Иммунологическая характеристика антифосфолипидного синдрома
На правах рукописи
АЛЕКСАНДРОВА
Елена Николаевна
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА
14.00.39 – Ревматология
14.00.46 – Клиническая лабораторная диагностика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва – 2008
Работа выполнена в Государственном учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН НАСОНОВ Евгений Львович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор АНАНЬЕВА Лидия Петровна
доктор медицинских наук, профессор КОРШУНОВ Николай Иванович
доктор медицинских наук, профессор ЛУГОВСКАЯ Светлана Алексеевна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»
Защита состоится 10 октября 2008 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д. 001.018.01 при Государственном учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34 А)
С диссертацией можно ознакомиться в медицинской библиотеке Государственного учреждения Института ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34 А)
Автореферат разослан _____________ 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук ДЫДЫКИНА И.С.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ
Актуальность темы
Антифосфолипидный синдром (АФС) – клинико-лабораторный симптомокомплекс, характеризующийся рецидивирующими венозными и артериальными тромбозами, акушерской патологией, тромбоцитопенией и гиперпродукцией антифосфолипидных антител (аФЛ) (Hughes G.R.V., 1983; Насонов Е.Л. и соавт., 1987; Алекберова З.С. и соавт., 1988). аФЛ – гетерогенная группа аутоантител, распознающих антигенные детерминанты анионных и нейтральных фосфолипидов (ФЛ) и комплексные эпитопы, образующиеся в процессе взаимодействия ФЛ и фосфолипидсвязывающих белков плазмы крови (Roubey R.A., 1996). Обязательные методы лабораторной диагностики АФС включают обнаружение волчаночного антикоагулянта (ВА) с помощью фосфолипидзависимых коагуляционных тестов и определение 2-гликопротеин – 1 (2-ГП 1) зависимых антител к кардиолипину (аКЛ) класса IgG и IgM стандартным иммуноферментным методом (Harris E.N., 1990; Galli M. И соавт., 1990; Matsuura E. И соавт., 1990; McNeil H.P. и соавт., 1990; Brandt J.T. и соавт., 1995; Pierangeli S.S. и соавт., 1998; Wilson W. A. и соавт., 1999; Баркаган З.С. и соавт., 2000). Вместе с тем определение ВА и аКЛ не позволяет выявить весь спектр аФЛ, ассоциирующихся с различными клиническими проявлениями АФС. При наличии у пациентов характерных клинических признаков АФС и низкоположительных или отрицательных результатов тестирования ВА и аКЛ рекомендуется использовать дополнительные лабораторные методы для диагностики АФС, в первую очередь, иммуноферментный анализ (ИФА) антител к 2-ГП I (а2-ГП I) классов IgG и IgM (Cabral A.R. и соавт., 1996; Miyakis S. и соавт., 2006). Клиническое значение аКЛ и а2-ГП I класса IgА, а также антител к другим ФЛ и кофакторным белкам (фосфатидилсерину, фосфатидилинозитолу, фосфатидилэтанола-мину, фосфатидилхолину, смеси ФЛ, протромбину – ПТ, комплексу фосфатидилсерин/ПТ, белкам C, S, Z и аннексину V) остается неясным. По мнению большинства исследователей эти субтипы аФЛ не являются лабораторными критериями достоверного АФС, однако могут оказаться полезными для диагностики «вероятного» или «пре – АФС» (Harris E.N., Pierangeli S.S., 2000; Asherson R.A., 2006; Miyakis S. и соавт., 2006). К одной из наиболее сложных проблем лабораторной диагностики АФС относится недостаточно высокая специфичность аКЛ. Показано, что, а2-ГП I обладают большей специфичностью, но меньшей чувствительностью в отношении диагностики АФС по сравнению с аКЛ (Reddel S.W., Krilis S.A., 1999). Однако в целом результаты изучения диагностической точности иммуноферментного метода определения аФЛ носят противоречивый характер и зависят от выбранного уровня позитивности, подбора групп больных АФС и методических особенностей анализа аФЛ.
аФЛ являются не только серологическим маркером и критерием диагноза АФС, но и патогенетическим медиатором тромбозов и акушерской патологии при АФС (Pierangeli S.S., Harris E.N., 1996; Rand J.H. и соавт., 2002; Насонов Е.Л., 2004; De Groot P.G., Derksen R.H.W.M., 2005; Giannokopoulos B. и соавт., 2007). Механизмы патогенетического действия аФЛ связаны с подавлением функциональной активности белков каскада свертывания крови (Shibata S. и соавт., 1994; De Groot P.G. и соавт., 1996), угнетением фибринолиза (Schousboe I., Rasmussen M.S., 1995), повреждением эндотелиальных клеток (Del Papa N. и соавт., 1997), активацией тромбоцитов (Wiener M.H. и соавт., 2001; Lutters B.C. и соавт., 2003) и моноцитов (Zhou H. и соавт., 2004).
Важным фактором поражения сосудистой стенки при АФС служит активация/дисфункция эндотелиальных клеток, индуцированная провоспалительными цитокинами (фактором некроза опухоли – ФНО, интерлейкином - 1 – ИЛ-1, интерфероном - ИФН), а также 2-ГП 1 зависимыми аФЛ, антиэндотелиальными клеточными антителами и антителами к ДНК, обладающими способностью перекрестно реагировать с эндотелием (Salogin K.V. и соавт., 1992; Cinez D.B. и соавт., 1998). Это проявляется гиперэкспрессией клеточных молекул адгезии (КМА), синтезом провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6), простагландинов, оксида азота, что ассоциируется с развитием тромботической васкулопатии, характерной для АФС. Основными серологическими маркерами дисфункции эндотелия являются растворимые (р) КМА и антиген фактора Виллебранда (ФВАг). Повышение концентрации рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP-селектина, рЕ-селектина) и ФВАг в сыворотке крови наблюдается при многих воспалительных, аутоиммунных, инфекционных, опухолевых заболеваниях, атеросклеротическом поражении сосудов, системных васкулитах (Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шилкина Н.П., 1999). Данные о связи гиперпродукции рКМА и ФВАг с развитием тромботических осложнений при АФС немногочисленны и противоречивы (Nassonov E. и соавт., 1994; Баранов А.А., 1998; Kaplanski G. и соавт., 2000).
Другой механизм активации эндотелия при АФС и СКВ опосредуется С-реактивным белком (СРБ), который усиливает экспрессию КМА на мембране эндотелиальных клеток (Verma S., Yeh E.T., 2003; Jialal I. и соавт., 2004; Khreiss T. и соавт., 2004; Venugopal S.K. и соавт., 2005). В последние годы СРБ, определяемый в сыворотке высокочувствительными (вч) иммунохимическими методами (вч-СРБ), рассматривается в качестве лабораторного маркера субклинического воспаления сосудистой стенки и возможного патогенетического медиатора тромбоза и атеротромбоза при АФС и СКВ (Насонов Е.Л., 2004). Поэтому изучение связи между сывороточной концентрацией вч-СРБ и клинико-лабораторными проявлениями АФС представляет несомненный интерес.
