WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Трансплантация аутологичных клеток костного мозга для коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном сахарном диабете i типа (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

ВЕЛИКИЙ ДМИТРИЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ

ПРИ АУТОИММУННОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ I ТИПА

(ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

14.01.24. – Трансплантология и искусственные органы

14.03.03. Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в ФГУ «ФНЦ Трансплантологии и Искусственных Органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Поздняков Олег Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Скалецкий Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Меркулова Дина Мироновна

Ведущее учреждение: ФГУ «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» ФМБА РФ

Защита состоится «___»____________ 2010 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.055.01 при ФГУ «ФНЦ Трансплантологии и Искусственных Органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФНЦ Трансплантологии и Искусственных Органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ

Автореферат разослан: «___»_____________2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна

Актуальность темы

Несмотря на определенные достижения медикаментозной терапии последних лет, сахарный диабет (СД) и его тяжелые сосудистые осложнения - по-прежнему остаются одной из ведущих причин ранней инвалидизации и гибели людей во всех странах мира [Gillespie K.M., 2006]. По современным представлениям СД I типа является тяжелым прогрессирующим аутоиммунным заболеванием, в основе которого лежит глубокая дизрегуляция иммунной системы, при которой имеет место повышенный апоптоз и гибель островковых клеток поджелудочной железы на фоне ингибирования их восстановительной регенерации.

В последние годы во всем мире стали активно изучаться возможности применения клеточных технологий, в частности трансплантации стволовых/прогениторных клеток костного мозга (ККМ), для индукции восстановительных процессов в поврежденных органах. Была показана эффективность применения этих клеток при моделировании на животных заболеваний сердечно-сосудистой системы [Pittenger M.F., Martin B.J., 2004; Iso Y. et al., 2007], опорно-двигательного аппарата [De Kok I.J. et al., 2003; Awad H.A. et al., 2003; Murphy J.M. et al., 2003], неврологических нарушений [Iihoshi S. et al., 2004; Zappia E. et al., 2005; Zhang J. et al., 2005], повреждений легких, печени, почек [Ortiz L.A. et al., 2003; Fang B. et al., 2004; Togel F. et al., 2005]; в клинической практике ККМ использовали для восстановления функции сердца [Perin E.C. et al., 2003; Stamm C. et al., 2004; Rosenzweig A., 2006], регенерации костной ткани [Arthur A. et al., 2009] и ингибирования «реакции трансплантат против хозяина» [Ringden O. et al., 2006].

Показана терапевтическая эффективность ККМ (мононуклеарной и стромальной фракций) и на экспериментальных моделях некоторых аутоиммунных заболеваний [van Bekkum D.W., 2004; Zappia E. et al., 2005; Zhang J. et al., 2005; Augello A. et al., 2007], которая, как полагают, связана с коррекцией популяционного состава иммунорегуляторных клеток [Herrmann M.M. et al., 2005; de Kleer I. et al., 2006] и достигается устранением цитокинового дисбаланса в организме [Aggarwal S., Pittenger M.F., 2005].

Приступая к своим исследованиям, мы полагали, что применение стволовых/прогениторных ККМ при СД I типа, при котором роль аутоиммунных механизмов повреждения островковых клеток патогенетически значима, может оказаться весьма перспективным способом коррекции клинических проявлений СД I типа. Однако исследований по коррекции ККМ аутоиммунного СД I типа мы не обнаружили. Только в работе Hasegawa et al. (2007) были приведены результаты коррекции аутоиммунного СД I типа ККМ. Но в этой работе были использованы животные, генетически предрасположенные к развитию СД I типа, и результаты, полученные в этих опытах, дают искаженное представление о возможностях реагирования адаптивных систем организма и потому генетическая модель не может быть использована для оценки эффективности восстановительных процессов в островковых клетках поджелудочной железы у животных с аутоиммунным СД I типа без генетических дефектов развития их иммунной системы.

Обычно используемые экспериментальные модели СД I типа – аллоксановая и стрептозотоциновая являются цитотоксическими, избирательно повреждают -клетки поджелудочной железы, и сопровождаются фиброзирующей регенерацией поджелудочной железы без сопутствующего развития в ней аутоиммунного повреждения [Nir T. et al., 2007].

Отсутствие адекватной модели аутоиммунного СД I типа на генетически не предрасположенных животных и отсутствие данных об эффективности коррекции патогенетических нарушений СД I типа на такой экспериментальной модели путем трансплантации аутологичных ККМ позволило нам сформулировать цели и задачи настоящего исследования.

Цели и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилось изучение эффективности трансплантации аутологичных клеток костного мозга для коррекции патогенетических нарушений на модели аутоиммунного СД I типа.

Для достижения указанной цели нами были поставлены следующие задачи:

  1. Создать адекватную модель аутоиммунного СД I типа и оценить ее пригодность для изучения иммунных механизмов развития аутоиммунного СД I типа и эффективности клеточной терапии при этом заболевании.
  2. Оценить целесообразность предварительного культивирования аутологичных клеток костного мозга от животных с аутоиммунным СД I для восстановления функциональной и биорегуляторной активности этих клеток.
  3. Выявить наличие функционально активных трансплантированных клеток костного мозга (маркер - GFP) в органах животных с аутоиммунным СД I типа при длительных сроках наблюдения (60 суток) и установить связь присутствия жизнеспособных клеток с восстановлением функции поврежденных органов.
  4. Сравнить эффективность коррекции клинических, морфологических и иммунных нарушений при СД I типа в зависимости от дозы (кратности введения) аутологичных клеток костного мозга.
  5. Сравнить эффективность коррекции клинических, морфологических и иммунных нарушений при СД I типа в зависимости от стадии (тяжести) развития заболевания.
  6. Связать терапевтическую роль клеток костного мозга с восстановлением структуры и функции органов иммуногенеза, устранением иммунной дизрегуляции в организме и индукцией иммунной толерантности для коррекции клинических проявлений, развивающихся при аутоиммунном СД I типа.

Выполнение работы осуществлялось в рамках темы: «Разработка методов лечения сахарного диабета I типа аутологичными клетками костного мозга» по заданию Минздравсоцразвития РФ на 2007-2010 гг (Регистрационный номер 0120.0800280 от 04.12.07).

Научная новизна

Впервые для изучения патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа и их коррекции методами клеточной терапии разработана и охарактеризована иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа у генетически не предрасположенных животных. Новизна модели подтверждена выдачей патента на изобретение №2400822 «Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс» от 27.09.2010. Гистологическими и морфометрическими методами показано, что при моделировании СД I типа имеет место уменьшение площади островков Лангерганса (ОЛ) поджелудочной железы (ПЖ), снижение количества -клеток в них, а также наличие выраженной воспалительной инфильтрации в ОЛ ПЖ. Установлено, что развитие аутоиммунного СД I типа сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов в организме на фоне гипоплазии ткани селезенки. Показано, что среди клеток воспалительного инфильтрата находятся различные популяции Т-клеток, с присутствием которых связано поддержание аутоиммунного воспаления в ОЛ ПЖ. Аутоиммунный механизм повреждения инсулярного аппарата островковой ткани ПЖ подтвержден выполнением адоптивного переноса СД интактным животным путем трансплантации спленоцитов от животных с аутоиммунным СД I типа.

