Особенности течения постоперационного периода и роль противомикробн ы х пептидов и интерлейкина-17 в раневом процессе при хирургическом лечении больных первичной открытоугольной глаукомой

на правах рукописи

Дугина Алевтина Евгеньевна

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ПОСТОПЕРАЦИОННОГО ПЕРИОДА И РОЛЬ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИНТЕРЛЕЙКИНА-17 В РАНЕВОМ ПРОЦЕССЕ ПРИ ХИРУРГИЧЕСКОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ПЕРВИЧНОЙ открытоугольной ГЛАУКОМОЙ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

14.01.07 - глазные болезни

М о с к в а – 2010

Диссертационная работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте глазных болезней РАМН и ГОУ ВПО Российском Государственном Медицинском Университете Росздрава.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Еричев Валерий Петрович

доктор медицинских наук, профессор Ганковская Людмила Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Либман Елена Соломоновна

доктор медицинских наук, профессор Луцевич Екатерина Эммануиловна

Ведущая организация: ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии»

Защита состоится «27» сентября 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 001.040.01 в НИИГБ РАМН по адресу: 119021, Москва, ул. Россолимо, д. 11 «А-Б».

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке НИИГБ РАМН.

Автореферат разослан «____» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук, Макашова Надежда Васильевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Глаукома занимает лидирующее место среди причин необратимой потери зрения в мире. По прогнозам ученых, к 2030 году число больных глаукомой в мире удвоится и превысит 80 миллионов человек (Либман Е.С., 2000-2004; Quigley H.A., 1996-2008; Goldberg I., 2000-2006). Масштабы и динамика роста данной нозологии позволяют говорить не только о медицинской, но и о социальной проблеме преодоления этого недуга.

Одним из общепризнанных способов эффективного лечения глаукомы является хирургический (Еричев В.П., 1998-2003; Нестеров А.П. 1995-2008; Lerner S.F., Parrish R.K., 2003). Результат хирургического вмешательства во многом зависит от течения иммунных реакций, особенностей постоперационного периода, продолжительности и степени воспалительного ответа на операционную травму (Василенкова Л.В., 2005-2007; Лебедев О.И., 1990-2007; Ловпаче Д.Н., 2000).

Особенности воспалительных и репаративных процессов в глазу определяются иммунологической привилегированностью последнего. На течение иммунных реакций оказывают влияние множество факторов, основными из которых являются наличие гематоофтальмического барьера, недостаточность лимфатического дренажа, иммуносупрессивное влияние состава водянистой влаги (Niederkorn J.Y., Kaplan H.J., 2007; Streilein J.W., 2003; Taylor A., 2003). Кроме того, у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой (ПОУГ) выявлены выраженные нарушения нейро-гуморальных механизмов регуляции местного кровотока, дефицит кровоснабжения тканей глазного яблока, изменение реологических свойств крови, ведущие к тканевой гипоксии, а также признаки системной аутоагрессии к тканям глаза (Журавлева А.Н., 2007; Нестеров А.П., 2008; Grus F.H., Joachim S.C., 2004-2008; Sacca S.C., Izzotti A., 2007-2008; Tezel G., Wax M.B., 1998-2007).

Исследования последних лет позволяют утверждать, что существенное влияние на развитие раневого процесса на самых разных уровнях оказывают компоненты системы врожденного иммунитета (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008; Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., 2000-2008). В рамках этой системы работает недавно открытый класс иммунорегуляторных молекул – противомикробные пептиды (ПМП), которые, помимо прямого действия на различные патогенные организмы, оказывают влияние на такие клеточные реакции как продукция цитокинов, выброс гистамина тучными клетками, хемотаксис, ангиогенез и сокращение гладкомышечных клеток (Bowdish D.M., 2006, Chaly Y.V.et al., 2000, McDermott A.M, 2004; Niyonsaba F. et al., 2002-2004; Redfern R.L. et al., 2004; Schutte B.C., 2002; Yang D., 2002).

Цитокины и ПМП взаимно индуцируют синтез друг друга. В литературе представлены данные об участии IL-17 в стимулировании экспрессии гена HBD-2 на транскрипционном уровне посредством JAK-киназ и фактора NF-Kb, а также развитии провоспалительных реакций (Gaffen S.L. et al., 2006; Kao C.Y. et al., 2004; Khaw P.T. et al., 2001).

В последние годы появились единичные исследования роли ПМП в репаративных процессах переднего отрезка глаза in vitro, указывающие на их участие в стимуляции экспрессии генов коллагена I, III, VI и VIII, а также пролиферации конъюнктивальных фибробластов (Li J. et al., 2006; McDermott A.M. et al., 2001-2004). Имеются данные о существенном повышении концентрации ПМП на фоне острого (после хирургического вмешательства) и хронического (синдром сухого глаза) воспалительных процессов (Zhou L. et al., 2004; Narayanan S. et al., 2003). В то же время влияние ПМП и IL-17 на течение постоперационного периода у пациентов с ПОУГ неизвестно.

Цель работы: изучить изменения и взаимосвязь противомикробных пептидов и IL-17 в ходе раневого процесса в постоперационном периоде у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой.