Внимание исследователей привлекает значение клеточных иммунных реакций в патогенезе АФС (Papo T. и соавт., 1994; Blank M. и соавт., 1995; Visvanathan S., McNeil H.P., 1999; Yoshida K. и соавт., 2002). Показано, что развитие АФС ассоциируется с поляризацией клеточного иммунного ответа по Th1 типу, характеризующегося 2-ГП 1 зависимым синтезом ИФН и ИЛ-2 CD4+ Т-лимфоцитами (Karakantza M. и соавт., 2004). Однако комплексное исследование цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18 и др.), участвующих в регуляции воспаления и антигенспецифического иммунного ответа, при АФС не проводилось. Также в рамках АФС мало изучено клинико - патогенетическое значение интегрального маркера активации клеточного иммунитета – неоптерина и Т-клеточного фактора пролиферации и дифференцировки В-клеток – рCD40 лиганда, играющих важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний и кардиоваскулярных осложнений (Насонов Е.Л., 2004).
Изучение лабораторных биомаркеров АФС представляется актуальным как с теоретических позиций в плане расшифровки иммунологических механизмов развития тромботической васкулопатии, так и с практической точки зрения для определения оптимальных подходов к диагностике, оценке активности, тяжести течения, прогноза и результатов лечения заболевания.
Цель исследования
Изучить особенности иммунологических нарушений при АФС в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания, оценить роль лабораторных иммунологических маркеров в диагностике и оценке прогноза АФС.
Задачи исследования
1. Разработать стандартный метод ИФА для количественного определения IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови.
2. Изучить связь между уровнем аФЛ в сыворотке крови и основными клиническими признаками АФС.
3. Оценить диагностическую точность и прогностическое значение ИФА аКЛ, а2 - ГП I и аПТ при АФС.
4. Исследовать сывороточный уровень лабораторных маркеров активации/дисфункции эндотелия - рКМА (рVCAM-1, pICAM-1, pP- селектина, рЕ-селектина) и ФВАг при АФС и оценить их связь с клинико-лабораторными проявлениями ПАФС и СКВ с АФС.
5. Определить сывороточную концентрацию вч-СРБ и его связь с развитием повреждения сосудистой стенки при ПАФС и СКВ с АФС.
6. Изучить клинико-патогенетическое значение серологических маркеров активации клеточного иммунитета при АФС, включая цитокины и их растворимые рецепторы (ФНО и рФНОРI, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-18), рCD40лиганд и неоптерин.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение иммунологических факторов повреждения сосудистой стенки при ПАФС и ВАФС, включая исследование аутоантител (аФЛ), показателей активации клеточного иммунитета (цитокины, рCD40-лиганд, неоптерин), маркеров дисфункции эндотелия (рКМА и ФВАг) и белков острой фазы воспаления (вч-СРБ), в зависимости от основных клинических проявлений заболевания.
Показано, что для диагностики и оценки прогноза АФС наиболее точными и эффективными тестами являются методы ИФА IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I, причем у IgG аКЛ выше диагностическая чувствительность, а у IgG а2 – ГП I – диагностическая специфичность.
При изучении маркеров активации эндотелия отмечена связь между гиперпродукцией рЕ-селектина у больных ПАФС и развитием венозных тромбозов и акушерской патологии. Выявлено увеличение концентрации ФВАг в сыворотках больных ПАФС и ВАФС, сопровождавшееся наличием венозных тромбозов в анамнезе и поражением клапанов сердца.
Впервые установлено повышение базального уровня вч-СРБ у больных ПАФС, сопоставимое с таковым у больных ВАФС и СКВ. Показано, что при АФС увеличение концентрации вч-СРБ ассоциируется с высоким риском кардиоваскулярных осложнений и наличием артериальных тромбозов.
При анализе показателей активации клеточного иммунитета продемонстрировано увеличение сывороточной концентрации Th1 цитокинов (ФНО, ИЛ-18) и рФНО-РI при ПАФС и ВАФС; Th2 цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10) при ВАФС. Выявлено, что повышение концентрации ИЛ-10 сопровождается уменьшением числа случаев тромбозов в анамнезе и снижением индекса повреждения, в то время как гиперпродукция ИЛ-18, ассоциируется с атеротромботическими нарушениями. При АФС установлена положительная корреляция значений рCD40 лиганда с увеличением числа случаев тромботических осложнений и наличием венозных тромбозов в анамнезе. Впервые обнаружено повышение уровня неоптерина при ПАФС и ВАФС, наиболее выраженное у больных с поражением клапанов сердца.
Доказана тесная взаимосвязь между образованием антифосфолипидных аутоантител, активацией эндотелиальных клеток, нарушениями Т – клеточной иммунорегуляции и хроническим субклиническим воспалением сосудистой стенки в развитии тромботической васкулопатии при АФС.
Практическая значимость
На основе полученных данных определен комплекс наиболее информативных и адекватных методов ИФА аФЛ для диагностики АФС и прогнозирования риска развития тромботических осложнений и акушерской патологии при данном заболевании. Обнаружение в сыворотках больных аКЛ и/или а2 - ГП I классов IgG и IgM в концентрации, превышающей M+5SD у доноров (IgG аКЛ 25,0 GPL, IgM аКЛ 24,7 MPL, IgG а2 - ГП I 15,3 ЕД/мл и IgM а2 - ГП I 17,0 ЕД/мл), рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики АФС. Для диагностики тромбозов наиболее полезными лабораторными тестами являются ИФА IgG аКЛ и ИФА IgG а2 – ГП I, акушерской патологии – ИФА IgG аКЛ. Наиболее полезными прогностическими маркерами тромбозов служат положительные результаты ИФА IgG а2 – ГП I, ПНБ – ИФА IgG аКЛ.
Повышенные уровни рЕ-селектина, ФВАг, вч-СРБ и рCD40 лиганда в сыворотках больных АФС являются дополнительными лабораторными маркерами тромботических осложнений данного заболевания.
Измерение сывороточной концентрации рКМА (рVCAM-1, рЕ-селектина, рР-селектина), ФВАг, цитокинов и их растворимых рецепторов (ИЛ-6, ФНО, рФНО-РI, ИЛ-10, ИЛ-18), неоптерина позволяет уточнить активность патологического процесса при ВАФС.
