускоренного заживления аутоиммунных ДНЯЖ применены культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных и мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга и выявлена предпочтительность (более высокая эффективность) ММСК.

Показано, что при использовании клеток аутологичного костного мозга при лечении ДНЯЖ необходимо проводить предварительное культивирование этих клеток для восстановления их биорегуляторной активности, ингибированной хроническим заболеванием. Установлен оптимальный срок культивирования ММСК костного мозга (9-12 суток), при котором восстанавливается до нормы цитокиновый баланс и пролиферативная активность клеток. С помощью рекомбинантного аденовирусного вектора (содержащего LacZ ген E.coli), внедренного в клетки (аутологичные ММСК) на этапе культивирования, доказано, что ускорение темпа регенерации ДНЯЖ после трансплантации клеток костного мозга связано с присутствием и функционированием (продукция факторов роста, цитокинов) их в зоне язвенного дефекта (в сроках не менее 30 суток).

Установлено, что аутологичные прекультивированные ММСК КМ, трансплантированные в зону язвенного дефекта, ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ (сокращение сроков и выраженности деструктивно-воспалительной фазы и активизация пролиферативно-регенераторной фазы язвенного процесса) и это происходит за счет усиления ангиогенеза, улучшения микроциркуляции, активизации регуляции в системе «простагландины–циклические нуклеотиды» и ингибирования процессов клеточного апоптоза.

Показано, что ММСК и МНК костного мозга устраняют иммунный (цитокиновый) дисбаланс в организме и восстанавливают морфофункциональные компартменты органов иммуногенеза (тимус и селезенка), дисфункция которых развивается при хронической длительно незаживающей аутоиммунной язве желудка и становится фактором ее хронического течения. На клиническом и экспериментальном биопсийном материале иммуногистохимически и электронно–микроскопически подтвержден цитотоксический эффект лимфоцитов (CD8+;CD16+) в отношении фибробластов собственной пластинки слизистой оболочки желудка и установлено снижение активности молекулярного маркера иммунорегуляторных клеток–FOXP3, что подтверждает важное патогенетическое значение глубокой иммунной дизрегуляции в организме при развитии ДНЯЖ.

Практическая значимость работы

Разработана модель аутоиммунной длительно незаживающей язвы желудка у крыс, на которой могут быть изучены иммунопатологические механизмы развития хронических язв желудка, типичных для патологии человека. Разработанная модель может быть использована для скрининга медикаментозных препаратов, пригодных для лечения язв желудка, а также для разработки оптимальных режимов применения клеточной терапии.

Установлена необходимость и оптимальные сроки прекультивирования клеток костного мозга при аутологичном применении для эффективного лечения ДНЯЖ. Показано, что аутологичный костный мозг после предварительной подготовки может служить источником оптимального биоматериала для эффективной клеточной терапии ДНЯЖ, так как клетки костного мозга, особенно ММСК, продуцируют широкий спектр разнообразных биорегуляторных пептидов и факторов роста и способны возместить дефицит их регуляторных функций в организме у больных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами.

Показана необходимость включения в комплексную терапию язвенной болезни иммунокорректоров, так как доказано, что в патогенезе ДНЯЖ иммунопатологические (аутоиммунные) механизмы занимают ведущую роль.

Основные положения, выносимые на защиту

- Предварительное культивирование клеток костного мозга in vitro – важный этап подготовки клеток при проведении клеточной терапии хронической длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка, так как устраняет дисрегуляторное влияние на них хронического патологического процесса и восстановливает биорегуляторную активность.

- Культивированные in vitro и трансплантированные в слизистую оболочку желудка аутологичные ММСК или МНК КМ, ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой смены фаз язвенного процесса: сокращения сроков и выраженности деструктивно-воспалительной фазы и активизации пролиферативно-регенераторной фазы язвенного процесса, что обусловлено длительным (30 суток – срок исследования) функционированием трансплантированных клеток в зоне язвенного дефекта.

- Трансплантированные клетки костного мозга (ММСК и МНК) способствуют эффективной регенерации ДНЯЖ путем усиления процессов ангиогенеза и улучшения микроциркуляции в слизистой оболочке желудка, восстановления регуляции иммунного (цитокинового) гомеостаза в организме и местной регуляции системы «простагландины – циклические нуклеотиды», а также ингибирования апоптоза эпителиоцитов.

Внедрение результатов работы

Разработанная модель экспериментальной язвы желудка с аутоиммунным компонентом и технология приготовления водно–солевого антигена для ее моделирования внедрены и используются в научно – исследовательской работе: лаборатории патологической физиологии ГУ ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г. Москвы; в лаборатории иммуноморфологии воспаления ГУ НИИ морфологии человека РАМН, г.Москва; в лаборатории клеточных технологий ГУН Центр биомедицинских технологий РАМН, г.Москва. Результаты экспериментальной работы используются в лекционном курсе на кафедре трансплантологии и искусственных органов ММА им. И.М. Сеченова, а также приняты за основу при разработке медицинских клеточных технологий для лечения больных с язвенной болезнью в ГУ ГКБ им. С.П.Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы.

Апробация диссертации

Апробация работы состоялась 7 октября 2008 года на межлабораторной конференции в ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи.

Основные положения работы доложены и обсуждены: на Международной конференции «Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов» (Казахстан, г. Астана, ноябрь 2005г.); на 7съезде Научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, март 2007г.); на Научной конференции «Клеточные технологии в травматологии и ортопедии» (г. Москва, апрель 2007); на Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г. Москва, май 2007); на 8 съезде Научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, март 2008); на 15 Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, апрель 2008); на Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г. Москва, май 2008); на Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (г.Москва, июнь 2008); на Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященной 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ (г.Самара, июнь 2008); на 4 Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (г. Москва, 9-10 ноября 2008); на 9 съезде Научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, 2-5 марта 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 35 работ, в том числе 10 работ в центральной печати и 2 главы в монографии. По теме диссертации получены решения о выдаче патентов на 2 изобретения: № 2007128128/14 (030617) от 11.11.2008г и № 2007128125/14 (030614) от 09.02.2009г.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 251 странице компьютерного текста. Состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы (492 источника, из них 277 – отечественных и 215 – зарубежных). Работа иллюстрирована 61 рисунком и 17 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Общая характеристика экспериментального и

клинического материала

Экспериментальный раздел работы выполнен на 687 лабораторных животных: 670 крысах-самцах Вистар массой 250-300г, а также на 17 трансгенных мышах B 10. GFP, которых содержали в виварии ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологий при свободном доступе к пище и воде, на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа.

Экспериментальный раздел состоит из 3-х основных частей (табл. 1). В 1 части работы проводилась отработка методов культуральных исследований и моделирования ДНЯЖ. Во 2 части работы была дана цитохимическая характеристика фенотипических свойств культур, подготовленных и использованных для трансплантации. В 3 разделе работы производили изучение патогенетических нарушений при развитий ДНЯЖ и процессов репаративной регенерации этих язв с помощью клеток КМ. В 1 разделе работы было выполнено 5 групп исследований: отрабатывалась технология получения первичных культур МНК и ММСК и выбор сроков их прекультивирования; отрабатывалась техника мечения ММСК в культуре; идентификация пригодности использования флуоресцирующих ККМ от трансгенных мышей В. 10 GFP; отрабатывалась технология приготовления водно-солевого антигена и моделирования с его помощью длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка. Всего в 1 разделе работы было использовано 552 животных. Во 2 разделе работы была дана цитоморфологическая и цитохимическая характеристика клеток, подготовленных для трансплантации: ММСК КМ, ММСК, меченых геном LacZ и ММСК от трансгенных мышей В. 10 GFP, содержащих ген зеленого белка. Всего во втором разделе работы было израсходовано 60 животных. В 3 разделе работы было выполнено 3 группы исследований: определение сроков формирования монослоя при культивировании ММСК от животных с ДНЯЖ, а также выявление терапевтических эффектов аутологичных мононуклеарных клеток и ММСК при лечении животных с ДНЯЖ.

Таблица 1. Распределение животных (крысы Вистар и мыши B 10.GFP), по разделам экспериментальной работы

Разделы работ	Выполненные исследования	Вид животных	Всего
1 Отработка методов культуральных исследований и моделирования ДНЯЖ	Получение и ведение первичных культур ММСК КМ и их прекультивирование	Крысы-самцы, мыши B 10.GFP	30 7
	Получение и ведение первичных культур МНК КМ и их прекультивирование	Крысы-самцы	30
	Отработка техники мечения ММСК КМ в культуре и способов идентификации клеток	Крысы-самцы, мыши B 10.GFP	35 10
	Приготовление водно-солевого антигена для моделирования ДНЯЖ	Крысы-самцы	350
	Моделирование ДНЯЖ и изучение иммунопатогенетических механизмов их формирования*	Крысы-самцы	90
2 Изучение фенотипических характеристик клеточных культур in vitro и жизнеспособности клеток in vivo после трансплантации	Характеристика мезенхимальных клеточных культур для определения степени их зрелости	Крысы-самцы	25
	Идентификация ММСК, маркированных LacZ геном и ММСК от трансгенных мышей, содержащих ген GFP, в культуре и в зоне язвенного дефекта после трансплантации	Крысы-самцы, мышиB10.GFP	35 15**
3 Изучение процессов регенерации и устранения патогенетических нарушений ДНЯЖ на фоне клеточной терапии	Изучение сроков формирования монослоя ММСК КМ при ДНЯЖ	Крысы-самцы	30
	Трансплантация суспензий ММСК КМ в зону язвенного дефекта	Крысы-самцы	30
	Трансплантация суспензий МНК КМ в зону язвенного дефекта	Крысы-самцы	15
Итого:			687
*- Исследование проводилось параллельно и на биопсийном материале от больных с ДНЯЖ **- Были использованы мыши из первого раздела работы

При моделировании ДНЯЖ и лечении этих язв клетками аутологичного костного мозга всего было израсходовано 100 крыс. Распределение животных в группах при лечении ДНЯЖ прекультивированными МНК и прекультивированными ММСК, представлено в таблице 2.

Таблица 2. Распределение крыс Вистар при клеточной терапии ДНЯЖ

Группы исследований	Серии выполненных экспериментов	Расход животных	Включено в стат. обработку
1 Трансплантация суспензии ММСК КМ в зону ДНЯЖ	ДНЯЖ без применения клеточной терапии (введение физиологического раствора)	20	19
	ДНЯЖ с трансплантацией суспензии ММСК КМ	30	28
2 Трансплантация суспензии МНК КМ в зону ДНЯЖ	ДНЯЖ без применения клеточной терапии (введение физиологического раствора)	20	20
	ДНЯЖ с трансплантацией суспензии МНК КМ	30	29
	Всего:	100	96

Приготовленные суспензии клеток МНК и ММСК, во всех сериях опытов трансплантировали периульцерозно в 4 равноудаленные точки в количестве 6 млн. и 4 млн. клеток в 0,5 мл. физиологического раствора, соответственно на 35- 40 сутки после моделирования аутоиммунных ДНЯЖ и визуального подтвердждения формирования язвенного дефекта. Контролем служило обкалывание язвенного дефекта 0,5 мл 0,9% NaCl.

