Фармакологическое изучение ряда растительных нефропротекторов ( экспериментальное исследование )
На правах рукописи
СИВАК
Константин Владимирович
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЯДА
РАСТИТЕЛЬНЫХ НЕФРОПРОТЕКТОРОВ
(экспериментальное исследование)
14.00.25 _ фармакология, клиническая фармакология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2007
Работа выполнена на кафедре фармакологии ГОУ ВПО СПХФА Росздрава и в лаборатории лекарственной токсикологии
ФГУН Института токсикологии ФМБА России
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Елена Евгеньевна Лесиовская
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Валерий Борисович Долго-Сабуров
доктор медицинских наук Владимир Леонидович Козловский
Ведущее учреждение:
Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет
им. академика И.П. Павлова
Защита диссертации состоится «_____» ________ 2007 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.030.01 при ФГУН Институт токсикологии ФМБА России (192019, г. Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д. 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Института токсикологии ФМБА России
Автореферат разослан «_____» ____________ 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук Татьяна Николаевна Саватеева-Любимова
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Терапия заболеваний мочевыделительной системы имеет много сложностей и нерешенных задач. Общий рост заболеваемости населения из-за неблагоприятного влияния техногенных факторов и ухудшения экологической обстановки во многом объясняет увеличение продаж лекарственных средств лечения этих заболеваний сегодня (Мониторинг продаж…, 2005). Однако ассортимент препаратов нормализующих функциональную активность почек очень мал. Среди средств, назначаемых больным с пиелонефритами, гломерулонефритами, циститами и мочекаменной болезнью 64% составляют антибиотики и химиотерапевтические препараты (РЛС, 2005), большинство из которых нефротоксичны. Для коррекции побочных эффектов и для устранения токсического действия на почки в терапию этих заболеваний необходимо включать средства, защищающие почки от повреждения – нефропротекторы (Лесиовская Е.Е., Пастушенков Л.В., 2003). Нефропротекторы устраняют кислородную недостаточность и улучшают обменные процессы в почках, препятствуют развитию патологических изменений при различных состояниях и воздействии на почки эндо- и экзотоксинов.
Касатик молочно-белый содержит комплекс полифенольных соединений. Результаты исследований, проведённых на кафедрах фармакогнозии и фармакологии СПХФА, позволили установить антигипоксическую и иммунотропную активность экстракта касатика (Пряхина Н.И., 1984; Мельникова Т.И., 1994). Побеги кустарника караганы колючей служат исходным сырьём для получения ряда фармакологически активных извлечений. Доминирующим свойством экстрактов караганы является их иммунодепрессивная активность (Николаев В.О., 2003). Трава верблюжьей колючки достаточно недавно стала предметом детального химического изучения, а также установления основных видов фармакологической активности (Гончаров М.Ю., 2002; Сидибе А., 2003). Расширенное фармакологическое изучение экстракта касатика молочно-белого, экстракта караганы колючей и травы верблюжьей колючки является перспективным направлением, позволяющим разрабатывать новые препараты на их основе.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось фармакологическое изучение нефропротекторов растительного происхождения - экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки.
В задачи исследования входили:
1. Разработка методологии оценки нефропротекторной активности изучаемых извлечений и препаратов на различных моделях патологии почек.
2. Определение острой токсичности экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки.
3. Изучение специфической нефропротекторной активности экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки на моделях сулемового нефрита и аутоиммунного гломерулонефрита.
4. Оценка антигипоксической активности экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки.
5. Изучение мембранопротекторных, противовоспалительных и иммуномодулирующих свойств экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории лекарственной токсикологии ФГУН Института токсикологии ФМБА России в рамках федеральной целевой программы «Национальная система биологической и химической безопасности Российской Федерации» и на кафедре фармакологии ГОУ ВПО СПХФА Росздрава.
Научная новизна. Разработан новый методический подход к поиску и изучению потенциальных нефропротектров с учётом степени выраженности их антигипоксической активности. Впервые проведено сравнительное исследование экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки, на основных моделях нефропатологии, позволившее оценить степень их влияния на концентрационную и выделительную функции почек, а также динамику морфологических изменений в условиях аутоиммунной и токсической патологии почек.
Теоретическая и практическая значимость. Выявлены и обоснованы основные критерии, позволяющие определить степень нефропротекторной активности в эксперименте. Доказана связь между антигипоксическими свойствами и нефропротекторным действием применяемых в практике препаратов (леспефлана и канефрона Н) и новых извлечений из лекарственного растительного сырья – экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и верблюжьей колючки.
Доказано, что для полного выявления профиля нефропротективных свойств необходимо поэтапное исследование препарата в условиях острой и хронической патологии почек токсического и аутоиммунного генеза. В результате сравнительного исследования различных по составу растительных препаратов выявлены перспективные для дальнейшей разработки экстракты. При этом важным для изучения клинической эффективности являются выявленные в экспериментах различия в действии растительных средств при поражении почек различного генеза: при токсических поражениях, моделирующих преимущественно канальцевую патологию, наиболее эффективными оказались извлечения из травы верблюжьей колючки, а при аутоиммунном варианте поражения – экстракт караганы. Универсальным нефропротекторным эффектом обладал только экстракт касатика молочно-белого.
Модифицированы две модели поражения почек: аутоиммунного гломерулонефрита и сулемового нефрита, что позволило более адекватно оценивать степень нефропротекторной активности препаратов. Проведены доклинические испытания специфической фармакологической активности экстрактов касатика молочно-белого, караганы колючей и травы верблюжьей колючки, что позволяет создавать на их основе комплексные фитопрепараты, обладающие нефропротекторной активностью. У изученных экстрактов выявлены противовоспалительные, иммуномодулирующие и мембранопротективные свойства, что также определяет перспективность их клинического применения при острых и хронических заболеваниях почек.
Положения, выносимые на защиту:
- При поиске потенциальных нефропротекторов обязательными являются исследования их антигипоксических и мембранопротекторных свойств, оценка профилактического и лечебного действия на моделях клубочковой и канальцевой патологии почек.
- Экстракты касатика молочно-белого, караганы колючей и извлечения из травы верблюжьей колючки обладают выраженной нефропротекторной активностью.