Положения, выносимые на защиту
1. Иммунологическими маркерами для диагностики АФС являются IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM а2 – ГП I, для прогнозирования риска тромботических осложнений и акушерской патологии при АФС – IgG/IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I.
2. Увеличение сывороточной концентрации рКМА и ФВАг отражает активацию/повреждение эндотелиальных клеток при АФС.
3. Повышенные уровни цитокинов, рCD40 лиганда и неоптерина в сыворотках больных АФС свидетельствуют о выраженной активации клеточного иммунитета при данном заболевании.
4. Увеличение продукции вч-СРБ является важным фактором тромбообразования при АФС.
Внедрение в практику
Методы определения аФЛ, рКМА, ФВАг, цитокинов, неоптерина, рCD40 лиганда и вч-СРБ внедрены в работу клинических подразделений ГУ Института ревматологии РАМН, в практику ГУ Научного центра неврологии РАМН, НИИ кардиологии им. А.Л. Мясникова ФГУ РКНПК Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, ММА им. И.М. Сеченова и других лечебных учреждений г. Москвы.
Материалы работы использовались в написании главы «Методы определения антител к фосфолипидам» в монографии «Патология сосудов при антифосфолипидном синдроме. Клиника, диагностика, лечение» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина, З.С. Алекберова. – М. – Ярославль, 1995), главы «Лабораторная диагностика системных васулитов» в монографии «Васкулиты и васкулопатии» (Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина. – Ярославль: Верхняя Волга, 1999), главы «Клиническое значение антифосфолипидных антител» в монографии «Антифосфолипидный синдром» (Е.Л. Насонов. – М., Литтерра, 2004), методического пособия «Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний» (М.: Биохиммак, 2006), главы «Лабораторная диагностика» в национальном руководстве по ревматологии (М.: Гэотар-Медиа, 2008).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 50 печатных работ: 37 статей, 13 тезисов, 11 из которых в иностранной печати.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на Четвертой конференции по ревматологии Северо-Западного федерального округа (Великий Новгород, 2004), научно-практической конференции «Проблема тромбозов в ревматологии» (Москва, 2004), Национальных днях лабораторной медицины России (Москва, 2004, 2005, 2006), IV Съезде ревматологов России (Казань, 2005), ежегодном Европейском конгрессе ревматологов EULAR (Вена, 2005; Амстердам, 2006), 10-ой Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006), научно-практической конференции «Роль воспаления в развитии ревматических заболеваний» (Москва, 2006), VIII конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), научно-практическом семинаре «Проблемы диагностики аллергии и аутоиммунных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2007), 10-ом юбилейном научно-образовательном форуме «Кардиология - 2008» (Москва, 2008), IV Всероссийской конференции «Инновационные технологии в ревматологии» (Нижний Новгород, 2008). Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого Совета ГУ Института ревматологии РАМН 10 апреля 2008 года.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 262 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 31 отечественных и 369 зарубежных источников. Диссертация проиллюстрирована 127 таблицами и 34 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ
Материалы и методы исследования
Общая клиническая характеристика больных
Обследовано 408 больных, в том числе 82 – с ПАФС (27 мужчин и 55 женщин; средний возраст 36,8±11,3 лет), 99 – с ВАФС, ассоциированным с СКВ (29 мужчин и 70 женщин; средний возраст 37,9±11,7 лет) и 227 – с СКВ без АФС (67 мужчин и 160 женщин; средний возраст 33,2±11,1 лет), наблюдавшихся в ГУ Институте ревматологии РАМН в период с 1993 по 2007 год. Группы больных не различались между собой по возрасту, однако средняя продолжительность заболевания у больных ВАФС (15,5±10,0 лет) была выше, чем у больных ПАФС (10,9±10,5 лет, p<0,001) и СКВ (9,3±8,7 лет, p<0,001). Во всех группах больных преобладали женщины.
Диагноз СКВ основывался на критериях Американской Коллегии Ревматологов (Tan E.M. и соавт., 1982; Hochberg M.C., 1997). Для оценки течения и активности СКВ использовались: классификация В.А. Насоновой (1972), индекс ECLAM (Vitali C. и соавт., 1992), индекс SLEDAI (Bombardier C. и соавт., 1992), индекс повреждения SLICC/ACR (Gladman D.D. и соавт., 1996). Диагноз АФС основывался на международных диагностических критериях W.А. Wilson и соавт. (1999). ПАФС верифицировался у больных АФС при отсутствии признаков других заболеваний.
Клинические и лабораторные проявления АФС в группах больных ПАФС и ВАФС представлены в табл. 1. Как следует из таблицы, преобладающими признаками АФС в обеих группах были тромбозы, а также повышенные уровни ВА и IgG аКЛ.
Таблица 1
Клинические и лабораторные проявления АФС (n=181)
| Признаки | ПАФС (n=82) | ВАФС (n=99) | Всего (n=181) |
| n (%) | n (%) | n (%) | |
| Тромбозы артериальные венозные артериальные+венозные ПНБ* Сетчатое ливедо Поражение ЦНС Поражение клапанного аппарата сердца Хронические язвы ног Гемолитическая анемия Тромбоцитопения ВА IgG аКЛ IgM аКЛ | 77 (94%) 17 (21%) 27 (33%) 33 (40%) 27/41 (66%) 47 (57%) 34 (42%) 35 (43%) 18 (22%) 19 (23%) 19 (23%) 64 (78%) 66 (81%) 34 (42%) | 92 (93%) 27 (27%) 40 (40%) 25 (25%) 33/49 (67%) 66 (67%) 59 (59%) 51 (52%) 40 (40%) 59 (59%) 42 (42%) 81 (82%) 79 (80%) 38 (38%) | 169 (93%) 44 (24%) 67 (37%) 58 (32%) 60/90 (67%) 113 (62%) 93 (51%) 86 (48%) 58 (32%) 78 (43%) 61 (33%) 145 (80%) 145 (80%) 72 (40%) |
П р и м е ч а н и е. * - в числителе число женщин с привычным невынашиванием беременности, в знаменателе – число женщин, имевших беременность.
Оценка характера течения и активности СКВ приведена в табл. 2. Большинство больных СКВ с/без АФС имели хроническое течение (57%), а также I и II степень активности заболевания (72%).
Таблица 2
Характеристика течения и активности СКВ
| Показатели | ВАФС (n=99) | СКВ (n=227) | Всего (n=326) |
| Течение, n (%) острое подострое хроническое Степень активности, n (%) I степень II степень III степень Индекс активности ECLAМ (баллы; M±SD) Индекс активности SLEDAI (баллы; M±SD) Индекс повреждения SLICC (баллы; M±SD) | 11 (12%) 21 (21%) 67 (67%) 36 (37%) 40 (40%) 23 (23%) 4,0±3,1 11,9±9,4 3,1±1,9 | 52 (23%) 56 (25%) 119 (52%) 78 (34%) 82 (36%) 67 (30%) 4,1±2,8 10,4±8,1 1,5±1,8 | 63 (19%) 77 (24%) 186 (57%) 114 (35%) 122 (37%) 90 (28%) 4,1±2,8 10,9±8,5 2,0±2,0 |
Частота клинических и лабораторных проявлений СКВ у больных с/без АФС (с учетом анамнеза) представлена в табл. 3.