Задачи работы

1. Учитывая цель работы, проанализировать частоту и характер основных причин, способных влиять на течение репаративного процесса, вызывая рубцовую блокаду вновь созданных путей оттока камерной влаги при трабекулэктомии.
2. Разработать способ клинико-функциональной характеристики фильтрационных подушек.
3. Определить концентрацию нейтрофильных пептидов (HNP 1-3) в слезной жидкости и камерной влаге у пациентов с ПОУГ.
4. Исследовать экспрессию молекул врожденного иммунитета HBD-2 на уровне генов в эпителиальных клетках конъюнктивы у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой.
5. Определить концентрацию IL-17 в слезной жидкости и камерной влаге у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой.
6. Исследовать изменение концентрации дефензинов (HNP 1-3 и HBD-2) и IL-17 в слезной жидкости и конъюнктиве глазного яблока на фоне терапии постоперационного периода глаукомы.
7. На основании полученных данных изучить возможное влияние изменения во времени концентрации HNP 1-3 и IL-17 в слезной жидкости и уровня экспрессии гена HBD-2 на динамику раневого процесса, имея ввиду степень рубцевания в зоне хирургического вмешательства.

Научная новизна работы

1. Разработан способ оценки функционального состояния фильтрационной подушки после антиглаукомной операции (заявка на патент РФ № 2009142574 от 19.11.2009; программа для ЭВМ «Гиперемия-3», номер государственной регистрации 2010610642, зарегистрирована от 18.01.2010).
2. Определена концентрация ПМП и IL-17 в слезной жидкости, влаге передней камеры и эпителиальных клетках конъюнктивы при ПОУГ.
3. Выявлены статистически достоверные отличия в уровне концентрации HNP 1-3 и IL-17 в СЖ, а также в уровне экспрессии гена HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы пациентов с ПОУГ от аналогичных показателей в группе сравнения.
4. Получены данные, указывающие на активное функционирование ПМП и IL-17 до хирургического вмешательства – предположительно, в поддержании хронического воспаления на фоне местной терапии.
5. Установлена взаимосвязь исследуемых ПМП и цитокина IL-17 с динамикой раневого процесса в хирургии глауком; обнаружено, что появление признаков избыточного рубцевания ассоциировано со стабилизацией скорости изменения концентрации HNP 1-3 и IL-17 в СЖ.
6. Разработаны иммунологические критерии риска развития и способ иммунологического прогнозирования избыточного рубцевания после антиглаукомных операций (заявка на патент РФ № 2009107216 от 02.03.2009 г).

Теоретическая и практическая значимость работы

Клиническое состояние фильтрационной подушки является косвенным признаком функциональной состоятельности сформированных путей оттока камерной влаги. Объективная оценка функциональной способности ФП и знание топографии рубцовой ретенции внутриглазной жидкости позволят расширить арсенал практических действий офтальмолога по устранению препятствий для оттока последней, а также сохранению и усилению гипотензивного эффекта хирургического вмешательства.

Полученные данные дополняют и уточняют имеющиеся представления о причинах развития избыточного рубцевания в зоне хирургического вмешательства у пациентов с ПОУГ. Разработка иммунологических критериев риска развития рубцовой блокады вновь созданных путей оттока при антиглаукомных операциях расширяет возможности принятия профилактических и лечебных мер, повышающих гипотензивную эффективность хирургического лечения глаукомы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработан способ оценки функционального состояния хирургически сформированных путей оттока, в рамках которого учитывается высота, ширина и степень гиперемии фильтрационной подушки.
2. Исходно повышенный уровень ПМП и IL-17 (особенно гена HBD-2, экспрессия которого в клетках конъюнктивы у пациентов с глаукомой превышает таковую в группе сравнения в 10-13 раз) может свидетельствовать об активном их участии в поддержании местного хронического воспаления на фоне токсического действия бензалкониума гидрохлорида при ПОУГ.
3. Изменение уровня HNP 1-3 и IL-17 на протяжении первого месяца после хирургического вмешательства (период завершения острого воспаления и начала формирования рубцовой ткани) определяется системой взаимодействий, сложившейся в течение первой недели после операции и не зависит от их исходного уровня.
4. Стабилизация скорости изменения концентрации HNP 1-3 и IL-17 в СЖ в постоперационном периоде у пациентов с ПОУГ является фактором риска развития избыточного рубцевания в области хирургического вмешательства.

Апробация результатов исследования. Результаты работы доложены на IV Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2009), Международном медицинском форуме «Индустрия здоровья» (Москва, 2010).

Реализация результатов работы. Способ оценки функционального состояния фильтрационных подушек внедрен в практику НИИГБ РАМН; на его основе обследуются пациенты после антиглаукомных операций в научных и практических целях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, 6 из них – в журналах, входящих в перечень рецензируемых журналов и изданий, рекомендованных ВАК. Поданы две заявки на патент, зарегистрирована программа для ЭВМ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 7 таблицами. Библиографический указатель содержит 186 источников (60 отечественных и 126 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы

Под нашим наблюдением находилось 174 пациента (174 глаза), поступивших для проведения плановой антиглаукомной операции с 2007 по 2009 год.

Критерии включения в исследование: возраст от 50 лет, диагностированная ПОУГ, отсутствие сопутствующей выраженной офтальмопатологии.

Критерии исключения из исследования: проведенные ранее оперативные (в том числе лазерные) вмешательства на исследуемом органе зрения; наличие травм и хронических воспалительных или аллергических заболеваний глаз в анамнезе; наличие прочих видов глауком и причин повышения офтальмотонуса; сопутствующие аутоиммунные заболевания, патология эндокринной системы.

Возраст пациентов варьировал от 51 до 85 (медиана – 71 год). Срок с момента установления диагноза ПОУГ до проведения хирургического вмешательства – от 6 месяцев до 10 лет. Распределение пациентов по стадиям представлено в табл. 1. Всем пациентам в плановом порядке производили синусотрабекулэктомию (СТЭ) по Cairns.

