Роль клеток фагоцитарного ряда в патогенезе миомы матки
На правах рукописи
Соснина Анна Евгеньевна
РОЛЬ КЛЕТОК ФАГОЦИТАРНОГО РЯДА В ПАТОГЕНЕЗЕ
МИОМЫ МАТКИ
14.00.36. – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2008
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ,
доктор медицинских наук, профессор Наталья Юрьевна Сотникова
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Марина Александровна Стенина
Российский государственный медицинский университет
доктор медицинских наук, профессор Людмила Ивановна Краснопрошина
ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Ведущая организация:
ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Защита диссертации состоится «15» декабря 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «14» ноября 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова
Актуальность темы исследования
Миома матки – доброкачественная гормонально-зависимая опухоль, развивающаяся в миометрии в результате гипертрофии и пролиферации элементов мышечной и соединительной ткани [Вихляева Е.М., 1997; Савицкий Г. А., Савицкий А. Г., 2000; Сидорова И.С., 2002]. Миома матки традиционно считается наиболее распространенным гинекологическим заболеванием, частота встречаемости которого среди женщин старше 35 лет колеблется по данным разных авторов от 25% до 50% [Савицкий Г. А., Савицкий А. Г., 2000; Тихомиров А.Л., 2006; Sozen I., е.а., 2002; Flake G.P., е.а., 2003; Miura S., е.а., 2006]. Миома матки оказывает отрицательное влияние на менструальную и репродуктивную функции, общее состояние здоровья женщины [Flake G.P., е.а., 2003; Miura S., е.а., 2006].
Патогенез миомы матки до конца не установлен. Исследованиями последних лет показано, что развитие миомы матки ассоциировано со значительными иммунными нарушениями [Колганова И.А., 2006; Малышкина А.И., 2006; Корниенко Е.Б., с соавт., 2007; Сотникова Н.Ю., 2008; Hrycek A., е.а., 2000]. Установлено, что развитие миомы матки и ее рост сопровождаются выраженным повышением уровня ряда провоспалительных цитокинов и факторов роста в ткани самой миомы [Sozen I., е.а., 2002; Dixon D., е.а., 2002; Wolanska M., е.а., 2004]. Фагоциты являются основными продуцентами провоспалительных цитокинов [Ковальчук Л.В. с соавт, 2001]. Однако нет данных о том, в какой мере меняется продукция цитокинов фагоцитами при миоме матки в зависимости от темпа и типа роста опухоли.
Известно, что фагоцитарные клетки играют важную роль в поддержании клеточного гомеостаза и противоопухолевой защите, участвуя в регуляции процессов ангиогенеза, регенерации, дифференцировки и клеточной пролиферации [Wu R., е.а., 2004; Gordon I.O., 2006; Van Ginderachter J.A., 2008]. Имеющиеся работы свидетельствуют о значительных нарушениях экспрессии различного рода рецепторов и цитокинового профиля фагоцитов при опухолевом росте [Sica A., e.a., 2007; Van Ginderachter J.A., 2008; Allavena P., e.a., 2008; Ono M., 2008; Marconi C., e.a., 2008]. Получены данные, свидетельствующие о вовлечении toll-like рецепторов (TLR) в регуляцию фагоцитарными клетками опухолевого роста [West J., e.a., 2007; Allhorn S., e.a., 2008]. Так, по литературным данным экспрессия TLR3 и TLR4 связана с ростом аденокарциномы [Allhorn S., e.a., 2008]. Известно, что этот класс рецепторов является мощным индуктором адаптивного иммунитета, проводит сигнал в клетку, запуская цитокиновый каскад при взаимодействии со своими специфическими лигандами [Симбирцев А.С., 2004; Ковальчук Л.В., с соавт., 2005; Akira S., 2003]. Однако отсутствуют данные о взаимосвязи между характером экспрессии TLRs, продукции цитокинов фагоцитарными клетками и ростом миомы матки.
Таким образом, определение роли фагоцитов в механизмах развития доброкачественного опухолевого роста у женщин с миомой матки является актуальной задачей современной клинической иммунологии, так как позволит уточнить иммунные механизмы, участвующие в развитии противоопухолевого ответа.
Цель исследования
На основании определения особенностей фенотипа и цитокинового профиля фагоцитов на системном и локальном уровне у женщин с миомой матки стабильно малых размеров и с быстрорастущей миомой матки, уточнить роль клеток фагоцитарного ряда в иммунных механизмах, определяющих темп и тип роста опухоли.
Задачи исследования
- Установить закономерности изменения фенотипа клеток фагоцитарного ряда на системном и локальном уровне при миоме матки в зависимости от темпа и морфологического типа роста опухоли.
- Определить особенности экспрессии сигнальных молекул TLR-2 и TLR-4 на поверхности клеток фагоцитарного ряда у женщин с миомой матки с различным темпом и типом роста опухоли.
- Выявить особенности синтеза и продукции синтеза цитокинов (IL-1, IL-12, INF, IL-8, IL-10) фагоцитами периферической крови и эндометрия у женщин с миомой матки, в зависимости от темпа и типа роста опухоли.