Таблица 3
Клинические и лабораторные проявления СКВ
| Показатели | ВАФС (n=99) n (%) | СКВ (n=227) n (%) | Всего (n=326) n (%) |
| Фотосенсибилизация Эритема в форме «бабочки» Дискоидные высыпания Поражение слизистых оболочек (энантема, язвенный стоматит, хейлит) Артриты/артралгии Серозиты Нефрит Поражение ЦНС Гематологические нарушения Иммунологические нарушения Антинуклеарный фактор | 63 (64%) 62 (63%) 15 (15%) 43 (43%) 84 (85%) 57 (58%) 47 (47%) 59 (60%) 77 (78%) 94 (95%) 86 (87%) | 160 (71%) 148 (65%) 33 (15%) 94 (41%) 201 (89%) 148 (65%) 119 (52%) 88 (39%) 155 (68%) 209 (92%) 200 (88%) | 223 (68%) 210 (64%) 48 (15%) 137 (42%) 285 (87%) 205 (63%) 166 (51%) 147 (45%) 232 (71%) 303 (93%) 286 (88%) |
Контрольная группа состояла из 286 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными.
Методы исследования
Всем больным проводилось полное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование с использованием стандартных методов, применяемых в ГУ Институт ревматологии РАМН.
Рентгенография органов грудной клетки выполнялась в рентгенологическом отделении ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая отделением – к.м.н. И.А.Удельнова).
Электрокардиографическое, эхокардиографическое и ультразвуковое исследование внутренних органов проводились в лаборатории функциональной диагностики ГУ Института ревматологии РАМН (руководитель – д.м.н., профессор Э.С. Мач). Состояние сосудов конечностей (артерий и вен) и церебрального кровообращения оценивалось методом ультразвукового дуплексного сканирования периферических и церебральных сосудов на УЗ-аппарате «Voluson 730 Expert» (Австрия) линейным датчиком частотой излучения 7,5 MHz. Тромбозы церебральных сосудов были подтверждены проведением компъютерной и магнитно-резонансной томографии головного мозга.
Исследование гематологических, биохимических показателей крови и анализов мочи проводилось унифицированным методом в биохимической лаборатории ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая лабораторией – к.б.н. Л.Н. Кашникова).
Общее иммунологическое обследование больных, включавшее определение антинуклеарного фактора методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием срезов печени крыс и НЕр-2 клеток человека; IgM-ревматоидного фактора в реакции латекс-агглютинации; иммуноглобулинов классов G,M,A методом радиальной иммунодиффузии; циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) турбидиметрическим методом с помощью преципитации 3,5% полиэтиленгликолем (молекулярная масса 6000 кДа); общей гемолитической активности комплемента CH50 по 50% гемолизу (метод Кэбот и Мейер), выполнялось в лаборатории клинической иммунологии ГУ Института ревматологии РАМН (руководитель – д.м.н., профессор А.И. Сперанский).
ВА определяли по удлинению времени свертывания крови в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах при использовании свежей цитратной плазмы, бедной тромбоцитами (Brandt J.T. и соавт., 1995; Баркаган З.С. и соавт., 2000). Скрининговыми тестами являлись активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), каолиновое время свертывания (КВС), АЧТВ с добавлением яда гадюки Рассела. Подтверждающими методами были коррекция нарушений коагуляции при добавлении ФЛ и сохранение удлинения времени свертывания при смешивании исследуемой и донорской плазмы. Тестирование ВА осуществлялось ручным методом в дубликатах с помощью наборов реагентов «Ренам» (Россия) в биохимической лаборатории ГУ Института ревматологии РАМН (заведующая лабораторией – к.б.н. Л.Н. Кашникова), а также на автоматическом коагулометре CA 560 («Sysmax», Япония) при использовании наборов реагентов LA1 (Screening Reagent) и LA2 (Confirmation Reagent) фирмы «Dade Behring» (Германия).
Количественное определение IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови в единицах GPL/MPL проводилось стандартным методом ИФА (Gharavi A.E. и соавт. 1987) в модификации с использованием калибратора собственного изготовления в пяти разведениях (1:50 – 1:800), тестированного относительно международных стандартов. Средний уровень (M±SD) IgG/IgM аКЛ в сыворотках здоровых доноров составил 4,5±4,1 GPL (n=178) и 7,2±3,5 MPL (n=87) соответственно. Для увеличения достоверности результатов определения аКЛ в качестве верхней границы нормы была принята концентрация аКЛ, превышающая средние значения данного показателя у доноров на 5 SD (M+5SD), т.е. 25,0 GPL и 24,7 MPL. Сыворотки с более высокой концентрацией IgG/IgM аКЛ рассматривали как позитивные. Выделены высоко (65,0 GPL и 45,0 MPL), умеренно (35,0-65,0 GPL и 35,0-45,0 MPL), низко (25,0-35,0 GPL и 24,7-35,0 MPL) позитивные и негативные (25,0 GPL и 24,7 MPL) уровни аКЛ.
Концентрацию IgG/IgM а2 – ГП I в сыворотке крови определяли методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-beta-2-Glycoprotein I IgG/IgM («ORGENTEC Diagnostika», Германия). Верхняя граница нормы для IgG а2 – ГП I и IgM а2 – ГП I (М+5SD), полученная при исследовании 74 сывороток здоровых доноров, составляла 15,3 ЕД/мл и 17,0 ЕД/мл соответственно. Установлены высоко (60,0 ЕД/мл), умеренно (30,0-60,0 ЕД/мл), низко (15,3-30,0 ЕД/мл и 17,0-30,0 ЕД/мл) позитивные и негативные (15,3 ЕД/мл и 17,0 ЕД/мл) уровни IgG а2 – ГП I и IgM а2 – ГП I соответствено.
Определение аПТ классов IgG и IgM в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-Protrombin IgG/IgM («ORGENTEC Diagnostika», Германия). Верхняя граница нормы (М+5SD) при исследовании 33 сывороток здоровых доноров составляла 10,1 ЕД/мл для IgG аПТ и 9,8 ЕД/мл для IgM аПТ, что совпадает с рекомендациями фирмы-изготовителя (10,0 ЕД/мл).