Таблица 1.

Распределение пациентов по стадиям заболевания и степени компенсации офтальмотонуса

Стадия заболевания	Степень компенсации ВГД		Всего (n)
	B	C
II (развитая)	15 (34,1%)	29 (65,9%)	44 (25,3%)
III (далеко зашедшая)	89 (72,5%)	41 (27,4%)	130 (74,7%)
Итого (n)	104 (59,7%)	70 (40,2%)	174

Ведение пациентов в постоперационном периоде было стандартным (инстилляции стероидных и нестероидных противовоспалительных препаратов, антибактериальных препаратов, циклоплегиков; при выраженных явлениях воспаления – инъекции стероидных препаратов и холиноблокаторов). При появлении признаков избыточного рубцевания в зоне хирургического вмешательства проводили ревизию фильтрационной подушки с гидравлической и частично механической сепарацией тканей и введением раствора дексаметазона (нидлинг).

Офтальмологическое исследование пациентов до и после операции включало визометрию, биомикроскопию, тонометрию (бесконтактную и тонометром Маклакова – груз массой 10,0 грамм), гониоскопию, офтальмоскопию и периметрию.

Оценка интенсивности репаративных процессов в зоне хирургического вмешательства осуществлялась c учетом состояния ФП и уровня офтальмотонуса. Функциональное состояние ФП на протяжении трех месяцев постоперационного периода оценивали по предложенному нами способу (заявка на патент № 2009142574 от 19.11.2009) у 115 пациентов. С помощью программы «Гиперемия-3» определяли степень гиперемии конъюнктивы в зоне ФП, как процент яркости красного канала цветного цифрового изображения от суммарной яркости каналов, а также ширину ФП в миллиметрах (мм). Высоту ФП, измеряемую от поверхности склеры до поверхности конъюнктивы в миллиметрах (мм), оценивали с помощью ультразвуковой биомикроскопии. В результате обработки всех перечисленных выше параметров получали формулу, где римские цифры обозначают ширину (I), высоту (II) и степень гиперемии (III) ФП, а арабские (от 0 до 4) – выраженность описываемого признака (табл. 2).

Таблица 2.

Параметры оценки функционального состояния фильтрационной подушки

Ширина (мм)			Высота (мм)			Гиперемия (%)
0	отсутствует	-	0	отсутствует	> 0,2	0	Отсутствует	3
1	небольшая	2-3	1	небольшая	0,2-0,7	1	Нормальная	4-5
2	средняя	4-7	2	средняя	0,8-1,5	2	Слабая	6-11
3	разлитая	8-12	3	выраженная	1,5-2,5	3	Умеренная	12-21
4	вокруг лимба	>12	4	очень высокая	2,6	4	Выраженная	>21

Иммунологический статус исследован у 24 человек (24 глаза): основную группу составили 13 пациентов с ПОУГ (13 глаз), 9 мужчин и 4 женщины; группу сравнения – 11 практически здоровых лиц (11 глаз), 3 мужчины и 8 женщин той же возрастной категории. В основной группе развитая стадия (II) глаукомы определена в 3 (23%), далеко зашедшая (III) – в 10 случаях (76,9%). По уровню офтальмотонуса пациенты распределялись следующим образом: субкомпенсированное ВГД (в) – 9 глаз (69,2%), некомпенсированное (с) – 4 глаза (30,7%).

Иммунологические исследования проводили в динамике: за несколько часов до и на 7-е, 30-е и 90-е сутки после операции. В качестве тест-проб использовали слезную жидкость (СЖ), внутриглазную жидкость (ВГЖ) и соскоб с конъюнктивы век и переходных складок. Контролем служили СЖ и соскоб с конъюнктивы в группе сравнения. Изучали:

- Содержание в СЖ и во влаге передней камеры IL-17 и HNP 1-3, а также динамику изменения концентрации IL-17 и HNP 1-3 в СЖ у пациентов с ПОУГ в постоперационном периоде на протяжении 3 месяцев;

- Экспрессию гена HBD-2 в конъюнктиве у пациентов с ПОУГ и в контрольной группе, а также динамику экспрессии гена HBD-2 у пациентов с ПОУГ в постоперационном периоде на протяжении 3 месяцев.

Забор СЖ в объеме 0,1 мл производили атравматично из нижнего слезного мениска с помощью стеклянного капилляра с оплавленным срезом, не прибегая к местной анестезии. Соскоб с конъюнктивы проводили затупленным лезвием под местной инстилляционной анестезией 0,4% раствором оксибупрокаина. Забор ВГЖ проводили интраоперационно. Весь материал с момента его получения и до постановки иммунологических реакций хранили в морозильной камере при температуре -70С.

Метод твердофазного иммуноферментного анализа^[1] применяли для определения концентрации IL-17 (тест-система "Bender Medsystems", Австрия; чувствительность – 1,6 пг/мл) и HNP 1-3 (тест-система "Hycult biotechnology", Нидерланды; чувствительность – 102 пг/мл). Уровень экспрессии гена HBD-2 определи с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени^[2]. Результат подсчитывали относительно 1 млн. копий кДНК гена актина человека. Определение количества копий кДНК гена актина проводили с использованием набора Т404 (Синтол, Россия) четко по предложенной производителем методике. Для удобства экспрессия гена HBD-2 выражена в десятичных логарифмах.