- Определить особенности содержания ряда цитокинов и уровень экспрессии генов цитокинов в миоматозных узлах у женщин с быстрорастущей миомой матки, в зависимости от типа роста опухоли.
- На основании выявленных особенностей клеток фагоцитарного ряда женщин с миомой матки разработать иммунологические критерии темпа роста опухоли.
Научная новизна
Установлено, что миома матки вне зависимости от темпа роста опухоли характеризуются повышенным содержанием IL-10+ моноцитов/макрофагов и TLR4+ фагоцитов, как в периферической крови, так и в эндометрии и сниженным уровнем моноцитов, экспрессирующих HLA-DR, CD11b и CD16 молекулы.
Показано, что быстрый рост миомы матки происходит на фоне снижения уровня CD11b+ макрофагов в эндометрии, увеличении количества фагоцитов крови и эндометрия, продуцирующих внутриклеточно провоспалительные цитокины, и повышенной экспрессии мРНК IL-8 в ткани эндометрия.
Установлено, что нерастущая миома матки характеризуется высоким уровнем CD16+ и низким - HLA-DR+ макрофагов в эндометрии, а также снижением уровня IL-1+ и IL-8+ фагоцитов как на системном, так и на локальном уровне.
Показано, что отличительной чертой «истинного» типа роста миомы матки за счет усиления пролиферации является высокое содержание CD105+ нейтрофилов в периферической крови, а «ложного» типа роста за счет отека – низкое содержание CD105+ моноцитов, а также высокий уровень эндометриальных INF+ и IL-12+ макрофагов, повышенное содержание IL-8 и МСР-1 в экстрактах эндометрия при усиленной экспрессии мРНК IL-8 в эндометрии.
Установлено, что в миоматозных узлах больших размеров отмечается высокое содержание IL-1 и IL-8 и усиленная экспрессия мРНК IL-8 по сравнению с неизмененным миометрием; при «истинном» типе роста миомы матки характерно высокое содержание IL-1, IL-8, MCP-1 в миоматозном узле и высокий уровень экспрессии мРНК IL-8 в ткани опухоли, а при «ложном» – низкое содержание IL-8 и м-РНК IL-8 в ткани миоматозного узла.
Выявлены закономерности изменения содержания моноцитов, продуцирующих IL-8, в зависимости от темпа роста миомы матки, на основании чего предложен новый прогностический критерий быстрого роста миомы матки.
Практическая значимость
Установлены новые патогенетические механизмы развития миомы матки, определяющие темп и тип ее роста.
Установлены новые иммунологические критерии, позволяющие оценить темп и тип роста миомы матки.
Разработан новый способ прогнозирования быстрого темпа роста опухоли, основанный на определении в периферической венозной крови содержания IL8+ моноцитов (положительное решение о выдаче патента РФ от 15.05.2008 г.).
Реализация результатов работы
Результаты диссертационной работы внедрены в практику гинекологической клиники и консультативно-диагностической поликлиники ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н.Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».
Апробация работы
Диссертация прошла апробацию на совместной конференции сотрудников ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» 23 июня 2008 года. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых «Неделя науки – 2006» (Иваново, 2006), на Х Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), на научно-практической конференции молодых ученых «Неделя науки – 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области (Иваново, 2007), на 2-й Российской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007), в областном конкурсе научных работ среди молодых ученых в номинации «Естественные науки» (Иваново, 2007); на ХI Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007); в научных чтениях, посвященных памяти академика В.И. Кулакова (Москва, 2008), на конференции ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий» (Иваново, 2008), на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008).
Основные положения, выносимые на защиту
Развитие доброкачественной опухоли в миометрии ассоциировано с увеличением периферического и эндометриального пула М2 моноцитов/макрофагов при нарушении экспрессии на поверхности фагоцитов функциональных и сигнальных молекул. Быстрый рост миомы матки связан с усилением продукции цитокинов фагоцитами крови и эндометрия, определяющим повышение содержания провоспалительных цитокинов в ткани опухоли. Пролиферативный тип роста миомы матки определяется высоким уровнем периферических нейтрофилов, экспрессирующих эндоглин, и высокой локальной продукцией провоспалительных цитокинов в миоматозных узлах.
Повышение количества IL8+ моноцитов в периферической крови ассоциируется с быстрым ростом миомы матки.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 13 печатных работ
Структура и объем диссертации
Материалы диссертации изложены на 105 страницах, состоит из введения, обзора литературы, методов исследования, 3 глав результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 22 таблицами. Список литературы включает 43 работы отечественных и 87 публикаций иностранных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий» (директор – Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., проф. Л.В. Посисеева). Обследование больных осуществлялось в 1 гинекологическом отделении (зав. отделением – к.м.н. И.А.Колганова), исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии (зав. лабораторией – Заслуженный врач РФ, д.м.н., проф. Н.Ю. Сотникова).