Определение анДНК в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов KallestadTM Anti-dsDNA Microplate EIA («BIO-RAD Laboratories», США). Согласно рекомендациям фирмы-изготовителя за верхнюю границу нормы была принята концентрация анДНК, равная 30,0 МЕ/мл.
Концентрацию рVCAM-1, рICAM-1, рP-селектина и рЕ-селектина в сыворотке крови измеряли методом ИФА с помощью коммерческих наборов реагентов Parameter human sVCAM-1, sICAM-1, sP-Selectin, sE-Selectin Immunoassay («R&D Systems», США). У здоровых доноров верхняя граница нормы (М+1SD) для рVCAM-1 составляла 881 нг/мл (n=37), рICAM-1 – 338 нг/мл (n=17), рP-селектина – 174 нг/мл (n=38), рЕ-селектина – 49,9 нг/мл (n=8).
Количественное определение ФВАг в сыворотке крови проводилось твердофазным иммуноферментным методом (Баранов А.А. и соавт., 1997). Верхняя граница нормы для ФВАг (М+3SD), полученная при исследовании 69 сывороток здоровых доноров, составляла 2,48 МЕ/мл.
Сывороточную концентрацию вчСРБ измеряли высокочувствительным иммунонефелометрическим методом с латексным усилением на анализаторе BN-100 («Dade Behring», Германия) при использовании реагентов CardioPhase hs CRP («Dade Behring», Германия). Чувствительность метода составляла 0,175 мг/л.
Определение сывороточной концентрации ИЛ-6 и ФНО- проводили методом ИФА с помощью коммерческих наборов реагентов Human IL-6 и TNF- UltraSensitive ELISA («BioSource International, Inc.», США); рФНОРI, ИЛ-10, ИЛ-18 и рCD40 лиганда – используя коммерческие тест-системы Human sTNF-R (60 kDa), IL-10, IL-18, sCD40L ELISA («Bender MedSystems», Австрия). У здоровых доноров верхняя граница нормы (М+2SD) для ИЛ-6 составляла 1,58 пг/мл (n=27), ФНО- – 2,35 пг/мл (n=20), рФНОРI – 3,04 нг/мл (n=54), ИЛ-18 – 51,7 пг/мл (n=20); концентрация ИЛ-10 не превышала 0,01 пг/мл (n=20). Верхняя граница нормы (М+1SD) для рCD40 лиганда соответствовала 7,37 нг/мл (n=36).
Концентрацию неоптерина в сыворотке крови измеряли методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Neopterin ELISA («IBL», Германия). Верхняя граница нормы (М+2SD) при тестировании 30 сывороток здоровых доноров составляла 11,7 нмоль/л.
Оценка диагностической точности ИФА аФЛ осуществлялась путем расчета операционных характеристик теста: диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), предсказательной ценности положительного и отрицательного результатов (ПЦПР и ПЦОР), отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР и ОПОР) (Реброва О.Ю., 2003). Наиболее полезными для диагностики АФС являлись лабораторные тесты с ОППР>5 и ОПОР<0,2; полезными – с ОППР>2 и 5, ОПОР>0,2 и 0,5; не имеющими пользы - с ОППР2 и ОПОР>0,5. Для анализа диагностической эффективности лабораторных тестов использовалась также характеристическая кривая (ROC-кривая), отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов (чувствительность) от частоты ложноположительных результатов (1-специфичность). Клиническая информативность лабораторного теста определялась тем, насколько высоко лежит его ROC-кривая. Для оценки ROC–кривых вычислялась площадь под кривой (AUC), варьирующая от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста). Отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал для него (ОШ, ДИ 95%) оценивались по методу Woolf (Реброва О.Ю., 2003).
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «Stаtistica 6,0» («StatSoft», США), включая общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. При сравнении параметров с нормальным распределением применялся парный t-тест для независимых выборок, результаты представлены в виде среднего значения (М) и среднего квадратичного отклонения (SD). Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовали критерий Манна-Уитни, а при сравнении трех и более групп – критерий Краскела-Уоллеса, результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (ИР, 25-й – 75-й процентили). Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05.
Результаты исследования
Уровень антифосфолипидных антител и
клинико-лабораторные проявления антифосфолипидного
синдрома
Результаты определения концентрации аФЛ в сыворотках больных ПАФС, ВАФС и СКВ и доноров представлены в табл. 4.
Таблица 4
Уровни аФЛ в сыворотках больных ПАФС, ВАФС, СКВ и доноров, Ме (ИР)
| аФЛ | Группы обследованных | |||
| ПАФС | ВАФС | СКВ | Доноры | |
| аКЛ IgG (GPL) IgM (MPL) | 56,3 (23,0-123,6)* n=82 11,2 (6,0-40,2)* n=80 | 38,0 (17,5-81,7)* n=99 14,4 (4,2-38,0)* n=97 | 11,3 (5,2-23,8)* n=224 6,5 (3,3-12,4) n=221 | 3,2 (1,5-6,4) n=178 7,1 (4,6-9,6) n=87 |
| а2 – ГП I IgG (ЕД/мл) IgM (ЕД/мл) | 15,5 (4,2-62,3)* n=66 2,3 (1,2-8,3) n=51 | 13,4 (5,5-46,9)* n=73 2,6 (0,9-5,7) n=35 | 3,0 (1,5-5,7) n=96 2,6 (0,9-5,7) n=31 | 5,5 (3,9-6,6) n=74 2,4 (1,5-4,1) n=74 |
| аПТ IgG (ЕД/мл) IgM (ЕД/мл) | 3,1 (0,1-7,7) n=33 0,1 (0,1-2,5) n=33 | 4,5 (2,7-8,3)* n=38 2,6 (0,2-5,4)* n=38 | 4,0 (2,7-7,3)* n=18 1,9 (0,9-4,3)* n=18 | 2,2 (0,2-3,1) n=33 0,6 (0,1-1,8) n=33 |
П р и м е ч а н и е. *р<0,05 относительно доноров.
Антитела к кардиолипину
Сывороточный уровень IgG аКЛ у больных ПАФС, ВАФС и СКВ был достоверно выше данного показателя у доноров (p<0,001).