Статистический анализ изменений иммунологических показателей проведен с помощью программы Microsoft Exel 2003 с использованием непараметрических критериев – медиана (Me), Т-критерий Манна-Уитни, критерий Фридмэна, коэффициента корреляции Спирмэна.

Для критериев Манна-Уитни и Фридмэна достоверным считали уровень значимости 5% (вероятность ошибочной оценки р<0,05). Корреляционные связи рассматривали лишь в том случае, если абсолютное значение коэффициента корреляции Спирмэна 0,4.

Поскольку исходный уровень исследуемых компонентов иммунной системы различался на несколько порядков, динамику изменения уровня концентрации оценивали посредством расчета логарифмической скорости.

Результаты исследования

Динамика функционального состояния фильтрационных подушек представлена в таблице 3. В постоперационном периоде наиболее частыми осложнениями были ЦХО, гифема, асептический иридоциклит и синдром мелкой передней камеры (14,0, 12,6, 7,3 и 3,3% соответственно). В 27,3% случаев наблюдали сочетание двух или трех из перечисленных осложнений.

Таблица 3.

Состояние фильтрационных подушек после операции (n = 115)

		1 сутки	7 сутки	30 сутки	90 сутки
Ширина (I)	0	-	-	2 (1,7%)	1 (0,8%)
	1	-	-	3 (2,6%)	7 (6,1%)
	2	21 (18,2%)	22 (19,1%)	43 (37,3%)	46 (40,0%)
	3	91 (79,1%)	93 (80,8%)	67 (58,2%)	61 (53,0%)
	4	3 (2,6%)	-	-	-
Высота (II)	0	-	-	2 (1,7%)	1 (0,8%)
	1			6 (5,2%)	7 (6,0%)
	2			47 (40,8%)	63 (54,7%)
	3			58 (50,4%)	37 (32,1%)
	4			2 (1,7%)	7 (6,1%)
Степень гиперемии (III)	0	-	-	-	1 (0,8%)
	1	-	-	38 (33,0%)	98 (85,2%)
	2	5 (4,3%)	7 (6,1%)	71 (61,7%)	12 (10,4%)
	3	68 (59,1%)	72 (62,6%)	5 (4,3%)	4 (3,4%)
	4	42 (36,5%)	36 (31,3%)	1 (0,8%)	-

Повышение ВГД в различные сроки зафиксировано в 32 случаях (21,3%): шесть в течение первой недели после операции, 17 – со второй по четвертую неделю и девять – спустя месяц после операции. В течение первой недели повышение ВГД было связано с блокадой зоны внутренней фистулы корнем радужки или сгустком крови, в более поздние – развитием рубцовой блокады в области ФП. Снижение эффективности антиглаукомных вмешательств вследствие развития рубцовых блокад наблюдали 3,5 раз чаще у пациентов с осложненным течением репаративного процесса (p<0,05). Выявлено, что к формированию рубцовых блокад предрасполагает не только избыточный воспалительный процесс, но и сниженная скорость репарации в зоне вмешательства.

Выявлены сочетания показателей, позволяющие оценить функциональное состояние ФП как удовлетворительное или неудовлетворительное. Удовлетворительное характеризуется шириной ФП 8 мм и более и высотой 0,8-2,5 мм и показателем гиперемии 4-11% (I 3-4, II 2-3, III 1-2). Неудовлетворительное – двумя сочетаниями параметров: ширина до 4 мм и высота до 0,8 мм, показатель гиперемии 12% и более (I 0-1, II 0-1, III 3-4) и ширина менее 8 мм и высота 2,6 мм и более, показатель гиперемии менее 4% (I 2, II 4, III 0).

Исходный уровень исследуемых ПМП в основной группе статистически значимо отличался (в большинстве случаев превышал) от такового в группе сравнения (p < 0,05, критерий Манна-Уитни). Вероятно, это результат хронического воспаления на фоне постоянного использования гипотензивных капель (доказано, что длительная местная терапия провоцирует рост гранулярной ткани на поверхности склеры, ведет к локальной инфильтрации тканей макрофагами, лимфоцитами, тучными клетками и фибробластами, уменьшению времени разрушения слезной пленки и т.д.). Широкий диапазон, в котором располагались значения исходного уровня каждого из исследуемых компонентов, мог бы найти свое объяснение в особенностях иммунной системы, уникальной для каждого пациента. В таком случае на одинаковый травмирующий фактор (в нашем случае – токсическое действие консерванта) правомерно ожидать разную степень выраженности воспалительного ответа.

Исходный уровень экспрессии гена HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы до операции в основной группе варьировал от 6,19 до 9,13 (Ме = 7,36); в группе сравнения – от 5,5 до 6,99 (Ме = 6,58) lg (копий кДНК) относительно экспрессии гена актина.

Значительные колебания отмечены в исходном уровне концентрации HNP 1-3 в СЖ у пациентов основной группы – от 169,68 до 28220 (Ме = 6084) пг/мл; в контрольной группе данный показатель находился в пределах от 2050 до 5450 (Ме = 3815) пг/мл. Уровень концентрации HNP 1-3 в ВГЖ варьировал в пределах от 268 до 31440 (Me = 2194,4) пг/мл. Статистически достоверной корреляции с исходным уровнем дефензина в СЖ не выявлено (r < 0,4).

Исходный уровень IL-17 в СЖ пациентов с ПОУГ варьировал от 57,33 до 659,85 (Me = 211,39) пг/мл. В 84,6% случаях в ВГЖ цитокин обнаружен не был. Статистически значимой зависимости между наличием IL-17 во влаге передней камеры и исходным уровнем цитокина в СЖ, а также течением постоперационного периода не выявлено (r < 0,4).