- При преимущественном поражении клубочков почек наряду с канефроном Н высоко эффективны экстракты касатика и караганы, а при патологии канальцев – извлечения из травы верблюжьей колючки и экстракт касатика.
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы диссертации доложены на юбилейной конференции, посвященной 60-летию факультета промышленной технологии лекарств Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (Санкт-Петербург, 2005), XIII конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), I Международном съезде фитотерапевтов (Москва, 2006). Апробация диссертации прошла на заседании секции фитотерапии Санкт-Петербургского Общества терапевтов имени С.П.Боткина (Санкт-Петербург, 2006).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 151 страницах машинописного текста, иллюстрированы 30 таблицами и 11 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных исследований, главы с обсуждением результатов исследований, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель содержит 249 наименований, в том числе 162 отечественных и 87 иностранных источника.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объекты исследования. Образцы сырья надземной части верблюжьей колючки были заготовлены сотрудником кафедры фармакогнозии СПХФА М.Ю. Гончаровым во время экспедиций в окрестности города Астрахань (2002). Траву верблюжьей колючки (ТВК) измельчали на электротраворезке (ТУ 37-53 тип 622-1-М). Из сырья получали настой на воде очищенной в соотношении 1:50 (НВК). Сухой экстракт караганы колючей (СЭКК) получали путём перколяции и сушки (Yirenkyi, 2005). Экстракт касатика молочно-белого (ЭК) получали методом перколяции и сушки (Минина С.А., 1999). Изучаемые объекты были стандартизированы по содержанию действующих веществ, что отражено в таблице 1.
Таблица 1
Содержание действующих веществ в экстрактах касатика, караганы и
траве верблюжьей колючки
| Объекты исследования | Действующие вещества | Содержание |
| Экстракт касатика молочно-белого (ЭК) | Сумма ксантонов | не менее 3% |
| Сухой экстракт караганы колючей (СЭКК) | Сумма флавоноидов | не менее 3% |
| Трава верблюжьей колючки (ТВК) | Полисахариды Дубильные вещества | не менее 5,5% не менее 7% |
Выбор животных. Фармакологические испытания проводили на нелинейных мышах, мышах линии СВА, крысах альбиносах и крысах линий Sprаgue-Dawley, Wistar и BD-9. В работе использовано 1260 мышей и 1964 крысы.
Методы исследования
Острая токсичность. Изучение острой токсичности проводили на беспородных мышах самцах. Расчёт токсикометрических показателей осуществляли по методу Миллера-Тейнтера.
Антигипоксическая активность. Острую гипобарическую гипоксию вызывали у животных при помещении в барокамеру, острую гемическую гипоксию моделировали на белых беспородных мышах самцах при введении нитрита натрия в дозе 300 мг/кг. Регистрировали продолжительность жизни и выживаемость (Пастушенков Л.В., 1989).
Мембранопротекторное действие. Мембранопротекторное действие исследуемых препаратов оценивали в условиях in vitro по ингибированию гемолиза эритроцитов в системе Фентон. Мембранопротекторное действие выражали в % ингибирования перекисного гемолиза (Ковалёв И.Е., 1986).
Противовоспалительную активность изучали на моделях острого экссудативного воспаления у крыс линии Wistar вызванного субплантарным введением 0,1 мл 2 % раствора формальдегида в правую заднюю лапу. Определяли степень экссудации задней конечности крыс (Попов С.Б., 1989); пролиферативного воспаления на крысах линии Wistar путём введения в подкожную клетчатку хлопкового шарика (Sedgwick & Willoughby, 1998).
Иммуномодулирующее действие нефропротекторов на фоне экспериментальной иммунодепрессии. Эксперименты выполняли на мышах самцах линии СВА, которых иммунизировали эритроцитами человека (0) группы крови. Изучаемые препараты вводили внутрибрюшинно через 24 часа после инъекции циклофосфана и в течение 5 дней; циклофосфан в дозе 100 мг/кг вводили дробно (1 день – 30 мг/кг, 2 день – 70 мг/кг). На 6-е сутки у мышей отбирали пробы крови. Изотип антител определяли по Фримель Г. (1987).
Острую интоксикацию сулемой создавали на беспородных мышах самцах массой тела 18-20 г. Сулему вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг одновременно с изучаемыми препаратами. В качестве препарата сравнения использовали унитиол в эффективной дозе 100 мг/кг. Оценивали реакцию на введение яда и выживаемость мышей в течение трёх дней в контрольных и опытных группах.
Сулемовый нефрит вызывали у крыс самцов линии SD путём однократного внутрибрюшинного введения сулемы в дозе 0,5 мг/кг. Изучаемые вещества вводили в течение 5 дней после интоксикации. Оценивали общее состояние и выживаемость животных. В сыворотке крови на 6-е сутки определяли биохимические показатели. Проводили патоморфологическое исследование почек.
Нефрит Хейманна воспроизводили у молодых крыс линии BD-9 по Albini путём однократной иммунизации животных. Иммунотоксин (гомогенат почек крыс, полный адъювант Фрейнда (ПАФ) и масло оливковое - 1:1:25 по массе) вводили из расчёта 1 мл на 100 г массы тела крысы внутрибрюшинно. «Отвечающим» крысам вводили изучаемые вещества. Общее время эксперимента – 2 месяца. В крови животных определяли показатели иммунной реакции, выраженность нефротического синдрома, степень гипоксии, антиоксидантный статус. В моче определяли уровень белка, натрия, калия, фосфатов, псевдохолинэстеразы. По окончании введения препаратов животных умерщвляли под лёгким наркозом путём мгновенной декапитации. Почки фиксировали в 10 % растворе формалина. Проводили морфологическое исследование срезов.
Гистологическое исследование ткани почек. Почки фиксировали, срезы окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку препаратов проводили с помощью микроскопа «Биолам» при малом и большом увеличении под руководством к.м.н. Е.К. Вишневской.
