Изучение роли дендритных клеток в противоинфекционном и противоопухолевом иммунитете на экспериментальных моделях
На правах рукописи
Макашин
Алексей Игоревич
Изучение роли дендритных клеток в противоинфекционном и противоопухолевом иммунитете на экспериментальных моделях
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук.
Москва – 2006 г.
Работа выполнена в ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН и ГУ Научно–исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Киселевский Михаил Валентинович
кандидат медицинских наук Ахматова Нэлли Кимовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Кедрова Анна Генриховна
доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич
Ведущая организация: ФГУН Государственный институт стандартизации и контроля медицинских
биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича
Защита состоится «___»___________2006 года в ________ на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (119992, г. Москва ул. Трубецкая, д. 8, строение 2)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49)
Автореферат разослан «___»________2006г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
Доктор медицинских наук,
профессор Миронов Андрей Юрьевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
В настоящее время использование аутологичных дендритных клеток (ДК), презентирующих заданный антиген, рассматривают как новую стратегию в разработке вакцинных препаратов для адоптивной иммунотерапии инфекционных и онкологических заболеваний (Jeannin, 2002). Это объясняется тем, что среди других профессиональных антиген- презентирующих клеток (АПК), ДК являются наиболее эффективным связующим звеном при активации врожденного и приобретенного иммунитета (Bancherau, 2005). Пульсированные ex vivo различными белковыми антигенами ДК способны примировать наивные Т-лимфоциты in vivo, вырабатывать ряд цитокинов и индуцировать протективный иммунитет против различных патогенов. При использовании ДК, во-первых, можно получить эффективные препараты в отношении инфекций, для которых создание традиционных вакцин невозможно. Так, исследования последних лет выявили обнадеживающие результаты адоптивной иммунотерапии при использовании пульсированных антигеном ДК у больных с ВИЧ-инфекцией (Walsh, 2003). Во-вторых, создание готового препарата ДК, обладающего протективным эффектом, занимает всего несколько дней и может быть использовано для экстренной профилактики инфекций неизвестной этиологии. Для этого достаточно иметь образец патогенного микроорганизма без проведения предварительной идентификации возбудителя и получения отдельных антигенов патогенного микрорганизма.
Учитывая то, что в последние десятилетия проблема лечения и профилактики инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, сохраняет свою актуальность, в качестве модели исследования для получения вакцины на основе ДК мы выбрали Klebsiella pneumoniaе, занимающую одно из первых мест в структуре внутрибольничных инфекций (Hostacka, 2001; Sahly, 2000; Красноголовец, 1996). Вакцины на основе дендритных клеток в настоящее время находят клиническое применение в области онкологии, при этом для получения дендритно-клеточных препаратов с противоинфескционной и противоопухолевой активностью могут быть использованы идентичные технологии.
Цель исследования
Изучение роли дендритных клеток в противоинфекционном (на модели K. pneumoniae) и противоопухолевом (на модели меланомы В-16) иммунитете.
Задачи исследования
- Оптимизация метода получения зрелых дендритных клеток из костномозговых предшественников, с использованием ФНО- и бактериальных факторов в качестве индукторов созревания.
- Исследование иммунофенотипа, морфологических параметров, уровня продукции цитокинов, а так же фагоцитарной активности дендритных клеток на разных этапах их созревания.
- Определение дозы и кратности введения экспериментального образца клебсиеллезной и противоопухолевой вакцины на основе ДК для выяснения оптимальных режимов вакцинации, обеспечивающих протективный эффект.
- Оценка пролиферативной и цитотоксической активности лимфоцитов вакцинированных мышей.
Основные положения, выносимые на защиту
- С использованием коктейля цитокинов (ГМ-КСФ, ИЛ-4) и индукторов созревания (ФНО-, лизат K. Pneumoniae, ВП-4) из клеток-предшественников костного мозга могут быть получены дендритные клетки, обладающие высокой антигенпрезентирующей активностью.
- Вакцинация с использованием зрелых дендритных клеток, нагруженных лизатом клеток опухоли или микроорганизмов вызывает специфический иммунный ответ.
- Предложенная технология получения вакцины на основе дендритных клеток позволяет индуцировать адаптивный противоопухолевый или противоинфекционный иммунный ответ.
Научная новизна
Впервые изучена противоинфекционная активность дендритных клеток в отношении K. pneumoniae. и произведена цейттраферная видеосъемка дендритных клеток на разных этапах их созревания. Впервые в сравнительном аспекте изучены бактериальные препараты (лизат К. pneumoniae, вакцина ВП-4) в качестве индукторов созревания ДК.