Показано, что при использовании аутологичных ККМ для лечения аутоиммунного СД I типа необходимо проводить предварительное культивирование этих клеток для восстановления их биорегуляторной активности, ингибированной хроническим заболеванием (стрессом).

Установлено, что эффективность коррекции патогенетических нарушений у животных с аутоиммунным СД I типа при трансплантации аутологичных ККМ, находится в непосредственной зависимости от суммарной дозы (кратности введения) клеток, а также от стадии развития заболевания. При этом более выраженный эффект был отмечен при многократной трансплантации ККМ на начальной стадии заболевания, что характеризовалось наиболее выраженным снижением уровня глюкозы по сравнению с другими экспериментальными сериями, достоверно более значительным повышением площади ОЛ ПЖ и количества -клеток в них, а также снижением выраженности воспалительной инфильтрации ОЛ ПЖ. Показано, что многократная трансплантация ККМ на начальной стадии заболевания сопровождается также новообразованием островков вблизи протоков ПЖ.

Показано, что аутологичные ККМ нормализуют углеводный обмен на фоне устранения иммунной дизрегуляции в организме и восстановления морфофункциональных компартментов органов иммуногенеза (тимус и селезенка), дисфункция которых развивается при аутоиммунном СД I типа, а также на фоне снижения уровня провоспалительных цитокинов. При пилотном исследовании содержания Т-регуляторных клеток установлено, что ККМ тормозят процессы активации иммунной реактивности при СД I типа и это происходит за счет повышения содержания клеток с супрессивными свойствами. Впервые высказано предположение, что корригирующий эффект клеточной терапии аутологичными ККМ является результатом коррекции и восстановления иммунного баланса в организме за счет восстановления морфофункциональной активности центральных органов иммуногенеза и активации процессов как центральной, так и периферической толерантности.

Практическая значимость работы

Разработана иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа у крыс, на которой были изучены иммунные механизмы развития данного заболевания; показана связь их развития с торможением процессов репаративной регенерации органов иммуногенеза, а также изучены условия и показана возможность коррекции нарушений, возникающих при аутоиммунном СД I типа, методами клеточной терапии.

Показано, что для осуществления эффективной терапии СД I типа необходимо осуществить иммунокоррекцию в организме с помощью тканевых регуляторных пептидов, выделяемых ККМ для индукции иммунной толерантности и активации процессов репаративной регенерации поврежденных органов. Установлено, что клеточную терапию культивированными аутологичными ККМ целесообразно использовать как на начальной стадии, так и на стадии развернутых клинических проявлений СД I типа, но особенно клеточная терапия показана на начальной стадии заболевания, то есть на этапе сохранения в организме резервов восстановительной регенерации как островкового аппарата, так и органов иммуногенеза, способствующих поддержанию процессов толерантности.

Установлена необходимость предварительного культивирования аутологичных ККМ для восстановления их исходно нарушенной биорегуляторной (иммунорегуляторной) активности. Показано, что эффективность трансплантации ККМ для коррекции патогенетических нарушений при СД I типа зависит от суммарной дозы (кратности введения) клеток. а также от стадии развития заболевания.

Показано, что наиболее выраженный эффект коррекции клинических, иммунологических и морфологических нарушений в организме животных с аутоиммунным СД I типа наблюдается при многократной трансплантации ККМ на начальной стадии развития заболевания. Однократная трансплантация ККМ как на начальной стадии, так и на стадии развернутых клинических проявлений СД I типа и многократная трансплантация ККМ на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа снижают темпы развития необратимых нарушений во внутренних органах и потому являются целесообразной процедурой в комплексной терапии аутоиммунного СД I типа.

Положения выносимые на защиту

  1. Разработанная иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа является адекватной экспериментальной моделью, так как воспроизводит клинические, иммунологические и морфологические нарушения в организме, свойственные данному заболеванию. Эта модель может быть использована для оценки эффективности новых способов коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа, в том числе при трансплантации аутологичных ККМ.
  2. Предварительное культивирование мононуклеарных и стромальных клеток аутологичного костного мозга in vitro является важным этапом подготовки их к проведению клеточной терапии аутоиммунного СД I типа, так как позволяет устранить иммунодизрегуляторное влияние на них хронического патологического (аутоиммунного) процесса и восстановить их биорегуляторную активность.
  3. Эффективность коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа путем трансплантации аутологичных ККМ зависит от суммарной дозы (кратности введения) клеток, а также от стадии развития заболевания.
  4. Наиболее выраженный клинический эффект, характеризующийся длительной нормализацией уровня гликемии, устранением иммунной дизрегуляции в организме и активацией процессов репаративной регенерации в островковой ткани поджелудочной железы и других органах наступает при многократной трансплантации аутологичных ККМ на начальной стадии развития аутоиммунного СД I типа.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 29 сентября 2010г. на заседании объединённой межлабораторной научной конференции ФГУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.

Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на IX Съезде научного общества гастроэнтерологов России (г. Москва, 2-5 марта 2009 г.); на Конференции «Клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии» (г. Москва, 2009 г.); на Всероссийской конференции «Клеточные исследования и технологии в современной биомедицине» (г. Тула, 9-10 ноября 2009 г.); на V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-10 октября 2010 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 в центральных рецензируемых журналах. По теме диссертации получен патент на изобретение №2400822 «Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс» от 27.09.2010.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 144 страницах печатного текста. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), характеристик материала и методов исследования (глава II), результатов собственных исследований (глава III и IV), обсуждения полученных результатов (глава V), выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы (185 источников, из них 16 - отечественных и 169 - зарубежных). Работа иллюстрирована 41 рисунком и 10 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Характеристика экспериментального материала. Для решения поставленных задач работа поводилась по трем основным направлениям - по пути создания адекватной модели аутоиммунного СД I типа на генетически не предрасположенных животных и изучения динамики патофизиологических изменений в состоянии этих животных; по пути отработки протокола получения и применения клеточных технологий и по пути изучения эффективности коррекции клинических и морфологических проявлений СД I типа с помощью аутологичных ККМ.

Вся эта работа была выполнена на 365 экспериментальных животных, из которых 345 - крысы породы Wistar и 20 - трансгенные мыши линии B10.GFP. Все экспериментальные животные содержались в условиях свободного доступа к воде и пище на рационном питании, соответствующем нормативам ГОСТа. Все исследования проводились в лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГУ «ФНЦТИО имени ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ. Распределение животных по разделам экспериментальной работы представлено в таблице 1.

В I разделе работы отрабатывалась технология моделирования аутоиммунного СД I типа, а также были получены биохимические, морфологические и патофизиологические доказательства создания адекватной иммунопатологической модели аутоиммунного СД I типа. Во II разделе работы отрабатывалась технология получения первичных культур мононуклеарных клеток (МНК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга (КМ) и устанавливались сроки их прекультивирования. Срок формирования монослоя при культивировании ММСК КМ от животных с аутоиммунным СД I типа рассматривался как оптимальный срок для культивирования ММСК; была установлена пригодность использования флуоресцирующих ККМ от трансгенных мышей В10.GFP с геном зеленого белка для маркировки введенных в организм клеток; установлены сроки пребывания меченых клеток в организме в жизнеспособном состоянии. В III разделе работы были получены и изучены терапевтические эффекты трансплантации аутологичных ККМ (мононуклеарной и стромальной фракций) при аутоиммунном СД I типа у крыс.