Биохимические и иммунологические методы. Для проведения биохимических исследований получали сыворотку или плазму крови. В исследованиях пользовались унифицированными методами лабораторной диагностики (Меньшиков В.В., 1987), приборами и стандартными наборами реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум», Санкт-Петербург. Содержание натрия, калия, кальция определяли методом пламенной фотометрии. Фосфаты в моче определяли методом Фиске-Суббароу. Содержание альбумина в моче определяли по реакции с сульфосалициловой кислотой; церулоплазмин – методом Ревина. Концентрациию малонового диальдегида и общую антиоксидантную активность крови определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Арутюнян А.В., 2000).
Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили по Насонову Е.Л. (1987). Криоглобулины (КГ) определяли быстрым фотометрическим методом. Методом турбодиметрии определяли С-реактивный белок (СРБ) (Иммунологические методы, 1987). Статистическую обработку данных с нормальным распределением проводили с использованием t-критерия Стьюдента по программе статистической обработки «Biostat», результаты с иным распределением анализировали с помощью теста Вилькоксона-Манна-Уитни. Вычисляли средние значения, их стандартные отклонения и доверительные интервалы при р0,05. В тексте, таблицах и на рисунках представлены средние значения исследуемых показателей (М±m).
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментальные модели. Простая в исполнении модель нефрита Хейманна была взята за основу на первом этапе данной работы. В ходе экспериментов были отработаны различные сочетания компонентов иммунотоксина и выбраны основные дозы для моделирования хронического гломерулонефрита у крыс с целью изучения эффективности нефропротекторов. В ходе исследования было установлено, что из общей группы проиммунизированных нелинейных крыс «отвечающими» были около 60 %, остальные крысы оказались резистентными к действию иммунотоксина. Резистентность части крыс к нефриту Хейманна могла быть обусловлена аутологичной толерантностью. Крысы линии BD-9 оказались высоко восприимчивыми к нефриту Хейманна (90 % «отвечающих» животных). Развитие и тяжесть аутоиммунного гломерулонефрита (АИГ) оценивали по результатам иммунологического исследования крови и общего анализа мочи крыс. При введении почечного иммунотоксина в дозах от 1 до 5 мл/кг наблюдали существенное нарастание уровня циркулирующих иммунных комплексов, выраженную протеинурию, гематурию и снижение диуреза. Продолжительность жизни животных с выраженной протеинурией не превышала 21 дня. При выраженном снижении массы тела животные погибали.
В последующих сериях экспериментов был использован почечный иммунотоксин (ПИТ), полученный при смешении гомогената почки крысы, ПАФ и растительного масла в соотношении 1:1:25 по массе. Исходя из принципа представления минимальной дозы антигена для запуска аутоиммунной патологии и из полученных данных, очевидно, что оптимальной дозой почечного иммунотоксина является доза 1 мл/100 г. На 10-е сутки определяли тенденцию к увеличению уровней ЦИК и криоглобулинов. Снижение уровня общего белка также имело характер тенденции. Выраженное увеличение уровней ЦИК и криоглобулинов происходило на 21-е сутки, что свидетельствовало о тяжести иммунного воспаления. Одновременно отмечали повышение уровня мочевины и креатинина крови, что соответствовало началу развития почечной недостаточности. Существенное снижение содержания общего белка, альбумина и церулоплазмина в крови на 60-е сутки свидетельствовало о массивной потере их с мочой. Некоторое увеличение содержания белка в крови на 21-е сутки объясняется компенсаторным увеличением белоксинтетической функции печени на фоне протеинурии. Данные изменения отражены на рисунке 1.
Для верификации хронического гломерулонефрита дополнительно определяли содержание в моче фермента, не обнаруженного в ткани почек и содержащегося лишь в плазме крови – псевдохолинэстеразы. Этот крупномолекулярный белок появляется в моче при повреждении гломерулярной мембраны и наряду с гематурией и альбуминурией служит дифференциальным показателем гломерулонефрита (Делекторская Л.Н. и соавт., 1988). Содержание псевдохолинэстеразы (ПХЭ) мочи определяли микрометодом Эллмана в лунках иммунологического планшета. Было установлено, что при введении ПИТ, содержание ПХЭ в моче превышало фоновое значение приблизительно в 20 раз.
Модель сулемового нефрита разрабатывалась в нескольких сериях экспериментов на крысах линий Sprague-Dawley и Wistar с различной массой тела - от 120 до 240 г. В качестве нефротоксина использовали раствор дихлорида ртути (сулемы) на физиологическом растворе, который вводили внутрибрюшинно из расчёта 1 мл на 100 г массы тела. Было установлено, что введение доз сулемы более 1 мг/кг сопровождалось развитием острой почечной недостаточности.
Тест-дозой сулемы была выбрана доза 0,5 мг/кг, так как это приводило к развитию почечной недостаточности без гибели животных, что позволяло оценивать эффективность исследуемых препаратов.
Рисунок 1. Динамика биохимических изменений в крови при аутоиммунном
гломерулонефрите у крыс (условные обозначения: ЦИК– циркулирующие иммунные комплексы, КГ - криоглобулины; ОБ - общий белок, А – альбумин; М, – мочевина, К - креатинин; ЦП - церулоплазмин; Х – общий холестерин, ТГ - триглицериды).
Отравление крыс сулемой сопровождалось выраженными биохимическими изменениями крови уже через 24 часа. Значимое снижение содержания общих сульфгидрильных групп крови (СГ) и увеличение содержания калия отмечали на фоне нарастания азотемии (мочевины и креатинина), достигающей максимума через 72 часа. На седьмые сутки отмечали умеренную азотемию, восстановление уровня сульфгидрильных групп, увеличение концентрации конечного продукта липопероксидации МДА, уровня олигопептидов (ОП) и общей антиоксидантной активности крови (ОАА). Значимое нарастание уровня олигопептидов свидетельствовало о постепенном развитии эндотоксемии, происхождение которой связано с некробиотическими процессами под влиянием сулемы. Содержание ртути в плазме крови всех опытных животных значительно превышало физиологические значения и составило более 85 мкг/л. При гистологическом изучении срезов почек всех опытных животных выявлены характерные для воздействия сулемы патологические изменения: просветы канальцев были резко или умеренно расширены, эпителий канальцев уплощён, имела место дистрофия, преимущественно вакуольная, эпителия канальцев промежуточной зоны и мозгового вещества, выраженная в различной степени. У ряда животных в одной из почек наблюдали субтотальный некроз канальцев и дистрофию эпителия канальцев вне зоны некроза.