Впервые было показано, что бактериальный лизат может быть использован одновременно в качестве антигена и фактора созревания ДК.
Получены новые данные, характеризующие иммунофенотип, морфологические параметры, уровень продукции цитокинов ДК.
Научно-практическая значимость
Предложенная технология культивирования ДК может быть использована для получения противоопухолевых и противоинфекционных вакцин.
Для получения противоопухолевых и противоинфеккционных вакцин на основе ДК могут быть использованы различные бактериальные препараты (лизат К. pneumoniae, вакцина ВП-4).
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на совместном заседании кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им И.М. Сеченова и лаборатории клеточного иммунитета ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН 20 февраля 2006г., протокол №26.
Публикации
Основные положения диссертации отражены в 9 научных публикациях в центральной и местной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, материалов и методов исследования, двух глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов и указателя литературы; иллюстрирована 12 таблицами и 20 рисунками. Объем диссертации - 116 страниц машинописного текста, было использовано 198 источников литературы из них 7 отечественных и 191 зарубежных.
Материалы и методы исследования
Лабораторные животные. Исследования проведены на 150 мышах линий СВА и DВА, массой 18-20 г полученных из питомника “Столбовая” Московской области. Для генерации дендритных клеток (ДК) использованы клетки костного мозга 30 мышей. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом.
Культивирование ДК. ДК получали из клеток костного мозга мышей линии СВА. Костный мозг мышей пипетировали до получения клеточной взвеси в среде RPMI–1640 (Sigma, США), трижды осаждали центрифугированием (250 g x 5 мин) и переводили в обогащенную среду культивирования (106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 с добавлением 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки – ЭТС), содержащую по 10 нг/мл рекомбинантные ГМ-КСФ и ИЛ-4 (Biosource, США). На шестые сутки производили смену среды с добавлением поликомпонентной вакцины Иммуновак ВП-4 (50 мкг/мл) или липополисахарида (ЛПС) К. pneumoniae (0,125 мкг/мл) (Sigma, США), или фактора некроза опухоли (ФНО-) для индукции созревания ДК.
Методика получения лизата микробных клеток. Выросшую микробную культуру штаммов К2 К. pneumoniae смывали с плотной питательной среды дистиллированной водой. Доводили концентрацию бактериальной взвеси до 106 микробных клеток/мл и подвергали ее 8-10-кратному замораживанию и оттаиванию. Полноту инактивации микробной массы оценивали по высеву на чашке с питательным агаром, затем стерилизовали.
Анализ фенотипа ДК. Фенотип ДК исследовали с использованием моноклональных антител (фирмы Caltag Laboratories, USA) против соответствующих антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и окрашивали FITC (флюоресциинизотиоционат) и PE (фикоэритрин)мечеными антителами согласно инструкции производителя. Затем отмывали 2 раза холодным ФСБ. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur (фирмы Becton Dickinson, USA). На ДК, полученных из эмбриональных клеток печени мышей, исследовали уровни экспрессии молекул F4/80, CD34, CD38, CD40, CD80, CD86, MHC I и МНС II. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8.
Цитологическое исследование. Фазово-контрастная микроскопия клеток меченых соответствующими антителами проводилась с помощью системы Axiovision 4 (Germany). Мазки, полученные из взвеси клеток, фиксировали метиловым спиртом и окрашивали эозин-азуром по Романовскому-Гимза, метиловым зеленым-пиронином по Браше на РНК с контрольной обработкой РНК-зой и Шифф-реактивом по Шабадашу с контролем амилазой на гликоген и гликозаминогликаны [Armant M, 2002]. Фотографирование меченых клеток и окрашенных мазков производилось с использованием системы Axiovision 4 (фирмы Carl Zeiss, Germany).
Электронномикроскопическое исследование. Клетки фиксировали в 2% растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере и заключали в смолу эпон-аралгит по стандартной методике. Срезы получали на ультамикротоме LKB-3 (LKB, Sweden) и контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-100CX (LEOL, Japan).
Фагоцитарную активность ДК оценивали по поглотительной способности в отношении S. Typhimurium, S. Aureus
Определяли фагоцитарный индекс (ФИ) – процент клеток, вступивших в фагоцитоз, и фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число бактерий, находящихся внутриклеточно (частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число клеток, вступивших в фагоцитоз).
Уровень цитокинов определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы Biosource (США).