Отсутствие статистически значимой связи между уровнем HNP 1-3 и IL-17 в ВГЖ и СЖ, а также ходом репаративного процесса, можно объяснить иммунологической изоляцией внутриглазных структур при локализации раневого процесса в поверхностных тканях глаза.

Динамика изменений исследуемых иммунных показателей представлена в табл. 4.

Таблица 4.

Динамика изменения концентрации HNP 1-3 и IL-17 (пг/мл) в слезной жидкости и экспрессии гена HBD-2 (lg копий кДНК) в эпителиальных клетках конъюнктивы

Исследуемые показатели	Время (сутки)
	Исходно	7 сутки	30 сутки	90 сутки
HBD-2 (lg копий кДНК)	7,36	7,93	7,62	7,20
HNP 1-3 (пг/мл)	8035	12976	21962,6	13695
IL-17 (пг/мл)	220,4576	146,4	262,24	146,886

Примечание: приведены медианы

На седьмые сутки уровень экспрессии HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы колебался в пределах от 6,12 до 9,4 (Me = 7,93) lg (копий кДНК) относительно экспрессии гена актина. В 61,53% случаев отмечено повышение (в 10,9-16,2 раза относительно исходного уровня), а в 15,38% – снижение (в 10,2-13,8 раз) экспрессии дефензина. В 23% случаев значимых изменений экспрессии HBD-2 не зафиксировано.

К 30 суткам исследования уровень экспрессии HBD-2 варьировал от 6,04 до 8,89 (Me = 7,62) lg (копий кДНК). В 38,46% случаев экспрессия HBD-2 повысилась (в 3,1-12,5 раза) относительно предшествующего значения и в 46,15% случаев снизилась (в 10,9 раза). В 15,38% экспрессия HBD-2 осталась приблизительно на том же уровне. К 90 суткам исследования уровень экспрессии HBD-2 колебался в пределах от 6,25 до 7,81 (Me = 7,2) lg (копий кДНК). Из всех случаев, в которых к 90 суткам имелись признаки избыточного рубцевания, в 60% уровень экспрессии HBD-2 был ниже исходного и в 40% – вернулся к прежнему. Таким образом, появление признаков избыточного рубцевания ни в одном случае не сопровождалось превышением исходного уровня экспрессии.

Изменения HNP 1-3 в СЖ в постоперационном периоде носили неоднородный характер. Хотя различия между измерениями статистически недостаточно значимы (p>0,05), индивидуальный анализ данных позволил выявить ряд устойчивых связей и зависимостей, которые в дальнейших исследованиях можно было рассматривать как тенденцию.

На седьмые сутки исследования уровень HNP 1-3 в СЖ колебался в пределах от 417,3 до 65600 (Me = 16986,9) пг/мл. В 76,9% случаев отмечено четко выраженное повышение (в 1,5-6 раз относительно исходного уровня), а в 23% – снижение (в 1-3 раза) концентрации дефензинов в СЖ. На 30 сутки исследования уровень HNP 1-3 в СЖ колебался в пределах от 5644,8 до 64520 (Me = 21962,6) пг/мл. В 69,23% случаев концентрация HNP 1-3 была выше предшествующего значения, а в 30,7% осталась приблизительно на том же уровне. Все случаи отклонения от нормального течения или осложнения сочетались с повышением уровня HNP 1-3. Тенденция к отграничению ФП в 67% случаев также сопровождалась более высоким относительно предыдущего уровнем HNP 1-3 и в 33% – отсутствием изменения концентрации дефензинов. К исходу 90 суток исследования уровень HNP 1-3 в СЖ колебался в пределах от 4928 до 33020 (Me = 15360) пг/мл. Несмотря на очевидную тенденцию к снижению, исходный уровень не был достигнут ни в одном случае. Дальнейшее повышение уровня концентрации HNP 1-3 зафиксировано в трех случаях (23%), где наблюдали изменения в области ФП в виде зон отграничения, формирования кистообразной подушки или отсутствие таковой.

К исходу седьмых суток постоперационного периода уровень IL-17 в СЖ варьировал от 29,48 до 266,39 (Me = 152,76) пг/мл. В 46,15% случаев отмечено выраженное повышение (в 1,5-6 раз относительно исходного уровня), а в 53,8% – снижение (в 1-3 раза) концентрации цитокина в СЖ.

К 30 суткам исследования уровень IL-17 в СЖ колебался в пределах от 22,5 до 675,6 (Me = 262,24) пг/мл. В 53,84% случаев концентрация IL-17 была выше предшествующего значения, в 23% снизилась и в 23% осталась приблизительно на том же уровне. На 90 сутки исследования наблюдалась тенденция к снижению IL-17 в СЖ (уровень концентрации от 7,48 до 361,06; Me = 106,71 пг/мл).