При ПАФС и ВАФС выявлена более высокая концентрация IgG аКЛ, чем при СКВ (p<0,001). Статистически значимых различий по уровню IgG аКЛ между группами больных ПАФС и ВАФС не обнаружено (p>0,05). Увеличение сывороточной концентрации IgG аКЛ отмечалось у 72% больных ПАФС, 68% больных ВАФС и 24% больных СКВ, причем высоко позитивные результаты определения IgG аКЛ имели 46% больных ПАФС, 36% больных ВАФС и 5% больных СКВ. При ВАФС уровень и частота обнаружения IgG аКЛ у 27 больных с артериальными тромбозами были выше, чем у 40 больных с венозными тромбозами – 47,9 (33,5-107,3) GPL и 26,7 (14,4-57,3) GPL (p<0,03); 78% и 50% (p<0,05) соответственно. При ПАФС уровень IgG аКЛ в сыворотках 29 больных с поражением клапанов сердца (72,9; 35,0-143,0 GPL) в 2 раза превышал соответствующий показатель у 38 больных без патологических изменений клапанов сердца (35,9; 16,7-88,0 GPL; p<0,02). Наряду с этим при ПАФС уровень IgG аКЛ отрицательно коррелировал с количеством тромбоцитов в крови (n=65; r=-0,3; p<0,02). У больных СКВ отмечена положительная корреляция между значениями IgG аКЛ, SLEDAI (n=202; r=0,2; p<0,01), ECLAM (n=170; r=0,2; p<0,03), анДНК (n=181; r=0,3; p<0,001) и ЦИК (n=196; r=0,2; p<0,01).
Сывороточный уровень IgM аКЛ у больных ПАФС и ВАФС достоверно превышал данный показатель у доноров и больных СКВ (p<0,001). Статистически значимых различий по уровню IgG аКЛ между группами больных ПАФС и ВАФС не обнаружено (p>0,05). При СКВ медиана концентрации IgM аКЛ была в пределах нормы. Увеличение сывороточной концентрации IgM аКЛ отмечено у 34% больных ПАФС, 39% больных ВАФС и 12% больных СКВ. Высоко и умеренно позитивные результаты определения IgM аКЛ имели 28% больных ПАФС, 32% больных ВАФС и 4% больных СКВ. У больных АФС обнаружена положительная корреляция между сывороточными уровнями IgM аКЛ и IgG аКЛ (n=177; r=0,4; p<0,001). Увеличение концентрации аКЛ обоих классов выявлено у 29% больных ПАФС, 31% больных ВАФС и 4% больных СКВ. Изолированное повышение уровня IgG аКЛ отмечалось у 44% больных ПАФС, 34% больных ВАФС и 18% больных СКВ. Изолированное увеличение концентрации IgM аКЛ встречалось значительно реже – у 5% больных ПАФС, 8% больных ВАФС и 8% больных СКВ. В группе больных АФС с изолированным повышением уровня IgM аКЛ (n=12) артериальные тромбозы (8%) и поражение клапанов сердца (25%) наблюдались с меньшей частотой по сравнению с больными, позитивными одновременно по IgG/IgM аКЛ (n=53) (30% и 55% соответственно; p<0,05), а кожные язвы ног – чаще, чем у больных с изолированным обнаружением IgG аКЛ (n=68) (58% и 28%; p<0,02). При АФС концентрация IgM аКЛ отрицательно коррелировала с количеством тромбоцитов в крови (n=150; r=-0,3; p<0,001). У больных СКВ увеличение сывороточной концентрации IgM аКЛ было связано с повышением SLEDAI (n=199; r=0,2; p<0,05), ECLAM (n=172; r=0,2; p<0,05) и уровня ЦИК (n=198; r=0,2; p<0,001).
Антитела к 2 - гликопротеину I
Сывороточный уровень IgG а2 - ГП I у больных ПАФС и ВАФС был выше, чем у доноров и больных СКВ (р<0,001). Статистически значимых различий по уровню IgG а2 - ГП I между группами больных ПАФС и ВАФС не обнаружено (p>0,05). У больных СКВ медиана концентрации IgG а2 - ГП I не превышала таковую у доноров. Увеличение концентрации IgG а2 - ГП I отмечалось у 50% больных ПАФС, 47% больных ВАФС и 9% больных СКВ, при этом высоко позитивные результаты определения IgG а2 - ГП I имели 26% больных ПАФС, 21% больных ВАФС и 1% больных СКВ. Уровень IgG а2 – ГП I в сыворотках 5 больных ПАФС с тромбоцитопенией (194,4; 42,2-230,8 ЕД/мл) был выше, чем у 51 больного ПАФС без тромбоцитопении (9,6; 4,1-44,9 ЕД/мл; p<0,01). При АФС обнаружена положительная корреляция между уровнями IgG а2 - ГП I и IgG аКЛ (n=139; r=0,6; p<0,001) в крови. Одновременное увеличение концентрации IgG а2 - ГП I и IgG аКЛ обнаружено у 44% больных ПАФС, 40% больных ВАФС и 7% больных СКВ. Изолированное повышение уровня IgG аКЛ отмечалось у 29% больных ПАФС, 26% больных ВАФС и 12% больных СКВ. Изолированное увеличение концентрации IgG а2 - ГП I встречалось значительно реже, чем IgG аКЛ, – у 6% больных ПАФС, 5% больных ВАФС и 2% больных СКВ. При АФС в группе больных с сочетанной гиперпродукцией IgG аКЛ и IgG а2 - ГП I (n=58) эти антитела выявлялись преимущественно в высоких титрах (с частотой 74% и 56% соответственно), а в группах больных с изолированным увеличением IgG аКЛ (n=38) и IgG а2 - ГП I (n=8) – в низких и умеренных титрах (с частотой 66% и 100% соответственно). В то же время достоверных различий по спектру клинических проявлений в сравниваемых группах больных АФС не обнаружено. При СКВ уровень IgG а2 - ГП I положительно коррелировал с концентрацией анДНК (n=72; r=0,4; p<0,001) и ЦИК (n=196; r=0,2; p<0,01) в крови.
Достоверных различий по уровню IgМ а2 - ГП I у больных ПАФС, ВАФС и СКВ и здоровых доноров не выявлено (p>0,05). Увеличение сывороточной концентрации IgМ а2 - ГП I отмечалось у 16% больных ПАФС, 6% больных ВАФС и 3% больных СКВ, при этом высоко позитивные результаты определения IgМ а2 - ГП I имели 4% больных ПАФС и 3% больных ВАФС. При ПАФС уровень IgM а2 - ГП I в сыворотках 17 больных с ПНБ был выше, чем у 15 больных без признаков акушерской патологии – 8,3 (2,5-23,6) ЕД/мл и 1,9 (1,2-5,3) ЕД/мл соответственно (р<0,05), причем наиболее высокая концентрация IgM а2 - ГП I определялась у 5 больных с ПНБ, но без тромботических осложнений в анамнезе, – 19,2 (4,0-27,2) ЕД/мл. Одновременное увеличение концентрации IgG а2 - ГП I и IgM а2 - ГП I обнаружено у 12% больных ПАФС. Изолированное повышение уровня IgG а2 - ГП I отмечалось у 41% больных ПАФС, 43% больных ВАФС и 7% больных СКВ. Изолированное увеличение концентрации IgM а2 - ГП I встречалось значительно реже по сравнению с IgG а2 - ГП I – у 4% больных ПАФС, 6% больных ВАФС и 1% больных СКВ. При АФС отмечена положительная корреляционная связь между уровнями IgM а2 - ГП I и IgM аКЛ в сыворотке крови (n=86; r=0,4; p<0,001). Сочетанное увеличение концентрации IgM а2 - ГП I и IgM аКЛ обнаружено 10% больных ПАФС, 6% больных ВАФС и 3% больных СКВ. Изолированное повышение уровня IgM аКЛ отмечалось у 26% больных ПАФС, 49% больных ВАФС и 19% больных СКВ, а IgM а2 - ГП I – только у 6% больных ПАФС.
