Противовоспалительные свойства нового растительного препарата артрофлекс и анализ механизма его действия
На правах рукописи
РЫДЛОВСКАЯ
АНАСТАСИЯ ВЛАДИМИРОВНА
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА НОВОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРЕПАРАТА АРТРОФЛЕКС И АНАЛИЗ МЕХАНИЗМА ЕГО ДЕЙСТВИЯ
14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2007
Диссертационная работа выполнена в Межрегиональном Центре “Адаптоген”
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Макаров Валерий Геннадиевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Лесиовская Елена Евгеньевна
доктор медицинских наук, профессор Дьячук Георгий Иванович
Ведущая организация: НИИ экспериментальной медицины РАМН
Защита состоится «__»________2007 г в __ часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.030.01 при Институте токсикологии ФМБА России (193019, Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке по адресу: Санкт-Петербург, ул. Бехтерева 1
Автореферат разослан «__» _______2007г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета,
доктор медицинских наук Саватеева-Любимова Т.Н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Социальная значимость воспалительных заболеваний растет во всем мире. Это определяет необходимость разработки новых противовоспалительных препаратов. Сложность разработки эффективных и в то же время безопасных средств для лечения воспаления заключается в том, что это поливалентный, весьма динамичный процесс с множеством альтернативных и перекрещивающихся путей, существующих как на уровне внутриклеточных взаимодействий сигнальных каскадов, так и на уровне регуляции продукции медиаторов воспаления (Черешнев, 2002; Руднов, 2006). В соответствие с этим, влияние только на одну мишень патогенеза либо не сопровождается достаточным фармакологическим эффектом, либо вызывает ряд побочных явлений (Schmid-Schonbein, 2006).
На основании вышесказанного современная медицинская наука постулирует необходимость создания новых препаратов, способных регулировать функциональную активность не одной, а многих молекул, участвующих в воспалении (Krakauer, 2004).
Проблемой, стоящей перед фармакологами, является отсутствие на сегодняшний день полного представления о работе всех звеньев сигнальных каскадов, а также функционального значения многих регуляторных молекул, обеспечивающих воспаление. Это создает трудности при выборе потенциальных мишеней для новых синтетических субстанций (Aderem, Smith, 2004).
В связи с этим хорошие перспективы имеют препараты, созданные на основе растительного сырья (Пастушенков, Лесиовская, 1995; Darshan, Doreswamy, 2004). Современной науке известно не менее 1200 видов растений, обладающих выраженной фармакологической активностью (Болотина, 2007). Их терапевтическая ценность доказана тысячелетней историей применения и научно обоснована результатами доклинических (Krieglstein et al., 2001; Camacho-Barquero et al., 2007; Kurup et al., 2007) и клинических исследований (Саратиков, Краснов, 2004; Deodhar et al., 1980; Gupta et al., 2001). Анализ механизмов действия некоторых субстанций растительного происхождения показал, что фармакологическая активность природных соединений обусловлена их способностью воздействовать комплексно и изменять активность многих регуляторных белков (Aggarwal et al., 2006). В соответствие с этим определение механизмов действия компонентов растительных препаратов может оказаться полезным не только для их грамотного применения в клинике, но и для раскрытия ключевых регуляторных молекул воспаления.
Однако определение фармакологических мишеней действия препаратов растительного происхождения, как правило, сопровождается трудностями, связанными с их фармакокинетикой и особенно метаболической трансформацией действующих веществ в организме. В результате, изучение механизмов действия природных субстанций in vitro зачастую не дает корректных результатов и делает актуальным совершенствование методических подходов.
В настоящей работе предприняты попытки определения противовоспалительных свойств и анализа механизма действия нового оригинального растительного препарата артрофлекс. Выбор лекарственного средства в качестве объекта исследования обусловлен несколькими предпосылками. Во-первых, артрофлекс является комбинированным препаратом, включающим три широко известных в мировой фитомедицине компонента: экстракт смолы ладанного дерева (Boswellia serrata), экстракт корней куркумы (Curcuma longa) и экстракт семян сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica) (Александрова и др., 2004) Это дает основание предполагать наличие у артрофлекса множественности механизмов действия. Во-вторых, предварительные исследования компонентов артрофлекса выявили их высокую фармакологическую активность, в частности, выраженные противовоспалительные свойства (Shikov et al., 2005). В-третьих, основные действующие вещества артрофлекса обладают выраженной гидрофобностью и тем самым затрудняют изучение механизмов действия препарата по общепринятым методикам in vitro.
Все эти предпосылки с одной стороны позволяют ожидать выраженную фармакологическую активность нового препарата, с другой, говорят о необходимости подбора методов для изучения механизмов его действия.
Цель исследования
Оценка противовоспалительных свойств нового растительного препарата артрофлекс и определение основных механизмов его действия.
Задачи исследования:
- Оценить противовоспалительные свойства препарата артрофлекс на моделях острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспаления у крыс.
- Провести сравнительный анализ эффективности артрофлекса с синтетическими препаратами стероидной (преднизолон) и нестероидной (диклофенак, бутадион) природы.