Учитывая то, что в СЖ лиц без выраженной офтальмопатологии средний уровень цитокина составляет 50 пг/мл (Malvitte L. et al., 2007), мы разделили основную группу на три подгруппы в зависимости от исходного уровня IL-17 в СЖ: I подгруппа характеризовалась содержанием IL-17 до 100 пг/мл, II – от 100 до 300 пг/мл и III– более 300 пг/мл. Детальный анализ полученных данных позволил выявить особенности динамики IL-17 в каждой из описанных выше подгрупп:

В I подгруппе на седьмые сутки после операции было отмечено выраженное (в 2 раза) повышение концентрации цитокина, на 30 – повышение или сохранение на прежнем уровне, на 90 – сохранение на прежнем уровне или снижение. Во II и III подгруппах наоборот, обращает на себя внимание резкое (в 1,4 – 7 раз) снижение IL-17 на седьмые сутки после операции, причем в III подгруппе наблюдался более высокий перепад концентрации. В течение дальнейшего наблюдения отмечено колебание концентрации IL-17 с постепенным ее повышением относительно предшествующего измерения. Тем не менее, говорить о тенденции на основании данного повышения преждевременно, т.к. ни в одном случае уровень IL-17 не поднялся до исходного. Что же касается особенностей репарации, то к окончанию срока наблюдения признаки избыточного рубцевания чаще наблюдались у пациентов III подгруппы.

Установлена прямая взаимосвязь между показателями динамики изменения концентрации уровня HNP 1-3 и IL-17 в СЖ и появлением клинических признаков патологического рубцевания: по полученным данным, во всех случаях появления признаков избыточного рубцевания значение lgCn стремилось к нулю, т.е. происходила стабилизация уровня исследуемого иммунологического показателя в СЖ (рис. 1А,Б). Зависимости между уровнем, на котором происходила эта стабилизация и частотой клинических проявлений рубцовой блокады не выявлено (r < 0,4).

Последующие расчеты показали, что критические значения lgCn HNP 1-3 равны -0,0072 и 0,0097, а lgCn IL-17 – -0,02 и 0,015. Значения lgCn, находящиеся внутри указанных диапазонов, соответствовали появлению клинических признаков избыточного рубцевания; значения, расположенные вне указанных диапазонов, соответствовали благоприятному течению репаративного процесса с формированием разлитых ФП без признаков избыточного рубцевания. Полагаем, что описанная закономерность справедлива для всех проявлений избыточного рубцевания (от локальных конъюнктивально-склеральных сращений до отсутствия ФП с тенденцией к повышению офтальмотонуса) и всех сроков наблюдения. В отличие от HNP 1-3 и IL-17 ни прямой, ни обратной зависимости между lgCn HBD-2 и появлением признаков избыточного рубцевания не обнаружено.

Рис 1 А. Динамика логарифмической скорости изменения концентрации HNP 1-3 в СЖ в постоперационном периоде

Рис. 1 Б. Динамика логарифмической скорости изменения концентрации IL-17 в СЖ в постоперационном периоде

Примечание: квадратные условные значки соответствуют измерениям, сделанным в те моменты, когда клинически наблюдали признаки избыточного рубцевания, треугольные – значениям lgCn HNP 1-3 или IL-17, зафиксированным в сроки, когда признаков патологического рубцевания клинически не выявлено. Прямоугольник показывает границы диапазона значений lgCn, ассоциированных с клинически наблюдаемыми признаками избыточного рубцевания.

Характер корреляционной связи между уровнем каждого компонента рассчитывали отдельно в каждом случае в соответствии со следующими временными интервалами: 0 (до операции) – 7 сутки, 7 – 30 сутки, 30 – 90 сутки и 90 – 0 сутки (табл. 5).

Таблица 5.

Корреляционная связь между уровнем экспрессии HBD-2, HNP 1-3 и IL-17

в течение постоперационного периода (r, коэффициент корреляции Спирмэна)

Исследуемые показатели	Время (сутки)
	0 – 7 сутки	7 – 30 сутки	30 – 90 сутки	90 – 0 сутки
HBD-2	0,71*	0,71*	0,70*	0,70*
HNP 1-3	0,36	0,77*	0,32	0,28
IL-17	- 0,21	0,70*	0,072	0,70*

Примечание: * – данные статистически значимы

Наиболее сильная прямая корреляция для каждого из исследуемых компонентов зафиксирована между уровнями, измеренными на 7 и 30 сутки (период, характеризующийся завершением острого воспаления, организацией фибриллярных волокон и формированием рубцовой ткани). Логично предположить, что в результате операционной травмы запускается каскад реакций, ведущих к изменению содержания HNP 1-3 и IL-17 в СЖ, на которые исходный уровень существенного влияния не оказывает. При этом изменение уровня исследуемых компонентов врожденного иммунитета на протяжении первого месяца постоперационного периода определяется системой взаимодействий, сложившейся в течение первой недели после вмешательства.

Обнаружена статистически значимая корреляция между исходным уровнем всех исследуемых компонентов, что можно интерпретировать как наличие выраженной взаимозависимости между ними еще на этапе, предваряющем хирургическое вмешательство (табл. 6). В соответствии с полученными данными исходно корреляционная связь более всего выражена между уровнем экспрессии HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и концентрацией IL-17 в СЖ (r=7,8). Столь высокий уровень корреляции следовало ожидать, если принять во внимание регуляторное влияние цитокина в отношении экспрессии HBD-2 (Kao C.Y. et al., 2004).

Полученные данные позволяют предположить, что и дефензины оказывают взаимное влияние в течение первой недели после хирургического вмешательства, а в процессе развития избыточного рубцевания координируются с IL-17 независимо друг от друга.

Таблица 6.