Животных выводили из эксперимента на 10, 20 и 30 сутки после трансплантации клеток и соответственно в эти же сроки изучали динамику заживления язвенного дефекта, а также проводили оценку эффективности клеточной терапии ДНЯЖ.

Для иммунопатогенетической характеристики аутоиммунных длительно незаживающих язв желудка, а также оценки эффективности используемой терапии аутологичными прекультивированными МНК и ММСК КМ, нами было проведено 8 серий исследований с использованием комплекса морфологических, иммуногистохимических, биохимических и физиологических методов исследования, перечень и количество которых представлены в таблице 3.

Таблица 3. Исследования иммунопатогенетических механизмов развития ДНЯЖ и их коррекция путем трансплантации ККМ в эксперименте на животных

Серии выполненных работ	Методика исследования	Количество исследований, провед-ых на 150 животных
1. Гистологическое исследование СОЖ при формировании ДНЯЖ и при ДНЯЖ+ККМ	Окраска гематоксилином и эозином	246
2. Исследование цитокинового статуса организма	ИФА с использованием тест-систем «Diamed» Швейцария.	190
3. Исследование системы «простагландины-циклические нуклеотиды»	Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии ИФА с помощью тест-систем «R&D Systems» США	45
4. Исследование апоптоза эпителиоцитов СОЖ	Иммуногистохимическое исследование с помощью моноклональных антител к каспазе-9,«Novocastra» США	20
5. Исследование морфофункционального состояния органов иммуногенеза (тимус и селезенка)	Окраска гематоксилином и эозином Морфометрическое исследование компартментов методом точечного счета с помощью сетки Автандилова	45
6. Исследование цитотоксического эффекта лимфоцитов в СОЖ	Электронно-микроскопическое исследование зоны язвенного дефекта	15
7. Исследование микроциркуляции в зоне язвенного дефекта	Лазерная допплеровская флоуметрия	197
8. Исследование динамики заживления язвенного дефекта	Метод планиметрии	100
Всего:		948

Клинический раздел работы. Для подтверждения роли иммунопатогенетических механизмов в развитии длительно незаживающих язв у больных и установления корреляций с иммунопатогенетическими механизмами при моделировании аутоиммунных язв желудка в эксперименте, нами было проведено электронно-микроскопическое и иммуноморфологическое изучение слизистой оболочки желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки у 53 пациентов с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, обследовавшихся в эндоскопическом отделении ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росмедтехнологий.

Общий объем этих исследований представлен в таблице 4. Электронно-микроскопическое исследование проводилось для выявления роли цитотоксического эффекта лимфоцитов в СОЖ (n=17); иммуногистохимическое исследование предпринималось – для фенотипической характеристики иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих СОЖ (n=19), а также для выявления экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток (CD4+CD25+) – FOXP3 (n=17).

Таблица 4. Исследование биоптатов слизистой оболочки желудка у больных с хроническими длительно незаживающими язвами желудка для изучения иммунопатологических механизмов развития ДНЯЖ

Группы больных	Серии выполненных работ	Количество
		мужчин	женщин
1. Электронно-микроскопическое исследование	1. Исследование цитотоксического эффекта лимфоцитов в СОЖ	10	7
2. Иммуногистохимическое исследование	1. Фенотипическая характеристика иммунокомпетентных клеток в СОЖ с применением моноклональных антител	13	6
	2. Исследование экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток (CD4+CD25+) – FOXP3	13	4
Итого:		53 больных

Технология получения, культивирования и подготовки культур клеток костного мозга для трансплантации

Мононуклеарные клетки (МНК) получали из аспирата костного мозга (КМ) животных. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых костей получали клетки КМ путем промывания полости этих костей фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток КМ центрифугировали при 1500 об/мин 3-5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4Cl, 7,5 мМ КНСОз, 100 мкМ EDTA) в течение 5 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в среде IMDM (Gibco, USA), содержащей 10% бычью эмбриональную сыворотку («HyClone», USA), инсулин 0,4 мкМ и 0,25 мг/л гентамицина.

Эти клетки, представляли собой первичную культуру, преимущественно мононуклеарных клеток КМ, которые затем высаживали в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл на чашки Петри при 37С в СО2-инкубаторе, в атмосфере воздуха с 5% СО2 и 95% влажности для культивирования с целью очистки и повышения функциональной и биорегуляторной активности этих клеток. На 3-сутки инкубации среду полностью заменяли на среду IMDM (Gibo, USA), содержащую 10% бычьей сыворотки («HyClone», USA), инсулин 0,4 мкМ/л, дексаметазон 10 нМ/л, а также основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл («Sigma», USA), а на 5-6 сутки культивирования освобождались от пластикадгезивных клеток, относящихся к фракции стромальных клеток. В результате очищенная культура мононуклеарных клеток была готова для трансплантации животному с ДНЯЖ.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) получали из аспирата ККМ, обработывали лизирующим раствором, отмывали, центрифугировали и высевали на культуральный пластик в ростовой среде IMDM, как описано выше (см. раздел подготовки МНК). На 3-4 сутки инкубации среду полностью заменяли на среду IMDM (Gibo, USA), содержащую кроме 10% бычьей сыворотки («HyClone», USA), инсулин 0,4 мкМ/л, также дексаметазон 10 нМ/л и основной фактор роста фибробластов (bFGF) 20нг/мл («Sigma», USA) для стимуляции пролиферативной активности ММСК, содержащихся в суммарной фракции ККМ. В результате на 6-7 сутки культивирования ММСК из КМ формировали на дне чашки Петри колонии адгезированных мезенхимальных клеток. Смену среды проводили каждые 3-е суток для элиминации неприкрепившихся клеток.

На 12-14 сутки культивирования ММСК формировался 95-100% монослой клеток с фибробластоподобной морфологией, которые использовали для трансплантации животным.

Техника моделирования длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка у крыс

Моделирование аутоиммунной ДНЯЖ проводили у животных под эфирным наркозом путем 3-х кратного введения водно-солевого антигена, смешанного с адьювантом Фрейнда (по 1,5-2,0 мл гомогенизированной СОЖ аллогенного животного в подкожную клетчатку лапок, через 7-10 дней; концентрация белка 35мг/мл) (заявка на изобретение № 2007128123 от 23.07.2007). Через 35–40 дней у крыс развивалась хроническая язва желудка (d = 5–7мм) без тенденции к заживлению в течение 2,5 месяцев и более.

Методы идентификации ММСК в культуре и в зоне язвенного дефекта

Идентификацию ММСК в культуре осуществляли методом непрямой иммунофлуоресценции, используя моноклональные антитела к коллагену 1 типа.

Для идентификации ММСК в зоне язвенного дефекта использовали гистохимический метод Wacitani S. et al. (1995), основанный на прижизненном введении кодирующей метки в клеточную культуру. Введение метки в культивируемые клетки осуществляли с помощью рекомбинантного делецированного аденовируса, содержащего ген LacZ из E. coli, кодирующего бактериальную -галактозидазу. Активность -галактозидазы выявляли гистохимически по сине-зеленому окрашиванию при добавлении субстрата X-Gal.

Для идентификации трансплантированных клеток использовали также метод люминесцентной микроскопии при использовании донорских клеток (ММСК из КМ) от трансгенных мышей B 10. GFP, содержащих в ядрах клеток флуоресцирующий ген зеленого белка.

Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию клеточных культур проводили на микроскопах «Axiovert-25» (Karl Zeiss, Германия). Для фотографирования использовали цифровую фотокамеру «Axiocam color» (Karl Zeiss, Германия).

Методы исследования функциональной активности трансплантируемых клеток

Суммарное накопление цитокинов в культуральной среде: IL1,IFN,TNF,IL-10,IL-4,TGF определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест систем Diamed (Швейцария) для крыс.

Пролиферативная активность клеток в культуре оценивалась по скорости образования монослоя.

Жизнеспособность клеток в культуре оценивали по окрашиванию клеток трипановым синим (должна быть не менее 95%).

Морфологические, биохимические и инструментальные методы исследования зоны язвенного дефекта

Оценка регенерации язв осуществлялась по скорости заживления язвенного дефекта. Для этого динамически измеряли площадь язвы методом планиметрии с использованием компьютерного анализа изображений Видео ТесТ-Мастер 4.0 (ООО «Видео ТесТ», СПб.) и путем расчета площади язвенного дефекта с погрешностью до 0,01 мм. Одновременно проводили гистологические исследования язвенных дефектов с помощью криостатной и парафиновой техники. Криостатную технику применяли для выявления -галактозидазы в срезах и для быстрого контроля процессов новообразования сосудов. Срезы производили на криостатном аппарате Microm (Karl Zeiss – Германия). Парафиновую технику применяли для полного морфологического контроля процессов заживления язвы. Для этого желудок фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, вырезали стенку желудка, содержащую язву, и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические препараты изучали на микроскопе Axiovert-100 (Karl Zeiss) и микрофотографировали цифровой фотокамерой Axiocam color фирмы Karl Zeiss (Германия).

Оценка апоптоза эпителиальных клеток в слизистой оболочке желудка. Для установления связи регенерации ДНЯЖ с активностью апоптоза эпителиоцитов в СОЖ в препаратах при 400-кратном увеличении определяли индекс апоптоза (ИА) как отношение экспрессии маркера апоптоза (каспазы-9) в эпителиоцитах СОЖ в 100 эпителиоцитах поля зрения. Для этого проводили иммуногистохимические исследования стрептавидин – биотиновым методом (Novostain Universal Detection Kit «Novocastra») с использованием крысиных моноклональных антител к Caspasa 9. Подсчет эпителиоцитов с экспрессией маркера апоптоза (коричневое окрашивание) проводили в трех компартментах СОЖ под микроскопом Axiovert 100 (Karl Zeiss).

Оценка системы «простагландины – циклические нуклеотиды» в СОЖ. Для установления связи процессов регенерации с восстановлением регуляции системы «простагландины – циклические нуклеотиды» в организме проводилось определение содержания ПГЕ2 и циклических нуклеотидов в биоптатах из зоны язвенного дефекта. Содержание циклических нуклеотидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Экстракцию ПГ из СОЖ проводили по Jaffe et al. (1973). Уровень ПГЕ2 определяли иммуноферментным методом с помощью наборов фирмы R&D Systems (USA).