Опухолевые модели. В качестве моделей опухолей использовали клетки мышиной меланомы В16.
Для поддержания опухолевых клеток меланомы В16 клетки имплантировали подкожно или внутрибрюшинно в дозе 500 тыс./мышь. На десятые сутки определялись опухолевые узлы в месте введения или асцит, через 2 недели мышей забивали с помощью внутривенного введения гексенала в апноэтической дозе. Опухолевый узел удаляли и помещали в стерильную чашку Петри со средой Хенкса. Опухоль измельчали ножницами, а затем тщательно пипетировали для получения клеточной взвеси. Клетки подсчитывали, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавками (HEPES, L-глютамин, гентамицин) в концентрации 1х106/мл. Часть клеток перевивали мышам, а остальные помещали в культуральные флаконы с добавлением 10 % телячьей фетальной сыворотки и инкубировали в СО2-инкубаторе. Культивируемые клетки использовали для тестирования цитотоксической активности лимфоцитов мышей и имплантации мышам.
Цитотоксическую активность лимфоцитов, полученных из селезенки мышей, определяли на линии клеток мышиной меланомы В16 в тесте восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Опухолевые клетки (1104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с лимфоцитами в разных соотношениях в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (фирмы Costar, Франция) 18 часов при 37С и 4 % СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ (фирмы Sigma, США) и по оптической плотности при длине волны 540 нм, измеряемой на мультискане МS (фирмы Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток
Получение суспензии мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) и лимфоцитов мышей. Селезенки мышей гомогенизировали в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) и трижды осаждали центрифугированием. Взвесь клеток селезенки центрифугировали при 400 g в течение 30 минут в градиенте плотности фиколл-урографина (“Pharmacia”, плотностью 1,077 г/см3). МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали средой 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центирифугированием при 200 g. Для получения лимфоцитов взвесь МЛ в среде RPMI-1640 разливали во флаконы и неприлипшие клетки переводили в среду культивирования (106 клеток в 1 мл обогащенной среды RPMI-1640).
Статистическую обработку данных проводили при использовании t-критерия Стъюдента, применяя стандартный пакет статистических программ Windows 98 (StatSoft 5.5).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологическая характеристика дендритных клеток
Незрелые дендритные клетки (ДК) получали по стандартной методике из клеток-предшественников костного мозга путем культивирования в присутствии интерлейкина-4 (ИЛ-4) и гранулоцитарно-макрофагального-колоние стимулирующего фактора (ГМ-КСФ). В качестве индукторов созревания использовали фактор некроза опухоли- (ФНО-) или лизат К. pneumoniae. Уже на седьмые сутки культивирования клетки костного мозга (ККМ) с ИЛ-4 и ГМ-КСФ приобрели характерные признаки незрелых ДК, такие как наличие вуалевидной мембраны, цитоплазматических отростков, высокой степени адгезии (рис.1).
Рисунок 1. ДК, прилипшие ко дну культурального флакона из культуры клеток костного мозга мышей Слева – ДК на 9 сутки (3 сутки после обработки ТНФ-), справа ДК на 6 сутки культивирования без индукторов созревания.
Окраска по Романовскому-Гимза. Ок. 10, об. 100.
На протяжении первых 7 суток, т.е. до момента добавления факторов созревания (ФНО- или лизат К. pneumoniae.) ДК проявляли высокую пролиферативную способность, которую утрачивали по мере созревания. На десятые сутки (третьи сутки инкубирования с фактором созревания) ДК приобретали звездчатую форму с характерными для зрелых форм цитоплазматическим отростками. Клетки, культивируемые с добавлением в качестве фактора созревания ФНО-, имели многочисленные длинные тонкие отростки на поверхности. Электронно-микроскопические исследования показали, что ДК, генерированные из клеток–предшественников костного мозга мышей, пульсированых ФНО-, имели крупные размеры, овальную или неправильную форму с многочисленными разветвленными или булавовидными отростками, эксцентрично расположенное ядро с многочисленными инвагинациями, хроматином, сконцентрированным преимущественно по периферии, и крупными ядрышками. Таким образом, полученные клетки по морфологическим признакам могут быть отнесены к зрелым ДК.