Корреляционная связь между компонентами врожденного иммунитета в течение постоперационного периода (r, коэффициент корреляции Спирмэна)

Исследуемые показатели	Время (сутки)
	Исходно	7 сутки	30 сутки	90 сутки
HBD-2 – HNP 1-3	0,63*	0,60*	0,11	0,14
HBD-2 – IL-17	0,78*	- 0,03	0,42*	0,42*
HNP 1-3 – IL-17	0,49*	0,75*	0,38	0,58*

Примечание: * – данные статистически значимы

После воздействия травмирующего агента (хирургического вмешательства) запускается репаративный процесс, в течение которого взаимодействие ПМП и IL-17 на разных этапах определяется многообразием факторов и условий. В результате выстраивается новая система взаимодействий – в период с 7 по 30 сутки у всех рассматриваемых компонентов наблюдается сильная корреляционная зависимость уровней концентрации. В этот период моноциты покидают сосудистое русло, происходит мощный выброс цитокинов, факторов роста, ангиогенеза, формируется грануляционная ткань. На седьмые сутки постоперационного периода корреляция с исходным уровнем сохраняется только у HBD-2, практически отсутствует у IL-17 и недостаточно достоверна у HNP 1-3. В то же время взаимная зависимость в наибольшей степени выражена между изменением концентрации HNP 1-3 и IL-17, а также экспрессией HBD-2 и концентрацией HNP 1-3.

Позже, уже к исходу 30 суток взаимная зависимость уровней рассматриваемых компонентов вновь претерпевает существенные изменения: появляется статистически достоверная корреляция между экспрессией HBD-2 и концентрацией IL-17 и по-прежнему сохраняется выраженная зависимость уровня HBD-2 от предшествующих значений. В то же время, корреляция между HNP 1-3 и HBD-2, а также HNP 1-3 и IL-17, столь явно выраженная на седьмые сутки постоперационного периода, постепенно исчезает. Также ослабевает зависимость между зафиксированным и предшествующим уровнями концентрации этих компонентов. Примечательно, что именно в этот период у некоторых пациентов клинически наблюдалось появление признаков патологического рубцевания. У этой же группы испытуемых расчет показал стабилизацию скорости изменения концентрации и отсутствие зависимости от уровня, на котором произошла данная стабилизация.

На 90 сутки степень корреляции между экспрессией HBD-2 в клетках конъюнктивы и концентрацией IL-17 в СЖ, а также зависимость уровня экспрессии HBD-2 от предшествующих значений остаются стабильными. Следует отметить, что к этому моменту корреляционная связь с исходным уровнем выражена именно у HBD-2 и IL-17. На фоне отсутствия достоверной связи с предшествующим уровнем концентрации появляется прямая зависимость между HNP 1-3 и IL-17. Это можно объяснить увеличением числа пациентов с признаками патологического рубцевания – расчет коэффициента корреляции концентраций только для пациентов с таковыми показал сильную прямую связь (r=0,83). С патологическим рубцеванием, опять же, ассоциирована стабилизация скорости изменения HNP 1-3 и IL-17. В то же время связь между дефензинами оказалась статистически не значимой.

Появление признаков патологического рубцевания отмечается на фоне снижения уровня экспрессии HBD-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и стабилизации скорости изменения концентрации HNP 1-3 и IL-17 в СЖ. Судя по полученным данным, большую роль в регуляции репаративных процессов у пациентов с ПОУГ играет IL-17, который, с одной стороны, регулирует уровень экспрессии HBD-2, а с другой – оказывает влияние на развитие избыточного рубцевания в ассоциации с HNP 1-3.

Результаты проведенной работы указывают на бесспорное участие компонентов врожденного иммунитета на разных этапах репаративного процесса после антиглаукомных операций. Выявленная связь между стабилизацией скорости изменения HNP 1-3 и IL-17 в СЖ и развитием признаков избыточного рубцевания требует дальнейшего детального рассмотрения. Изучение сложной сети взаимодействий, приводящих к стабилизации скорости изменения HNP 1-3 и IL-17, позволит выявить новые аспекты хода раневого процесса, его особенностей у пациентов с ПОУГ и, возможно, оказывать влияние на регуляцию процессов избыточного рубцевания.

ВЫВОДЫ

1. Клиническое исследование, включавшее анализ постоперационного состояния 174 пациентов с ПОУГ, подвергшихся хирургическому лечению, показало, что при наличии таких осложнений, как асептический иридоциклит, цилиохориоидальная отслойка и синдром мелкой передней камеры, способных оказать влияние на течение репаративного процесса, повышают частоту развития рубцовых блокад в течение первых трех месяцев постоперационного период а в 3,5 раза (p<0,05).
2. Разработан и апробирован на 115 пациентах способ клинико-функциональной оценки состояния хирургически сформированных путей оттока, в основе которого лежит оценка биометрических показателей и характеристика яркости красного канала цветного цифрового изображения на полигональном участке конъюнктивы (программа для ЭВМ «Гиперемия-3», номер государственной регистрации 2010610642 от 18.01.2010).
3. Выявлено, что у пациентов с ПОУГ исходный уровень экспрессии гена HBD-2 в клетках конъюнктивы в среднем превышает аналогичный показатель в группе сравнения в 10-13 раз. Такое существенное различие в показателях может свидетельствовать о высокой степени асептической воспалительной реакции (предположительно, на фоне токсического действия бензалкониума гидрохлорида) и сказываться на особенностях репаративного процесса.
4. Установлены значительные колебания концентрации нейтрофильных пептидов (HNP 1-3) в слезной жидкости пациентов с ПОУГ. Только в 15,4% случаев их уровень находился в пределах так называемой нормы, определенной в группе сравнения. В 53,8% случаев концентрация HNP 1-3 превышала, а в 30,7% была значительно ниже по сравнению с контролем. Повышенная концентрация пептидов свидетельствует об активности нейтрофилов в зоне хирургического вмешательства, что характерно для воспалительной реакции, способной оказать влияние на течение репаративного процесса.
5. У пациентов с ПОУГ до хирургического вмешательства выявлена прямая корреляция между уровнем экспрессии гена HBD-2 в клетках конъюнктивы и концентрацией HNP 1-3 в СЖ (r = 0,63), уровнем экспрессии гена HBD-2 в клетках конъюнктивы и концентрацией IL-17 в СЖ (r = 0,78), а также концентрацией HNP 1-3 и IL-17 в СЖ (r = 0,63), что указывает на их исходное взаимозависимое функционирование.
6. У каждого из исследованных компонентов иммунной системы в постоперационном периоде выявлена прямая корреляционная связь (r = 0,71 для HBD-2; 0,77 для HNP 1-3 и 0,70 для IL-17) между уровнями экспрессии, зафиксированными на 7 и 30 сутки. Это может указывать на то, что изменение уровня HNP 1-3, HBD-2 и IL-17 на протяжении первого месяца после хирургического вмешательства (т.е. в период, соответствующий окончанию острой фазы воспаления и началу формирования незрелой рубцовой ткани) определяется системой взаимодействий, сложившейся в течение первой недели после операции и не зависит от их исходного уровня (кроме HBD-2).
7. Стабилизация логарифмической скорости изменения концентрации HNP 1-3 и IL-17 в СЖ в постоперационном периоде у пациентов с ПОУГ является фактором риска развития избыточного рубцевания в области хирургического вмешательства.