Оценку острой токсичности исследуемых препаратов проводили по результатам двух серий экспериментов на 150 мышах массой тела 18-20 г. ЭК, СЭКК и ТВК представляют собой малотоксичные вещества. ЛД50 при внутрибрюшинном введении составили больше 2000 мг/кг, при пероральном введении токсических доз установлено не было, что свидетельствует о потенциально высокой безопасности исследованных объектов. ЛД50 составили: ЭК - 7100±210 мг/кг, СЭКК - 2260±125 мг/кг, ТВК (в пересчёте на абсолютно сухое сырьё) - 8850±455 мг/кг.
Антигипоксическую активность нефропротекторов определяли на 480 нелинейных мышах самцах массой тела 18-20 г. В качестве препаратов сравнения использовали гутимин, натрия оксибутират и цитофлавин. ЭК оказал выраженный антигипоксический эффект, превосходящий действие гутимина в 1,4 раза и выживаемость животных составила около 40 %.
Для ЭК имело место наличие двух пиков активности: в области малых и высоких доз. СЭКК проявил умеренную антигипоксическую активность, сопоставимую с таковой препарата сравнения. Выживаемость животных составила также около 40 %. Увеличение дозы больше 100 мг/кг не сопровождалось увеличением продолжительности жизни и выживаемости мышей. НВК обладал высокой антигипоксической активностью, увеличивающейся пропорционально дозе (до 14 мл/кг) и превосходящей активность гутимина. Выживаемость животных составила 40 и 90 % при введении НВК в дозах 7 и 14 мл/кг.
Мембранопротекторная активность. Нарушение структуры мембран приводит к повышению проницаемости и ломкости капилляров, что часто наблюдается при гломерулонефритах, системных васкулитах и других аутоиммунных заболеваниях. Препарат триметазидин уменьшал степень гемолиза эритроцитов на 19 % в концентрации 10-3 %. Канефрон Н уменьшал степень гемолиза на 22,5 % в концентрации 0,1 %. Леспефлан также проявлял максимальное действие в концентрации 0,1 %. ЭК и СЭКК проявляли своё мембранопротекторное действие в концентрациях 10-4 - 10-3 %, значительно снижая гемолиз. Настой травы верблюжьей колючки проявлял мембранопротекторное действие в концентрациях 10-1 - 10-3 %, отвар листьев толокнянки - 10-4 - 10-3 %. Настой листьев ортосифона тычиночного проявлял мембранопротекторное действие, которое повышалось с увеличением концентрации до 0,1 %. Настой травы эрвы шерстистой снижал гемолиз в широком диапазоне концентрации от 10-4 % до 10-2 %.
Антиэкссудативные свойства. Изучение противовоспалительного действия нефропротекторов проводили на модели формалинового отёка лап крыс. Опыты поставлены на 570 крысах самцах массой тела 180-220 г в двух сериях. Препараты сравнения диклофенак натрия, канефрон и леспефлан значительно снижали отёчность лап крыс, вызванную введением ирританта формалина. В группе ЭК антиэкссудативная активность увеличивалась до 69 %. СЭКК также проявлял антиэкссудативную активность, которая была максимальной в диапазоне доз от 50 мг/кг (1/50 ЛД50) до 200 мг/кг (1/10 ЛД50). НВК обладал высокой антиэкссудативной активностью, в дозе 14 мл/кг по эффективности настой был сравним с препаратом диклофенаком натрия. Противовоспалительный эффект леспефлана зависил от дозы и был максимальным при увеличении дозы от 2,50 мл/кг (56 %) до 5,00 мл/кг (79 %). В дозе 5,00 мл/кг леспефлан по активности превосходил препарат сравнения диклофенак натрия. Анализ полученных данных свидетельствует, что для всех изученных препаратов характерна антиэкссудативная активность.
Антипролиферативные свойства. Активность нефропротекторов изучали на модели неиммунного воспаления, вызванного имплантацией в подкожную клетчатку стерильного хлопкового шарика. Опыты поставлены на 380 крысах самцах массой тела 180-220 г. Диклофенак натрия значительно замедлял пролиферативные процессы. Изученные препараты обладали умеренной антипролиферативной активностью. Масса грануляционно-фиброзной ткани была существенно меньше, чем в контрольной группе. ЭК наиболее выражено подавлял пролиферативную реакцию в дозе 1/35 ЛД50 (210 мг/кг). СЭКК также проявлял антипролиферативную активность, которая была максимальной в диапазоне доз от 50 мг/кг до 200 мг/кг. НВК обладал антипролиферативной активностью при введении доз 7 и 14 мл/кг. В дозе 14 мл/кг по эффективности настой был сравним с препаратом диклофенаком натрия. Леспефлан проявлял слабую антипролиферативную активность при введении доз 0,2 мл/кг и 1,0 мл/кг. Значительное увеличение активности наблюдали при увеличении дозы. В дозе 5,00 мл/кг леспефлан по активности превосходил препарат сравнения диклофенак натрия.
Иммуномодулирующее действие нефропротекторов. Эксперименты поставлены на 240 мышах линии CBA. Глутоксим более чем в 2,5 раза повышал общий титр антител при введении в дозе 60 мг/кг. При оценке баланса антител было установлено, что под влиянием глутоксима происходит повышение в основном содержания иммуноглобулинов класса G. При этом титр этих иммуноглобулинов был существенно выше такового у контрольных мышей без иммунодепрессии.