Определение фенотипа ДК
Фенотипически клетки, инкубированные в присутствии ИЛ-4 и ГМ-КСФ, были незрелыми (СD34+, CD80-, CD86-). Использование лизата штамма К. pneumoniae К2, вакцины ВП-4 и ФНО-, в качестве индукторов созревания, позволило получить зрелые ДК, характеризующиеся типичной морфологией и фенотипом CD34-, CD38+, CD40+, CD80+, CD86+, MHC I+, MHC II+, F4/80-+(рис.2).
 |  |  |
Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) зрелых ДК, полученных с использованием Иммуновак ВП-4 (50 нг/мл).
 |  |  |
Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) зрелых ДК, полученных с использованием рекомбинантного TNF-a (20 нг/мл).
Рисунок 2. Экспрессия маркеров CD80, CD86
Как следует из данных, представленных на рис.3 и в таб.1, ЛПС и лизат К. pneumoniae обладают сходной по сравнению с ФНО активностью по способности повышать уровень экспрессии маркеров созревания ДК (CD80+, CD86). Эти данные свидетельствуют о возможности использования рассматриваемых бактериальных препаратов в качестве индукторов созревания ДК.
Рисунок 3. Экспрессия маркеров CD80, CD86 незрелыми, зрелыми ДК и ККМ.
* Достоверность различий между зрелыми ДК и остальными группами: (р1 и p2,3,4,5 ) <0,05.
В литературе существуют противоречивые данные относительно уровня повышения CD80: в подавляющем большинстве экспериментов костимулятор СD80 (В7-1) экспрессировался много слабее, чем CD86, причем, уровень его экспрессии по данным разных авторов варьирует в значительных пределах (2-87%), однако сам факт повышения экспрессии этого маркера не вызывает сомнений [Sallusto, 2000;Hasebe, 2000;Morse, 1999;Piemonti, 2000;Triozzi, 2000]. У зрелых ДК, инкубированных с бактериальными препаратами, наряду с повышением экспрессии маркеров зрелых ДК наблюдалось повышение уровня макрофагального антигена F4/80 (рецептора к ЛПС), что, вероятно, связано с присутствием ЛПС в бактериальных препаратах, которыми пульсировали незрелые ДК.
Продукция цитокинов дендритными клетками
В ходе исследования было обнаружено, что в культуральной среде со зрелыми ДК достоверно повышался уровень ряда цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, интерферона- и ФНО-) по сравнению с незрелыми ДК, при этом наиболее высокими были концентрации ИЛ-6 (566,2±10,3 pg/ml), ИЛ-12 (152,1±7,2 pg/ml), ФНО- (733,2±12,8 pg/ml) и ИФН- (159,8±6,4) (рис.4, таб.2). Содержание ИЛ-2, ИЛ-10 не претерпевало существенных изменений, в то время как продукция ИЛ-4 зрелыми ДК была достоверно ниже, чем у незрелых форм.
Рисунок 4. Индукция цитокинов зрелыми и незрелыми ДК.
Достоверность различий между группами: * p <0,05; **p <0,001.
Таблица1. Влияние препаратов – индукторов созревания ДК, генерированных из клеток костного мозга мышей (n=15), на уровень экспрессии поверхностных молекул
| Концентрация компонентов в среде культивирования ДК | Уровень экспрессии поверхностных молекул, % | |||||||||||
| Лизат мкл/мл | ЛПС мкг/мл | ВП-4, мкг/мл | ФНО-, нг/мл | СD34 | СD38 | CD40 | СD80 | СD86 | MHC I | MHC II | F4/80 | |
| 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 15,9±1,2 | 5,0±0,1 | 0,5±0,1 | 8,1±0,4 | 5,3±0,4 | 9,3±2,3 | 9,1±2,1 | 58,9±2,2 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 20 | 6,9±3,5 | 22,6±2,7* | 23,2±3,4* | 65,9±0,9* | 61,2±2,8* | 31,0±4,5* | 32,3±4,2* | 4,6±0,7* |
| 3 | 0 | 0 | 50 | 0 | 5,8±2,3* | 13,5±1,2* | 36,8±2,3* | 66,3±0,8* | 30,3±3,5* | 18,1±3,8* | 18,3±3,4* | 36,5±2,5 |
| 4 | 0 | 0,125 | 0 | 0 | 6,2±1,5* | 10,8±1,7* | 10,6±3,5* | 64,3±1,5* | 59,1±8,5* | 22,1±4,7* | 17,5±2,5* | 45,3±7,7 |
| 5 | 50 | 0 | 0 | 0 | 6,2±2,3* | 12,3±1,2* | 10,2±2,8* | 63,1±1,6* | 48,4±5,2* | 21,6±0,7 | 14,7±0,8* | 32,1±5,1 |
| 6 | Исходный фенотип клеток костного мозга | 28,2±3,7 | 0,3±1,5 | 0,3±0,1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0,5±0,1 | |||
Достоверность различий между группами: * р1 и 2,3,4,5 <0,05.