- Изучить механизмы противовоспалительного действия препарата артрофлекс.
- Разработать метод корректной пробоподготовки препарата с целью тестирования его активности в культуре клеток.
- Определить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов: фактора некроза опухолей- (TNF), интерлейкина-1 (IL-1) и интерлейкина-6 (IL-6) in vitro.
- Подтвердить влияние на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и простагландина Е2 (ex vivo) в крови крыс при однократном пероральном введении препарата (300 мг/кг) животным c оценкой динамики проявления противовоспалительного действия.
- Определить влияние на TNF-индуцированную активацию ядерного фактора kB и ЛПС-индуцированную активацию митоген-активированных (МАР) протеинкиназ (p38, JNK1/2, ERK1/2) in vitro.
- Адаптировать метод оценки активации МАР-киназ p38, JNK1/2, ERK1/2 в органах животных для определения механизма действия растительного препарата in vivo. Изучить влияние артрофлекса (300 мг/кг; in vivo) на изменение уровня ЛПС-индуцированной активации МАР-киназ p38, JNK1/2, ERK1/2 в легком, селезенке и костном мозге, а также продукцию TNF в крови крыс.
- Определить возможность проявления побочного (ульцерогенного и иммуносупрессорного) действия артрофлекса.
- Подготовить материалы по изучению противовоспалительных свойств препарата артрофлекс для представления в фармакологический комитет с целью получения разрешения на проведение клинических испытаний.
Научная новизна исследования
С использованием современных методов фармакологии и молекулярной биологии впервые проведено комплексное изучение противовоспалительных свойств нового отечественного растительного препарата артрофлекс в сравнении с известными синтетическими средствами стероидной и нестероидной природы. Установлено, что артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгетическое и жаропонижающее действие при остром и подостром воспалениях, а также предотвращает деструкцию хрящевой и костной тканей сустава при хроническом воспалении.
Впервые установлено, что противовоспалительное действие проявляется через 0.5 и 4-8 часов после перорального введения препарата крысам.
Впервые проведена оценка побочных действий. Показано наличие слабовыраженного ульцерогенного эффекта и отсутствие иммуносупрессорного действия, что позволяет говорить о преимуществе исследуемого препарата перед синтетическими противовоспалительными средствами.
Впервые проведен анализ механизмов противовоспалительного действия артрофлекса. Учитывая высокую гидрофобность действующих веществ, разработан метод по подготовке препарата для тестирования его активности в культуре клеток. Метод оценки активации МАР-киназ p38, JNK1/2, ERK1/2 в органах животных адаптирован для определения механизма противовоспалительного действия растительного препарата.
В результате исследований in vitro и in vivo получены данные о том, что противовоспалительное действие артрофлекса связано с подавлением индуцированной продукции TNF, IL-6, IL-1 и PGE2, ингибированием транскрипционной активности ядерного фактора kB и снижением активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2.
Научно-практическая значимость
Проведены доклинические испытания, выявившие противовоспалительные свойства и раскрывающие механизм действия нового отечественного препарата растительного происхождения артрофлекс.
Результаты настоящего исследования послужили основанием для подготовки и предоставления материалов по новому отечественному препарату артрофлекс для регистрации в ФГУ “НЦЭСМП” Росздравнадзора МЗ и СР РФ.
Модифицированный и апробированный нами метод определения влияния препаратов природного происхождения на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при их пероральном введении используется при изучении механизмов действия целого ряда других фармакологических субстанций.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Артрофлекс оказывает выраженное противовоспалительное действие в дозе 250-300 мг/кг у крыс. По эффективности противовоспалительное действие артрофлекса сопоставимо с таковым синтетических стероидных (преднизолон, 10 мг/кг) и нестероидных (бутадион (56 мг/кг), диклофенак натрия (8 мг/кг)) противовоспалительных препаратов. При этом он оказывает менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорного действия.
- В исследованиях in vitro, ex vivo и in vivo показано, что механизм противовоспалительного действия артрофлекса связан с ингибированием ЛПС-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов TNF, IL-6 и IL-1 и метаболита арахидоновой кислоты PGE2.
- Противовоспалительное действие артрофлекса реализуется через регуляцию активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2, а также ядерного фактора kB.
Апробация работы
Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на международной конференции «Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию» (Химки, 2006); X Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященных памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006); 54th annual congress on medical plant research (Helsinki, Finland, 2006); Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants in biology» (Santa Barbara, California, 2006); «Политехническом симпозиуме: Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); Nordic Natural Products Conference (Sankt Helene, Denmark, 2007); VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, пяти глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, заключение, выводов, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована таблицами, схемами и рисунками. Список литературы включает 225 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования по определению противовоспалительных свойств артрофлекса in vivo.
Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс производилась на моделях острого (каррагениновый отек), подострого (формалиновый отек) и хронического (адьювантный артрит) воспалений. Исследования проводились на крысах-самцах линии Вистар (массой 180-200 г) по 10 штук в группе.