Канефрон Н значимо увеличивал общий титр антител, который превосходил таковой в контрольной группе более чем в 2 раза. Однако при рассмотрении баланса антител при увеличении дозы доля иммуноглобулинов класса M существенно увеличивалась, чего не наблюдали при введении препарата в низкой дозе. Титр IgG был достоверно выше при использовании его в дозе 0,15 мл/кг. Подобную картину наблюдали и при введении Леспефлана. Вклад иммуноглобулинов IgM в общий титр также увеличивался с повышением дозы препарата, однако был значительно ниже, чем при использовании Канефрона. Титр иммуноглобулинов класса G был существенно выше при введении низкой дозы Леспефлана. Введение настоя верблюжьей колючки сопровождалось дозозависимым увеличением общего титра антител. В низкой дозе НВК значительно увеличивал вклад IgG в общий титр. В следующей серии экспериментов оценивали влияние ЭК и СЭКК на гуморальное звено иммунитета при циклофосфановой иммунодепрессии. В ходе экспериментов было установлено, что экстракты касатика и караганы оказывали разнонаправленное иммунорегуляторное действие. СЭКК существенно увеличивал общий титр антител при введении в дозе 50 мг/кг, но эта реакция не достигала уровня контрольных животных. Значимо увеличивалась доля иммуноглобулинов класса G. Введение СЭКК в дозе 200 мг/кг сопровождалось некоторым увеличением общего титра антител и существенным увеличением доли IgM. ЭК в дозе 35 мг/кг увеличивал общий титр антител, а при введении в дозе 210 мг/кг значимо снижал общий титр и титр отдельных антител, потенцируя действие циклофосфана, что согласуется с полученными ранее результатами (Мельникова Т.И., 1994). На титр IgM введение ЭК в обеих дозах не оказало заметного влияния.
Настой верблюжьей колючки восстанавливал продукцию антител, в большей степени - высокоаффинных иммуноглобулинов класса G. Экстракт караганы при использовании в дозе 50 мг/кг способствовал восстановлению синтеза антител, в основном IgG. Введение его в дозе 200 мг/кг либо не оказало влияния, либо было однонаправленным с действием иммунодепрессанта.
Экстракт касатика в низкой дозе способствовал восстановлению антителосинтетической функции В-лимфоцитов. При введении его в дозе 210 мг/кг наблюдали потенцирование иммунодепрессантного действия циклофосфана. Таким образом, ЭК, СЭКК, НВК, канефрон Н и леспефлан представляют собой иммуномодуляторы, способные в низких дозах восстанавливать иммунные реакции. ЭК и СЭКК, при использовании в высоких дозах могут вызвать иммунодепрессивное действие, имитирующее эффекты классических иммунодепрессантов.
Острое отравление сулемой. Эксперимент поставлен на 390 мышах массой тела 18-20 г. Скрининг нефропротекторов проводили на модели острого отравления ртути дихлоридом. Оценивали выживаемость животных в течение 3 дней. За этот срок происходили патологические изменения в почках, приводящие к острой почечной недостаточности и гибели. Результаты представлены на рисунке 2. По влиянию на выживаемость мышей изученные препараты и извлечения можно расположить в следующий ряд в порядке уменьшения нефропротекторой активности: унитиол > НВК > леспефлан > СЭКК > ЭК > канефрон.
Рисунок 2. Влияние нефропротекторов на выживаемость мышей, отравленных дихлоридом ртути (n = 15 в группе; отличия значимы по сравнению с контролем, р<0,05; среднее по двум сериям). Условные обозначения: 1- контроль; 2- унитиол, 100 мг/кг; 3- канефрон Н (0,5 и 3,0 мл/кг); 4- леспефлан (1,0 и 5,0 мл/кг); 5- ЭК (1/200 и 1/35 ЛД50); 6- СЭКК (1/100 и 1/10 ЛД50); 7- НВК (1/500 и 1/25 ЛД50).
Сулемовый нефрит. Опыты поставлены на 160 крысах самцах массой тела 160-180 г. Биохимические изменения в крови свидетельствовали о развитии почечной патологии средней степени тяжести. Содержание мочевины составило 17,5 ммоль/л, креатинина – 312 мкмоль/л, что существенно превосходило значения интактных крыс. Выраженная азотемия была связана со специфическим поражением почек. Результаты представлены в таблице 2. Введение нефропротекторов способствовало уменьшению выраженности азотемии и гиперкалиемии. Леспефлан при введении в дозах 2,5 и 5,0 мл/кг, соответственно, в 2 раза снижал содержание креатинина, в 2,2-1,7 раза - концентрацию мочевины, в 2,3-1,8 раза - содержание калия.
СЭКК снижал содержание креатинина в 2 раза, содержание мочевины - в 1,4-1,5 раза, калия – в 1,6-2,1. ЭК снижал содержание креатинина в 1,8-1,7 раза, мочевины в 1,3 и калия в 1,4 раза.
Влияние нефропротекторов на баланс антиоксидантной системы и процессов ПОЛ отражено в таблице 3. Леспефлан не влиял на содержание сульфгидрильных групп, но снижал содержание продукта ПОЛ МДА в 1,5 раза и общей антиоксидантной активности в 1,6 раза. СЭКК увеличивал концентрацию сульфгидрильных групп в 1,4 -1,5 раза и снижал уровень ОАА. ЭК повышал содержание сульфгидрильных групп в 1,2-1,6 раза, снижал продукцию МДА в 1,5-1,7 раза и уровень ОАА - в 2,4 и 3,6 раза. Эти данные свидетельствуют о выраженной антиоксидантной активности экстракта касатика. Эффект НВК был выражен слабее: содержание МДА уменьшалось в 2,2-2,4 раза, а ОАА – в 1,4-2,2 раза.
Таким образом, исследованные извлечения способствовали уменьшению перекисных процессов и восстанавливали тиол-дисульфидную систему крови. Наиболее выраженными антиоксидантными свойствами на данной модели обладали ЭК (210 мг/кг) и СЭКК (200 мг/кг), а также НВК (в обеих дозах). По эффективности извлечения превосходили препарат леспефлан. По способности нормализовывать гиперазотемию исследованные извлечения и препараты можно расположить в следующий ряд: НВК > леспефлан > СЭКК = ЭК.