Фагоцитарная активность дендритных клеток на разных этапах созревания
При исследовании фагоцитарной активности ДК были получены данные, свидетельствующие о том, что незрелые ДК более активно фагоцитировали бактерии по сравнению с ДК, обработанными бактериальными препаратами и ФНО-. Фагоцитарная активность ДК значительно варьировала в зависимости от степени зрелости. Уже через 5 мин после введения культуры S. aureus в среду с незрелыми клетками ФИ составил 23,1 %, в последующие сроки наблюдения ФИ повышался до 55,1-57,2 %.
В группах с добавлением ФНО- и ВП-4 фагоцитарная активность была существенно ниже, причем при прибавлении ВП-4 ФИ был несколько выше, чем в случае созревания ДК под влиянием ФНО- (p<0,05). Также было установлено, что макрофаги обладают более высокой фагоцитарной активностью, по сравнению с ДК, как зрелыми, так и незрелыми. ФИ у первых по отношению к S. aureus уже через 30 мин инкубации составлял 86,0+4,8 % и он оставался на высоком уровне в течение 3-х часов наблюдения (таб.3).
Таблица 3. Фагоцитарная активность дендритных клеток по отношению к S. aureus (1х109 кл/мл)
| № групп | Культура 10х106 кл/мл | Время | Фагоцитарный индекс (%) | Фагоцитарное число (%) |
| 1 | ДК незрелые | 5 мин | 23,1±3,14 | 15,8±0,6 |
| 30 мин | 55,1±3,0 | 23,6±2,1 | ||
| 1,5 часа | 57,2±2,9 | 22,1±1,2 | ||
| 3 часа | 57,0±3,0 | 20,2±1,3 | ||
| 2 | ДК+TNF (20 нг/мл) | 5 мин | 5,1±0,3 | 7,3±2,3 |
| 30 мин | 11,7±0,6 | 8,2±2,4 | ||
| 1,5 час | 12,4±0,7 | 6,2±1,3 | ||
| 3 часа | 12,1±0,8 | 6,1±1,5 | ||
| 3 | ДК+ВП-4 (25 мкг/мл) | 5 мин | 12,6±0,6* | 10,5±1,4 |
| 30 мин | 17,3±1,0* | 12,4±1,4 | ||
| 1,5 час | 18,3±1,2** | 10,6±0,7 | ||
| 3 часа | 18,2±1,4* | 10,1±1,1 | ||
| 4 | Макрофаги | 5 мин | 11,2±0,5 | 5,1±0,5 |
| 30 мин | 86,0±4,8 | 11,3±0,7 | ||
| 1,5 час | 84,0±5,3 | 9,8±0,6 | ||
| 3 часа | 83,5±6,5 | 9,7±1,3 |
Достоверность различий между 2 и 3 группами: *p<0,05; **p<0,01
Как следует из данных, приведенных в таблице 4, ДК обладали более высокой степенью фагоцитоза в отношении S. Typhimurium по сравнению с S. Aureus.
Таблица 4. Фагоцитарная активность дендритных клеток по отношению к S. aureus и S.typhimurium (1х109 кл/мл)
| Культура | Время | ФИ | ФЧ | ||
| ДК незрелые | S. aureus | S. typhimurium | S. aureus | S. typhimurium | |
| 30 мин | 55,1±3,0 | 43,7±4,8 | 23,6±2,1 | 24,8±2,5 | |
| 1,5 часа | 57,2±2,9 | 55,4±5,6 | 22,1±1,2 | 25,0±2,7 | |
| ДК+TNF | 30 мин | 11,7±0,6** | 9,1±0,4** | 8,2±2,4 | 6,3±0,3 |
| 1,5 час | 12,4±0,7* | 10,2±0,5* | 6,2±1,3 | 6,8±0,5 | |
| ДК+ВП-4 | 30 мин | 17,3±1,0* | 25,3±2,6* | 12,4±1,4 | 10,7±0,4 |
| 1,5 час | 18,3±1,2* | 24,2±2,4* | 10,6±0,7 | 11,5±0,5 | |
Достоверность различий между ФИ S. aureus и S.typhimurium: *p<0,05; **p<0,01
Влияние ДК на пролиферативную активность МНК
При культивировании МЛ в присутствии зрелых ДК, пульсированных бактериальными препаратами и ФНО-, отмечалось повышение пролиферативной активности мононуклеаров (p<0,05), причем все исследуемые препараты усиливали активность ДК практически в равной степени, в то время как присутствие незрелых ДК не оказывало заметного влияния на пролиферацию МЛ. Эти результаты свидетельствуют о высокой антигенпрезентирующей активности зрелых ДК (рис.4).