Табл. 1. Распределение животных по разделам экспериментальной работы

Раздел работы Выполненные исследования Вид животных Кол-во жив-ых
I. Моделирование аутоиммунного СД I типа Патофизиологическая характеристика аутоиммунной модели СД I типа и изучение иммунозависимых механизмов ее формирования Крысы Wistar 150
Выполнение адоптивного переноса аутоиммунного СД I типа интактным животным Крысы Wistar 15
II. Отработка техники применения клеточных технологий в эксперименте Отработка технологии выделения различных фракций ККМ и их культивирования Крысы Wistar Мыши B10.GFP 20 10
Определение сроков формирования монослоя ММСК КМ при культивировании от животных с аутоиммунным СД I типа Крысы Wistar 10
Идентификация ККМ от трансгенных мышей, содержащих ген GFP, в культуре и в органах после трансплантации Мыши B10.GFP 10
III. Исследование эффекта трансплантации аутологичных ККМ (мононуклеарной и мультипотентной мезенхимальной стромальной фракций) при аутоиммунном СД I типа Однократное получение и трансплантация двух фракций аутологичных ККМ на начальной стадии развития аутоиммунного СД I типа Крысы Wistar 25
Однократное получение и трансплантация двух фракций аутологичных ККМ на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа Крысы Wistar 25
Трехкратное получение и трансплантация двух фракций аутологичных ККМ на начальной стадии развития аутоиммунного СД I типа Крысы Wistar 25
Трехкратное получение и трансплантация двух фракций аутологичных ККМ на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа Крысы Wistar 25
Контроль Крысы Wistar 50
Итого: 365

В III разделе работы было выполнено 4 серии опытов с внутривенным (в хвостовую вену) введением ККМ. В 1ой серии опытов забор ККМ производили однократно через 7 суток после окончания моделирования СД I типа (на начальной стадии заболевания). Из полученной порции ККМ выделяли две фракции клеток, которые вводили последовательно: МНК КМ – после 4 суток культивирования в количестве 6х106 клеток, а ММСК КМ после 12 суток культивирования в количестве 4х106 клеток. Во 2ой серии опытов забор ККМ также производили однократно, но через 30 суток после окончания моделирования СД I типа (на стадии развернутых клинических проявлений заболевания). Выделенные из полученной порции ККМ две фракции клеток также вводили последовательно после культивирования в суммарной дозе 10х106 клеток. В 3ей серии опытов забор ККМ производили трехкратно через 7, 21 и 35 суток после окончания моделирования СД I типа (начальная стадия заболевания). Выделенные из каждой порции ККМ две фракции клеток вводили последовательно: МНК КМ – после 4 суток культивирования в количестве 6х106 клеток, а ММСК КМ после 12 суток культивирования в количестве 4х106 клеток. Суммарная доза вводимых клеток в этой серии составила – МНК КМ - 18х106, ММСК КМ - 12х106 клеток на одно животное. В 4ой серии опытов забор ККМ также производили трехкратно, но через 30, 44 и 58 суток после окончания моделирования СД I типа (стадия развернутых клинических проявлений заболевания). Выделенные из каждой порции ККМ две фракции клеток также вводили последовательно после культивирования в суммарной дозе 30х106 клеток на одно животное.

Технология выполнения культуральных исследований

Получение и ведение культур МНК КМ. Мононуклеарную фракцию клеток получали из аспирата КМ животных. Для этого под эфирным наркозом из костномозгового канала большеберцовых костей получали ККМ путем промывания полости этих костей фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ЕД/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию ККМ центрифугировали при 1500 об/мин 3-5 минут, осадок клеток ресуспендировали в растворе для лизиса эритроцитов (114 мМ NH4Cl, 7,5 мМ КНСО3, 100 мкМ EDTA) в течение 5 мин и повторно центрифугировали. Гемолизированный супернатант удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в питательной ростовой среде DMEM («Панэко»), содержащей 25мМ HEPES, 0,58 г/л глютамина, 100мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки («HyClone», USA), 5 мкг/л инсулина. Эти клетки представляли собой преимущественно МНК КМ, которые затем высаживали на чашки Петри в количестве 2,0-2,5 млн. кл/мл и культивировали при 37С в СО2-инкубаторе, в атмосфере воздуха с 5% СО2 и 95% влажности с целью очистки и повышения функциональной и биорегуляторной активности этих клеток. Через 4 суток культура ККМ содержала до 50% округлых не прикрепившихся МНК и до 50% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных клеток ММСК КМ. Не прикрепившиеся к пластику клетки отбирали и затем использовали в опытах на животных для трансплантации как очищенную от стромальных (пластикадгезивных) клеток мононуклеарную фракцию ККМ. Полученная культура МНК КМ содержала 80,2±9,6% лимфоцитов, 18,7±1,3% моноцитов и 1,1±1,4% гранулоцитов (при окраске по Романовскому-Гимзэ), а также 2,5±0,3% CD34+/CD45+ клеток (по данным проточной цитофлуометрии с использованием крысиных моноклональных АТ фирмы «Abcam», США).

Получение и ведение культур ММСК КМ. Получение аспирата ККМ, его обработку лизирующим раствором, отмывание, центрифугирование и посев на культуральный пластик в питательной ростовой среде DMEM описано выше. Далее через 4 суток не прикрепившиеся клетки отбирали, а к оставшимся пластикадгезивным клеткам в ростовую среду добавляли основной фактор роста фибробластов (bFGF) («Sigma», USA) 20 нг/мл для стимуляции пролиферативной активности ММСК КМ. Культивирование ММСК производилось в течение 12 суток с заменой ростовой среды через каждые 3 суток. На 12 сутки культивирования на чашках Петри возникали колонии ММСК с фибробластоподобной морфологией, образующие примерно 80-90% монослой (колонии ММСК от интактных животных образуют 90% монослой на 9 сутки культивирования). Данный клеточный материал, представляющий собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки (ММСК), был признан пригодным для трансплантации, так как сохранял популяционную активность и не содержал погибшие клетки. Гомогенность культуры ММСК КМ подтверждена иммуногистохимически путем выявления коллагена I типа с помощью кроличьих моноклональных АТ («Имтэк»).

Техника моделирования аутоиммунного СД I типа. Аутоиммунный СД I типа моделировали по разработанной нами технологии путем попеременного введения субдиабетогенных (малотоксичных) доз стрептозотоцина (STZ) и адъюванта Фрейнда. STZ вводили внутрибрюшинно трехкратно с интервалом в 7 суток. При этом во время первого введения количество STZ определяли из расчета 25 мг/кг массы тела животного; во время второго введения - 20 мг/кг; во время третьего введения - 25 мг/кг. При этом каждое введение STZ осуществляли после 12 часов голодания, а за сутки перед каждым введением STZ для неспецифической активации иммунной системы животным внутрибрюшинно вводили 1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Общий срок моделирования аутоиммунного СД I типа составил 14 суток.