Таблица 2
Влияние нефропротекторов на биохимические показатели крови при сулемовом нефрите
(n = 14 в каждой группе)
| Группа/доза | Креатинин, мкмоль/л | Мочевина, ммоль/л | Калий, ммоль/л |
| Интактные | 98±11 | 6,1±0,6 | 2,97±0,31 |
| Контроль | 312±14* | 17,5±0,4* | 7,48±0,34* |
| Леспефлан, 2,5 мл/кг | 149±17*/** | 8,1±0,2*/** | 3,28±0,24*/** |
| Леспефлан, 5 мл/кг | 151±15*/** | 10,1±0,2*/** | 4,20±0,28*/** |
| СЭКК, 50 мг/кг | 159±18*/** | 11,3±0,3*/** | 3,55±0,32** |
| СЭКК, 200 мг/кг | 191±12*/** | 12,2±0,2*/** | 4,53±0,26*/** |
| ЭК, 70 мг/кг | 177±11*/** | 13,3±0,2*/** | 5,35±0,22*/** |
| ЭК, 210 мг/кг | 184±21*/** | 13,2±0,2*/** | 5,21±0,20*/** |
| НВК, 7 мл/кг | 168±10*/** | 7,3±0,2** | 5,64±0,30*/** |
| НВК, 14 мл/кг | 169±18*/** | 5,5±0,3** | 3,91±0,27*/** |
Примечание: * отличия значимы по сравнению с интактными, р<0,05;
** отличия значимы по сравнению с контролем, р<0,05;
Таблица 3
Влияние нефропротекторов на показатели АОС-ПОЛ (n = 14 в каждой группе)
| Группа/доза | Т-SH, мкмоль/л | МДА, мкмоль/л | ОАА, ЕД |
| Интактные | 283±13 | 4,7±0,7 | 21±3 |
| Контроль (сулема) | 151±15* | 12,1±1,6* | 68±7* |
| Леспефлан, 2,5 мл/кг | 174±14* | 8,1±0,6*/** | 41±5*/** |
| Леспефлан, 5 мл/кг | 173±13* | 8,8±1,0*/** | 44±3*/** |
| СЭКК, 50 мг/кг | 206±12*/** | 8,7±1,3*/** | 41±4*/** |
| СЭКК, 200 мг/кг | 229±16*/** | 5,2±0,5** | 41±3*/** |
| ЭК, 70 мг/кг | 179±12* | 8,2±0,9*/** | 28±4** |
| ЭК, 210 мг/кг | 242±17** | 7,2±0,7*/** | 19±5** |
| НВК, 7 мл/кг | 201±13*/** | 5,1±1,4** | 31±4** |
| НВК, 14 мл/кг | 205±11*/** | 5,4±1,1** | 47±3*/** |
Примечание: * отличия значимы по сравнению с интактными, р<0,05;
** отличия значимы по сравнению с контролем, р<0,05;
Степень токсемии оценивали по содержанию олигопептидов (ОП) крови. Увеличение уровня ОП связано с выходом протеиназ из разрушенных эпителиоцитов канальцев почек и кластогенных факторов в кровь, а также изменением плазменных протеинов под действием уремических токсинов. Результаты представлены на рисунке 3. Анализ представленных данных показал, что нефропротекторы способствовали снижению выраженности токсемии. Наиболее существенное снижение уровня олигопептидов наблюдали при введении леспефлана (дозы 2,5 и 5,0 мл/кг), СЭКК (дозы 50 и 200 мг/кг) и ЭК (доза 70 мг/кг). При введении НВК наблюдали умеренное снижение уровня олигопептидов.
При гистологическом изучении срезов почек были отмечены следующие морфологические изменения. В почках животных контрольной группы выявлены: субтотальный некроз эпителия канальцев, дистрофия эпителия канальцев, не подвергнувшихся некрозу. Степень атрофии варьировала от резчайшей до умеренной. Атрофичный эпителий наблюдали в резко расширенных канальцах, переполненных несовершенной мочой. Дистрофия носила вакуольный характер. Установлено, что исследуемые препараты значимо уменьшали выраженность патологических изменений. По способности уменьшать массовый коэффициент почек изученные препараты и извлечения можно расположить в следующем порядке: леспефлан > ЭК > СЭКК > НВК.
По степени снижения атрофии нефротелия препараты располагаются в следующем порядке: леспефлан > НВК > СЭКК > ЭК. Уменьшение степени дистрофии нефротелиоцитов отмечали в следующем ряду: леспефлан > НВК > ЭК > СЭКК. В почках крыс всех опытных групп не было выявлено некрозов как в корковом, так и мозговом веществе.
Все исследованные препараты и извлечения оказали нефропротекторное действие на модели сулемового нефрита. При сравнении препаратов между собой по данным биохимических анализов крови и морфологического исследования срезов почек было установлено, что наиболее выраженное нефропротекторное действие на данной модели оказали леспефлан и настой травы верблюжьей колючки, вероятно, в связи с их выраженной антигипоксической активностью.
Рисунок 3. Влияние нефропротекторов на содержание олигопептидов при сулемовом нефрите (отличия от контроля значимы: р0,05); условные обозначения: в скобках указаны дозы мг(мл)/кг; 1- интактные; 2- контроль (сулема 0,5 мг/кг); 3- леспефлан (2,5); 4- леспефлан (5,0); 5- СЭКК (50); 6- СЭКК (200); 7- ЭК (70); 8- ЭК (210); 9- НВК (7,0); 10- НВК (14,0).
Аутоиммунный гломерулонефрит Хейманна моделировали на 570 крысах обоего пола (начальная масса тела 80-100 г). В каждую группу было взято по 14 животных. Изучали эффективность исследуемых препаратов и извлечений в режиме лечения, т.е. при уже сформировавшемся аутопатологическом процессе. Данный подход позволял оценить способность препарата или извлечения стабилизировать лабораторные показатели, улучшать функциональную активность почек. Разница в терапевтическом действии изучаемых препаратов и извлечений из лекарственного растительного сырья проявлялась на 60-е сутки терапии.