Рисунок4. Влияние ДК на пролиферативную активность МНК.
ИС – индекс стимуляции – отношение пролиферативной активности МНК при стимуляции зрелыми ДК к пролиферативной активности МНК при стимуляции незрелыми ДК (группа 2).
*Достоверность различий между группами: p 2 и 3,4,5,6<0,05.
Оценка протективного эффекта вакцин на основе ДК у зараженных Klebsiella pneumoniae мышей
В серии опытов на мышах, зараженных абсолютно смертельной дозой (10 LD50) K. pneumoniae было показано, что при 4-кратном введении (в/бр) ДК, пульсированные лизатом K. pneumoniae (3x106/0,5мл/мышь), вызывали доставерный протективный эффект. В экспериментальной группе животных выживаемость составила 83,3
15,2%. При этом в контрольной серии отмечалась 100% гибель животных (таб.5).
Таблица 5. Протективный эффект дендритных клеток, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2, при заражении мышей гомологичным штаммом в дозе 10 LD50.
| №№ группы | Популяция клеток (антиген для пульсированрия) | Штамм K.pneumoniae для заражения | % выживших  m |
| 1 | ДК(К2) | К2 | 83,3 15,2* |
| 2 | Контроль | Интактные | 0 |
50,0 20,4 |
* достоверность разности между опытом и контролем р<0,01
В аналогичных условиях трехкратная иммунизация пульсированными ДК приводила к 100% выживаемости иммунизированных животных.
Таблица 6. Протективный эффект дендритных клеток, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2, при заражении мышей гомологичным штаммом в дозе 10 LD50.
| №№ группы | Популяция клеток (антиген для пульсированрия) | Штамм K.pneumoniae для заражения | % выживших  m |
| 1 | ДК(К2) | К2 | 100* |
| 2 | Контроль | Интактные | 0 |
33,3 19,2 |
*достоверность разности между опытом и контролем р<0,02
Как следует из таблицы 7, при двукратной иммунизации мышей дендритными клетками, нагруженными лизатом K. pneumonia, с интервалом в 14 суток и последующим заражением K. pneumoniae на 10-е сутки после последней иммунизации, в группе иммунизированных животных выжило 100% мышей, в то время, как в контрольной серии - 20,0
17,9%, р<0,02.
Таблица 7. Протективный эффект дендритных клеток, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2, при заражении мышей гомологичным штаммом в дозе 10 LD50.
| №№ группы | Популяция клеток (антиген для пульсированрия) | Штамм K.pneumoni ae для заражения | % выживших  m |
| 1 | ДК(К2) | К2 | 100* |
| 2 | Контроль | Интактные | 20,0 17,9 |
| 40,0 |
*достоверность разности между опытом и контролем р<0,02
В специальной серии экспериментов была проведена сравнительная оценка протективной активности ДК, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2, ВП-4, а также интактных зрелых ДК. Как следует из данных, приведенных в таблице 8, 100% протективный эффект отмечался у животных, иммунизированных ДК, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2. В группе животных, получавших ДК, нагруженные ВП-4, выжило 33,3%
19,2 мышей. При введении животным зрелых интактных ДК, так же, как и в контрольной серии регистрировалась 100% гибель при заражениии K. Pneumoniae К2 (10 LD50).
Таблица 8. Протективный эффект дендритных клеток, пульсированных лизатом K. pneumoniae К2, ВП-4 и интактных зрелых ДК, при заражении мышей K. pneumoniae К2 в дозе 10 LD50.
| №№ группы | Популяция клеток (антиген для пульсированрия) | Штамм K.pneumoniae для заражения | % выживших  m |
| 1 | ДК(К2) | К2 | 100* |
| 2 | ДК(ВП-4) | К2 | 33,3 19,2 |
| 3 | ДК(TNF-) зрелые | К2 | 0 |
| 4 | Контроль | Интактные | 0 |
*достоверность разности между опытом и контролем р<0,02
Полученные результаты согласуются с данными различных исследователей [Bacci, 2002;Bourguin,;Francotte, 1985;Ludewig, 1998;Manickan, 1997;Mbow, 1997;Perruccio, 2004;Rey-Ladino, 2005;Shaw, 2002;Su, 1998;von Stebut, 2000;Worgall, 2001], показавшими противоинфекционный эффект ДК вакцин.