Методы исследования

В работе применен комплекс клинических, биохимических, морфологических и иммунологических методов исследования. Общий объем специализированных исследований, выполненных в динамике при проведении работы, представлен в таблице 2. Кроме того у всех животных экспериментальных серий опытов еженедельно определялся уровень глюкозы в периферической крови и производилось взвешивание животных.

Табл. 2. Количество выполненных специализированных исследований

Методы исследования Количество исследований
Морфологические исследования Гистологическое исследование: ПЖ Тимуса Селезенки Почки 80 35 35 35
Морфометрическое исследование: ПЖ Тимус Селезенки 30 20 20
Иммуногистохимические исследования: С использованием АТ к инсулину С использованием АТ к PCNA С использованием АТ к CD3, CD8, СD45R, СD20 и CD79 20 20 20
Иммуноферментный анализ Определение провоспалительных цитокинов: TNF, IL-1, IFN 95
Проточная цитофлуометрия Определение количества CD4CD25Foxp3 Treg-клеток 10
Флуоресцентная микроскопия Идентификация трансплантированных ККМ от мышей линии B10.GFP 20
Итого: 440

Биохимическое исследование крови. Содержание глюкозы в периферической крови измеряли натощак еженедельно с помощью прибора «One Touch Ultra» (“Life Scan”, “Johnson and Johnson”, США) через 12 часов после последнего приема пищи.

Морфологическое исследование органов

Гистологические и гистохимические методы исследования. Изучение структурных нарушений в паренхиме внутренних органов проводили морфологическими методами. Для этого после 12-часового голодания животных декапитировали под эфирным наркозом, извлекали поджелудочную железу, которую затем фиксировали в растворе Буэна. Состояние ОЛ ПЖ и их функциональную активность оценивали на срезах ПЖ, окрашенных гематоксилином и эозином. Тимус, селезёнку и почки каждого животного фиксировали в 10% формалине, затем готовили парафиновые срезы и окрашивали гематоксилином и эозином для последующего выявления и оценки степени тяжести структурных нарушений в органах.

Морфометричексое исследование ткани ПЖ, тимуса и селезенки. Материал для исследования ПЖ был взят из средней части тела ПЖ и морфометрические исследования проводили с учетом всех обнаруженных ОЛ в поле зрения (от 0 до 30). Проводили подсчет средней площади ОЛ, среднего количества клеток в островках ОЛ. В селезенке осуществляли измерение средней площади лимфоидных фолликулов. В тимусе рассчитывали процентное соотношение объемной плотности коркового и мозгового слоев. Эти расчеты проводили под микроскопом фирмы "NIKON" (Япония) при увеличении х200 в микрометрах (mkm2) на компьютере с использованием программы «–Морфология», фирма «Телемедсистема».

Методы иммуногистохимического исследования. Для иммунногистохимического (ИГХ) выявления пролиферативной активности клеток островковой части ПЖ и степени ее выраженности был применен иммунопероксидазный метод с АТ (фирмы «DAKO», Дания) на маркер репликации ДНК PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Фазово-контрастную микроскопию материала проводили на микроскопе фирмы "NIKON" (Япония). Для фотографирования использовали цифровой фотоаппарат фирмы "OLYMPUS" (Япония). Интенсивность ИГХ реакции оценивали визуально под микроскопом. Индекс пролиферации клеток с помощью PCNA вычисляли как среднее число меченых ядер на 100 учтенных ядер. Подсчет меченых ядер проводили в репрезентативных полях зрения (100) с относительно равномерным распределением клеток инфильтрата, сверху вниз и слева направо. Для ИГХ определения инсулинпродуцирующих клеток в эндокринной части ПЖ использовали мышиные моноклональные АТ к инсулину фирмы «DAKO», Дания. С целью иммунофенотипирования клеток воспалительного инфильтрата в ткани ПЖ использовали набор мышиных моноклональных и поликлональных антител к CD3, CD8, СD45R, СD20 и CD79 (фирма «DAKO», Дания). Положительное цитоплазмотическое окрашивание соответствующими АТ оценивали полуколичественным методом по степени выраженности - от слабой (несколько положительно окрашенных клеток), что было оценено нами как «+», до выраженной (тотальное положительное цитоплазматическое окрашивание клеток) – «+++».

Исследование цитокинового статуса в сыворотке крови. Для подтверждения зависимости процессов восстановительной регенерации и аутоиммунной деструкции от состояния иммунного баланса в организме, маркерами которого являются цитокины, в работе оценивали содержание провоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных. Содержание в сыворотке крови животных провоспалительных цитокинов (TNF-, IL-1, IFN-) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест систем «Diamed» (Швейцария).

Определение содержания Т-регуляторных клеток в периферической крови. Для определения содержания Т-регуляторных клеток в периферической крови лимфоциты крыс метили крысиными антителами к CD4, CD25 и Foxp3 фирмы «eBioscience» США и проводили подсчет концентрации Т-регуляторных клеток на проточном цитофлуориметре фирмы «Beckman Coulter» США.

Определение жизнеспособности клеток в культуре. Жизнеспособность культивированных МНК и ММСК КМ определяли перед трансплантацией по окраске трипановым синим. Жизнеспособность клеток перед трансплантацией составляла 95±2%.

Методы идентификации трансплантированных ККМ в культуре и в органах реципиента. Для идентификации трансплантируемых клеток в качестве доноров клеток были использованы трансгенные мыши линии B10.GFP, в ядрах клеток которых содержится ген, продуцирующий белок с зеленой флуоресценцией. Фазово-контрастную и флуоресцентную микроскопию клеточного материала и криосрезы внутренних органов доноров и реципиентов проводили на микроскопе фирмы «NIKON» (Япония). Флуоресцентную микроскопию проводили с использованием ультрафиолетового излучения с длиной волны 390 нм. Для фотографирования использовали цифровой фотоаппарат фирмы «OLYMPUS» (Япония).

Методы статистической обработки. Статистическую обработку результатов производили на персональном компьютере с использованием специального статистического пакета Biostat; достоверность различий между сравниваемыми группами оценивали по критерию t - Стьюдента c учетом поправки Бонферонни. В таблицах приведены средние значения величин, где ± стандартное отклонение (SD). Различия считали достоверными при р <0,05 (Статистический пакет рекомендованный ВОЗ Epi Info 5.0).

Считаю необходимым отметить, что отработка отдельных этапов работы проводилась совместно и при непосредственном участии врача отделения коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ А.Р. Закирьянова, сотрудников лаборатории биотехнологии стволовых клеток ФГУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ (зав. лаб. - д.м.н., профессор Н.А. Онищенко), ассистента кафедры патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития РФ О.В. Барановой, сотрудников лаборатории патоморфологии ГУ «НИИ ОПП» РАМН (зав. лаб. - член-корр. РАМН, профессор О.М. Поздняков), а также сотрудников вивария ФГУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ (зав. виварием - П.В. Аврамов). Всем им выражаю свою сердечную благодарность за помощь в работе.