Всего было обследовано 110 женщин:
- 25 женщин имели миому матки стабильно малых размеров (общие размеры матки не превышали 9-недельного срока беременности и в течение предшествующего года наблюдения не было отмечено роста опухоли) – первая клиническая группа;
- 50 женщин имели быстрорастущую миому (общие размеры матки 12 недель и более и темпом роста 4-5 недель беременности и более за год наблюдения) – вторая клиническая группа;
3. 35 женщин, не имеющих гинекологической патологии на момент обследования, обратившихся в клинику для введения внутриматочных спиралей – контрольная группа.
В зависимости от типа опухолевого роста были сформированы 2 подгруппы:
1) 25 женщин с «истинным» типом роста опухоли (увеличение размеров миомы матки происходило преимущественно за счет усиления процессов клеточной пролиферации);
2) 21 женщина с «ложным» типом роста опухоли (увеличение размеров миомы матки происходило преимущественно за счет отека миоматозных узлов).
Материалом для исследования служили: периферическая венозная кровь, биоптаты эндометрия, миометрия и миоматозных узлов.
Выделение обогащенный популяций мононуклеарных и гранулоцитарных клеток из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в двойном градиенте плотности фиколл-урографина (d=1,078, d=1,114) (Upsala, Sweden). Мононуклеарные клетки из эндометрия выделяли безферментативным механическим методом [Сhemyshov V.P., 1993].
Поверхностный фенотип и цитокиновый профиль моноцитов, нейтрофилов периферической крови и макрофагов эндометрия определяли с помощью моноклональных антител методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickincon, USA) с использованием программы «LYSYS II». При определении внутриклеточной продукции цитокинов фагоцитами предварительно проводили пермеабилизацию их клеточной мембраны с помощью набора FIX & PERM (CALTAG Laboratories, USA).
Таблица 1.
Панель мАТ, использованных в исследовании
№ п/п | мАТ | Фирма-производитель | Флюорохромная метка |
1. | анти-CD16 | ООО «Сорбент», Москва | FITC |
2. | анти-CD11b | ООО «Сорбент», Москва | FITC |
3. | анти-HLA-DR | ООО «Сорбент», Москва | PE |
4. | анти-CD45 | ООО «Сорбент», Москва | FITC |
5. | анти-CD14 | ООО «Сорбент», Москва | PE |
6. | анти-TLR2 | CALTAG Laboratories, USA | FITC |
7. | анти-TLR4 | CALTAG Laboratories, USA | FITC |
8. | анти-CD105 | CALTAG Laboratories, USA | PE |
9. | aнти-IFN | CALTAG Laboratories, USA | FITC |
10. | aнти-IL-10 | CALTAG Laboratories, USA | PE |
11. | aнти-IL-12 | CALTAG Laboratories, USA | PE |
12. | aнти-IL-1 | R&D, USA | PE |
13. | aнти-IL-8 | R&D, USA | PE |
14. | Мышиные IgG1 | Becton Dickinson, USA | FIFC |
15. | Мышиные IgG2a | Becton Dickinson, USA | PE |
FITC – флюоресцеинизотоицианат
PE – фикоэритрин
В экстрактах эндометрия, миометрия, миоматозных узлов определяли концентрацию провоспалительных цитокинов IL-1, MCP-1, IL-8 методом ИФА на микроплашетном ридере «Multiscan ЕХ» (Labsystetems, Finland). Тканевые экстракты получали путем 3-х кратного замораживания и размораживания измельченных образцов ткани в равном объеме фосфатного буфера [Фримель Г., 1987]. Концентрацию цитокинов определяли с помощью тест-систем, характеристика которых представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Характеристика тест-систем для ИФА, использованных в работе
Исследуемый показатель | Фирма-производитель | Чувствительность системы | |
IL-1 | ООО «Цитокин», Россия | > 6,3 пг/мл | |
IL-8 | ООО «Цитокин», Россия | > 9,8 пг/мл | |
МСР-1 | BioSource International, США | > 1,7 пг/мл |
Для количественной оценки экспрессии мРНК в ткани эндометрия, миометрия и миоматозных узлов использовали метод RT-PCR в режиме реального времени. Процедуру выделения тотальной РНК из ткани эндометрия проводили стандартным гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформным методом [Velden van V.H.J., е.а., 2003]. РНК переводили в комплементарную кДНК, используя коммерческий набор реагентов Онкоскрин RT (OOO «Генотехнология», Гематологический научный центр РАМН, лаборатория генной инженерии, Москва, Россия). Для оценки экспрессии в ткани эндометрия мРНК 2-микроглобулина и IL-8 использовались наборы праймеров, зондов и реагентов производства OOO «Генотехнология». ПЦР-амплификацию в режиме реального времени проводили на амплификаторе с оптической насадкой iCycler iQ (BIO RAD, USA). Для определения количества копий пар кДНК в исследуемых образцах строили калибровочную кривую для 2-микроглобулина и IL-8 с использованием серии десятикратных разведений образцов контрольной кДНК и рассчитывали нормализованного значения количества копий гена IL-8. Полученные результаты представлены как нормализованное количество копий в образце х 104 на мкл.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использование программных компонентов пакета MS Office 2005. Достоверность различий показателей женщин с миомой матки по сравнению с контрольной группой определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Для определения роли фагоцитарных клеток в механизмах, определяющих темп и тип роста миомы матки, нами была проведена оценка особенностей фенотипа и цитокинового профиля фагоцитарных клеток на системном и локальном уровнях в периферической крови и эндометрии пациенток с данным заболеванием.