Оценка состояния микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка. Влияние клеточной терапии на восстановление микроциркуляции в СОЖ оценивали методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). ЛДФ проводили с помощью лазерного анализатора капиллярного кровотока ЛАКК-02 производства НПП «Лазма», г. Москва, разрешенного Минздравом РФ для применения в практическом здравоохранении (Протокол №1 от 13.01.1993г Комиссией по клинико-диагностическим приборам).

Оценка структурно-функциональных особенностей лимфоцитов в слизистой оболочке желудка при длительно незаживающих язвах желудка (в эксперименте и клинике). Исследовали биоптаты из края язвы желудка методом электронной микроскопии. Для этого обрабатывали биоптаты по стандартной методике и готовили полутонкие срезы, окрашенные метиленовым синим. Ультратонкие срезы после двойного контрастирования уранилацетатом и нитратом свинца просматривали в электронном микроскопе JEM-1200 EX при увеличении от 5000 до 50 000.

Исследования иммунного (цитокинового) статуса организма

Иммунный статус слизистой оболочки желудка у больных в клинике исследовали иммуногистохимически с помощью моноклональных антител («Dako», USA) к антигенам CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD38+, CD79, с помощью молекулярного маркера регуляторных клеток (CD4+CD25+) - FOXP3, а также гранзима B в биоптатах СОЖ. Для подсчета клеток использовали метод точечного счета по Г.Г.Автандилову (1984).

Оценка морфофункционального состояния органов иммунной системы

Морфофункциональное состояние тимуса и селезенки у животных с ДНЯЖ исследовали гистологически в парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Морфометрию тимуса и селезенки проводили с помощью методики точечного счета по Г.Г.Автандилову (1984).

Исследование цитокинового статуса в сыворотке крови животных

Для подтверждения связи процессов регенерации с состоянием иммунного баланса в организме, маркерами которого являются цитокины, в работе оценивали их содержание в сыворотке крови до и после клеточной терапии. Содержание цитокинов (TNF, IL1, IFN, IL-10, IL-4, TGF) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест систем Diamed (Швейцария).

Статистическая обработка материала была проведена вариационно-статистическим методом. Достоверность различий ряда признаков определяли путем сравнения средних величин, используя t-критерий Стъюдента. Полученные результаты считали достоверными при p<0,05. Использовали также стандартную вариационную обработку рядов с подсчетом значений арифметических величин (М) и ошибок средних (м), либо (SE). Статистическая обработка данных выполнена с использованием пакета прикладных программ «Statistica 5,0» на персональном компьютере.

Считаю необходимым отметить, что в освоении методик, использованных в данной работе, автору помогали сотрудники лаборатории биотехнологии стволовых клеток (зав. лаб., д.м.н., профессор Н.А.Онищенко), культуральные исследования были проведены под руководством старшего научного сотрудника М.Е.Крашенинникова; гистологические исследования были осуществлены под руководством зав. лаб. иммуноморфологии воспаления ГУ НИИ морфологии человека РАМН., д.м.н., профессора О.В.Макаровой и зав. лаб. электронной микроскопии ГУ ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г.Москвы., д.м.н. В.Б.Потаповой; иммунологические исследования были осуществлены при участии зав. лаб. патофизиологии, д.м.н. И.Е.Трубицыной и зав. лаб. иммунологии, д.м.н., профессора Т.М.Царегородцевой (ГУ ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г.Москвы), в отборе больных для клинической части работы принимали участие сотрудники отделения эндоскопии ФГУ НИИТ и ИО Росмедтехнологий. Содействие в обеспечении адекватного содержания животных в длительных экспериментах оказывал зав. виварием П.В. Аврамов. Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Прекультивирование клеток костного мозга – как способ восстановления биорегуляторной активности ММСК КМ

Приступая к исследованию, мы исходили из того, что для индукции качественной и ускоренной регенерации ДНЯЖ должны использоваться клетки с оптимальными характеристиками их биологических свойств – таких как однородность фенотипического состава клеток, их зрелость, жизнеспособность и функциональная активность.

Применив иммуногистохимический метод идентификации ММСК КМ по маркеру коллагена 1 типа, мы установили, что практически в 100% всех прикрепившихся клеток выявляется этот белок. Результаты наших исследований полностью согласуются с результатами аналогичных исследований, проведенных М.Ф. Расуловым (2007), который применив иммунофлуоресцирующее окрашивание культуры ММСК человека на коллаген 1 типа и применив высокую разрешающую способность микроскопической техники выявил коллаген 1 типа, как во внешних так и во внутренних микрофиламентах исследуемых клеток.

Таким образом, экспрессия маркера на коллаген 1 типа в культурах ММСК крысы на 14 сутки их культивирования подтвердила однородность культуры и принадлежность ее к мезенхимальным стромальным клеткам.

Исследование функциональной активности ММСК интактных животных и животных с ДНЯЖ по скорости образования монослоя показало, что ММСК от животных с ДНЯЖ обладают меньшей пролиферативной активностью, так как образуют монослой в культуре лишь к 13-14 суткам, вместо 9 суток в контроле. Это исследование выявило, более низкую биорегуляторную активность аутологичных клеток КМ, полученных от животных с ДНЯЖ, с одной строны, а с другой стороны, возможность восстановления их пролиферативной (биорегуляторной) активности путем культивирования. Доказательства восстановления биорегуляторной активности клеток в процессе культивирования были получены нами также по изучению изменений в спектре продукции этими клетками про- и противовоспалительных цитокинов (рис.1). Измеряя в динамике накопле­ние про- (IFN, TNF, IL-1) и противовоспалительных (TGF, IL-4,IL-10) ци­токинов в среде культивирования ММСК КМ от крыс с хрони­ческой аутоиммунной язвой желудка мы отметили, что начи­ная с 6 суток культивирования, ММСК освобождаются от влияния системной воспалительной реакции, которая имела место в организме и к 12 суткам (когда образуется монослой) восстанавливается баланс про- и противовоспалительных цитокинов, что сви­детельствует о восстановлении регуляторных свойств ММСК и готовности их к индукции восстановительных (репаративных) процессов.

Таким образом, темп формирования монослоя при культивиро­вании ММСК и совпадающий с ним темп восстановления баланса продукции про- и противовоспа­лительных цитокинов позволили нам рассматривать эти результаты не только как доказательство восстановления биорегуляторной актив­ности ММСК в про­цессе культивирования, но и как способ (неотъемлемый этап) подготовки аутологичных клеток к эффективному применению у больных с ДНЯЖ.

Рис.1. Динамика про- и противовоспалительных цитокинов в среде при культивировании ММСК КМ. x-p<0,05 по сравнению к исходным данным (3-и сутки культивирования).

2. Местные и системные патогенетические нарушения в организме при формировании длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка

2.1. Патоморфология аутоиммунной язвы желудка. ДНЯЖ возникали на 35-40 сутки после завершения процедуры моделирования и в 90% были одиночными. Язвы имели округлую, овальную или неправильную форму с d от нескольких мм до 1,1 см и глубиной 0,2-0,5 мм. Вокруг язвенного дефекта отмечались множественные эрозии, гиперемия и отек. Микроскопически поверхностный слой язв был широким и покрыт некротическими массами, слизью, фибрином, десквамированным эпителием, а также распадающимися лейкоцитами и эритроцитами. Зона фибриноидного некроза характеризовалась деструкцией коллагеновых волокон и выраженной макрофагальной и лимфоидной реакцией. Клеточные элементы глубокого слоя фибриноидного некроза были представлены в основном фибробластами, с признаками деструкции (до 45%), свидетельствующими об ингибировании процессов регенерации.

2.2. Апоптоз эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка как индикатор хронического течения аутоиммунных язв желудка. У животных с ДНЯЖ в зоне язвенного дефекта отмечался высокий уровень экспрессии маркера апоптоза – каспазы 9 в эпителиоцитах СОЖ и соответственно имел место высокий индекс апоптоза эпителиоцитов в трех компартментах СОЖ (покровно-ямочном эпителии, перешеечной зоне и в основании желез) по сравнению с интактной СОЖ у здоровых животных (табл.5).

Таблица 5. Индекс апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка животных (M±m) на 40 сутки моделирования язвы желудка

Группа животных	Покровно-ямочный эпителий	Перешеечная зона (истмический отдел, пролиферативный компартмент)	Основание желез (средняя и нижняя треть желез до базальных отделов)
Интактная СОЖ	3,9±0,32	2,0±0,21	5,8±0,45
Язва желудка	37,3±2,87*	23,8±2,34*	44,9±3,0*

*- p<0,05 по сравнению с интактной

Таким образом, мы убедительно показали, что при аутоиммунных ДНЯЖ имеет место дисрегуляция процессов программируемой гибели эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка, что свидетелствует о глубоком рассогласовании процессов аутоиммунного воспаления, апоптоза и регенерации, в результате чего аутоиммунные язвы приобретают хроническое течение, без признаков заживления.

2.3. Нарушения микроциркуляции при моделировании аутоиммунных язв желудка. Возникновение аутоиммунной ДНЯЖ сопровождается также нарушениями в ней микроциркуляции. Исследование микроциркуляторного русла СОЖ в зоне язвенного дефекта методом лазерной допплеровской флоуметрии показало, что язвы желудка характеризуются снижением показателя микроциркуляции во всех исследуемых зонах язвенного дефекта (в дне язвы, крае язвы и на расстоянии 0,5 см от края язвы), которое способствует нарушению трофики ткани и торможению процессов репаративной регенерации.

2.4. Дисрегуляция системы «простагландины – циклические нуклеотиды» при язвообразовании. Возникновение аутоиммунных ДНЯЖ сопровождается снижением уровня циклических нуклеотидов в СОЖ на 40 сутки моделирования, что соответствует гистологическим признакам деструктивно-язвенного процесса в СОЖ и указывает на угнетение механизмов регуляции восстановительных процессов. Так, уровень цАМФ в слизистой оболочке снижался с 735±89 пмоль/г тк. в норме до 176±27 пмоль/г (p<0,05) при ДНЯЖ; уровень цГМФ в слизистой оболочке снижался с 476±48 пмоль/г тк. в норме до 96,3±5 пмоль/г (p<0,05) при ДНЯЖ. При изучении содержания простагландина Е2 (ПГЕ2) в СОЖ было установлено снижение уровня ПГЕ2 с 378±57 нг/г тк. в норме до 148±21 нг/г тк. (p<0,05) при ДНЯЖ, что составляет 39-40% от нормы.

Таким образом, при моделировании аутоиммунной ДНЯЖ возникает существенное снижение уровня ПГЕ2, а также цАМФ, цГМФ и их отношения, что свидетельствует о депрессии образования тканевых биологически активных веществ, нарушении фаз клеточного цикла, снижении цитопротективных свойств СОЖ и ингибировании процессов регенерации.