Важно отметить, что значительную роль в обеспечении протективного эффекта, ДК-вакцинами, играет тип антигена, используемого для пульсации ДК. При этом предпочтение должно быть отдано лизатам патогенов, убитым или живым микроорганизмам, но не рекомбинантным антигенам, иммунологический ответ на которые in vivo труднопредсказуем и может не соответствовать таковому ex vivo [Shaw, 2002;Rey-Ladino, 2005].
Оценка противоопухолевого действия вакцин на основе ДК
На первом этапе была исследована антигенпрезентирующая активность ДК, пульсированных лизатом клеток меланомы В16. ДК вводили трижды с интервалом в 2 недели мышам в диапазоне доз от 100 тыс. до 1,5 млн клеток на мышь (в/бр). После каждой вакцинации и перед трансплантацией, часть мышей забивали и выделяли лимфоциты селезенки. Цитотоксическую активность лимфоцитов определяли на клетках меланомы В16. Как показано на рис.5, максимальное увеличение цитотоксической активности лимфоцитов иммунизированных мышей по отношению к клеткам меланомы В16 ex vivo отмечалось при введении ДК в дозе от 1 млн. Дальнейшее увеличение дозы не приводило к увеличению цитотоксической активности. Поэтому оптимальной дозой для вакцинации мышей является 1 млн. пульсированных дендритных клеток. При этом максимальная киллерная активность лимфоцитов достигалась после второй прививки. Учитывая вышеизложенное, в последующих экспериментах использовали двукратное введение ДК в дозе 1млн./мышь.
Рисунок 5. Цитотоксическая активность лимфоцитов после вакцинации мышей (%).
Также было установлено, что минимальной прививочной дозой меланомы В16, вызывающей образование опухоли и гибель животных в 100% случаев, является 50 тыс. опухолевых клеток/мышь (табл.9).
Таблица 9. Гибель животных после имплантации опухолевых клеток (%).
| Показатель | Прививочная доза меланомы В16 (в тыс.) | |||||||
| 10 | 25 | 50 | 100 | 300 | 500 | 750 | 1000 | |
| Процент погибших животных | 20 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
В данных условиях вакцинация ДК, пульсированными лизатом меланомы, полностью предотвращала гибель животных-опухоленосителей при прививочной дозе в 50 тыс. опухолевых клеток (табл.10). При более высоких прививочных дозах меланомы В16 вакцина была менее эффективна, хотя при всех испытанных уровнях у провакцинированных животных опухолевые узлы верифицировались позднее, а гибель животных наступала в более поздние сроки по сравнению с контрольной группой.
Таблица 10. Процент гибели вакцинированных мышей при различных прививочных дозах опухолевых клеток.
| Показатель | Прививочная доза меланомы В16 (в тыс.) | ||||
| 50 | 100 | 300 | 500 | 1000 | |
| Процент погибших животных | 0 | 20 | 60 | 100 | 100 |
Учитывая приведенные выше результаты, представляется целесообразным дальнейшее исследование и совершенствование данного способа лечения как патенциального метода продления безрецидивного периода жизни онкологических больных после максимальной циторедукции хирургическим путем и/или при помощи химиотерапии. Об этом также свидетельствуют эксперименты на мышах Homma, 2001, показавшие эффективность ДК-вакцин для предотвращения рецидива карциномы печени.
Таким образом, из клеток-предшественников костного мозга при культивировании с ростовыми факторами (ИЛ-4 и ГМ-КСФ) и факторами созревания (ФНО- и бактериальными препаратами) могут быть получены зрелые ДК, обладающие типичной морфологией и фенотипом, а также спектром продуцируемых цитокинов. Незрелые ДК характеризуются большей способностью к фагоцитозу, чем зрелые формы. Зрелые ДК, пульсированные лизатом возбудителя способны обеспечивать специфический протективный эффект в отношении этого патогенна. Зрелые ДК, нагруженные опухолевым лизатом, могут тормозить рост опухолей. Предложенная методика может быть использована для создания специфических противоинфекционных и противоопухолевых вакцин на основе ДК.
Выводы
- С помощью ростовых факторов (ГМ-КСФ, ИЛ-4) и бактериальных препаратов из клеток-предшественников костного мозга мышей могут быть получены зрелые дендритные клетки.