Результаты исследования

Для оценки терапевтических возможностей трансплантации аутологичных ККМ и пригодности их для коррекции патогенетических нарушений при аутоиммунном СД I типа нами была разработана аутоиммунная модель этого заболевания. Известные модели аутоиммунного СД I типа, которые были созданы у генетически предрасположенных животных: у крыс линии ВВ (BioBreeding) и у мышей линии NOD (Non-Obese Diabetic) были отклонены нами вследствие того, что генетические модели СД I типа дают искаженное представление о регенерации островковой ткани ПЖ вследствие измененного реагирования адаптивных и компенсаторных систем организма. Экспериментальные модели на генетически не предрасположенных животных, в основе которых лежит химически индуцированный СД с помощью введения стрептозотоцина (однократно в дозе 65 мг/кг) или аллоксана (однократно в дозе 80-100 мг/кг) также имеют свои недостатки [Arai T. et al., 1996; Babaya N. et al., 2005; Hosokawa M. et al., 2001], в частности STZ, повреждая -клетки ПЖ, индуцирует фиброзирующую регенерацию ПЖ без развития аутоиммунного повреждения. В связи с указанными обстоятельствами свою работу мы начали с разработки и создания новой модели аутоиммунного СД I типа у крыс не предрасположенных к развитию СД I типа.

Для обоснования адекватности разработанной нами модели аутоиммунного СД I типа, для выявления патогенетических и патофизиологических нарушений, протекающих на местном и системном уровнях при моделировании СД I типа на генетически не предрасположенных животных нами было использовано 150 животных (крысы-самцы породы Wistar). При исследовании показателей углеводного обмена у животных с аутоиммунной моделью СД I типа нами было отмечено достоверное увеличение уровня глюкозы уже через 3-4 дня после последнего введения STZ. К концу третьей недели после последнего введения STZ уровень глюкозы был равен 18-20 ммол/л. В дальнейшем происходило нарастание и стабилизация уровня глюкозы, достоверно сохраняющаяся в течение 5-6 месяцев (Табл. 3). Клинически отмечалась полиурия, полидипсия и достоверное снижение массы тела животных по сравнению с контролем.

Табл. 3. Динамика изменения показателей уровня глюкозы и массы тела у крыс с аутоиммунным СД I типа

Сутки после окончания моделирования СД I типа уровень глюкозы (ммоль/л) масса тела
30-е 60-е 90-е 30-е 60-е 90-е
Норма 5,2±0,6 5,5±0,8 5,6±1,2 331±32 372±36 424±38
аутоиммунный СД I типа 18,4±4,6* 21,6±4,3* 23,9±4,7* 265±45 243±42* 234±47*

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей нормы (интактные крысы)

Стабильно высокий уровень глюкозы в крови свидетельствовал о развитии выраженных структурных нарушений в эндокринной части ПЖ. При гистологическом исследовании нами была обнаружена выраженная воспалительная инфильтрация ОЛ, с замещением воспалительными элементами большей их части. Сами же островки были без четких границ с явлениями выраженного отека межклеточного вещества и гидропической дистрофией -клеток. Отмечались признаки тотального некроза клеток в ОЛ, окруженных клетками воспалительного инфильтрата. При морфометрическом исследовании ПЖ отмечено достоверное уменьшение площади ОЛ ПЖ и количества в них клеток (Табл. 4), причем гибель ОЛ происходила на фоне глубокой иммунной дизрегуляции в организме. Так в селезенке крыс при СД I типа отмечались явления прогрессирующей гипоплазии. Площадь лимфоидных фолликулов селезенки была достоверно снижена более чем в два раза по сравнению со здоровыми животными.

Табл. 4. Морфометрическая характеристика ПЖ и селезенки здоровых крыс и крыс с аутоиммунным СД I типа (через 4 мес после окончания моделирования СД I типа)

Норма Аутоиммунный СД I типа
Площадь ОЛ ПЖ (мкм2) 64152,7±490 11318,8±738*
Количество клеток в ОЛ ПЖ 226±40 81±27*
Площадь фолликулов селезенки (мкм2) 77348,8±513 30693,8±1047,2*

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей нормы (интактные крысы)

Лимфоидные фолликулы селезенки были с явлениями гипоплазии и атрофии, в большинстве наблюдений фолликулы не имели центров размножения. Подтверждением развития иммунного дисбаланса в организме служат результаты динамического измерения содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс. На разных сроках после окончания моделирования СД I типа происходило достоверное повышение концентрации провоспалительных цитокинов (IL-1, IFN-, TNF-) по сравнению с интактными животными.

Для подтверждения аутоиммунных механизмов развивающегося инсулита нами было проведено определение иммунофенотипической принадлежности клеток воспалительного инфильтрата ОЛ с помощью набора моноклональных АТ к различным популяциям Т- и В-клеток. Анализ результатов проведенного иммуногистохимического исследования показал, что в ОЛ ПЖ крыс с аутоиммунным СД I типа среди клеток инфильтрата преобладают Т-клетки, особенно CD8 цитотоксические лимфоциты, а экспрессия В-клеточных маркеров отсутствовала или имела слабо выраженный характер.

Еще одним доказательством аутоиммунной природы разработанной иммунопатологической модели СД I типа служат результаты внутривенного адоптивного переноса лимфоцитов селезенки от животных с аутоиммунным СД I типа (на 40-ые сутки эксперимента) интактным крысам и индукция у них аутоиммунного СД I типа. Оказалось что у интактных животных уже через 2-3 недели после адоптивного переноса спленоцитов происходило повышение уровня глюкозы в крови и наступало развитие клиники СД. Через 4 месяца клинические и морфологические показатели у этих крыс имели достоверные отличия от показателей здоровых животных, а уровень глюкозы был стабильно повышен (Табл. 5).

Табл. 5. Клинические и морфологические показатели исходно здоровых крыс после адоптивного переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД I типа (через 4 месяца).

Показатели Результат адоптивного переноса спленоцитов от крыс с аутоиммунным СД I типа Аутоиммунный СД I типа (контроль) Норма
Уровень глюкозы (ммоль/л) 14,8±3,9* 24,4±4,8* 6,2±1,2
Масса тела (г) 321±24* 233±18* 439±20
Площадь ОЛ ПЖ (мкм2) 33247,2±895* 11318,8±738* 64152,7±490
Количество клеток в ОЛ ПЖ 144±36 81±27* 226±40

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей нормы (интактные крысы)

При морфологическом исследовании имели место признаки воспалительной инфильтрации ОЛ иммунными клетками с последующими дистрофическими изменениями ОЛ ПЖ, что подтвердило специфическую аутоиммунную природу индуцированного нами СД I типа.

При морфологическом исследовании почек животных с аутоиммунным СД I типа были выявлены выраженные изменения. Эпителий дистальных и проксимальных канальцев местами был с явлениями атрофии, местами с признаками белковой и жировой дистрофии, набухший, просветы канальцев несколько расширены, заполнены эозинофильными и PAS-положительными массами. В строме отмечались явления выраженного полнокровия сосудов всех калибров, мелкие диапедезные кровоизлияния.