2.5. Цитокиновый дисбаланс как фактор развития и хронизации язвенной болезни. Изучение цитокинового статуса организма в процессе формирования аутоиммунной ДНЯЖ показало, что на всех исследуемых сроках от начала моделирования язв содержание провоспалительных цитокинов (IL1, TNF, IFN) так же как и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10) в сыворотке крови достоверно (p<0,05) увеличивалось по сравнению с показателями у интактных крыс (рис.2).

Рис.2. Уровень провоспалительных (IL1,TNF,IFN) и противовоспалительных (IL-4,IL-10) цитокинов в сыворотке крови животных в норме (N) и в динамике моделирования аутоиммунной язвы желудка (ЯБ) (пг/мл).

Таким образом, у крыс с аутоиммунной ДНЯЖ был выявлен значительный цитокиновый дисбаланс, который свидетельствует о дисбалансе в системе Th1/Th2 и о нарушении иммунной регуляции восстановительных процессов в зоне язвенного дефекта.

Четкая связь выявленного цитокинового дисбаланса с активностью деструктивно-язвенного процесса предполагает использование направленных воздействий на реакции иммунного ответа с целью регуляции Th1/Th2 при обязательном учете фазы заболевания. Однако, эти требования обычно не учитываются при лечении больных с язвенной болезнью, в частности при назначении антибактериальных препаратов, что может усугубить нарушения иммунного гомеостаза на местном и системном уровнях, приводя к рецидивированию болезни.

2.6. Морфофункциональное состояние органов иммуногенеза в процессе развития длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка.

Морфофункциональное исследование тимуса и селезенки при аутоиммунной ДНЯЖ позволило установить выраженную недостаточность этих органов по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о дисбалансе не только иммунной системы, но косвенно и о дисбалансе других интегративных систем организма – нервной и эндокринной, которые регулируют процессы адаптации, компенсации и процессы устойчивого заживления язв.

2.7. Цитотоксический эффект лимфоцитов в слизистой оболочке желудка при длительно незаживающей аутоиммунной язве желудка. По представлениям А.С.Логинова и др. (1990; 1992), одним из ведущих механизмов «агрессии» при ЯБ выступает цитотоксическое действие иммунокомпетентных клеток слизистой оболочки желудка, которое, проявляется разрушением фибробластов собственной пластинки слизистой – Т - лимфоцитами.

Нами на клиническом биопсийном материале электронно-микроскопически было подтверждено цитотоксическое действие лимфоцитов на фибробласты собственной пластинки СОЖ у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки в области края язвы (наиболее выражен) и в отдалении – 0,5 см от края язвы, причем цитотоксический эффект реализовывался с участием различных популяций лимфоцитов.

Используя иммуногистохимическое исследование активности различных популяции клеток лимфоидного ряда в биоптатах СОЖ из зоны язвенного дефекта мы подтвердили связь гибели фибробластов в СОЖ с цитотоксическим действием активированных лимфоцитов, в частности, была выявлена экспрессия в собственной пластинке СОЖ большого количества CD8+ - Т клеток, число которых преобладало по сравнению с CD4+ (3:1); около 40% CD8+ клеток представляли собой NK+ - клетки. Встречались многочисленные клетки c экспрессией маркера CD38+, CD3+ и CD20+.

Кроме того, в зоне язвенного дефекта была выявлена сниженная экспрессия молекулярного маркера регуляторных (CD4+CD25+) клеток – FOXP3, по сравнению с интактной СОЖ, где его экспрессия была более выраженной.

Лизирующая активность цитотоксических лимфоцитов по данным наших иммуногистохимических исследований была связана с повышенной выработкой гранзимов B, которые могут [Ройт А. и др., 2000] в эпителиоцитах вызывать запуск программы апоптоза и деструкцию фибробластов собственной пластинки СОЖ.

Таким образом, исследования биопсийного материала из зоны язвенного дефекта в клинике указывают на дисбаланс и преимущественный дефицит Т-регуляторов, что приводит к усилению выраженности и прогрессированию местных иммунных (аутоиммунных) процессов, отягощающих течение заболевания и способствующих его хронизации.

Для выявления связи между иммунопатологическими нарушениями в СОЖ у больных с ДНЯЖ с иммунопатологическими нарушениями в ДНЯЖ в эксперименте было изучено наличие цитотоксического эффекта у лимфоцитов в зоне язвенного дефекта экспериментальных животных.

Электронно-микроскопические исследования подтвердили наличие цитотоксического действия различных популяций лимфоцитов на фибробласты собственной пластинки слизистой оболочки желудка у крыс с ДНЯЖ, особенно в области края язвы.

Результаты проведенных экспериментов подтверждают, что при моделировании аутоиммунных ДНЯЖ также как и в клинике [Логинов А.С и др., 1990; 1992], активируется цитотоксическое действие Т-лимфоцитов СОЖ, которое проявляется разрушением фибробластов собственной пластинки. Этот факт подтверждает аутоиммунный механизм повреждения слизистой оболочки желудка при моделировании ДНЯЖ в эксперименте.

Дополнительным доказательством аутоиммунной природы ДНЯЖ, полученной в эксперименте, может служить выявление и других признаков аутоиммунного заболевания, перечень которых был постулирован Rose N.R., Bona C. (1993). Нами была доказана возможность переноса ДНЯЖ активированными лимфоцитами от больного животного; возникновение цитокинового дисбаланса, манифестирующего развитие гуморальных и клеточных иммунных реакций (раздел 2.5), а также возможность индукции ДНЯЖ сенсибилизацией антигеном СОЖ аллогенного животного.

Таким образом, нами были получены доказательства аутоиммунной природы ДНЯЖ не только в клинике, но и в эксперименте, которые свидетельствуют о развитии общего типового иммунопатологического процесса при формировании язвы желудка и, следовательно, о пригодности созданной нами в эксперименте модели ДНЯЖ для подбора и исследования новых терапевтических воздействий, пригодных для лечения ДНЯЖ у человека в клинике.

3. Влияние трансплантации культивированных клеток костного мозга на заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка

3.1. Влияние ММСК и МНК аутологичного КМ на динамику заживления язв и морфологическое состояние слизистой оболочки желудка

Исследование влияния трансплантации клеток КМ на регенерацию аутоиммунных ДНЯЖ проводилось нами в 3-х сериях опытов. В таблице 6 представлен планиметрический контроль динамики заживления язвенного дефекта у крыс без и после трансплантации культивированных аутологичных ММСК или МНК КМ.

Таблица 6. Динамика уменьшения площади язвенного дефекта в зависимости от типа трансплантируемых клеток у животных

Серии исследовании	Площадь язвенного дефекта (мм)
	10 сутки	20 сутки	30 сутки
Контроль (n=15)	364±42,6	276±34,8	112±16,0
ММСК КМ (n=15)	147±18,9*	91±14,3*	0,8±0,34*
МНК КМ (n=15)	179±23,7*	136±16,9*	9,7±2,8*

*-p<0,05 по отношению к контролю.

В исследуемых 3-х группах выявлялись существенные различия не только планиметрического, но и макроскопического состояния язвенных дефектов. В контрольной группе к 10 суткам наблюдения макроскопическое состояние язв соответствовало исходному. Язвы оставались таких же размеров с выраженным отеком, были покрыты фибринозно-некротическим налетом с признаками хронического воспаления и мелкими эрозиями вокруг язвы. В группе с трансплантацией ММСК КМ через 10 суток отмечается не только уменьшение площади язвенного дефекта, но и его глубины, а также очищение дна язвы от некротических масс и уменьшение воспаления вокруг язвы. В группе с трансплантацией МНК КМ на 10 сутки отмечается уменьшение площади язвенного дефекта, вокруг язвенного дефекта сохраняются отек, бледная окраска слизистой оболочки. Глубина язвы по сравнению с контрольной группой становилась меньше.

На 20 сутки у животных контрольной группы размеры язвы несколько уменьшились, но дно язв оставалось покрытым некротическим налетом, признаки хронического воспаления становились менее выраженными. После трансплантации ММСК КМ макроскопически выявлялось значительное уменьшение размеров язвенного дефекта и его глубины. Слизистая оболочка приобретала равномерно розовую окраску. В группе с трансплантацией МНК отмечалось значительное уменьшение, как размеров язвенного дефекта, так и их глубины. Вокруг язвы сохранялся отек и точечные эрозии.

На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты сохранялись, тогда, как в группе с трансплантацией ММСК КМ макроскопически язвенные дефекты не выявлялись. Слизистая оболочка желудка была равномерно эпителизирована и имела розовую окраску. В группе с трансплантацией МНК макроскопически в большинстве случаев язвенные дефекты не выявлялись, но на месте язвы сохранялись мелкие эрозии, вокруг которых имелись незначительные признаки воспаления: умеренный отек, гиперемия и точечные кровоизлияния в слизистой оболочке.

В полном соответствии с макроскопическими различиями язвенных дефектов в 3 исследуемых группах животных находятся результаты их гистологического исследования на разных сроках наблюдения. Установлено, что в контрольной группе животных на 10 сутки в дне язвы выявляется широкий лейкоцитарно–некротический слой. В подлежащем слое определяется грануляционная ткань с повышенным количеством тонкостенных кровеносных сосудов и преобладанием фибробластов. В более глубоких отделах грануляционной ткани выявляются коллагеновые волокна, с их частично упорядоченным ходом и небольшим количеством сосудов. В подлежащем к зоне некроза и более глубоких слоях грануляционной ткани отмечается выраженная диффузная воспалительная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов.

При гистологическом исследовании язвы желудка на 10 сутки в группе животных с трансплантацией ММСК КМ лейкоцитарно – некротический слой был более тонким. Подлежащий слой был представлен созревающей грануляционной тканью с большим количеством сосудов и умеренно выраженной диффузной лейкоцитарной инфильтрацией преимущественно из гистиоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно–расширенные железы с пролиферирующим эпителием.

На 10-е сутки в группе животных с трансплантацией МНК КМ по сравнению с контрольной группой отмечалась более ранняя смена деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса на пролиферативно-регенераторную фазу. Это выражалось более быстрым отторжением некротических масс, что свидетельствовало о начале репаративного процесса. В грануляционной ткани наблюдалось большое количество сосудов и умеренно выраженная диффузная воспалительная инфильтрация сегментоядерными нейтрофилами, лимфоцитами с примесью гистиоцитов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно–расширенные железы с пролиферирующим эпителием.

На 20 сутки у животных контрольной группы размеры язвы несколько уменьшились, но при гистологическом исследовании выраженных различий по сравнению с предыдущим сроком не отмечалось. В то же время, в группе с трансплантацией ММСК КМ при гистологическом исследовании была выявлена частичная эпителизация краев язвенного дефекта. В дне язвы выявлялся тонкий лейкоцитарно–некротический слой. По сравнению с предыдущим сроком отмечалось разрастание грануляционной ткани и увеличение количества кровеносных сосудов; ход коллагеновых волокон в грануляционной ткани был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженной за счет клеток преимущественно лимфоидно–гистиоцитарного ряда.