Антитела к протромбину
Медиана концентрации IgG/IgМ аПТ при ПАФС не отличалась от нормы, а при ВАФС и СКВ была выше, чем у доноров (p<0,05). Достоверных различий по уровню IgG аПТ между больными ПАФС, ВАФС и СКВ не выявлено (p>0,05), в то же время уровень IgМ аПТ у больных ПАФС был ниже, чем у больных ВАФС (p<0,02) и СКВ (p<0,01). Увеличение сывороточной концентрации аПТ класса IgG отмечалось у 18% больных ПАФС, 11% больных ВАФС и 17% больных СКВ; класса IgM – у 3% больных ПАФС, 11% больных ВАФС и 11% больных СКВ. При ВАФС уровень IgM аПТ у 14 больных с венозными тромбозами был выше, чем у 12 больных с артериальными тромбозами – 5,0 (2,7-8,1) ЕД/мл и 1,5 (0,4-3,7) ЕД/мл (p<0,02). При АФС отмечена положительная корреляционная связь уровня IgM аПТ с концентрацией IgG аПТ (n=71; r=0,5; p<0,001), IgM аКЛ (n=38; r=0,4; p<0,01) и IgM а2 - ГП I в сыворотке крови (n=20; r=0,5; p<0,02). Позитивными одновременно по IgG аКЛ, IgG а2 - ГП I и IgG аПТ являлись 7% больных ПАФС и 7% больных ВАФС; позитивными по IgG аКЛ и IgG а2 - ГП I, но негативными по IgG аПТ – 38% больных ПАФС и 28% больных ВАФС; позитивными только по IgG аПТ – 7% больных ПАФС, 3% больных ВАФС и 18% больных СКВ. Позитивными одновременно по IgM аКЛ, IgM а2 - ГП I и IgM аПТ являлись 5% больных ВАФС; позитивными по IgM аКЛ и IgM а2 - ГП I, но негативными по IgM аПТ – 13% больных ПАФС; позитивными только по IgM аПТ – 4% больных ПАФС, 15% больных ВАФС и 12% больных СКВ. При ВАФС повышение уровня IgG аПТ было связано с увеличением концентрации анДНК в крови (n=20; r=0,5; p<0,05). При СКВ обнаружена положительная корреляция значений IgG аПТ с ECLAM (n=12; r=0,7; p<0,01) и уровнем анДНК (n=10; r=0,7; p<0,02), но отрицательная корреляция с количеством тромбозов в анамнезе (n=18; r=-0,5; p<0,03).
Полученные результаты подтверждают данные многих исследователей о связи между гиперпродукцией аФЛ и развитием АФС (Насонов Е.Л. и соавт., 1987; Cabiedes J. и соавт., 1995; Amengual O. и соавт., 1996; Horbach D.A. и соавт., 1996; Tsutsumi A. и соавт., 1996; Guerin J. и соавт., 1997; Решетняк Т.М. и соавт., 1997; Detkova D. и соавт., 1999; Reddel S.W., Krilis S.A., 1999; Bertolaccini M.L. и соавт., 2005). Уровни IgG/IgM аКЛ и IgG а2 - ГП I в сыворотках больных ПАФС и ВАФС существенно не различались между собой и были достоверно выше, чем у больных СКВ без АФС и у доноров, что соответствует данным других авторов (Cabiedes J. и соавт., 1995; Amengual O. и соавт., 1996; Horbach D.A. и соавт., 1996; Detkova D. и соавт., 1999; Bertolaccini M.L. и соавт., 2005). В отличие от результатов, опубликованных D. Detkova и соавт. (1999) и M.L. Bertolaccini и соавт. (2005), не обнаружено cтатистически значимых различий по среднему уровню IgМ а2 - ГП I у больных ПАФС, ВАФС, СКВ и доноров. Сходные данные об отсутствии достоверно более высокой концентрации IgМ а2 - ГП I у больных ПАФС по сравнению с больными СКВ без АФС и донорами приводит D.A. Horbach и соавт. (1996). M.L. Bertolaccini и соавт. (2005) выявили более высокий уровень IgG аПТ при СКВ с АФС по сравнению с СКВ без АФС, в то же время концентрация IgМ аПТ в этих группах больных была примерно одинаковой. По данным D.A. Horbach и соавт. (1996) значения IgG аПТ при ПАФС и IgМ аПТ – при ПАФС и СКВ с АФС, были выше таковых при СКВ без АФС, однако различий между титрами IgG аПТ у больных СКВ с и без АФС авторами не прослеживалось.
При АФС отмечена достоверная прямая корреляция между сывороточными уровнями различных аФЛ, что совпадает с результатами других авторов (Amengual O. и соавт., 1996; Tsutsumi A. и соавт., 1996; Cucurull E. и соавт., 1999; Detkova D. и соавт., 1999). По этом наиболее выраженная корреляционная взаимосвязь имела место между IgG аКЛ и IgG а2 - ГП I. У больных с изолированным увеличением аКЛ или а2 - ГП I уровень соответствующих антител был более низким, чем у больных, в сыворотке которых выявлялись оба типа антител. Сходные данные получены A. Tsutsumi и соавт. (1996) и O. Amengual и соавт.(1999) и E. Cucurull и соавт. (1999).
Показано, что повышение уровня IgG аКЛ при ВАФС и сочетанное увеличение концентрации IgG аКЛ и IgM аКЛ при АФС ассоциируется с артериальными тромбозами, в то время как возрастание титров IgM аПТ при ВАФС – с венозными тромбозами. Обнаружение IgG а2 - ГП I и IgG аПТ в сыворотках больных АФС не зависело от локализации тромбозов в сосудистом русле, а уровень IgM а2 - ГП I при тромбозах был в пределах нормы. Анализ систематических обзоров литературы свидетельствует о связи положительных результатов определения аКЛ с артериальными тромбозами, а2 – ГП I – с венозными тромбозами (Galli M. и соавт., 2003). При этом отмечено, что увеличение IgM а2 – ГП I реже сопровождается развитием тромботических осложнений по сравнению с IgG а2 – ГП I. Имеются также данные о более частом развитии венозных тромбозов у больных СКВ с АФС в присутствии IgG/IgM аПТ (Horbach D.A. и соавт., 1996; Puurunen M. и соавт., 1996).