Описанные выше результаты позволяют признать созданную нами модель - адекватной аутоиммунной моделью СД I типа на не предрасположенных животных. Модель СД I типа является устойчивой и максимально приближенной к клинике и потому была использована для поиска и оценки эффективности новых способов лечения данного заболевания, в том числе для оценки терапевтических эффектов трансплантации аутологичных ККМ.

Приступая к оценке эффективности корригирующей терапии аутологичными ККМ при аутоиммунном СД I типа нам необходимо было прежде всего обеспечить применение ККМ с высокой иммунорегуляторной активностью. Это было особенно важным при использовании аутологичных ККМ, у которых в условиях патологической ауторегуляции, сложившейся при СД I типа, ингибируется популяционная и миграционную активность, а поэтому они снижают или даже утрачивают свои терапевтические регулирующие функции. Для восстановления иммунорегулирующих функций полученные ККМ больного животного подвергали предварительному культивированию in vitro в культуральных питательных средах. О восстановлении исходно сниженной биорегуляторной активности ККМ крыс с СД I типа в процессе культивирования судили по изменению популяционной активности этих клеток (по скорости образования монослоя клеток в культуре). Проведенное нами культивирование аутологичных ККМ (ММСК) показало, что достижение ими монослоя происходит на 12-13 сутки, тогда как при культивировании клеток от здоровых животных – на 9-10 сутки. Эти данные с одной стороны подтверждают исходно сниженную иммунорегуляторную активность ММСК КМ от животных с аутоиммунным СД I типа, а с другой стороны показывают, что к 12-13 суткам происходит ее восстановление, поэтому именно этот срок был использован нами при культивировании этих клеток перед применением.

Для контроля эффективности ККМ необходимо также иметь представление о длительности их пребывания в биоактивном состоянии в организме после трансплантации. Для идентификации трансплантируемых ККМ в тканях реципиента в качестве доноров клеток были использованы трансгенные мыши линии B10.GFP с геном зеленого белка. Наше исследование показало, что через 60 суток после трансплантации ККМ введенные клетки присутствуют в разных органах (ПЖ, селезенке, почках) и не погибают, а сохраняют свою жизнеспособность, что позволило связать возникающие в этих органах изменения (морфологические и функциональные) со стимуляцией в этих органах процессов адаптации, компенсации и восстановительной регенерации.

При выборе адекватного способа клеточной терапии СД I типа нам было необходимо определить эффективные дозы (кратность введения) ККМ, а также определить ту стадию болезни, на которой коррекция патогенетических нарушений СД I типа является наиболее эффективной. Наше исследование показало, что после однократного введения двух фракций ККМ как на начальной (серия №1), так и на стадии развернутых клинических проявлений заболевания (серия №2) отмечается некоторая положительная динамика изменения уровня глюкозы в периферической крови, причем в первой серии на раннем сроке введения клеток она была более выраженной (Табл. 6). Однако добиться стойкого и продолжительного эффекта снижения уровня глюкозы с помощью однократного введения аутологичных ККМ нам не удалось.

Табл. 6. Средние показатели уровня глюкозы у крыс через 30, 60 и 90 суток после однократного введения двух фракций ККМ на начальной стадии (Серия №1) и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа (Серия №2)

Серии опытов Уровень глюкозы (ммоль/л)
30 суток 60 суток 90 суток
Серия № 1 15,5±3,3* 19,1±4,2 21,2±4,7
Серия № 2 20,6±3,9 24,1±4,6 24,7±4,3
Аутоиммунный СД I типа 24,7±4,3 24,9±4,8 25,5±4,6
Норма 5,5±0,84 5,7±0,75 5,9±0,93

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей контроля (аутоиммунный СД I типа)

При гистологическом исследовании состояния ПЖ у животных с СД I типа после однократной трансплантации ККМ как на начальной, так и на стадии развернутых клинических проявлений заболевания также не были выявлены позитивные изменения. Большая часть ОЛ была неправильной формы с размытыми контурами. Количество клеток в островках было снижено, сохранные клетки располагались преимущественно по периферии островков небольшими группами, окружая большую зону некротизированной ткани, а так же располагаясь вокруг центральной зоны отечной межклеточной стромы островка. Сохранялись признаки незначительной лимфоидной инфильтрации в периферических участках, местами инфильтрация носила выраженный характер. При морфометрическом исследовании ПЖ и селезенки крыс с СД I типа после однократного введения ККМ нами не было выявлено достоверных отличий от контроля.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что несмотря на определенные положительные изменения однократная трансплантация ККМ как на начальной, так и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа является недостаточной для достижения выраженного и пролонгированного терапевтического эффекта. Исходя из этого мы предположили, что повышение дозы (кратности введения) клеток при многократной трансплантации ККМ как на начальной, так и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа может усилить эффективность клеточной терапии и позволит добиться устранения иммунной дизрегуляции в организме, а также достигнуть активации процессов репаративной регенерации в островковой ткани ПЖ.

В сериях опытов с многократной трансплантацией ККМ нами была отмечена более стабильная и продолжительная положительная динамика показателей веса и уровня глюкозы в крови, чем в опытах с однократной трансплантацией ККМ. Между тем выраженность клеточной терапии на начальной (серия №3) и на стадии развернутых клинических проявлений заболевания (серия №4) была неодинакова. Наилучшие показатели коррекции уровня глюкозы в крови у животных были получены при многократной трансплантации клеток на начальной стадии развития СД I типа (Табл. 7).

Табл. 7. Средние показатели уровня глюкозы у крыс через 30, 60 и 90 суток после многократного введением двух фракций ККМ на начальной стадии (Серия №3) и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа (Серия №4)

Серии опытов Уровень глюкозы (ммоль/л)
30 суток 60 суток 90 суток
Серия №3 8,6±3,8*) ^) 8,8±4,6*) ^) 10,3±4,8*
Серия №4 13,3±4,4* 14,1±4,3* 14,8±4,6*
Аутоиммунный СД I типа 24,7±3,7 24,9±4,2 25,5±3,8
Норма 5,5±0,84 5,7±0,75 5,9±0,93

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей контроля (аутоиммунный СД I типа)

^) р>0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей нормы (интактные крысы)

При гистологическом исследовании ПЖ животных после многократной трансплантации ККМ на начальной стадии заболевания была выявлена достоверно положительная динамика. Границы островков были четкими, признаков лимфоидной инфильтрации ОЛ не отмечалось. Количество клеток, а также расположение их в островках варьировало: часть островков была клеточного вида, а часть с признаками отека межклеточной стромы и диффузным расположением сниженного количества клеток. Среди ацинарных структур были обнаружены группы по 4-6 мелких клеток с базофильной цитоплазмой, подобно -клеткам, что, вероятнее всего, свидетельствовало о формировании «новых» регенераторных островков. Аналогичные скопления базофильных клеток были найдены и вокруг вставочных и выводных протоков. Подобных скоплений клеток в серии диабетического контроля нами обнаружено не было.