Практические рекомендации

Предложенный способ оценки фильтрационных подушек позволяет качественно и объективно сравнивать функциональное состояние сформированных путей оттока. Выявленные особенности динамики компонентов врожденного иммунитета в постоперационном периоде и их связь с развитием признаков избыточного рубцевания требуют дальнейшего детального рассмотрения. Изучение сложной сети взаимодействий, приводящих к стабилизации скорости изменения HNP 1-3 и IL-17 в СЖ, позволит раскрыть новые аспекты хода раневого процесса, его особенностей у пациентов с ПОУГ и, возможно, оказывать влияние на регуляцию процессов избыточного рубцевания.

Список сокращений

ВГЖ ВГД ИФА ПМП ПОУГ ПЦР-РВ ОЗ СЖ СТЭ ФП ЦХО	– внутриглазная жидкость – внутриглазное давление – иммуноферментный анализ – противомикробные пептиды – первичная открытоугольная глаукома – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени – острота зрения – слезная жидкость – синусотрабекулэктомия – фильтрационная подушка – цилиохориоидальная отслойка
IL-17 HNP HBD	– интерлейкин 17 – человеческие нейтрофильные пептиды (human neutrophil peptide) – человеческие бета-дефензины (human -defensin)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Роль компонентов врожденного иммунитета в репаративных процессах при первичной глаукоме // Глаукома. – 2008. – 3. – С. 60-63. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В.)
2. Взаимосвязь изменения концентрации интерлейкина-17 в слезе и процессов избыточного рубцевания после синусотрабекулэктомии // Глаукома и другие заболевания глаз: Сб. ст. – СПб., 2009. – С. 53-55. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В.)
3. Интерлейкин-17 и его возможное участие в репаративных процессах при глаукоме // Глаукома. – 2009. – 1. – C. 23-26. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В., Ковальчуком Л.В., Ганковской О.А.)
4. Раневой процесс и его особенности после хирургии глауком // Глаукома. – 2009. – 2. – C. 67-71.
5. Прогнозирование постоперационного репаративного процесса у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой на основе измерения логарифмической скорости изменения концентрации уровня ИЛ-17 в слезной жидкости // Актуальные проблемы офтальмологии: Сб. ст. – М., 2009. – С. 31-33. (в соавт. с Еричевым В.П., Новиковым И.А.)
6. Динамика противомикробных пептидов HNP 1-3 в слезе в постоперационном периоде у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Глаукома. – 2009. – 4. – C. 14-16. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В.)
7. Экспрессия противомикробного пептида -дефензина-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы при первичной открытоугольной глаукоме и в динамике в постоперационном периоде // Вестн. Офтальмол. – 2010. – Т. 126, № 2. – С. 19-22. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В. Ковальчуком Л.В., Ганковской О.А.)
8. Изменение некоторых иммунологических показателей слезной жидкости при избыточном рубцевании после антиглаукомных операций у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Вестн. Офтальмол. – 2010. – Т. 126, № 3. – С. 25-29. (в соавт. с Еричевым В.П., Ганковской Л.В. Ковальчуком Л.В., Ганковской О.А.)

Патенты

1. Еричев В.П., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Дугина А.Е., Новиков И.А., Карташов Д.Д. Способ прогнозирования избыточного рубцевания после антиглаукомных операций у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой // Заявка на патент № 2009107216 (от 02.03.2009)
2. Петров С.Ю., Новиков И.А., Дугина А.Е. Способ оценки функционального состояния фильтрационной подушки после антиглаукоматозной операции // Заявка на патент № 2009142574 (от 19.11.2009)
3. Петров С.Ю., Новиков И.А., Дугина А.Е. Программа для ЭВМ «Гиперемия-3». Номер государственной регистрации 2010610642, зарегистрирована (от 18.01.2010)

---

^[1] Совместно с аспирантом кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава Карташовым Д.Д.

^[2] Совместно с ведущим науч. сотруд. лаборатории диагностики вирусных инфекций ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, к.м.н. Ганковской О.А.