Анализ данных, характеризующих экспрессию функциональных молекул фагоцитами, показал, что, независимо от темпа и типа роста опухоли, в периферической крови женщин с миомой матки отмечалось достоверное снижение уровня HLA-DR+, CD11b+ и CD16+ моноцитов по сравнению с аналогичными показателями у здоровых женщин (р<0,001 во всех случаях) (см. приложение).
Известно, что эти функциональные молекулы определяют участие фагоцитов в осуществлении цитотоксических реакций и фагоцитоза. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют о непосредственном вовлечении этих рецепторов в осуществление противоопухолевого ответа фагоцитами. Показано, что опухолевая инвазия ассоциируется со снижением экспрессии МНС АГ II класса клетками иммунной системы [Foukas P.G., e.a., 2001] и с угнетением реакций антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, опосредованной CD16+ моноцитами/макрофагами [Gordon I.O., Freedman R.S., 2006]. Вероятно, снижение экспрессии функциональных молекул периферическими моноцитами является одним из механизмов, определяющих нарушение противоопухолевой защиты и способствующих формирования доброкачественной опухоли в миометрии.
Изменения экспрессии сигнальных молекул TLR2 и TLR4, независимо от темпа роста опухоли, имели одинаковую направленность как у женщин с миомой матки стабильно малых размеров, так и у женщин с быстрорастущей миомой матки. Уровень периферических моноцитов и нейтрофилов, а также эндометриальных макрофагов, экспрессирующих на своей поверхности TLR4 молекулы был значительно повышен относительно показателей контрольной группы как у женщин со стабильно малой миомой (р<0,02, р<0,005 и р<0,001 соответственно), так и у женщин с быстрорастущей миомой матки (р<0,01, р<0,01 и р<0,05 соответственно). При этом мы не выявили каких-либо изменений экспрессии TLR2 молекул фагоцитами крови и эндометрия у женщин с миомой матки (р>0,05 во всех случаях).
Известно, что TLR4 молекулы определяют ответ фагоцитов на бактериальные токсины [Jiang D., e.a., 2006]. В последнее время было выдвинуто предположение, что в развитии миомы матки важную роль играет инфекционный фактор [Малышкина А.И., 2006]. Вероятно, выявленное нами увеличение уровня TLR4+ фагоцитов у всех женщин с миомой матки отражает вовлечение системы фагоцитарных клеток в ответ на инфекционные антигены.
Состояние фагоцитов эндометрия было ассоциировано с темпом роста миомы матки. Нами было установлено, что у женщин с нерастущей миомой матки стабильно малых размеров в эндометрии снижено содержание HLA-DR-позитивных макрофагов, но повышен уровень CD16+ фагоцитов (р<0,05 и р<0,02 соответственно). Быстрое увеличение размеров опухоли сопровождалось снижением содержания CD11b+ эндометриальных макрофагов (р<0,001).
CD16-позитивным фагоцитам принадлежит важная роль в развитии цитотоксических реакций в отношении трансформированных клеток [Ancuta P., e.a., 2006], поэтому повышение содержания этой функционально активной популяции эндометриальных макрофагов у женщин с нерастущей миомой матки может свидетельствовать о достаточно высоком уровне цитотоксической активности макрофагов, определяющем отсутствие роста уже сформировавшейся миомы матки. CD11b молекулы, относящиеся к классу 2-интегринов, участвуют в осуществлении межклеточных взаимодействий по типу клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс [Wu R., e.a., 2006], а интегрины, в свою очередь, играют важную роль в регуляции межклеточных взаимодействий при опухолевом росте [Brakebusch C., e.a., 2002]. По-видимому, нарушение взаимодействия эндометриальных макрофагов с другими клетками может приводить к снижению противоопухолевой защиты в ткани, непосредственно прилегающей к миометрию, провоцируя быстрый рост миомы матки.
При дифференцированном анализе данных, характеризующих экспрессию на поверхности фагоцитов функциональных и сигнальных молекул в зависимости от типа быстрого роста миомы нами было установлено, что повышение в периферической крови содержания нейтрофилов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к TGF1 – эндоглин (CD105), было ассоциировано с «истинным» типом роста опухоли за счет усиления пролиферативных процессов в миометрии (р<0,002). В то же время для подгруппы женщин с «ложным» типом роста миомы матки было характерно сниженное содержание периферического пула моноцитов, экспрессирующих молекулы эндоглина (р<0,05).