У животных с многократной трансплантацией ККМ на начальной стадии заболевания иммуногистохимически выявлялись инсулинпродуцирующие (АТ к инсулину) и активно пролиферирующие (АТ к PCNA) клетки в островках различного размера. -клетки занимали центральные отделы островков, располагались плотными скоплениями среди несколько отечной стромы. Также мы отмечали наличие положительно окрашенных клеток среди ацинусов экзокринной части в виде очень мелких групповых скоплений (от 2-х до 5-и клеток), часть новообразованных мелких островков располагалась вблизи протоков ПЖ, что объясняло нормализацию показателей клинического состояния животных с СД I типа.

При морфометрическом исследовании ПЖ животных с многократной трансплантацией ККМ на начальной стадии развития СД I типа отмечено достоверное увеличение как площади ОЛ, так и количества в них клеток. При морфометрическом исследовании тимуса отмечено достоверное расширение коркового слоя, при исследовании селезенки отмечено достоверное увеличение площади лимфоидных фолликулов. Эти данные подтверждают, что ККМ стимулируют восстановление иммунного баланса в организме и что это восстановление проходит через фазу гиперактивации функции центральных и периферических органов иммуногенеза (Табл. 8).

При морфологическом исследовании селезенки отмечалась выраженная гиперплазия лимфоидной ткани, что проявилось в образовании лимфоидных фолликулов среднего и крупного размера, с относительно четкими границами и большими центрами размножения. Явления выраженной пролиферации клеток фолликулов были подтверждены при иммуногистохимическом исследовании с использованием АТ к PCNA. Положительное ядерное окрашивание клеток центральных отделов лимфоидных фолликулов в зонах размножения свидетельствовало о пролиферации спленоцитов в селезенке.

Табл. 8. Морфометрическая характеристика ПЖ, селезенки и тимуса крыс через 30 суток после многократного введения двух фракций ККМ на начальной стадии и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа.


Многократное введение суммы фракций ККМ Аутоиммунный СД I типа Норма
на начальной стадии на стадии развернутых клинических проявлений
Площадь ОЛ ПЖ (мкм2) 44284,01 ±1756*)^) 31078,4 ±1852* 11318,8±738 64152,7 ±490
Количество клеток в ОЛ ПЖ 142±23* 126±28 81±27 226±40
Площадь фолликулов селезенки (мкм2) 107527,6 ±21129,7* 83639,2 ±18753,2* 30693,8 ±1047,2 77348,8 ±513
Объемная плотность зон тимуса (%) Корковый слой 70,2±14,0* 39,0±7,8 52,29 ±2,59
Мозговой слой 29,2±5,8* 63,5±12,7 47,71 ±2,29
Индекс соотношения коркового к мозговому 2,3±0,46* 0,61±0,12 1,096±0,07

где *) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей контроля (аутоиммунный СД I типа)

^) р<0,05 по сравнению со значениями аналогичных показателей в серии с многократным введением двух фракций ККМ на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа.

Отражением нормализации морфофункционального состояния органов иммунной системы служит и нормализация динамики изменения профиля цитокинов в сыворотке крови животных с СД I типа после многократной трансплантации ККМ на начальной стадии заболевания. Было установлено, что под влиянием аутологичных ККМ происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов (IL-1, IFN-, TNF-).

Положительная динамика у этих животных отмечена и со стороны почек – одного из главных «органов-мишений» при СД I типа. Происходило снижение выраженности дистрофических изменений эпителия дистальных и проксимальных канальцев, исчезновение эозинофильных и PAS-положительных масс в просвете извитых канальцев и собирательных трубочек в отличие от почек животных с СД I типа.

Поскольку положительное влияние многократного введения ККМ на начальной стадии СД I типа мы связываем преимущественно с устранением иммунной дизрегуляции, снижением иммунной реактивности и индукцией иммунной толерантности в организме, то при введении ККМ мы считали необходимым изучить один из показателей развития иммунной толерантности. Нами впервые было выполнено исследование определения содержания Т-регуляторных клеток в периферической крови крыс. По его результатам отмечено, что после завершения многократной трансплантации ККМ на начальной стадии развития СД I типа происходит повышение концентрации CD4CD25Foxp3 Т-клеток в периферической крови крыс, по сравнению с животными с СД I типа (Табл. 9).

Табл. 9. Расчетные значения концентрации CD4CD25Foxp3 Т-клеток в периферической крови крыс в норме, при аутоиммунном СД I типа и в 3ей серии опытов (%)

Серии опытов Концентрация CD4CD25Foxp3 Т-клеток в периферической крови крыс (%)
Серия опытов №3 (через 30 суток после введения ККМ) 6,78
Аутоиммунный СД I типа (через 4 мес после окончания моделирования) 0,97
Норма 3,5±1,5

Таким образом, наше исследование выполненное на аутоиммунной модели СД I типа показало, что наиболее выраженный эффект коррекции патогенетических нарушений, возникающих при СД I типа, путем трансплантации ККМ наблюдается при введении достаточно больших биологически активных доз ККМ на начальной стадии развития заболевания, когда еще сохранены адаптационные резервы организма и регенерационные резервы ПЖ. Результаты нашей работы позволяют рекомендовать этот метод коррекции патогенетических нарушений при СД I типа в составе комплексной медикаментозной терапии на начальных стадиях развития этого тяжелого прогрессирующего заболевания.

Выводы

  1. Созданная модель аутоиммунного СД I типа у крыс является адекватной экспериментальной моделью для изучения иммунопатологических механизмов развития аутоиммунного СД у генетически не предрасположенных животных, так как воспроизводит характерные клинические, морфологические и иммунологические изменения в организме. Созданная модель пригодна для оценки эффективности коррекции патогенетических нарушений, возникающих при данном заболевании, путем трансплантации аутологичных ККМ (мононуклеарной и стромальной фракций).
  2. Культивирование (активирование) мононуклеарной и стромальной фракций клеток аутологичного КМ ex vivo является важным этапом подготовки их к трансплантации животным с СД I типа, так как позволяет восстановить их сниженную пролиферативную и иммунорегуляторную активность, обусловленную хроническим аутоиммунным заболеванием, а также увеличить клеточную массу, необходимую для проведения эффективной клеточной терапии.
  3. Пролонгированное поддержание восстановительного морфогенеза в поврежденных органах при моделировании аутоиммунного СД I типа и введении ККМ обусловлено длительным (по крайней мере до 60 суток) сохранением жизнеспособности введенных клеток, что подтверждается маркерной люминесценцией введенных в организм реципиента ККМ, полученных от мышей B10.GFP с геном зеленого белка.
  4. Трансплантация аутологичных ККМ животным с аутоиммунным СД I типа позволяет корригировать клинические и морфологические нарушения в островковой ткани ПЖ за счет устранения предсуществующей иммунной дизрегуляции в организме.
  5. Выраженность терапевтического эффекта от применения аутологичных ККМ у крыс с аутоиммунным СД I типа находится в прямой зависимости от дозы (кратности введения) используемых ККМ, а также от срока их применения (стадии развития заболевания).
  6. Однократная трансплантация аутологичных ККМ как на начальной так и на стадии развернутых клинических проявлений аутоиммунного СД I типа, а также многократная трансплантация аутологичных ККМ на стадии развернутых клинических проявлений заболевания не сопровождаются выраженным и стабильным снижением уровня глюкозы в крови, и не сопровождаются выраженным восстановлением структуры островковой ткани ПЖ и органов иммуногенеза.
  7. Многократная трансплантация аутологичных ККМ на начальной стадии развития аутоиммунного СД I типа позволяет добиться выраженного пролонгированного и стабильного снижения уровня глюкозы в крови, индуцировать процессы восстановительной регенерации и ингибировать процессы аутоиммунной деструкции в островках Лангерганса ПЖ, существенно ослабив выраженность воспалительной инфильтрации. Это нашло отражение в увеличении количества инсулинпродуцирующих клеток и пролиферативной активности островковых клеток ПЖ, а также в индукции новообразования островков Лангерганса (скопления 4-6 -клеток), примыкающих к ацинарным протокам ПЖ.
  8. Коррекция клинических нарушений и деструктивных изменений в островковой ткани ПЖ при многократном введении ККМ на начальной стадии развития СД I типа обусловлены коррекцией иммунного гомеостаза в организме, что нашло отражение в снижении иммунной реактивности – снижение содержания провоспалительных цитокинов (IL-1, IFN-, TNF-) в крови, восстановление структурных компартментов в центральных (тимус) и периферических (селезенка) органах иммуногенеза и в индукции иммунной толерантности - повышение процентного содержания CD4CD25Foxp3 Тreg-клеток, обладающих супрессорными свойствами.
  9. Многократное введение аутологичных ККМ на начальной стадии заболевания может служить средством патогенетической терапии аутоиммунного СД I типа, и его целесообразно использовать в комплексной медикаментозной терапии на начальной стадии развития этого тяжелого прогрессирующего заболевания.