Гистологическая картина ДНЯЖ, леченных МНК, на 20 сутки характеризовалась начальными признаками эпителизации. Отмечалось наползание уплощенного эпителия с краев на периферию дна язвенного дефекта, представленную грануляционной тканью. В центре дна сохранялся тонкий слой фибриноида. По сравнению с предыдущим сроком в грануляционной ткани отмечалось увеличение количества кровеносных сосудов, ход коллагеновых волокон был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженная, преимущественно лимфоидно–гистиоцитарная.

Доказательством того, что более высокий и качественный темп регенерации аутоиммунных язв связан с сохранением жизнеспособности и функциональной активности клеток КМ, после трансплантации в периульцерозную зону, являются результаты двух вариантов доказательств исследования: результаты гистохимического выявления в этой зоне ММСК с предварительно введенной в них метки–генетической конструкции - LacZ E.coli, вывляемой по сине – зеленому окрашиванию продуктов реакции X-GaL с -галактозидазой, введенной в структуру гена LacZ E.coli и результаты выявления ММСК по их флуоресценции, поскольку они были получены от трансгенных мышей B. 10 GFP, которые содержат ген зеленого флуоресцирующего белка.

На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты все еще сохранялись. Дно язвы было покрыто тонким некротическим слоем и диффузно инфильтрировано лейкоцитами. В подлежащем слое созревающая грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и умеренно выраженную воспалительную инфильтрацию гистиоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами. В краях язвы выявлялись кистозно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием. В группе с трансплантацией ММСК КМ микроскопически отмечалась эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке язвенных дефектов не было выявлено, обнаружены лишь зоны, где определялись железистые полости, выстланные пролиферирующим эпителием. В подлежащей строме слизистой оболочки определяется фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоидно – гистиоцитарной инфильтрацией.

В группе животных с трансплантацией МНК КМ к 30-м суткам макроскопически язва не выявлялась, на ее месте отмечались рубцовые тяжи, конвергирующие к центру. Микроскопически отмечалась эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке определялись кистозно-расширенные псевдопилорические железы. В подлежащей ткани выявлялась фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоидно–гистиоцитарной инфильтрацией.

Позитивную динамику в зоне язвенного дефекта к 30 суткам мы также связываем с присутствием и функционированием в этой зоне трансплантированных клеток, что было подтверждено гистохимически (по сине – зеленому окрашиванию введенных в ММСК генетической метки LacZ E.coli и по флуоресценции ММСК от трансгенных мышей B. 10 GFP. Это дает нам основание считать, что сохраняя свою жизнедеятельность в области язвы, ММСК длительно обеспечивали продукцию биорегуляторных пептидов, которые способствовали восстановлению местного и системного гомеостаза и создавали адекватные условия для более быстрой регенерации ДНЯЖ. Регенераторный процесс в ДНЯЖ без применения клеточной терапии так же имел место, но темп его был значительно замедлен. Достоверно более высокий темп заживления ДНЯЖ при использовании ММСК позволяет считать трансплантацию ММСК наиболее эффективным методом клеточной терапии ДНЯЖ.

3.2. Влияние ММСК КМ на активность апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка в динамике лечения

Одним из механизмов ускорения темпа регенерации язв под влиянием ММСК является восстановление регуляции активности процессов апоптоза в слизистой оболочке желудка. Об этом свидетельствует снижение индекса апоптоза (ИА) (уровень экспрессии каспазы-9) в трех компартментах слизистой оболочки желудка в динамике лечения (табл. 7).

Таблица 7. Динамика изменения индекса апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка у животных с ДНЯЖ без и при трансплантации ММСК (М±м)

Группа животных	Сроки исследования (от начала лечения)	Покровно-ямочный эпителий	Перешеечная зона (истмический отдел, пролиферативный компартмент)	Основание желез (средняя и нижняя треть желез до базальных отделов)
Контроль (0,9 % NaCl)	10 сутки	34,3±2,82	21,6±0,34	43,2±3,26
	20 сутки	28,7±1,74	17,0±1,56	27,9±1,64
	30 сутки	17,4±1,16	10,4±1,39	18,8±1,33
Трансплантация ММСК	10 сутки	21,9±2,48	12,3±2,11*	32,3±2,73
	20 сутки	11,1±0,82*	7,9±0,45*	14,5±1,79*
	30 сутки	5,5±0,25*	2,19±0,23*	6,7±0,38*

*p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке.

Было установлено, что во всех компартментах слизистой оболочки желудка в контрольной группе на 10 сутки отмечалась выраженная экспрессия маркера апоптоза в цитоплазме эпителиоцитов и соответственно высокий уровень ИА (табл. 7), тогда как в группе с трансплантацией ММСК, экспрессия маркера апоптоза была менее выражена и ИА имел тенденцию к снижению.

При оценке экспрессии маркера апоптоза в отдельных компартментах обеих групп нами были выявлены достоверные различия (табл. 7). Достоверное снижение ИА на 10 сутки после трансплантации ММСК КМ нами отмечено в эпителиоцитах перешеечной зоны слизистой оболочки желудка, в отличие от группы контроля, где ИА в этой зоне по-прежнему оставался высоким. Особенно отчетливое и достоверное снижение интенсивности экспрессии маркера апоптоза и, соответственно ИА (табл. 7) эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в трех компартментах наблюдалось на 20 и 30 сутки после трансплантации ММСК КМ, что, по-видимому, свидетельствовало о нормализации клеточного обновления в отсутствие воспалительной инфильтрации при активизации процессов дифференцировки на завершающей стадии регенераторного процесса. В контрольной группе животных, на 20 и 30 сутки исследования интенсивность экспрессии маркера апоптоза и соответственно ИА (табл. 7) эпителиоцитов снижались медленнее и оставались повышенными. Это указывало на сохранение хронического воспаления в слизистой оболочке желудка животных контрольной группы и вялое течение регенераторного процесса.

Позитивная динамика регенераторного процесса и снижение активности апоптоза в слизистой оболочке желудка у животных с трансплантацией ММСК КМ мы связываем с тем, что трансплантированные ММСК КМ создают условия для регуляции апоптоза эпителиоцитов и лимфоцитов, снижают аутоиммунное воспаление, меняют профиль цитокинов, а также участвуют в регуляции дифференцировки отдельных клонов Т-клеток, создавая оптимальные условия для процессов дифференцировки и пролиферации клеток и регенерации ДНЯЖ.

3.3. Влияние ММСК КМ на систему «простагландины – циклические нуклеотиды» в регуляции процессов регенерации и цитопротекции в слизистой оболочке желудка

Ускорению темпа регенерации язв способствовало ускорение темпа межклеточных взаимодействий о чем, хотя и косвенно, свидетельствует накопление в слизистой оболочке желудка вторичных мессенджеров межклеточных взаимодействий (цАМФ, цГМФ). Если исходить из того, что увеличение цАМФ в значительной степени отражает интенсификацию процессов пролиферации, а цГМФ – процессов дифференцировки, то на основании полученных нами данных мы заключили, что под влиянием трансплантации ММСК КМ к 10 и 20 суткам резко активизируются процессы пролиферации (рис. 3), тогда как процессы дифференцировки – активизируются только к 30 суткам, свидетельствуя о наступлении завершающей стадии регенераторного процесса. В контрольной группе животных уровни цАМФ и цГМФ на 30 сутки наблюдения оставались достоверно сниженными по сравнению с основной группой, что указывало на вялое течение регенераторного процесса в слизистой оболочке желудка.

Исследование содержания ПГЕ2 в СОЖ до лечения позволило установить его значительное снижение (134±11,7нг/г) по сравнению с интактными животными и этот факт косвенно свидетельствовал об уменьшении секреции бикарбонатов и слизи, и соответственно об уменьшении защитных возможностей слизистого секрета. На 30 сутки, после трансплантации ММСК КМ наблюдалось достоверное повышение ПГЕ2 (320±18,5нг/г) по сравнению с контролем (176±12,3нг/г) и исходными данными (146±9,7нг/г).

Рис. 3. Динамика изменения содержания цАМФ и цГМФ в слизистой оболочке желудка крыс с моделью аутоиммунной язвы желудка после трансплантации ММСК КМ и введения физиологического раствора в зону язвенного дефекта. Обозначения: темные столбики – цАМФ, столбики со штриховкой – цГМФ - p<0,05 по сравнению со значениями аналогичного показателя в исходе.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, длительно функционируя в зоне язвенного дефекта, становятся продуцентами не только дефицитных тканеспецифических пептидов, но и биологически активных веществ, которые при совместном воздействии на организм восстанавливают регуляцию межклеточного взаимодействия (цАМФ/цГМФ) и создают условия для ускоренного и качественного заживления ДНЯЖ.

4. Влияние ММСК и МНК КМ на коррекцию иммунного дисбаланса при ДНЯЖ

4.1. Морфофункциональное состояние тимуса при аутоиммунных ДНЯЖ и трансплантации ММСК и МНК КМ

Динамическое морфометрическое исследование тимуса в группе без применения клеточной терапии (контроль) и в группе с трансплантацией ММСК КМ позволило установить, что на 10-е сутки терапии в группе контроля (введение физиологического раствора), преобладает мозговой слой (табл. 8).

Объемная доля коркового слоя была снижена и составила 32,3%. Этот слой был «плотно заселен» лимфоцитами. Субкортикальный слой был представлен 5-10 рядами лимфобластов. Границы между корковым и мозговым слоями были четкими. В мозговом слое соотношение лимфоцитов и эпителиальных элементов составляло 4:1; 5:1. Тимические тельца (Гассаля) были 1-3 фаз развития по О.В.Зайратьянцу (1992) и представлены скоплениями из 5-7 эпителиальных клеток. В то же время, в группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 10 сутки терапии уже преобладал корковый слой (табл.8), который так же как в контрольной группе был «плотно заселен» лимфоцитами. Границы между корковым и мозговым слоями были четкие. В мозговом слое также преобладали лимфоидные элементы. Тельца Гассаля представлены скоплениями из 3-7 эпителиальных клеток. В субкортикальном слое определялись 12-14 рядов лимфобластов.