Эндоглин является вспомогательным рецептором TGF1 [Wipff J., е.а., 2007] и регулирует ангиогенез [Hayrabedyan S., e.a., 2005; Duwel A., е.а., 2007], определяя реализацию биологического действия этого фактора роста при опухолевом росте. Известно, что TGF ингибируют многие функции фагоцитарных клеток [Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и соавт. 2007; Kuo Y. e.a., 2001]. Поэтому повышение уровня экспрессии эндоглина периферическими нейтрофилами может вести к угнетению функциональной активности данной клеточной популяции, что, по-видимому, связано с усилением процессов опухолевого роста у пациенток с миомой матки.
Известно, что в ткани миоматозных узлов значительно изменяется по сравнению с неизмененным миометрием содержание ряда провоспалительных цитокинов и факторов роста [Nowak R.A., е.а., 2000; Sozen I., е.а., 2002]. Принимая во внимание тот факт, что фагоциты являются одними из основных продуцентов цитокинов в организме, можно предположить, что изменения локального цитокинового фона в миоме матке связано с нарушением секреторной активности фагоцитов крови и эндометрия. В связи с этим мы оценили характер внутриклеточной продукции ряда провоспалительных цитокинов мононуклеарными и гранулоцитарными фагоцитами при миоме матки (см. приложение).
Независимо от темпа роста миомы матки в периферической крови и эндометрии было выявлено значительное повышение содержания мононуклеарных фагоцитов, продуцирующих внутриклеточно IL-10 (см приложение). В последние годы получила широкое распространение теория о различной роли М1 и М2 макрофагов в регуляции опухолевого роста [Van Ginderachter J.A.,е.а.; 2006, Mantovani A., е.а., 2004]. Считают, что М1 или «классически» активированные макрофаги продуцируют цитокины Th1 типа и при активации участвуют в защите организма от опухолевых клеток. М2 клетки или «альтернативно» активированные макрофаги, активируются под воздействием Th2 цитокинов Th2 типа и могут влиять на поведение опухолевых клеток, изменяя опухолевое микроокружение и изменяя направленность противоопухолевого иммунного ответа, участвуя таким образом в росте и прогрессии опухоли [Van Ginderachter J.A., 2006]. Принадлежность к М2 популяции является высокая продукция IL-10 и низкая – IL-12 [Mantovani A., е.а., 2004]. Складывается впечатление, что в основе нарушений регуляции противоопухолевого ответа, ведущих к формированию миомы матки, является увеличение пула М2 фагоцитов как на системном, так и на локальном уровнях.
Темп роста опухоли, по нашим данным, был ассоциирован с различной направленностью изменений продукции провоспалительных цитокинов фагоцитарными клетками. У женщин с миомой матки стабильно малых размеров отмечалось достоверное снижение уровня моноцитов, нейтрофилов крови и эндометриальных макрофагов, экспрессирующих внутриклеточно IL-1 (р<0,05, р<0,05 и р<0,001 соответственно) и IL-8 (р<0,01, р<0,05 и р<0,05 соответственно). Быстрый рост миомы матки, напротив, сопровождался резким увеличением уровня IL-1+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно), IL12+ (р<0,01, р<0,02 и р<0,001 соответственно), IL-8+ (р<0,001 во всех случаях) и IFN+ клеток (р<0,05, р<0,001 и р<0,001 соответственно) в популяциях моноцитов и нейтрофилов периферической крови, а также в популяции эндометриальных макрофагов. На основании выявленных закономерностей изменения содержания моноцитов, продуцирующих IL-8, в зависимости от темпа роста миомы матки, был предложен новый диагностический критерий быстрого роста миомы матки.
Связь между воспалением и канцерогенезом была установлена достаточно давно [Lin W.W.,е.а., 2007; Balkwill F., е.а., 2007]. На сегодня можно считать доказанным, что хроническое воспаление усиливает опухолевую прогрессию [Allavena P., е.а., 2008]. В связи с этим, выявленное нами усиление продукции провоспалительных цитокинов периферическим и эндометриальными макрофагами только у женщин с быстрорастущей миомой матки представляется вполне логичным.
Характер продукции провоспалительных цитокинов также был связан и с типом быстрого роста миомы матки. Так, при «истинном» типе роста в эндометрии отмечалось более низкое содержание IL12+ и IFN+ клеток, чем при «ложном» типе роста (р<0,05 и р<0,005 соответственно). Известно, что IL-12 может усиливать процессы элиминации опухолевых клеток в экспериментальных моделях, а экзогенное введение IL-12 приводило к уменьшению количества внутриопухолевых макрофагов, поддерживающих злокачественный рост, при одновременном повышении содержания макрофагов с выраженной противоопухолевой активностью [Watkins S.K.,.e.a., 2007]. Можно предположить, что снижение уровня IL-12-позитивных макрофагов в эндометрии, ассоциированное с усилением пролиферативной активности в миометрии, отражает снижение функционально активных фагоцитов в эндометрии при «истинном» типе быстрого роста опухоли.