На моделях каррагенинового и формалинового отеков введение артрофлекса per os (125, 250 и 500 мг/кг) проводилось по профилактической и лечебно-профилактической схемам, соответственно. Препараты сравнения бутадион (56 мг/кг) и диклофенак натрия (8 мг/кг) вводили аналогично. Оценка действия артрофлекса производилась в динамике каждые 3-5 дней и включала противоотечную, анальгезирующую и гипотермическую активности (Руководство…, 2005). Унифицированными биохимическими и гематологическими методами оценивались СОЭ и содержание лейкоцитов, а также уровни лейкотриена B4 и простагландина Е2 (на модели формалинового отека) в крови опытных животных (Лаборат…, 1987; Справ…, 1970).
На модели адьювантного артрита введение артрофлекса per os (100, 300 и 900 мг/кг) проводилось по лечебной схеме. Препаратом сравнения служил преднизолон (10 мг/кг). Определяли влияние препарата на патологические изменения костной и хрящевой тканей сустава пораженной конечности животных, а также наличие побочного действия в отношении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и морфо-функционального состояния центрального (тимус) и периферического (селезенка) органов лимфоидной системы (Cai et al., 2005).
Для проведения исследования фармакологической активности артрофлекса in vitro был разработан метод по подготовке препарата с целью увеличения его биодоступности в культуре клеток. Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию IL-1, IL-6 и TNF проводили на человеческой моноцитарно/макрофагальной клеточной линии THP1 (ACCT). Клетки инкубировали с артрофлексом в изучаемых концентрациях и через 4 часа стимулировали ЛПС (10 нг/мл) в течение 24 часов. Все инкубации проводились при 37°С с 5% СО2. Концентрация цитокинов определялась методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ проводился в соответствии с инструкцией производителя тест-систем (ООО “Цитокин”, Россия).
Подтверждение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию TNF, а также PGE2 при его пероральном введении животным проводилось на крысах линии Вистар. Животных выдерживали без пищи сутки и однократно перорально вводили артрофлекс или кукурузное масло (плацебо) в дозе 300 мг/кг. Через 0.5, 1, 2, 4 и 8 часов животных подвергали эвтаназии и отбирали кровь. Кровь разводили культуральной средой RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) в соотношении 1:5 и инкубировали с ЛПС в течение 24 часов. Концентрацию TNF и PGE2 в культуральных супернатантах определяли методом ИФА с использованием тест-систем (BD Biosciences, USA; Сayman Chemical, USA).
Определение влияния артрофлекса на транскрипционную активность NF-kB проводилось на клеточной линии HEK293 (привезенной из Каролинского Института, Стокгольм, Швеция) методом репортерного гена люциферазы. Репортерный ген люциферазы, находящийся под контролем промотора NF-kB (pNF-kB-LUC; Stratagene, USA) с использованием реагента TransFast (Promega, США) трансфецировали в клетки HEK293. Для определения количества трансфецированных клеток параллельно проводили трансфекцию плазмиды pSV--galactosidase control vector (Promega, USA). Индуктором активации NF-kB служил TNF (100 нг/мл). По уровню экспрессии гена люциферазы судили о функциональной активности NF-kB.
Уровень экспрессии гена люциферазы измеряли на люминометре (DLReady™) при добавлении в клеточный лизат раствора субстрата Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). Уровень экспрессии гена -галактозидазы определяли по ферментативной активности -галактозидазы при добавлении к лизату субстрата о-нитрофенил--D-галактозида (Sigma). Интенсивность реакции определяли на спектрофотометре и активность -галактоидазы вычисляли по формуле OD420 – 1.75xOD550. Полученный результат (в оптических единицах) принимался за условную активность -галактоидазы. Окончательным количественным результатом определения уровня активности NF-kB являлось отношение уровня активности люциферазы к условной активности -галактоидазы.
Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ проводилось in vitro и in vivo.
Активация МАР-киназ оценивалась методом иммуноблота по количеству фосфорилированных форм белков. Для этого использовали поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и тирозину (Thr202/Tyr204) ERK1/2, (Thr183/Tyr185) SAPK/JNK, (Thr180/Tyr182) p38 (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США).
Исследования in vitro проводились на перевиваемой клеточной линии моноцитов человека U937, полученной из Российской коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН. Клетки инкубировали с препаратом в течение 16 часов и обрабатывали ЛПС (1 мкг/мл; 1 час).
Исследование in vivo проводилось на крысах линии Вистар и учитывало активацию МАР-киназ в легком, селезенке и костном мозге бедренной кости, а также продукцию TNF в крови животных. Артрофлекс (300 мг/кг) вводили крысам перорально за 49, 25 и 1 час до инъекции ЛПС. ЛПС (4 мг/кг) вводили в хвостовую вену голодавшим в течение 12 часов животным. Через 1 и 4 часа после введения ЛПС осуществлялась эвтаназия животных в СО2-камере, забор крови и отбор биоптатов исследуемых органов.