Таблица 8. Морфофункциональная характеристика тимуса крыс Wistar с ДНЯЖ при трансплантации ММСК КМ (местно) (М±м)

Зоны тимуса	Объемная плотность в %
	ДНЯЖ +0,9% NaCl (контроль)			ДНЯЖ+ММСК
	10сут	20сут	30сут	10сут	20сут	30сут
Корковый Слой	32,3±2,2	36,1±7,22	39,0±7,8	54,1±10,8*	54,4±10*	70,2±14,0*
Мозговой слой	68,3±11,6	65,5±13,1	63,5±12,7	48,5±9,7*	44,2±8,8*	29,2±5,8*
Индекс соотношения коркового к мозговому	0,47±0,09	0,55±0,11	0,61±0,12	1,11±0,2*	1,23±0,20*	2,30±0,46*

*p < 0,05 по сравнению с контролем

У животных контрольной группы на 20 сутки лечения продолжал преобладать мозговой слой (табл.8). Субкортикальный слой был представлен 3-7 рядами лимфобластов. Отмечалось очаговое опустошение коркового слоя. Граница между корковым и мозговым слоем была очагово-нечеткой. В мозговом слое соотношение лимфоцитов к клеткам ретикулоэпителия составляло 4:1; 5:1. Тельца Гассаля 4-5 фаз развития были представлены как скоплениями из 5-7 клеток, так и крупными тельцами, имеющими вид кистоподобных полостей. В то же время, в группе с применением ММСК КМ преобладал корковый слой (табл.8). В субкортикальном слое отмечалось 7-14 слоев лимфобластов. В мозговом слое преобладали лимфоциты. Тимические тельца были 2-4 фаз развития, встречались тельца в виде кистоподобных полостей.

На 30-е сутки у животных контрольной группы объемная доля коркового слоя составляла 39% (табл.8). Корковый слой был «плотно заселен» лимфоцитами. Субкортикальный слой представлен 8-12 рядами лимфобластов. Границы между корковым и мозговым слоем были четкие. Тельца Гассаля представлены скоплениями ретикулоэпителия (5-12 клеток). В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 30-е сутки преобладал корковый слой, объемная доля которого, достигала 70%. Корковый слой представлен лимфоцитами. Границы между корковым и мозговым слоем четкие. В субкортикальном слое отмечалось 8-14 рядов лимфобластов. В мозговом слое преобладали лимфоциты, тимические тельца 1-4 фаз развития, а также определялись единичные кистоподобные тельца.

При терапии МНК КМ морфофункциональное состояние тимуса претерпевало те же изменения, что и при использовании ММСК на всех сроках исследования (табл. 9), однако эти изменения были менее выражены.

Таблица 9. Морфофункциональная характеристика тимуса крыс Wistar при ДНЯЖ и трансплантации МНК КМ (местно) (М±м)

Зоны тимуса	Объемная плотность в %
	ДНЯЖ+0,9% NaCl (контроль)			ДНЯЖ+МНК
	10сут	20сут	30сут	10сут	20сут	30сут
Корковый Слой	32,3± 2,2	36,1± 7,22	39,0± 7,8	57,8± 11,5*	55,9± 11,1*	62,6± 12,0*
Мозговой слой	68,3± 11,6	65,5± 13,1	63,5± 12,7	42,1± 8,4*	42,1± 8,42*	38,2± 7,6*
Индекс соотношения коркового к мозговому	0,47± 0,09	0,55± 0,11	0,61± 0,12	1,3± 0,26	1,3± 0,26	1,6± 0,3

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, динамическое морфометрическое исследование тимуса – одного из центральных органов иммуногенеза позволило нам выявить стимуляцию Т-зон тимуса и восстановление структурных компартментов под влиянием как ММСК, так и МНК КМ. Оно проявлялось расширением коркового слоя и субкортикальной зоны, повышением количества лимфобластов, а по срокам эти изменения совпадали с активизацией регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка и существенным сокращением сроков заживления язв.

4.2. Морфофункциональное состояние селезенки животных при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации ММСК и МНК КМ

Морфофункциональное состояние селезенки также претерпевало соответствующие изменения. В контрольной группе на 10 сутки преобладала красная пульпа (табл. 10).

Таблица 10. Морфофункциональная характеристика селезенки крыс Wistar с ДНЯЖ при трансплантации ММСК КМ (местно) (M±m)

	Объемная плотность в %
Зоны селезенки	ДНЯЖ+0,9% NaCl (контроль)			ДНЯЖ+ММСК
	10сут	20сут	30сут	10сут	20сут	30сут
Лимфоидные фолликулы	22,8± 4,56	34,4± 6,8	42,4± 8,4	37,2± 7,4	33,4± 6,68	31,4± 6,28
ПАЛМ	7,2± 1,44	13,0± 2,6	11,6± 2,3	40,0± 8*	26,6± 5,32	34,2± 6,8*

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Лимфоидные фолликулы были средних размеров со светлыми центрами, представленными лимфобластами. В строме красной пульпы отмечались лимфоциты, гистиоциты, диффузно рассеянные нейтрофилы и мегакариоциты. В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 10-е сутки белая пульпа занимала около 40% площади среза и была представлена лимфоидными фолликулами со светлыми центрами из лимфобластов. Отмечались хорошо выраженные периартериальные муфты (ПАЛМ). В строме красной пульпы преобладали гистиоциты, лимфоциты и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов и мегакариоцитов. Отмечался выраженный диффузный гемосидероз.

У животных контрольной группы на 20 сутки после лечения по данным морфометрического исследования по-прежнему преобладала красная пульпа (табл. 10). Часть лимфоидных фолликулов имела некрупные светлые центры с лимфобластами. В строме красной пульпы отмечались преимущественно гистиоциты, диффузно рассеянные нейтрофилы и единичные в поле зрения мегакариоциты. В то же время, при морфометрическом исследовании селезенки животных, леченных ММСК КМ, на 20 сутки отмечено явное преобладание белой пульпы (табл. 10). Лимфоидные фолликулы имели светлые центры и были представлены рыхло расположенными лимфобластами. ПАЛМ были хорошо выражены. В строме красной пульпы преобладали лимфоциты, большое количество гистиоцитов и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов. В отличие от контрольной группы, в группе с трансплантацией ММСК КМ отмечалось большое количество в поле зрения мегакариоцитов.

На 30-е сутки у животных контрольной группы по сравнению с предыдущим сроком увеличилась площадь белой пульпы (табл. 10), занимаемой фолликулами со светлыми центрами, представленными лимфобластами и распадающимися клетками. ПАЛМ были выражены. В строме красной пульпы определялись лимфоциты, гистиоциты, единичные в поле зрения мегакариоциты, а также диффузный гемосидероз. В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 30-е сутки преобладала красная пульпа. Лимфоидные фолликулы были мелкие с небольшими светлыми центрами и рыхло расположенными в них лимфобластами, гистиоцитами и лимфоцитами. В строме красной пульпы преобладали лимфоциты, большое количество гистиоцитов и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов.

Морфофункциональная картина селезенки под влиянием МНК КМ претерпевала те же изменения, что и под влиянием ММСК КМ на всех исследуемых сроках. Однако, возникающие изменения были менее выраженными (табл. 11).

Таблица 11. Морфофункциональная характеристика селезенки крыс Wistar при ДНЯЖ и трансплантации МНК КМ (местно) (M±m)

	Объемная плотность в %
Зоны селезенки	ДНЯЖ+0,9% NaCl (контроль)			ДНЯЖ+МНК
	10сут	20сут	30сут	10сут	20сут	30сут
Лимфоидные фолликулы	22,8±4,56	34,4±6,8	42,4±8,4	37,2±7,4	33,4±6,68	31,4±6,28
ПАЛМ	7,2±1,44	13,0±2,6	11,6±2,3	8,4±1,6	22,0±2,3*	29,6±2,8*

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, динамические морфометрические исследования селезенки позволили выявить восстановление структурных компартментов под влиянием ММСК и МНК КМ. Это восстановление сопровождалось увеличением объемной доли лимфоидных фолликулов и ПАЛМ, что совпадало с активизацией регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка. При использовании клеточной терапии мы впервые отметили, что в красной пульпе селезенки значительно возрастает количество мегакариоцитов, по сравнению с контролем. В норме мегакариоциты в селезенке отсутствуют. Мы предполагаем, что наличие этого феномена (мегакариоциты в селезенке) следует рассматривать как компенсаторную реакцию организма в ответ на иммунопатологическое повреждение СОЖ и развитие иммунного дисбаланса, при котором имеет место повреждение органов иммуногенеза, в том числе костного мозга и как системы иммуногенеза, и как системы кроветворения.

4.3. Коррекция цитокинового дисбаланса при ДНЯЖ и трансплантации ММСК и МНК КМ

Подтверждением коррекции иммунного дисбаланса под влиянием ММСК КМ служит динамика изменения цитокинового баланса в сыворотке крови животных при ДНЯЖ. Нами установлено (рис.4), что под влиянием ММСК происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов - IL1, IFN, TNF к 30 суткам наблюдения, причем снижение IL1 было достоверным уже на ранних сроках (10-20 сутки) (рис. 4А). В тоже время уровень противовоспалительных цитокинов - IL-4, IL-10, TGF наоборот повышался и значения этих показателей становились достоверно выше по сравнению с контролем на 20 и 30 сутки лечения (рис. 4Б).

Рис.4.Изменение продукции провоспалительных (А) и противовоспалительных (Б) цитокинов в сыворотке крови крыс при трансплантации ММСК КМ в зону язвенного дефекта. 1 – после трансплантации ММСК КМ; 2 – после введения физиологического раствора (контроль); x-p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке исследования.

Аналогичная динамика цитокинового баланса была отмечена нами при трансплантации МНК КМ. Было установлено (рис. 5), что под влиянием МНК в сыворотке крови крыс с ДНЯЖ происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов - IL1, IFN, TNF к 30 суткам наблюдения, причем снижение IL1 было достоверным уже на ранних сроках (10-20 сутки). В тоже время уровень противовоспалительного цитокина - IL-4 наоборот под влиянием МНК резко повышался и значения этого показателя были достоверно выше по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения.

Рис. 5. Изменение продукции провоспалительных (IL1, TNF, IFN) и противовоспалительнго (IL-4) цитокинов в сыворотке крови крыс с ДНЯЖ при трансплантации МНК КМ в зону язвенного дефекта. 1 – после трансплантации МНК КМ; 2 – после введения физиологического раствора (контроль); x-p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке

Мы полагаем, что устранение цитокинового дисбаланса в организме под влиянием ММСК и МНК КМ, связано как с локальной продукцией трансплантированными клетками противовоспалительных цитокинов, и прежде всего, TGF, так и с усилением продукции этих цитокинов другими клетками иммунной системы, что в условиях нормализации морфофункционального состояния тимуса и селезенки восстанавливает программу адекватного функционирования всех интегративных систем организма и приводит к активизации процессов устойчивой репаративной регенерации ДНЯЖ.

5. Влияние ММСК и МНК КМ на стимуляцию неоангиогенеза и восстановление микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка

В результате проведенного лечения в группах с ДНЯЖ и применением клеточной терапии происходило значительное увеличение показателя микроциркуляции (ПМ) в СОЖ (табл. 12 и 13). Методом лазерной допплеровской флоуметрии было установлено, что уже на 10 сутки после применения ММСК у животных с ДНЯЖ уровень ПМ был в 2 раза выше, по сравнению с контролем (табл.12).