Глутоксим снижал уровень ЦИК в 2,5 раза, криоглобулинов в 1,5 раза, что соответствовало проявлению его иммуномодулирующей активности. Концентрация креатинина в крови снижалась в 1,5 раза, а общего холестерина – в 1,9 раза. Уровень общего белка существенно увеличивался, достигая фоновых значений. Преднизолон выраженно снижал ЦИК-емию (в 4 раза) и криоглобулинемию (в 7 раз). Однако он незначительно влиял на уровни креатинина и общего белка крови, что свидетельствовало в основном об иммунодепрессивном, но не нефропротективном действии. Канефрон Н при введении в дозе 3,0 мл/кг на 60-е сутки снижал уровни ЦИК в 1,9 раза, криоглобулинов - в 2,7 раза, креатинина - в 1,7 раза и общего холестерина в 2,4 раза по сравнению с контрольной группой. Содержание общего белка крови возрастало с 44 г/л в контроле до 67 г/л. СЭКК значимо уменьшал выраженность иммуновоспалительных процессов в почках. При введении экстракта наблюдали снижение уровней ЦИК (в 1,7-1,9 раза), криоглобулинов (в 3,6-6,5 раза), креатинина (в 1,8-2 раза), холестерина (в 1,8-2 раза). Содержание общего белка увеличивалось в 1,5 раза. ЭК также оказал выраженное влияние на лабораторные показатели крови. Под воздействием экстракта происходило существенное уменьшение содержания ЦИК и криоглобулинов (в 1,5-3; 3,5-5,8 раза, соответственно). Содержание общего белка в крови увеличивалось до фоновых значений, хотя и было несколько ниже, чем в группе интактных животных. НВК не влиял на содержание иммунных комплексов в крови при использовании в дозах 7,0 и 14,0 мл/кг. НВК снижал уровень криоглобулинов в 3,8-5,4 раза по сравнению с контрольной группой. Креатининемия была умеренной, что свидетельствовало об улучшении фильтрационной функции почек. НВК снижал содержание общего холестерина в 2,4 раза (в дозе 14 мл/кг) и по эффективности был сравним с канефроном Н. Уровень общего белка в крови увеличивался в 1,4-1,5 раза.
На фоне экспериментального гломерулонефрита происходило существенное (более чем в 5 раз) увеличение активности лактатдегидрогеназы и содержания МДА в крови, что свидетельствовало о глубокой хронической гипоксии.
Выраженное увеличение активности общей антиоксидантной системы (в 2,9 раза) характеризовало напряженность компенсаторных механизмов в условиях патологии. По влиянию на систему ПОЛ-АОС при гломерулонефрите исследуемые извлечения и препараты можно расположить в следующий ряд в порядке уменьшения антиоксидантной и антигипоксической активности: ЭК > СЭКК > НВК > глутоксим > канефрон Н > преднизолон.
У контрольных животных существенно снижалось содержание сывороточного церулоплазмина (в 1,8 раза), что могло быть связано как с потерей этого «острофазного» белка с мочой при нефротическом синдроме, так и с угнетением его синтеза под влиянием провоспалительного цитокина ФНО-, ответственного за развитие иммунного воспаления в почках. Это также хорошо согласовалось с увеличением титра С-реактивного белка сыворотки крови. Данные отражены на рисунках 4, 5. При введении преднизолона в дозе 10 мг/кг на 60-е сутки содержание церулоплазмина существенно уменьшалось, вероятно, в связи с угнетением его синтеза в печени.
По способности нормализовывать диурез изученные препараты и извлечения можно выстроить в ряд: НВК > канефрон Н > преднизолон > ЭК > глутоксим > СЭКК. Фитопрепараты в большей мере способствовали увеличению натрийуреза: НВК > преднизолон > СЭКК > ЭК > канефрон Н > глутоксим.
По антипротеинурической активности исследованные извлечения и препараты можно расположить в следующий ряд: преднизолон > ЭК > глутоксим > СЭКК > НВК > канефрон Н.
Полученные результаты доказывают, что растительные нефропротекторы способны восстанавливать выделительную функцию почек. Под влиянием исследуемых веществ увеличивалась экскреция с мочой калия, натрия и фосфата. НВК существенно увеличивал выведение натрия (в 10 раз по сравнению с контролем) и калия при гломерулонефрите. Фитопрепараты (особенно ЭК, СЭКК и канефрон Н) существенно увеличивали экскрецию фосфатов с мочой, восстанавливая таким образом секреторную функцию канальцевого эпителия почек. Данные отражены в таблице 4.
| Рисунок 4. Влияние нефропротекторов на содержание церулоплазмина при АИГ | Рисунок 5. Влияние нефропротекторов на титр С-реактивного белка при АИГ |
(n = 12 в группе; * отличия значимы по сравнению с контролем); условные обозначения: 1- интактные (фон); 2- контроль; 3- глутоксим (60 мг/кг*); 4- преднизолон (10 мг/кг*); 5- канефрон Н (3,0 мл/кг*); 6- СЭКК (50 мг/кг*); 7- СЭКК (200 мг/кг*); 8- ЭК (70 мг/кг); 9- ЭК (210 мг/кг*); 10- НВК (7,0 мл/кг*); 11- НВК (14,0 мл/кг*).
Таблица 4
Влияние нефропротекторов на диурез и экскрецию электролитов с мочой при АИГ
(60-е сутки) (n = 14 в каждой группе)
| Группа/препарат | Диурез, мкл/мин/100г | Калий, мкмоль/4 ч | Натрий, мкмоль/4 ч | Фосфат, ммоль/л |
| Интактные | 15,1±1,2 | 560±27 | 21,4±0,7 | 1,06±0,07 |
| Контроль | 6,4±1,1* | 122±19* | 2,7±0,4* | 0,41±0,07* |
| Глутоксим, 60 мг/кг | 8,8±0,6* | 476±26** | 14,1±0,3*/** | 0,56±0,05* |
| Преднизолон, 10 мг/кг | 9,7±0,7*/** | 324±25*/** | 23,1±0,6** | 0,43±0,06* |
| Канефрон Н, 3,0 мл/кг | 11,4±0,6*/** | 398±22*/** | 16,2±0,5*/** | 0,92±0,04** |
| СЭКК, 50 мг/кг | 8,1±1,3* | 192±16*/** | 20,1±0,6** | 0,70±0,05*/** |
| СЭКК, 200 мг/кг | 8,4±0,9*/** | 346±17*/** | 15,2±0,5*/** | 0,98±0,06** |
| ЭК, 70 мг/кг | 7,5±1,1* | 201±21*/** | 16,1±0,4*/** | 0,86±0,05*/** |
| ЭК, 210 мг/кг | 8,9±0,9*/** | 356±20*/** | 14,8±0,7*/** | 0,95±0,08** |
| НВК, 7,0 мл/кг | 10,6±1,1*/** | 441±18*/** | 9,8±0,3*/** | 0,40±0,04* |
| НВК, 14,0 мл/кг | 12,4±0,7** | 700±54*/** | 27,2±0,6*/** | 0,80±0,06*/** |
Примечание: * отличия значимы по сравнению с интактными, р<0,05;
** отличия значимы по сравнению с контролем, р<0,05;
| Рисунок 4. Влияние нефропротекторов на содержание церулоплазмина при АИГ | Рисунок 5. Влияние нефропротекторов на титр С-реактивного белка при АИГ |
(n = 12 в группе; * отличия значимы по сравнению с контролем); условные обозначения: 1- интактные (фон); 2- контроль; 3- глутоксим (60 мг/кг*); 4- преднизолон (10 мг/кг*); 5- канефрон Н (3,0 мл/кг*); 6- СЭКК (50 мг/кг*); 7- СЭКК (200 мг/кг*); 8- ЭК (70 мг/кг); 9- ЭК (210 мг/кг*); 10- НВК (7,0 мл/кг*); 11- НВК (14,0 мл/кг*).