Статистический анализ результатов проводили с помощью пакетов программ Excel`97 и SPSS 12. Для статистической обработки и определения различий между независимыми группами нормально распределенных данных использовали t критерий Стьюдента. Во всех экспериментах различие между контролем и опытом считалось статистически достоверным только при р<0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Оценка противовоспалительного действия препарата артрофлекс проводилось на моделях каррагенинового и формалинового отеков лапы крыс, характеризующих острое и подострое воспаления, соответственно. Проведенное исследование позволило установить, что прием артрофлекса оказывает выраженное превентивное и лечебное действие в отношении острого и подострого воспалений у крыс. На модели каррагенинового отека в дозах 125 и 500 мг/кг артрофлекс оказывал антиэксудативное, анальгетическое и антипирогенное действия по силе сопоставимые с таковыми диклофенака Na (8 мг/кг) и бутадиона (56 мг/кг), а в дозе 250 мг/кг превосходил их. В частности через 3 часа после введения каррагенина артрофлекс (250 мг/кг) снижал объем и температуру воспаленной конечности животных на 56% и 72%, а порог болевой чувствительности увеличивал на 259%, соответственно. На сроке 12 ч индукции воспаления действие артрофлекса усилилось, на сроке 24 ч оцениваемые показатели под влиянием препарата достигли значений нормы (рис. 1).
 | Рис. 1. Показатели активности воспалительного процесса в динамике течения каррагенинового отека у крыс на фоне применения препаратов. Здесь и далее: Белые столбцы – 3 ч после введения каррагенина; Серые столбцы – 12 ч после введения каррагенина; Черные столбцы – 24 ч после введения каррагенина. Цифрами 1-7 обозначены экспериментальные группы: 1 – интактные; 2 – плацебо; 3 – бутадион, 56 мг/кг; 4 – диклофенак, 8 мг/кг; 5 – артрофлекс, 125 мг/кг; 6 – артрофлекс, 250 мг/кг; 7 – артрофлекс, 500 мг/кг. |
 | |
 |
Анализ переферической крови животных подтвердил выраженное противовоспалительное действие артрофлекса в дозе 250 мг/кг. Уже через 3 часа после введения каррагенина крысам, артрофлекс снижал повышенные СОЭ и содержание лейкоцитов в крови на 69% и 68%, соответсвенно (рис. 2).
 | Рис. 2. Показатели крови, характеризующие воспалительный процесс в динамике течения каррагенинового отека у крыс на фоне применения препаратов. Примечания: Белые, серые, черные столбцы – 3, 12, 24 ч после введения каррагенина. Цифрами 1-7 обозначены экспериментальные группы: 1 – интактные; 2 – плацебо; 3 – бутадион, 56 мг/кг; 4 – диклофенак, 8 мг/кг; 5 – артрофлекс, 125 мг/кг; 6 – артрофлекс, 250 мг/кг; 7 – артрофлекс, 500 мг/кг. |
 |
Результаты исследования на модели формалинового отека подтвердили выраженное противовоспалительное действие артрофлекса и его наибольшую эффективность в дозе 250 мг/кг. На 4-ые сутки развития воспаления артрофлекс (250 мг/кг) снижал объем и температуру воспаленной конечности на 67 и 70%, соответственно, а порог болевой чувствительности увеличивал на 104%. На 8-ые сутки развития воспаления артрофлекс изменял указанные параметры на 89, 83 и 38%, соответственно. При этом по эффективности артрофлекс (250 мг/кг) значительно превосходил действие бутадиона (56 мг/кг) и соответствовал таковому диклофенака (8 мг/кг).
Измерение уровней простагландина Е2 (PG-E2) и лейкотриена В4 (LTB4) в крови экспериментальных животных на 4 и 8 сутки после введения формалина показало, что в отличие от классического неспецифического ингибитора циклооксиганазы-1/2 диклофенака Na, действие которого в основном было направлено на продукцию PGE2 (снижал на 63.3-68.4%) и лишь незначительно отражалось на продукции LTB4 (снижал на 11.5-35.4%), артрофлекс (250 мг/кг) эффективно подавлял продукцию обоих метаболитов арахидоновой кислоты (на 76.3-76.4% и 42.3-54.2%, соответственно) (табл. 1).
Полученные результаты, а также подтверждающие их литературные данные о механизмах действия куркумина (Hong et al., 2004) и ацетил-11-кето--босвелиевой кислоты (Sailer, 1998), позволили предположить, что артрофлекс влияет на оба (на циклоксигеназный и липоксигеназный) пути метаболизма арахидоновой кислоты, что дает преимущество природному препарату перед синтетическими НПВП.