- Зрелые дендритные клетки характеризуются крупным размером, имеют овальную или неправильную форму с многочисленными разветвленными или булавовидными отростками, эксцентрично расположенное ядро с многочисленными инвагинациями и фенотип CD34-, CD38+, CD40+, CD80+, CD86+, MHC I+, MHC II+, F4/80-+. При добавлении в культуру незрелых дендритных клеток ФНО- уровень CD86 увеличивается в 11,5 раз, а поликомпонентная вакцина ВП-4 повышает его экспрессию в 5,7 раз.
- При созревании дендритных клеток значительно увеличивается продукция ИЛ-6, ИЛ-12, ИНФ-.
- Незрелые дендритные клетки способны более активно фагоцитировать бактерии по сравнению со зрелыми дендритными клетками. Через 5 мин после введения культуры S. aureus в среду с незрелыми клетками фагоцитарный индекс составил 23,1 %, в последующие сроки наблюдения этот показатель повышался до 55,1-57,2 %.
- Зрелые дендритные клетки, пульсированные опухолевым или бактериальным антигеном, усиливают пролиферативную и цитотоксическую активность лимфоцитов, что свидетельствует об их антигенпрезентирующей способности.
- Двукратная иммунизация дендритными клетками, пульсированными лизатом K. Pneumoniae, в дозе 3 млн клеток, с интервалом в две недели, оказывает выраженное протективное действие в отношении клебсиеллезной инфекции, причем защита является специфической.
- Дендритные клетки, нагруженные лизатом меланомы В16 при двукратном введении мышам с интервалом в две недели обеспечивали полный защитный эффект при прививочной дозе равной 50 тыс. клеток меланомы В16. При больших уровнях воздействующих доз отмечалось достоверное увеличение продолжительности жизни иммунизированных животных.
Практические рекомендации
Разработанные методы генерации дендритных клеток могут быть использованы для создания противоинфекционных и противоопухолевых вакцин.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В, Макашин А.И., Семёнова И.Б, Курбатова Е.А., Егорова Н.Б.,. Семенов Б.Ф. Влияние дендритных клеток, генерированных при помощи иммуномодуляторов микробного происхождения, на пролиферативную и цитотоксическую активность лимфоцитов // ЖМЭИ. – 2005. - №6.– с.38-42.
- Ахматова Н.К, Лебединская О.В., Киселевский М.В., Макашин А.И., Семёнова И.Б., Семёнов Б.Ф. Генерация дендритных клеток с использованием в качестве индуктора созревания иммуномодуляторов бактериального происхождения // ЖМЭИ. – 2005. - №5.– с.57-62.
- Макашин А.И., Кузовлев Е.Н., Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Киселевский М.В.Генерация дендритных клеток из клеток-предшественников костномозгового происхождения // Успехи современного естествознания. - 2005. — №4. — с. 58.
- Макашин А.И., Кузовлев Е.Н., Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Киселевский М.В.Роль дендритных клеток в стимуляции противоинфекционного иммунного ответа на модели Klebsiella pneumoniae // Успехи современного естествознания. —2005. —№4.— с. 58-59.
- Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Особенности иммунофенотипа лимфоцитов, выделенных из поражённой опухолью печени мышей // Современные наукоёмкие технологии. — 2005. — № 3.— с. 44.
- Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В., Семёнов Б.Ф. Цитотоксическая активность натуральных киллеров (НК) у мышей с опухолевым поражением печени // Успехи современного естествознания. — 2005 — №4.. — с.32-33.
- Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Доненко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В., Семенов Б.Ф. Цитотоксическая активность натуральных киллеров Т-(НКТ)-клеток у мышей с опухолевым поражением печени //Материалы всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 100-летию со дня основания филиала “Иммунопрепарат”. — г. Уфа. — 2005.-.с.80-81.
- Ахматова Н.К., Кузовлев Е.Н., Лебединская О.В., Доценко Ф.В., Шубина И.Ж., Макашин А.И., Киселевский М.В. Цитотоксическая активность лимфоцитов, выделенных из пораженной опухолевым процессом печени мышей // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2006. - №1– -т. 141.- с.76-79.
- Н.К. Ахматова, М.В. Киселевский, Е.А. Курбатова, А.И. Макашин, Б.Ф. Семенов. Протективный эффект дендритных клеток при заражении мышей Klebsiella pneumoniae // Российский биотерапевтичекий журнал – 2006- №1 - с. 91-97.