Таблица 4
Влияние нефропротекторов на диурез и экскрецию электролитов с мочой при АИГ
(60-е сутки) (n = 14 в каждой группе)
| Группа/препарат | Диурез, мкл/мин/100г | Калий, мкмоль/4 ч | Натрий, мкмоль/4 ч | Фосфат, ммоль/л |
| Интактные | 15,1±1,2 | 560±27 | 21,4±0,7 | 1,06±0,07 |
| Контроль | 6,4±1,1* | 122±19* | 2,7±0,4* | 0,41±0,07* |
| Глутоксим, 60 мг/кг | 8,8±0,6* | 476±26** | 14,1±0,3*/** | 0,56±0,05* |
| Преднизолон, 10 мг/кг | 9,7±0,7*/** | 324±25*/** | 23,1±0,6** | 0,43±0,06* |
| Канефрон Н, 3,0 мл/кг | 11,4±0,6*/** | 398±22*/** | 16,2±0,5*/** | 0,92±0,04** |
| СЭКК, 50 мг/кг | 8,1±1,3* | 192±16*/** | 20,1±0,6** | 0,70±0,05*/** |
| СЭКК, 200 мг/кг | 8,4±0,9*/** | 346±17*/** | 15,2±0,5*/** | 0,98±0,06** |
| ЭК, 70 мг/кг | 7,5±1,1* | 201±21*/** | 16,1±0,4*/** | 0,86±0,05*/** |
| ЭК, 210 мг/кг | 8,9±0,9*/** | 356±20*/** | 14,8±0,7*/** | 0,95±0,08** |
| НВК, 7,0 мл/кг | 10,6±1,1*/** | 441±18*/** | 9,8±0,3*/** | 0,40±0,04* |
| НВК, 14,0 мл/кг | 12,4±0,7** | 700±54*/** | 27,2±0,6*/** | 0,80±0,06*/** |
Примечание: * отличия значимы по сравнению с интактными, р<0,05;
** отличия значимы по сравнению с контролем, р<0,05;
Результаты исследования активности ЭК, СЭКК и НВК при экспериментальном аутоиммунном гломерулонефрите показали, что при курсовом введении этих извлечений в эффективных дозах проявлялось нефропротекторное действие, о чем свидетельствовало уменьшение выраженности иммунопатологических признаков, гиперазотемии, значимое увеличение диуреза по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных. Наряду с этим установлено, что экстракты и настой оказывали антигипоксическое и антиоксидантное действие, превосходящее в ряде случаев эффекты препаратов сравнения.
ВЫВОДЫ
1. Оптимальным для поиска новых нефропротекторов является последовательное изучение их антигипоксических свойств и эффективности на моделях острого и хронического токсических поражений почек, а затем на модели аутоиммунного гломерулонефрита в предложенной модификации.
2. На модели токсической нефропатии, воспроизводящей поражение канальцев нефрона, наибольший протекторный эффект проявили извлечения из травы верблюжьей колючки и экстракт касатика молочно-белого, по эффективности они были сопоставимы с препаратом сравнения леспефланом.
3. На модели аутоиммунного гломерулонефрита наиболее выражено было протективное действие у экстрактов касатика молочно-белого и караганы колючей. Под влиянием экстрактов уменьшалась протеинурия на 86 %, содержание креатинина на 45 %, что превосходило влияние канефрона Н на эти показатели.
4. У канефрона Н, леспефлана и 3 растительных экстрактов выявлена выраженная антигипоксическая активность на основных моделях гипоксии.
5. По выраженности противовоспалительного эффекта изученные средства можно расположить в следующий ряд: антиэкссудативная активность – леспефлан > НВК > канефрон Н > СЭКК = ЭК; антипролиферативная активность – канефрон Н > СЭКК > ЭК > леспефлан > НВК.
6. У экстракта касатика молочно-белого и караганы колючей подтверждены, а у извлечений верблюжьей колючки выявлены иммуномодулирующие свойства.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Сивак К.В. Влияние пропранолола на нефропротекторную активность экстракта караганы колючей // Сб. науч. труд. конф., посв. 60-лет. факультета. промышленной технологии лекарств СПХФА. Санкт-Петербург, 9 дек. 2005г. – СПб: Изд-во СПХФА, 2005. – С.176-177.
2. Сивак К.В. Антиоксидантная активность растительных нефропротекторов при оксидативном стрессе // Тез. докл. XIII конгр. «Человек и лекарство», 19 апр. 2006. – М., 2006. – С.405.
3. Сивак К.В., Лесиовская Е.Е. Растительные нефропротекторы: применение и перспективы // Материалы I Международного съезда фитотерапевтов. – М: Изд-во «Оверлей», 2006. – С.218-221.
4. Сивак К.В., Авенирова Е.Л., Вишневская Е.К., Крауз В.А. Фармакотерапевтическая эффективность новых растительных нефропротекторных препаратов // Сб. тез. конф. «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины». – СПб: Изд. дом СПбМАПО, 2006. – С.264.
5. Лесиовская Е.Е., Сивак К.В. Пиелонефриты: возможности фармако- и фитотерапии // Ж. «Медлайн Экспресс», 1(185). – 2006. – С.26-31.
6. Сивак К.В., Коваленко А.Л. Сравнительное изучение нефропротекторной активности верблюжьей колючки и цитофлавина // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова, 1. – СПб., 2007. – С.12-15.