Изменение цитокинового профиля периферических и эндометриальных макрофагов, по нашим данным, было сопряжено с изменением содержания провоспалительных цитокинов непосредственно в опухолевой ткани. Так, мы выявили повышение концентрации IL-1 и IL-8 в экстрактах миоматозных узлов больших размеров по сравнению с аналогичными показателями в неизмененном миометрии и в миоматозных узлах малых размеров (р<0,05 во всех случаях). Причем в резкое повышение провоспалительных цитокинов IL-1 и IL-8, а также MCP-1 было выявлено в опухолевых узлах, увеличение которых происходило за счет пролиферации (р<0,05 во всех случаях). Известно, что МСР-1 способствует развитию опухоли, регулируя количество и распределение макрофагов, ассоциированных с ней [Bailey C., e.a., 2007]. Следует также отметить, что в ткани миоматозных узлов с «истинным» типом опухолевого роста в максимальной степени было выражено повышение содержания IL-8 при одновременном усилении и экспрессии мРНК IL-8 (р<0,05 в обоих случаях). Как известно, IL-8 может способствовать опухолевому росту, являясь мощным ангиогенным фактором [Фрейдлин И.С., Тотолян А.А., 2001]. Можно предположить, что усиление продукции провоспалительных цитокинов фагоцитами лежит в основе механизмов, определяющих развитие быстрого роста миомы за счет пролиферации.
Таким образом, суммируя полученные нами данные можно заключить, что в основе механизмов, приводящих к формированию миомы матки лежат нарушения экспрессии функциональных и сигнальных молекул на поверхности фагоцитов при повышении в периферической крови и эндометрии пула М2 моноцитов/макрофагов. Темп роста опухоли связан преимущественно с функциональным состоянием эндометриальных макрофагов и уровнем продукции провоспалительных цитокинов фагоцитами крови и эндометрия. Тип быстрого роста миомы матки определяется характером рецепции TGF периферическими нейтрофилами и моноцитами и уровнем продукции INF+ и IL12+. Изменение цитокинового профиля периферических и эндометриальных фагоцитов может лежать в основе механизмов, регулирующих содержание цитокинов в ткани миоматозного узла.
Выводы
- Развитие миомы матки независимо от темпа роста опухоли ассоциируется с выраженным снижением по сравнению с показателями здоровых женщин количества моноцитов, экспрессирующих функциональные молекулы (HLA-DR, CD11b, CD16), и повышением уровня TLR4+ фагоцитов, как в периферической крови, так и в эндометрии.
- Увеличение уровня CD105+ нейтрофилов в периферической крови и снижение количества CD11b+ макрофагов в эндометрии относительно аналогичных параметров здоровых женщин сочетается с быстрым ростом миомы матки, тогда как снижение содержания HLA-DR+ макрофагов и повышение количества CD16-макрофагов в эндометрии характерно для женщин с миомой матки стабильно малых размеров.
- «Истинный» тип быстрого роста миомы матки ассоциируется с повышенным количеством нейтрофилов периферической крови, экспрессирующих эндоглин, а «ложный» тип быстрого роста – со сниженным уровнем CD105-позитивных моноцитов.
- Независимо от темпа и типа роста для миомы матки характерно усиление внутриклеточного синтеза IL-10 моноцитами. При миоме матки стабильно малых размеров отмечается снижение продукции IL-1 и IL-8 фагоцитами крови и эндометрия, тогда как при быстром росте миомы матки - повышение спонтанной продукции провоспалительных цитокинов IL-1, IL-8, INF и IL-12 периферическими фагоцитарными клетками. Отличительной чертой «ложного» типа быстрого роста опухоли является высокий уровень INF+ и IL12+ макрофагов в эндометрии.
- В экстрактах эндометрия женщин с миомой матки стабильно малых размеров снижено по сравнению с показателями эндометрия здоровых женщин содержание IL-1, а при быстрорастущей миоме матки содержание провоспалительных цитокинов в тканевых экстрактах эндометриальной ткани не отличается от контрольных значений, но повышена экспрессия мРНК IL-8. «Ложный» тип быстрого роста миомы матки ассоциируется с высоким содержанием IL-8 и MCP-1 и повышенной экспрессией мРНК IL-8 в эндометрии.
- В экстрактах опухолевых узлов больших размеров по сравнению с показателями неизмененного миометрия и миоматозных узлов малых размеров повышено содержание IL-1 и IL-8 и усилена экспрессия мРНК IL-8. Высокое содержание IL-1, IL-8 и MCP-1 в экстрактах миоматозных узлов и повышенная экспрессия мРНК IL-8 в ткани опухоли сочетаются с «истинным» типом быстрого роста миомы, а сниженный уровень IL-8 и мРНК IL-8 в тканевых экстрактах узлов - с «ложным» типом роста опухоли.
- Высокие значения показателя периферических моноцитов, экспрессирующих внутриклеточно IL-8, являются прогностическим критерием развития быстрого роста миомы матки в течение года.
Практические рекомендации
Женщинам с миомой матки рекомендуется определять показатели функциональной активности периферических моноцитов и нейтрофилов с целью уточнения темпа и типа роста опухоли.
Женщинам с быстрорастущей миомой матки рекомендуется определять количество периферических моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих эндоглин, для дифференцировки «истинного» и «ложного» типа роста опухоли.