Таблица 1
Уровни медиаторов воспаления в крови экспериментальных животных в динамике течения адъювантного артрита на фоне применения препаратов на 4 и 8 сутки, пг/мл (M±m)
| Экспериментальная группа | PG-E2 | LTB4 | ||
| 4 день | 8 день | 4 день | 8 день | |
| Интактная | 500±40 | 520±60 | 900±70 | 910±60 |
| Плацебо | 3800±150 | 2750±200 | 5200±400 | 4800±300 |
| Бутадион, 56 мг/кг | 2500±240* | 1100±180* | 3600±250* | 2900±160* |
| Диклофенак, 8 мг/кг | 1200±300* | 1010±260* | 4600±450* | 3100±170* |
| Артрофлекс, 500 мг/кг | 1100±120* | 900±100* | 3200±200* | 3000±180* |
| Артрофлекс, 250 мг/кг | 900±70* | 650±50* | 3000±150* | 2200±200* |
| Артрофлекс, 125 мг/кг | 900±60* | 700±70* | 3200±200* | 2500±250* |
* - достоверные отличия от группы плацебо (р < 0.05)
Следующей моделью, поставленной для оценки эффективности нового препарата при развитии хронического иммунного воспаления, служил “адьювантный артрит” у крыс. Артрофлекс вводили в дозах 100, 300 и 900 мг/кг по лечебной схеме.
Учитывая, что наиболее информативными показателями развития адьювантного артрита являются патологические изменения хрящевой и костной ткани пораженной конечности животных, характеристике этих тканей мы уделили особое внимание. Результаты рентгенологического исследования показали, что введение артрофлекса крысам выражено снижает развитие патологических изменений костной ткани (утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей (рис. 3)). В частности, среди животных, получавших артрофлекс, большая часть не имела патологических изменений и только у 20-40% были отмечены слабовыраженные изменений. Тогда как среди крыс, получавших плацебо и преднизолон, большая часть имела утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей, причем не только слабо-, но и сильновыраженные (табл. 2). Морфометрическое исследование хрящевой ткани сустава пораженной конечности позволило установить, что артрофлекс предотвращает резорбцию гиалинового хряща, причем делает это эффективнее препарата сравнения преднизолона.
| Рис. 3. Рентгеновский снимок конечностей крысы (адьювантный артрит, 24-е сутки). |
| А) патологические изменения отсутствуют; Б) патологические изменения слабо выражены; В) патологические изменения сильно выражены. Стрелка указывает на утолщение и разволокнение кортикальных слоев плюсневых костей. |
Таблица 2
Состояние костной и хрящевой тканей пораженной конечности крыс на фоне адьювантного артрита и применения исследуемых препаратов
| Изменения костной ткани (n=10) | Толщина суставного хряща (n=6) | |||
| Группа | Сильно выражены | Слабо выражены | Отсутствуют | Значение (М±m, мкм) |
| Интактная | 0 | 0 | 10 | 91.3±7.4 |
| Плацебо | 3 | 4 | 3 | 37.4±6.1* |
| Преднизолон, 10 мг/кг | 1 | 6 | 3 | 49.8±6.2* |
| Артрофлекс, 100 мг/кг | 0 | 3 | 7 | 57.2±3.6*** |
| Артрофлекс, 300 мг/кг | 0 | 2 | 8 | 61.2±8.5*** |
| Артрофлекс, 900 мг/кг | 0 | 4 | 6 | 57.3±3.8*** |
* - различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (р<0.05)
** - различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо (р<0.05)
Учитывая возможность проявления побочных эффектов артрофлекса, на модели адъювантного артрита мы оценили наличие иммуносупрессорного и ульцерогенного действия препарата.
Исследование показало, что в отличие от преднизолона природный препарат не оказывает иммуносупрессорного действия. В частности, не снижает вес тимуса и толщину его коркового слоя. Более того, в дозе 300 мг/кг артрофлекс предотвращал стресс-индуцированную инволюцию коркового вещества тимуса, что подтвердило выраженные противовоспалительные свойства изучаемого препарата (табл. 3).
Таблица 3
Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов у крыс на фоне адьювантного артрита и применения исследуемых препаратов
| Состояние первичных и вторичных лимфоидных органов | |||
| Группа | Относительный вес селезенки (мг/100 г. крысы) (n=10) | Относительный вес тимуса (мг/100 г. крысы) (n=10) | Толщина коркового слоя тимуса (мкм) (n=6) |
| Интактная | 402.5±21.8 | 152.0±11.4 | 386.0±7.0 |
| Плацебо | 437.9±29.8 | 130.9±9.9 | 203.4±11.9* |
| Преднизолон, 10 мг/кг | 398.6±18.8 | 69.8±5.7*** | 74.7±7.4*** |
| Артрофлекс, 100 мг/кг | 467.8±27.3 | 116.4±6.8* | 279.4±16.7*** |
| Артрофлекс, 300 мг/кг | 471.3±30.0 | 126.9±11.3 | 319.6±7.3*** |
| Артрофлекс, 900 мг/кг | 471.8±27.7 | 122.9±9.6 | 359.7±10.6** |
*— различия статистически значимы по сравнению с интактной группой (р<0.05)
**— различия статистически значимы по сравнению с группой плацебо (р<0.05)
Вскрытие желудков крыс и визуальный осмотр их слизистой оболочки показал, что и артрофлекс и преднизолон оказывают ульцерогенное действие. Однако если в случае приема артрофлекса повреждения слизистой носили слабовыраженный характер в виде кровоизлияний и проявлялись только у 40% животных, то при введении крысам преднизолона нарушения морфологии слизистой оболочки желудка наблюдались у всех вошедших в исследование крыс и включали не только кровоизлияния, но и наличие множественных язв (рис. 4)
Рис. 4. Состояние слизистой оболочки крыс на фоне адьювантного артрита и применения препаратов.