Практические рекомендации

  1. Созданная иммунопатологическая модель аутоиммунного СД I типа может быть использована в качестве адекватной модели аутоиммунного СД I типа в эксперименте для отработки новых способов лечения и профилактики этого заболевания, в том числе методами клеточной терапии.
  2. Для восстановления сниженной иммунорегуляторной активности клеток аутологичного костного мозга с хроническими аутоиммунными заболеваниями (например, с аутоиммунным СД I типа) перед трансплантацией их необходимо культивировать (активировать) - мононуклерную фракцию клеток - 4-5 суток, стромальную фракцию клеток - 12-14 суток.
  3. Для проведения терапии клетками костного мозга могут быть использованы методики выделения и культивирования ККМ отработанные в настоящем исследовании.
  4. Для эффективной коррекции патогенетических нарушений и профилактики повреждений внутренних органов, возникающих при аутоиммунном СД I типа, трансплантацию культивированных аутологичных ККМ необходимо проводить многократно уже на начальных стадиях развития заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

  1. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Поздняков О.М., Онищенко Н.А. Трансплантация клеток костного мозга и пуповинной крови как способ коррекции аутоиммунных механизмов развития сахарного диабета I типа. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2009; 2(XI): 67-74.
  2. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Кобозева Л.П., Мичунская А.Б., Клименко Е.Д., Поздняков О.М., Онищенко Н.А. Многократная трансплантация прекультивированных аутологичных клеток костного мозга индуцирует процессы восстановительной регенерации -клеток при моделировании аутоиммунного сахарного диабета. Материалы IX съезда научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. 2-5 марта 2009 г. стр. 170-171.
  3. Закирьянов А.Р., Великий Д.А., Кобозева Л.П., Мичунская А.Б., Клименко Е.Д., Поздняков О.М., Онищенко Н.А. Сравнительная характеристика экспериментальных моделей сахарного диабета с аутоиммунным и цитотоксическим компонентами. Материалы IX съезда научного общества гастроэнтерологов России, II совместной школы последипломного образования AGA и НОГР, XXXV сессии ЦНИИГ. 2-5 марта 2009 г. стр. 176-177.
  4. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Кобозева Л.П., Мичунская А.Б., Клименко Е.Д., Поздняков О.М., Онищенко Н.А. Активация процессов регенерации в поджелудочной железе и коррекция метаболических нарушений при трансплантации аутологичных клеток костного мозга на модели аутоиммунного сахарного диабета. Материалы конференции клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии. 2009 г. стр. 38-40.
  5. Закирьянов А.Р., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Великий Д.А., Казаков Э.Н., Готье С.В. Первый клинический опыт трансплантации аутологичных клеток костного мозга для коррекции метаболических нарушений у больных ишемической болезнью сердца в сочетании с сахарным диабетом II типа. Материалы конференции клеточные технологии и регенеративная медицина в хирургии и трансплантологии. 2009 г. стр. 40-41.
  6. Онищенко Н.А., Артамонов С.Д., Крашенинников М.Е., Башкина Л.В., Никольская А.О., Шагидулин М.Ю., Великий Д.А. Клетки костного мозга донора как регуляторы индукции иммунной толерантности в организме реципиента при аллогенной пересадке органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2009; 4(XI): 97-102.
  7. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А. Трансплантация прекультивированных аутологичных клеток костного мозга на разных стадиях развития аутоиммунного сахарного диабета у крыс. Материалы Всероссийской конференции клеточные исследования и технологии в современной биомедицине. Тула, 2009, стр. 39-40.
  8. Артамонов С.Д., Онищенко Н.А., Башкина Л.В., Сускова В.С., Крашенинников М.Е., Никольская А.О., Великий Д.А. Роль систем врожденного и адаптивного иммунитета в развитии деструктивного иммунного ответа организма на аллотрансплантат. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2010; 3(XII): 112-121.
  9. Артамонов С.Д., Онищенко Н.А., Башкина Л.В., Сускова В.С., Крашенинников М.Е., Никольская А.О., Великий Д.А. Система аутотолерантности и ее функционирование при трансплантации аллогенных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2010; 3(XII): 121-128.
  10. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Клименко Е.Д., Кобозева Л.П., Мичунская А.Б., Поздняков О.М. Коррекция аутоиммунных механизмов развития сахарного диабета I типа методами клеточной терапии. Вестник Российской Академии Медицинских Наук. 2010, 9: 34-42.
  11. Великий Д.А., Закирьянов А.Р., Онищенко Н.А., Поздняков О.М., Клименко Е.Д., Кобозева Л.П., Мичунская А.Б. Многократная трансплантация прекультивированных аутологичных клеток костного мозга на разных стадиях аутоиммунного сахарного диабета у крыс. Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов. 8-10 октября 2010 г. стр. 254-255.
  12. Артамонов С.Д., Великий Д.А., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Башкина Л.В., Никольская А.О. Принципы выработки устойчивой толерантности после аллогенной пересадки органа с помощью дендритных клеток, выделенных из костного мозга донора. Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов. 8-10 октября 2010 г. стр. 289-290.

Патент:

Закирьянов А.Р., Великий Д.А., Онищенко Н.А., Клименко Е.Д., Поздняков О.М. Патент на изобретение №2400822 «Способ моделирования сахарного диабета I типа у крыс» от 27.09.2010.



 




<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.