Для прогнозирования быстрого роста миомы матки рекомендуется определять относительный уровень IL-8+ моноцитов, и при значении этого показателя равных или более 63% прогнозировать быстрый рост миомы матки в течение года с точностью 91,7%.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации
- Соснина А.Е. Цитокиновый профиль лимфоцитов и макрофагов эндометрия у женщин с миомой матки различных темпов роста / Соснина А.Е., Малышкина А.И., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Бойко О.М., Анциферова Ю.С. // Медицинская иммунология.- 2006. – Т. 8. - № 2-3. – С.314.
- Соснина А.Е. Роль фагоцитов периферической крови в процессах, определяющих темп роста миомы матки / Соснина А.Е., Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Сборник материалов VIII Всероссийского научного форума «Мать и дитя».- 2006.- С.520.
- Соснина А.Е., Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И. Взаимосвязь изменений цитокинового профиля моноцитов периферической крови с темпом роста миомы матки / Соснина А.Е., Анциферова Ю.С., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И. // Ж. Физиология и патология иммунной системы.- 2006.- №10 (приложение 1). – С. 58-59.
- Соснина А.Е. Изменения цитокинового профиля эндометриальных макрофагов у женщин с лейомиомой матки в зависимости от темпов роста опухоли / Соснина А.Е. // Сборник материалов научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука – развитию Ивановской области». - 2006. – С.81-83.
- Соснина А.Е. Особенности цитокинового профиля мононуклеарных клеток эндометрия женщин с быстрорастущей миомой матки / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Малышкина А.И., Посисеева Л.В., Сотникова Н.Ю., Бойко О.М. // Сборник материалов международного конгресса «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии». - 2006. - С.110-111.
- Соснина А.Е. Особенности экспрессии TLR2 и TLR4 на клетках фагоцитарного ряда периферической крови и эндометрия у женщин с лейомиомой матки / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Russian Journal of Immunology.- 2007.-V. 9, Suppl.4.- P.137-138.
- Соснина А.Е. Взаимосвязь особенностей цитокинового профиля фагоцитарных клеток при миоме матки с темпом и типом роста опухоли / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Бойко О.М., Перетятко Л.П. // Медицинская иммунология.- 2007. – Т 9. - № 2-3. – С.263.
- Соснина А.Е. Изменение экспрессии м-РНК TGF и IL-1 в ткани лейомиомы матки при быстром темпе роста опухоли / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Бойко О.М., Анциферова Ю.С., Малышкина А.И.// Сборник материалов VIII конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии».- 2007.-№3, приложение 1.- С.257.
- Соснина А.Е. Изменение экспрессии молекул TLR-2 и TLR-4 на клетках фагоцитарного ряда у женщин с лейомиомой матки / Соснина А.Е. // Сборник материалов научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки – 2007». - 2007. – С.80.
- Соснина А. Е. Взаимосвязь активности пролиферативных процессов в миоматозном узле с системной и локальной продукцией IL-8 и TGF / Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю., Посисеева Л.В., Бойко О.М., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Сборник материалов IX Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». –2007. - С. 523-524.
- Соснина А. Е. Роль IL-8 в патогенезе быстрого роста лейомиомы матки / Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю., Посисеева Л.В., Бойко О.М., Малышкина А.И., Анциферова Ю.С., Перетятко Л.П. // Ж. Бюллетень Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук. – 2008. - Приложение 1. – С. 64-68.
- Соснина А.Е. Особенности экспрессии м-РНК IL-8 в эндометрии женщин с миомой матки / Соснина А.Е., Сотникова Н.Ю., Анциферова Ю.С., Бойко О.М., Малышкина А.И. // Russian Journal of Immunology.- 2008.-Т 2(11) №2-3- P.297.
- Соснина А. Е. Роль IL-1 в механизмах, определяющих различный темп и тип роста лейомиомы матки / Соснина А. Е., Сотникова Н. Ю., Анциферова Ю.С., Бойко О.М. // Ж. «Проблемы репродукции». – 2008. – Специальный выпуск: Технологии XXI века в гинекологии. – С.75-77.
Приложение.