Примечание: белый сектор – отсутствие патологических изменений; светло-серый сектор – гиперемия; темно-серый сектор – кровоизлияния; черный сектор – язвы.
Изучение механизмов противовоспалительного действия фитопрепарата артрофлекс начали с определения влияния препарата на ЛПС-индуцированную продукцию ключевых провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и TNF. Исследование проводилось на перевиваемой культуре моноцитов человека линии THP-1 и выявило ингибирующее влияние артрофлекса в отношении продукции всех оцениваемых белков. Наиболее выраженно препарат снижал продукцию IL-6 (максимально на 76%), менее выраженно -продукцию TNF (максимально на 32%), самое слабое действие оказывал в отношении продукции IL-1 (максимум ингибирования составил 8.6%) (рис. 5).
Рис. 5. Влияние артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6 и TNF в культуре моноцитов человека линии THP-1.
Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.
Однако результаты, полученные in vitro, не всегда отражают реальную активность препарата in vivo, особенно, когда речь идет о комплексном препарате, который назначается перорально.
Чтобы убедиться в корректности полученных данных мы предложили модель, позволяющую оценить механизм действия препарата ex vivo. Модель построена на том, что после перорального введения препарата, его биологически активные компоненты (как в нативном виде, так и их метаболиты) поступают в кровь и оказывают свое действие. В соответствии с этим последовательный (повременный) забор крови у животного и индукция в ней реакции воспаления позволяет установить силу и время биологического действия препарата. Оценку воспаления мы проводили по определению в крови уровня продукции фактора некроза опухолей и простагландина Е2.
Результаты определения влияния перорального введения артрофлекса крысам на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и PGE2 в крови животных подтвердили, что противовоспалительное действие препарата связано с подавлением ЛПС-индуцированной продукции провоспалительного цитокина TNF и показали, что препарат также ингибирует ЛПС-индуцированную продукцию метаболита арахидоновой кислоты PGE2 (рис. 6).
Измерение продукции факторов воспаления клетками крови в динамике после введения артрофлекса крысам позволило установить, что препарат оказывает выраженное противовоспалительное действие через 30 минут (продукция TNF снизилась на 61%), а также через 4 (продукция TNF и PGE2 снизилась на 65 и 82%, соответсвенно) и 8 часов (продукция TNF снизилась на 49%) после введения в организм. Временные сроки проявления артрофлексом противовоспалительного действия совпадали с достижением максимальной концентрации в плазме крови метаболита 1 куркумина и ацетил-11-кето--босвелиевой кислоты (через 30 мин и 4 часа после введения препарата крысам, соответственно) (Карлина и соавт., 2007), что дало основание предполагать связь эффекта с определенными соединениями (рис. 6).
Рис. 6. Влияние артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и PGE2 в крови крыс при введении препарата per os. Сравнительный анализ сроков проявления противовоспалительного действия артрофлекса с концентрацией метаболитов и компонентов артрофлекса в крови крыс.
Примечание: * - р<0.05 при сравнении с контролем.
Наличие сходного влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную продукцию IL-6, TNF и IL-1 in vitro позволило предположить единый механизм действия препарата на продукцию цитокинов. На основании того, что главным регулятором при запуске синтеза IL-6, TNF- и IL-1 является ядерный транскрипционный фактор kB (NF-kB), было проведено определение влияния артрофлекса на TNF-индуцированную активацию данного фактора.
Результаты исследования показали, что артрофлекс способен подавлять TNF-индуцированную активность NF-kB in vitro (на 20-23% в дозах 0.01-0.1 мкг/мл и на 65% в дозе 125 мкг/мл) (рис. 7). Однако экстремальный характер зависимости “доза препарата – эффект” дали основание предполагать, что артрофлекс действует не на сам ядерный фактор kB, а на другие регуляторные молекулы, напрямую или косвенно влияющие на его активацию.
Рис. 7. Влияние препарата артрофлекс на TNF-индуцированную активность NF-kB.
Примечание: * - p<0.05 при сравнении контролем.
В качестве возможных мишеней действия артрофлекса были предложены митоген-активированные (МАР) протеинкиназы p38, JNK1/2 и ERK1/2. По данным многочисленных исследований МАР-киназы JNK1/2, p38 и ERK1/2 играют одну из ключевых ролей в развитии воспаления. Во-первых, они фосфорилируют и, таким образом, активируют многие факторы транскрипции, в числе которых NF-kB (Kyriakis et al., 2001; Saklatvala et al., 2004), во-вторых, МАР-киназы обеспечивают посттранскрипционную регуляцию синтеза некоторых провоспалительных цитокинов: повышают стабильность мРНК (Ming et al., 1998; Winzen et al., 1999) и регулируют ее транспорт из ядра в цитоплазму (Dumitru et al., 2000).