На 20 сутки у животных с ДНЯЖ и трансплантацией ММСК уровень ПМ становился еще выше, амплитудные характеристики микроциркуляции были также более выражены в опыте, чем в контроле, хотя и в контроле (ДНЯЖ без ММСК), ПМ возрос, но практически не отличался от показателя на сроке 10 суток лечения.

Изучение интегральной характеристики гемодинамики – индекс флаксмоции (ИФМ) у животных контрольной и основной группы подтвердило, что, начиная с 20-х суток (табл. 12) происходит не только достоверное увеличение ПМ, но и увеличение ИФМ, что указывает на улучшение состояния микроциркуляторного русла и способность к восстановлению его адекватной регуляции при воздействии имитационных нагрузок.

На 30 сутки у животных группы с трансплантацией ММСК КМ уровень и амплитудные характеристики ПМ были выше, чем в контроле, но не выше, чем в опыте на 20 сутки применения ММСК.

Дополнительным доказательством восстановления микроциркуляции в зоне язвенного дефекта под влиянием ММСК КМ являются результаты морфометрии сосудов в динамике процесса регенерации ДНЯЖ (рис. 6).

Рис. 6. Среднее количество сосудов (в 1 поле зрения) в краевой зоне язвенного дефекта длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка в динамике лечения. *-p<0,05 по сравнению с контролем при тех же сроках.

Из рисунка 6 видно, что обкалывание язвы ММСК ведет к достоверному увеличению количества микрососудов в 1 поле зрения по сравнению с аналогичными сроками в контроле и указывает на стимуляцию процессов неоангиогенеза.

Аналогичные результаты исследования микроциркуляции и ангиогенеза были получены нами в группах с применением МНК КМ. У этих животных также происходило значительное увеличение ПМ в СОЖ периульцерозной зоны (табл. 13). На 10 сутки после применения МНК КМ уровень ПМ был в 1,5 раза выше по сравнению с контролем.

На 20 сутки у животных с трансплантацией МНК КМ уровень ПМ становился еще выше; амплитудные характеристики микроциркуляции были также более выражены в опыте, чем в контроле, хотя и в контроле (ДНЯЖ без МНК), ПМ возрос, но практически оставался на уровне 10 суток лечения.

Изучение интегральной характеристики гемодинамики (ИФМ) у животных этих групп подтвердило, что, начиная с 10-х суток (табл.13) происходит не только достоверное увеличение ПМ, но и увеличение ИФМ, что указывает на улучшение состояния микроциркуляторного русла и способность к восстановлению его адекватной регуляции при воздействии имитационных нагрузок.

На 30 сутки у животных с трансплантацией МНК КМ уровень ПМ становился очень высоким, даже несколько выше, чем в группе с трансплантацией ММСК КМ в аналогичные сроки, но амплитудные характеристики микроциркуляции были слабо выражены и были ниже, чем в контроле, а также в группе с трансплантацией ММСК КМ. Хотя в контроле ПМ возрос, уровень его приближался к значениям ПМ на 10 сутки у животных опытной группы, где трансплантировались ММСК.

Дополнительным доказательством более эффективного восстановления микроциркуляции в зоне язвенного дефекта под влиянием МНК КМ являются результаты морфометрии сосудов в динамике процесса регенерации ДНЯЖ (рис. 6).

Таким образом, проведенное исследование состояния микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка позволило установить связь между более высокой регенерацией язвенных дефектов с улучшением микроциркуляции у животных, которым проводилась клеточная терапия, по сравнению с контрольной группой животных (ДНЯЖ без клеток КМ). Нами также отмечен, не только высокий темп регенерации язв при клеточной трансплантации (ММСК и МНК КМ), но и отмечено более высокое качество регенерации зоны язвенного дефекта, так как при завершении эксперимента даже через 6 месяцев после моделирования ДНЯЖ в контрольной группе сохранялись язвенные дефекты размерами до 0,4-0,5 мм, а у животных основных групп язвенные дефекты и рубцовые изменения в слизистой оболочке желудка отсутствовали. Мы полагаем, что высокое качество регенерации язвенного дефекта при использовании клеток костного мозга обусловлено более полноценным восстановлением структуры и регуляции сосудистого русла не только в зоне язвенного дефекта, но и в прилежащих тканях.

Таблица 12. Характеристика показателей микроциркуляции у крыс в зоне длительно незаживающих язв желудка в динамике восстановительного процесса без и на фоне клеточной трансплантации (ММСК КМ) (M±m).

Показатель (ПЕ)

Норма

Исходное состояние

В динамике восстановительного процесса

10 сутки

20 сутки

30 сутки

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

ПМ

43,2±19

2,13±0,5

1,88±0,4

4,15±2,1

3,21±2,3

7,19±4,6

7,78±4,8

10,1±4,7

11,8±5,2

15,5±2,0*

12,2±6,9

25,2±16

26,9±3,9*

2,43±0,2

1,44±0,1

6,35±0,3

1,88±0,4

5,89±0,6

9,86±4,9

3,99±37

8,31±4,1

14,7±7,2

5,39±0,2

8,78±3,2

3,58±0,2

19±11,2

0,94±0,5

2,52±0,2

6,38±0,2

4,04±0,2

5,51±0,4

1,0±0,11

9,35±4,6

1,59±0,1

3,0±2,1

0,2±0,04

0,9±0,39

1,8±0,41

3,58±0,4

5,42±0,3

26,1±17,9

5,47±0,2

9,9±4,4

14,6±6,9

KV

4,35±3,0

412,9±43,2

190,3±6,8

457±38,0

29,2±21

34,9±11

81,9±6,7

23,5±10

46,6±22

2,88±0,31

76,4±34

14,2±7,8

11,0±5,2

420±39,6

62,7±18

343±37,2

190±47,5

92±22,7

263,7±34,2

137±38

119±27,6

99,8±48,2

ИФМ

0,74±0,3

0,14±0,04

0,1±0,01

0,8±0,3

0,3±0,07

0,7±0,23

0,8±0,07

0,6±0,21

2,8±0,04*

0,94±0,63

1,5±0,17

1,7±0,21

1,73±0,12*

0,8±0,57

0,7±0,18

1,1±0,33

0,3±0,06

1,4±0,15

0,25±0,06

0,3±0,06

1,0±0,12

0,88±0,57

Примечание. Верхний ряд цифр – трансплантация ММСК КМ; нижний ряд – введение физиологического раствора (контроль).p<0,05 по сравнению с аналогичным показателем на 10 сутки исследования.

Таблица 13. Характеристика показателей микроциркуляции у крыс в зоне длительно незаживающих язв желудка в динамике восстановительного процесса без и на фоне клеточной трансплантации (МНК КМ) (M±m).

Показатель (ПЕ)

Норма

Исходное состояние

В динамике восстановительного процесса

10 сутки

20 сутки

30 сутки

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

Язва

Край язвы

0,5 см от края язвы

ПМ

43,2±19

2,13±0,5

1,88±0,4

4,15±2,1

3,0±2,1

5,69±3,8

6,24±4,8

8,7±3,1

10,0±5,2

12,4±2,0*

16,2±5,7*

27,7±13*

35,8±3,9*

2,11±0,2

1,17±0,1

5,23±0,3

1,68±0,4

5,3±0,6

8,47±4,9*

3,0±34

7,77±3,0

14,9±7,2

5,39±0,2

8,78±3,2

3,58±0,2

19±11,2

0,7±0,3

2,17±0,2

6,38±0,2

3,04±0,2

4,21±0,4

1,0±0,11

7,15±4,6

1,59±0,1

2,8±2,1

0,1±0,04

0,9±0,39

1,8±0,41

3,58±0,4

5,42±0,3

26,1±17,9

5,47±0,2

9,9±4,4

14,6±6,9

KV

4,35±3,0

412,9±43,2

190,3±6,8

457±38,0

20,2±19

25,4±9,9

76,6±5,7

20,3±10

37,6±20

3,74±0,27

84,4±37

15,2±8,4

14,0±5,2

310±39,6

52,9±18

343±37,2

190±47,5

92±22,7

263,7±34,2

137±38

119±27,6

99,8±48,2

ИФМ

0,74±0,3

0,14±0,04

0,1±0,01

0,8±0,3

0,3±0,07

0,6±0,33

0,76±0,06

1,2±0,21

3,0±0,04*

1,81±0,63

1,0±0,17

1,0±0,11

0,63±0,12*

0,6±0,57

0,6±0,18

1,1±0,33

0,3±0,06

1,4±0,15

0,25±0,06

0,3±0,06

1,0±0,12

0,88±0,57

Примечание. Верхний ряд цифр – трансплантация МНК КМ; нижний ряд – введение физиологического раствора (контроль).p<0,05 по сравнению с аналогичным показателем на 10 сутки исследования.

ВЫВОДЫ

1. Трансплантация прекультивированных аутологичных клеток костного мозга – мононуклеарных клеток и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в зону язвенного дефекта является эффективным методом лечения длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка, так как ускоряет процесс восстановительной регенерации в зоне язвенного дефекта и корригирует иммунопатологические изменения в организме, ликвидируя тем самым условия для их возникновения.

2. Разработанная модель длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка у крыс является адекватной экспериментальной моделью для изучения иммунопатологических механизмов развития язвенной болезни и для оценки эффективности лечения длительно незаживающих язв методами клеточной трансплантации, так как воспроизводит основные местные иммунопатологические изменения, возникающие в зоне язвенного дефекта у больных.

3. Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга также как культивирование мононуклеарных клеток является важным этапом подготовки этих клеток к трансплантации в зону язвенного дефекта, так как позволяет восстановить их пролиферативную и биорегуляторную активность от ингибирующего влияния хронического стресса, а также увеличить клеточную массу, необходимую для проведения клеточной терапии. Технология выделения ММСК является адекватной, так как выявление коллагена 1 типа в 100% этих клеток свидетельствует о мезенхимальной природе этих клеток и однородности клеточной культуры.

4. Прекультивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой смены фаз язвенного процесса: сокращения сроков и выраженности деструктивно – воспалительной фазы и активизации пролиферативно – регенераторной фазы язвенного процесса. Процессы регенерации ДНЯЖ при трансплантации ММСК протекают в более быстром темпе, чем при трансплантации МНК КМ.

5. Клетки костного мозга при трансплантации в зону язвенного дефекта реализуют свою биорегуляторную активность не краткосрочно, а за счет их длительного функционирования (не менее 30 суток), что подтверждается выявлением в зоне язвенного дефекта флуоресцирующих ММСК, использованных от трансгенных доноров с геном GFP, или ММСК, предварительно меченых геном LacZ E.coli.

6. Трансплантированные ММСК и МНК КМ обеспечивают более качественную и быструю регенерацию язв желудка за счет стимуляции неоангиогенеза и восстановления микроциркуляторного русла, улучшения процессов метаболической регуляции в системе «простагландины – циклические нуклеотиды», следствием чего становится ингибирование процессов усиленного апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка.

7. Культивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга, трансплантированные в зону язвенного дефекта, устраняют цитокиновый дисбаланс: снижается уровень провоспалительных (IL1 и TNF) и повышается уровень противовоспалительных (IL-10 и TGF) цитокинов.

8. Культивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают морфофункциональные компартменты органов иммуногенеза у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами: в тимусе отмечается расширение коркового слоя и субкортикальной зоны; в селезенке – увеличивается доля лимфоидных фолликулов и периартериальных лимфатических муфт. Появление в селезенке мегакариоцитов после проведения клеточной терапии может рассматриваться как феномен перестройки иммунной системы в ответ на активизацию ее прекультивированными клетками костного мозга.

9. Наиболее информативными показателями эффективности клеточной терапии длительно незаживающей язвы желудка и двенадцатиперстной кишки может стать фенотипический контроль активированных иммунокомпетентных клеток (цитотоксических лимфоцитов: CD8+, CD16+) и молекулярного маркера регуляторных клеток (CD4+CD25+) – FOXP3 в зоне язвенного дефекта.

10. Повышение уровня противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных, коррелирующее со снижением активности апоптоза в динамике после трансплантации ММСК и МНК КМ может служить показателем качественной регенерации слизистой оболочки желудка, так как устраняются факторы прогрессирования деструктивно-язвенного процесса.

11. Прекультивированные ММСК и МНК КМ аутологичного костного мозга целесообразно использовать для трансэндоскопического лечения хронических, длительно незаживающих, трудно рубцующихся гастродуоденальных язв.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При моделировании длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка подопытным животным (крысам) необходимо вводить подкожно 3-кратно, с интервалом в 7-10 дней антигены слизистой оболочки желудка в дозе до 1,5-2,0 мл (концентрация белка 35 мг/мл).

2. Для точного определения (с погрешностью до 0,01 мм) площади язвенного дефекта необходимо производить фотографирование язвенного дефекта на фоне линейки и производить расчеты с использованием компьютерной программы «Видео Тест-Мастер 5,0 («Видео Тест», СПб)».

3. С целью восстановления биорегуляторной и функциональной активности клеток аутологичного КМ (ММСК и МНК) перед трансплантацией следует их культивировать in vitro: МНК – 4-5 дней, а ММСК – 9-12 суток для устранения ингибирующего влияния стресса на эти клетки в организме.

4. При культивировании клеток площадь монослоя ММСК не должна превышать 80-85%, так как превышение этих значений может стать фактором ингибирования пролиферативной активности клеток в культуре.

5. Целесообразно исследовать возможности применения аутологичных клеток костного мозга (ММСК и МНК) для лечения длительно незаживающих и рецидивирующих язв, причем предпочтение следует отдавать ММСК, которые являются предшественниками фибробластов, дефицит которых имеет место в зоне язвенного дефекта, стимулируют региональные стволовые клетки в слизистой оболочке желудка и продуцируют биорегуляторные пептиды, корригирующие местный и общий гомеостаз.

6. Целесообразно эффективность клеточной терапии при длительно незаживающих язвах оценивать эндоскопически и в биоптатах из зоны язвенного дефекта по динамике снижения цитотоксического эффекта лимфоцитов в слизистой оболочке желудка и повышения экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток - FOXP3, отражающего степень нарушения иммунопатологических сдвигов в организме.

7. Клеточная терапия должна проводиться трансэндоскопически путем обкалывания зоны язвенного дефекта, что создает условия для более длительного функционирования мезенхимальных клеток в зоне язвенного дефекта, так как эти клетки попадают в условия адекватного микроокружения.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Потапов И.В., Аскаров М.Б. Прекультивирование клеток костного мозга как способ повышения их регуляторной активности при регенерационной терапии поврежденных органов / Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. Под ред. Шумакова В.И и Онищенко Н.А. М: «Лавр». - 2009. -С. 77-103.
2. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга как новый способ коррекции продукции регуляторных пептидов в организме и ускорения восстановительных (регенерационных) процессов длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка / Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. Под ред. Шумакова В.И и Онищенко Н.А. М: «Лавр».- 2009. -С. 204-209.
3. Цыпин А.Б., Васильченков А.В., Горшенин Т.Л., Аскаров М.Б. Лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки пептидами и цитокинами селезенки // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 128-129.
4. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация стволовых и прогениторных клеток аутологичного костного мозга ускоряет регенерацию длительно незаживающих язв желудка и двенадцатиперстной кишки // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 130-131.
5. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация стромальных клеток аутологичного костного мозга активизирует ядрышковые организаторы хромосом мРНК эпителиоцитов и ускоряет регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 131-132.
6. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Стромальные клетки аутологичного костного мозга стимулируют неоангиогенез и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Клеточные технологии в медицине, в травматологии и ортопедии. Тез. конф. НИИ травматологии и ортопедии им. Приорова, Москва,-2006.-С. 38-39.
7. Аскаров М.Б., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А., Трубицына И.Е. Стратегия применения SDF-1 фактора и его роль в активации и хоминге клеток в лечении хронических длительно незаживающих язв желудка // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 25.
8. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Экспериментальная язва желудка: стволовые клетки аутологичного костного мозга ускоряют процессы репаративной регенерации // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 26-27.
9. Васильченков А.В., Цыпин А.Б., Аскаров М.Б. Иммунотерапия язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 39-40.
10. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко Н.А. Аутологичные стромальные клетки костного мозга корригируют факторы регуляции морфогенеза и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Тез. Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции. - Москва, РГМУ. - 2007.-С. 31-32.
11. Васильченков А.В., Аскаров М.Б., Цыпин А.Б. Состояние иммунной системы при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил.1.-2008.-С. 19-20.
12. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Макарова О.В. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза - важный фактор заживления длительно незаживающих язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Тез. Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции.-Москва, РГМУ. - 2008. -С. 5-6.
13. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Коррекция цитокинового дисбаланса и стимуляция регенерации длительно незаживающих язв желудка при трансплантации стромальной фракции клеток аутологичного костного мозга // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 28-29.
14. Аскаров М.Б., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают дизрегуляцию системы «простагландины – циклические нуклеотиды» и ускоряют регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 30-31.
15. Аскаров М.Б., Дьяконова А.П., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. SDF-1 фактор и его роль в активации и хоминге клеток в лечении длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 27.
16. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают дизрегуляцию системы «простагландины-циклические нуклеотиды» и ускоряют регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 47-48.
17. Аскаров М.Б., Вострикова О.Ф., Воробьева Н.Н., Онищенко Н.А. Влияние аутологичных клеток костного мозга на процессы апоптоза и регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 49-50
18. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза и заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 51-52.
19. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Макарова О.В. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза и заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2008.-т.3.№ 3.-С. 36-42.
20. Аскаров М.Б., Вострикова О.Ф., Воробьева Н.Н., Онищенко Н.А. Влияние аутологичных клеток костного мозга на апоптоз и регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-№ 11.-С. 585-590.
21. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга стимулируют неоангиогенез, восстанавливают микроциркуляцию и способствуют заживлению длительно незаживающих язв желудка // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2008.-№ 4.-С. 195-200.
22. Аскаров М.Б., Цыпин А.Б., Трубицына И.Е., Иванов И.М., Онищенко Н.А. Репаративные процессы в длительно незаживающих язвах желудка у крыс при использовании биорегуляторных пептидов из ткани селезенки // Вестник трансплантологии и искусственных органов. -2008.-№ 3.-С. 35-39.
23. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Коррекция цитокинового дисбаланса и стимуляция регенерации длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации стромальной фракции клеток аутологичного костного мозга // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. -2008.-№ 4.-С. 26-28.
24. Аскаров М.Б. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2008.-№ 4.-С. 52-54.
25. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга устраняют цитотоксический эффект лимфоцитов в слизистой оболочке желудка и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // 4 Всероссийская конференция, посвященная памяти академика РАН и РАМН, профессора В.И.Шумакова, Москва, - 2008.-С. 225-226.
26. Аскаров М.Б., Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. Использование прекультивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга способствует заживлению длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Хирургия. Журнал имени Н.И.Пирогова -2009.-№ 2.-С. 37-41.
27. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. К механизму ускоренной регенерации длительно незаживающих язв желудка при трансплантации фибробластоподобных стромальных клеток аутологичного костного мозга. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. – 2009.- № 2.- С. 6-7.
28. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Анализ экспрессии молекулярного маркера регуляторных (CD4+CD25+) клеток – FOXP3 в норме и при длительно незаживающих гастродуоденальных язвах. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2009.-№ 2.-С. 7-8.
29. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Хохлова М.К., Онищенко Н.А. Про- и противовоспалительные цитокины у крыс с экспериментальной язвой желудка с иммунопатологическим компонентом. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2009.- № 2.- С. 9-11.
30. Васильченков А.В., Аскаров М.Б., Цыпин А.Б. Влияние иммуномодулятора «Спленопид» на элиминацию Helicobacter pylori при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2009.- № 2.- С. 43-45.
31. Васильченков А.В., Аскаров М.Б., Цыпин А.Б. Особенности влияния спленотерапии на иммунный статус у больных с язвенной болезнью. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. - 2009.- № 2.- С. 45-47.
32. Васильченков А.В., Аскаров М.Б., Цыпин А.Б., Онищенко Н.А. Функциональная активность и уровень апоптоза иммунокомпетентных клеток у больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. -2009.- № 2.- С. 47-48.
33. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Васильченков А.В., Потапова В.Б., Гудкова Р.Б. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга устраняют цитотоксический эффект лимфоцитов в слизистой оболочке желудка при хронической язве и ускоряют регенераторный процесс. Прил. №1. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.- 2009.- № 2.- С. 8-9.
34. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Влияние мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга на морфофункциональное состояние тимуса и селезенки, иммунный (цитокиновый) статус и регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка у крыс // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2009.- № 1.-С. 36-40.
35. Аскаров М.Б., Воробьева Н.Н., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Коррекция цитокинового дисбаланса и стимуляция регенерации длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при периульцерозной трансплантации мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2009.- № 4. - С. 52-55.

Патенты:

1. Аскаров М.Б., Дьяконова А.П., Крашенинников М.Е., Лазебник Л.Б., Онищенко Н.А., Трубицына И.Е., Шумаков В.И. Способ моделирования аутоиммунного гастрита. Решение о выдаче патента на изобретение № 2007128128/14 (030617) (54) от 11.11.2008 г.

2. Аскаров М.Б., Дьяконова А.П., Крашенинников М.Е., Лазебник Л.Б., Онищенко Н.А., Трубицына И.Е., Шумаков В.И. Способ моделирования аутоиммунной язвы желудка. Решение о выдаче патента на изобретение № 2007128125/14 (030614) от 09.02.2009 г.