Особенности фенотипа и цитокинового профиля фагоцитов периферической крови и эндометрия женщин с миомой матки
Показа- тель, % | Контроль-ная группа (n= 35) | Миома матки стабильно малых размеров (n=25) | Быстрорастущая миома матки | ||||||
«истинный» тип роста опухоли (n=25) | «ложный» тип роста опухоли (n=21) | ||||||||
Моноциты периферической крови | |||||||||
CD 11b+ | 63,63±1,73 | 40,47±2,69, р<0,001 | 47,63±3,58, р<0,002 | 48,25±5,01, р<0,02 | |||||
CD16+ | 64,19±1,66 | 45,03±3,47, р<0,001 | 50,25±2,61, р<0,001 | 50,88±3,61, р<0,01 | |||||
HLADR+ | 71,92±1,61 | 57,92±3,04, р<0,001 | 63,76±3,17, р<0,01 | 58,24±3,97, р<0,01 | |||||
CD105+ | 34,11±4,04 | 37,19±3,21, р>0,05 | 32,93±3,01, р>0,05 | 24,22±2,65, р<0,05 | |||||
TLR2+ | 60,69±2,28 | 59,11±3,24, р>0,05 | 61,15±2,38, р>0,05 | 65,46±2,57, р>0,05 | |||||
TLR4+ | 45,91±1,89 | 60,31±5,16, р<0,02 | 69,85±1,28, р<0,001 | 71,51±3,51, р<0,001 | |||||
IL1+ | 48,79±3,19 | 39,23±2,03, р<0,05 | 59,66±2,73, р<0,01 | 57,09±2,50, р<0,01 | |||||
IL12+ | 55,17±2,88 | 51,43±3,58, р>0,05 | 69,26±3,14, р<0,01 | 67,93±3,15, р<0,01 | |||||
INF+ | 39,08±2,07 | 41,07±2,47, р>0,05 | 47,71±3,69, р<0,05 | 48,71±3,19, р<0,05 | |||||
IL8+ | 45,86±3,37 | 33,98±2,04, р<0,01 | 75,09±2,63, р<0,001 | 71,66±4,66, р<0,001 | |||||
IL10+ | 38,31±1,88 | 44,82±1,28, р<0,01 | 58,01±1,99, р<0,05 | 61,90±2,24, р<0,001 | |||||
Нейтрофилы периферической крови | |||||||||
CD 11b+ | 64,28±3,14 | 58,97±3,09, р>0,05 | 69,65±2,87, р>0,05 | 65,53±7,33, р>0,05 | |||||
CD16+ | 74,95±2,92 | 71,93±3,04, р>0,05 | 82,88±2,44, р>0,05 | 75,36±4,39, р>0,05 | |||||
CD105+ | 26,39±2,68 | 30,50±4,07, р>0,05 | 42,25±2,92, р<0,002 | 27,09±3,95, р>0,05 | |||||
TLR2+ | 68,73±3,08 | 77,11±4,12, р>0,05 | 71,02±3,40, р>0,05 | 77,34±4,31, р>0,05 | |||||
TLR4+ | 53,29±6,03 | 81,62±3,63, р<0,005 | 73,74±0,92, р<0,01 | 78,94±2,18, р<0,01 | |||||
IL1+ | 44,12±2,88 | 32,97±3,01, р<0,05 | 57,64±3,74, р<0,02 | 55,14±2,90, p<0,02 | |||||
IL12+ | 46,79±2,51 | 39,45±3,35, р>0,05 | 57,24±6,68, р<0,05 | 58,20±3,64, p<0,02 | |||||
INF+ | 39,33±2,08 | 33,10±3,17, р>0,05 | 57,27±3,93, p<0,001 | 57,50±2,16, p<0,001 | |||||
IL8+ | 45,05±1,47 | 35,68±3,46, р<0,05 | 70,14±2,30, p<0,001 | 71,21±5,23, p<0,001 | |||||
IL10+ | 32,54±1,73 | 35,09±3,25, р>0,05 | 53,37±4,32, p<0,001 | 50,51±3,73, p<0,001 | |||||
Макрофаги эндометрия | |||||||||
CD 11b+ | 64,48±2,00 | 58,8±3,28, р>0,05 | 52,00±1,57, р<0,001 | 46,94±5,89, р<0,02 | |||||
CD16+ | 63,87±1,82 | 70,44±1,89, р<0,02 | 59,76±2,58, р>0,05 | 64,97±4,00, р>0,05 | |||||
HLADR+ | 61,83±1,88 | 55,99±2,09, р<0,05 | 61,99±3,02, р>0,05 | 59,64±1,81, р>0,05 | |||||
CD105+ | 38,47±5,05 | 43,48±2,34, р>0,05 | 38,28±2,09, р>0,05 | 36,39±2,39, р>0,05 | |||||
TLR2+ | 66,71±1,90 | 70,39±3,09, р>0,05 | 63,36±1,24, р>0,05 | 66,36±4,12, р>0,05 | |||||
TLR4+ | 52,69±2,64 | 70,32±3,12, р<0,001 | 72,14±2,58, р<0,005 | 75,63±3,85, р<0,005 | |||||
IL1+ | 40,62±1,56 | 31,59±1,97, p<0,001 | 63,56±6,29, p<0,01 | 64,69±2,60, p<0,001 | |||||
IL12+ | 53,36±4,55 | 42,08±3,64, р>0,05 | 66,73±1,78, p<0,02 | 74,88±2,62, p<0,001 | |||||
INF+ | 35,33±1,60 | 35,41±2,91, р>0,05 | 43,72±2,68, p<0,02 | 62,33±4,25, p<0,001 | |||||
IL8+ | 43,66±3,98 | 30,59±3,39, p<0,05 | 66,91±3,31, p<0,001 | 70,38±2,94, p<0,001 | |||||
IL10+ | 31,73±4,79 | 43,67±1,75, p<0,001 | 54,27±3,93, p<0,001 | 57,08±3,67, p<0,001 |
р – различия достоверны относительно показателя контрольной группы.