Определение влияния артрофлекса на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в перевиваемой клеточной культуре моноцитов человека U937 не дало значимых результатов, за исключением установленного действия препарата в отношении активации JNK1/2. В результате этого нами была предложена модель, позволяющая определить влияние препарата на ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в тканях животных. Предложенный метод включал внутривенное введение крысам ЛПС, забор крови и отбор биоптатов легкого, селезенки и костного мозга бедренной кости. В крови определяли уровень провоспалительного цитокина TNF, в органах – активацию МАР-киназ JNK1/2, p38 и ERK1/2.
Реализованная модель являлась инновационной. Анализ отечественной научной литературы не выявил наличие подобных исследований в России, а обзор мировой литературы показал, что число опубликованных работ, использовавших данный подход, не превышает 20.
Проведенное исследование показало, что пероральное введение препарата крысам ингибирует ЛПС-индуцированную активацию МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 в селезенке, а также р38 и ERK1/2 в легком и костном мозге на сроках 1 и/или 4 часа индукции воспаления (рис. 8-9). Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2.
Отсутствие влияния артрофлекса на активацию JNK1/2 в легком и костном мозге может быть связано с проявлением действия препарата в другие, отличные от 1 и 4 часов, сроки индукции воспаления и особенностями его фармакокинетики. К тому же артрофлекс подавлял активацию JNK1/2 in vitro.
Важно отметить, что во всех исследуемых органах артрофлекс снижал количество фосфорилированных форм МАР-киназы р38 до уровня интактных животных или более. Учитывая, что р38 является стрессорной МАР-киназой, в норме неактивной, полученные результаты можно объяснить проявлением действия артрофлекса не только в процессе развития воспаления у животных, но и при заборе биоптатов тканей. То есть, предполагается, что препарат способен подавлять передачу сигнала, как от факторов воспаления, так и от стрессов окружающей среды.
Рис. 8. Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per os) на активацию МАР-киназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 в селезенке крыс через 1 и 4 часа после внутривенного введения им ЛПС. * - p<0.05 при сравнении с контролем (плацебо)
Рис. 9. Влияние препарата артрофлекс (300 мг/кг, per os) на активацию МАР-киназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 в легком и костном мозге крыс через 1 и 4 часа после внутривенного введения им ЛПС.
Примечание: * - p<0.05 при сравнении с контролем (плацебо)
Определение влияния перорального введения артрофлекса крысам на ЛПС-индуцированное повышение уровня TNF в крови животных доказало способность препарата ингибировать продукцию провоспалительного цитокина in vivo. На сроке 1 час индукции воспаления артрофлекс снижал концентрацию TNF в плазме крови до <5%, на сроке 4 часа – до 42% от таковой животных из группы плацебо (табл. 4).
Таблица 4
Уровень TNF в плазме крови крыс на фоне внутривенного введения ЛПС и перорального приема препарата артрофлекс (300 мг/кг)
| Группа (n=7) | Уровень TNF в плазме крови крыс (пг/мл) | |
| через 1 ч после введения ЛПС | через 4 ч после введения ЛПС | |
| Интактные | <31 | <31 |
| Плацебо | 608.8±202.1* | 1243.2±205.9* |
| Артрофлекс (300 мг/кг) | <31*** | 510.4±78.9*** |
* - различия статистически значимы (р<0.05) по сравнению с группой интактных животных; ** - различия статистически значимы (р<0.05) по сравнению с группой плацебо.
Полученные данные позволяют заключить, что установленная ранее способность артрофлекса ингибировать ЛПС-индуцированную продукцию ключевого провоспалительного цитокина TNF в условиях in vitro и ex vivo подтвердилась на уровне in vivo при пероральном введении препарата животным. На основании этого можно утверждать, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование им продукции фактора некроза опухолей-.
Суммируя результаты изучения специфической фармакологической активности препарата артрофлекс, можно заключить, что препарат оказывает выраженное противовоспалительное действие по силе не уступающее синтетическим стероидным и нестероидным лекарственным средствам. Артрофлекс обладает противоотечной, анальгезирующей и антипиретической активностями, предотвращает индуцированные хроническим воспалением деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани.
Механизм действия артрофлекса выражается в снижении повышенной продукции провоспалительных цитокинов TNF, IL-6 и IL-1, а также метаболитов арахидоновой кислоты простагландина E2 и лейкотриена В4. Оказываемое действие проявляется за счет регулирования активации МАР-киназ (p38, JNK1/2, ERK1/2) и ядерного транскрипционного фактора kB.
ВЫВОДЫ
- В ходе комплексного исследования с использованием трех экспериментальных моделей острого, подострого и хронического воспалений у крыс установлено, что новый отечественный препарат растительного происхождения артрофлекс обладает выраженными противовоспалительными свойствами в дозе 250-300 мг/кг.
- При остром и подостром воспалениях артрофлекс оказывает антиэксудативное, анальгезирующее и жаропонижающее действие, нормализует СОЭ и лейкоцитоз, а также снижает уровень простагландина Е2 и лейкотриена В4 в периферической крови экспериментальных животных. При хроническом воспалении суставов артрофлекс предотвращает деструкцию хряща и патологические изменения костной ткани.
- По эффективности противовоспалительного действия артрофлекс (250-300 мг/кг) соответствует или превосходит стероидные (преднизолон (10 мг/кг)) и нестероидные (бутадион (56 мг/кг), диклофенак Na (8 мг/кг)) противовоспалительные препараты, при этом оказывает значительно менее выраженный ульцерогенный эффект и не проявляет иммуносупрессорных свойств.
- С использованием современных методов молекулярной биологии, адаптированных для изучения препаратов растительного происхождения, проведен анализ ряда механизмов противовоспалительного действия артрофлекса. В частности, установлено, что артрофлекс подавляет ЛПС-индуцированную продукцию факторов воспаления: TNF, IL-6, IL-1 и PGE2.
- Адаптирован метод определения влияния растительного препарата на активацию МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 в органах крыс при его пероральном введении животным. Установлено, что одним из механизмов противовоспалительного действия артрофлекса является ингибирование активации МАР-киназ р38, JNK1/2 и ERK1/2 и снижение транскрипционной активности ядерного фактора kB.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Rydlovskaya A.V., Makarova M.N., Makarov V.G., Tikhonov V.P. Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro and in vivo// Abstr. Book of Oxygen club of California «Oxidants and antioxidants in biology», 15-18 March 2006. – Santa Barbara, California, 2006. - P. 107.
- Рыдловская А.В., Макаров В.Г. К механизмам противовоспалительного действия босвеллиевых кислот // Материалы X междунар. Съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2006. – СПб, Россия, 2006. – С.754-759.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г. Оценка противовоспалительного действия комбинированного фитопрепарата артрофлекс и его компонентов на модели адьювантного артрита у крыс // Материалы X междунар. съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», 22-25 июня 2006. – СПб, Россия, 2006. – С. 754-759.
- Rydlovskaya A., Makarov V., Makarova M., Pozharitskaya O., Tikhonov V. Investigation of anti-inflammatory activity of complex herbal oil extract in vitro and in vivo// J. Planta Medica (54th annual congress on medical plant research; 29 August – 2 September, Helsinki, Finland, 2006). – 2006. – Vol. 72. – P. 1007-1008.
- Рыдловская А.В., Макаров В.Г. Механизмы противовоспалительного и иммуномодулирующего действий диферулоилметана// Вестник Уральской медицинской академии наук. – 2006. – Т.3, №1. – С.208-210.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Тесакова С.В., Столащук Н.В., Макаров В.Г. Оценка эффективности нового нестероидного противовоспалительного препарата растительного происхождения// «Политехнический симпозиум: Молодые ученые – промышленности Северо-Западного региона», 8 декабря 2006. – СПб, Россия, 2006. – С.202.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Оценка противовоспалительного действия комбинированного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека у крыс линии Вистар// Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. – 2006. - №3(7). – C.138-141.
- Рыдловская А.В., Макарова М.Н., Макаров В.Г., Тесакова С.В., Иванова С.А., Пожарицкая О.Н., Тихонов В.П. Противовоспалительная активность и механизм действия препарата “Артро-актив”// Фармация. – 2007. - №1. – С. 38-41.
- Рыдловская А.В., Гончар И.В., Тесакова С.В., Столащук Н.В., Гущин В.А., Макаров В.Г. Определение влияния противовоспалительного комбинированного растительного препарата артрофлекс на сигналинг МАР-киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2 и ядерного фактора kB// Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 5-7 июня 2007. – Пущино, Россия, 2007. – C.333-335.
- Rydlovskaya A.V., Gonchar I.V., Gushсhin V.A., Tesakova S.V., Stolashuk N.V., Makarov V.G., Tikhonov V.P. Study of mechanisms of action of a new non-steroidal anti-inflammatory remedy of plant origin// Abstr. Book of Nordic Natural Products Conference, - June 13-15 2007. - Sankt Helene, Denmark, 2007. – P. 57.
- Рыдловская А.В., Гончар И.В., Гущин В.А., Тесакова С.В., Столащук Н.В., Макаров В.Г. Влияние нового нестероидного противовоспалительного препарата растительного происхождения на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и активацию МАР-киназ JNK1/2, p38 и ERK1/2 in vivo// Российский аллергологический журнал (VIII Конгресс "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии”, 27-29 июня. – Москва, Россия, 2007). – 2007. - №3, приложение 1. - С. 34.
- Макаров В.Г., Макарова М.Н., Рыдловская А.В., Тесакова С.В. Нутриметаболомика с позиций системной оценки функционирования метаболических комплексов// Ж. вопросы питания. – 2007. - №3. – С. 4-10.