Наиболее выраженное повышение уровня IgM а2 - ГП I обнаружено у больных ПАФС с акушерской патологией. По данным литературы развитие акушерской патологии при АФС чаще ассоциируется с обнаружением аКЛ и а2 – ГП I класса IgG (Tsutsumi A. и соавт., 1996; Cucurull E. и соавт., 1999; Musial J. и соавт., 2003). Однако в некоторых работах указывается на достоверное увеличение у больных АФС с ПНБ титров аКЛ и а2 – ГП I класса IgM (De Laat H.B. и соавт., 2006; Sahin M. и соавт., 2007).
При анализе уровня аФЛ в зависимости от нетромботических проявлений АФС отмечена тесная связь между повышением уровня IgG/IgM аКЛ и поражением клапанов сердца у больных ПАФС, что соответствует данным, приведенным в литературе (Khamashta M.A. и соавт., 1990; Turiel M. и соавт., 2000). Наряду с этим изолированное увеличение сывороточной концентрации IgM аКЛ наиболее часто имело место у больных АФС с хроническими язвами ног. Сходные результаты о достоверной связи гиперпродукции IgM аКЛ и IgM а2 - ГП I с хроническими язвами нижних конечностей представлены J.-C. Wasmuth и соавт. (2002).
В группе больных ПАФС с тромбоцитопенией наблюдалось повышение уровня IgG а2 – ГП I, при этом титры IgG/IgM аКЛ и IgG а2 - ГП I отрицательно коррелировали с числом тромбоцитов в крови. Установлено, что увеличение титров IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM а2 - ГП I при АФС ассоциируется с гематологическими нарушениями, включая тромбоцитопению и гемолитическую анемию (Nojima J. и соавт., 1998; Cucurull E. и соавт., 1999; Detkova D. и соавт., 1999). При этом по данным ряда авторов тромбоцитопения и гемолитическая анемия у больных АФС чаще связаны с гиперпродукцией аФЛ класса IgM, в основном IgM аКЛ, IgM а2 - ГП I и IgM антител к фосфатидилсерину (Lpez-Soto A. и соавт., 1997; Voss A. и соавт., 2001; Musial J. и соавт., 2003; Sahin M. и соавт., 2007).
Положительные результаты определения аКЛ, а2 - ГП I и аПТ класса IgG при СКВ с и без АФС коррелировали с увеличением концентрации анДНК в крови, что может являться следствием перекрестной реактивности аФЛ и аДНК и косвенно отражать иммунологическую активность патологического процесса, связанного с СКВ. Другими авторами также указывается на положительную корреляцию уровня IgG а2 - ГП I с титрами анДНК (Tsutsumi A. и соавт., 1996) и более высокую концентрацию IgG/IgM аКЛ в сыворотках больных СКВ с АФС при наличии анДНК (Sahin M. и соавт., 2007).
Диагностическая точность и прогностическое значение
иммуноферментного анализа антифосфолипидных антител
при антифосфолипидном синдроме
Результаты оценки диагностической точности и прогностического значения ИФА аФЛ при АФС в зависимости от значений “сut off” представлены в табл. 5, 6 и 7. В качестве “сut off” были проанализированы различные уровни позитивности аФЛ, включая выбранную нами верхнюю границу нормы (M+5SD), 99-ый процентиль нормы, титры, соответствующие умеренно и высоко позитивным результатам определения аКЛ (40 GPL/MPL), а также точку разделения между нормой и патологией, наиболее близкую к перегибу ROC-кривой.
Анализ операционных характеристик ИФА аФЛ относительно верхней границы нормы (M+5SD) показал, что полезными маркерами для диагностики АФС (ОППР >2) являются IgG аКЛ, IgM аКЛ, IgG а2 – ГП I и IgM а2 – ГП I (табл. 5). При этом IgG аКЛ и IgM аКЛ обладают более высокой чувствительностью (p<0,01 и p<0,001 по сравнению с IgG а2 – ГП I и IgМ а2– ГП I
соответственно), а IgG а2 – ГП I и IgМ а2 – ГП I –специфичностью
(p<0,01 и p<0,05 по сравнению с IgG аКЛ и IgM аКЛ соответствен-
но). В отличие от IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM а2 – ГП I исследование IgG/IgM аПТ не представляет диагностической ценности при АФС (ОППР<1,0; ОПОР>1,0). Уровни позитивности относительно 99-го процентиля нормы для IgG аКЛ (16,3 GPL), IgM аКЛ (15,3 MPL), IgG а2 – ГП I (12,0 ЕД/мл) и IgМ а2 – ГП I (13,1 ЕД/мл) оказались
Таблица 5
Диагностическая точность иммуноферментного анализа аФЛ относительно АФС
| Тип аФЛ | аКЛ | а2 – ГП I | аПТ | ||||
| IgG | IgM | IgG | IgM | IgG | IgM | ||
| Анализ по верхней границе нормы (M+5SD) | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР | 25,0 GPL 68,0 76,3 69,9 74,6 2,16 0,54 | 24,7 MPL 36,7 87,3 69,9 63,3 2,89 0,73 | 15,3ЕД/мл 47,5 90,6 88,0 72,5 5,1 0,58 | 17,0ЕД/мл 11,6 96,8 90,9 28,3 3,60 0,91 | 10,0ЕД/мл 14,1 83,3 76,9 19,7 0,84 1,03 | 10,0ЕД/мл 7,0 88,9 71,4 19,5 0,84 1,03 | |
| Анализ по умеренной и высокой степени позитивности (40,0 GPL и 40,0 MPL) | |||||||
| Cut off ДЧ(%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР | 40,0 GPL 51,9 87,5 77,0 62,3 4,15 0,65 | 40,0 MPL 24,3 96,4 84,3 61,4 6,75 0,79 | - | - | - | - | |
| Анализ по 99-му процентилю | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР | 16,3 GPL 80,7 62,9 63,8 80,1 2,17 0,31 | 15,3 MPL 46,3 79,2 64,1 64,8 2,23 0,68 | 12,0ЕД/мл 52,5 89,6 88,0 56,6 5,05 0,53 | 13,1ЕД/мл 12,8 93,5 84,6 27,9 1,97 0,93 | - | - | |
| Анализ по ROC-кривым | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) AUC ДИ (95%) | 24,0 GPL 69,1 75,4 0,798 0,755- 0,842 | 13,3 MPL 50,8 77,4 0,660 0,605- 0,715 | 8,1 ЕД/мл 61,9 86,5 0,813 0,758- 0,868 | 3,2 ЕД/мл 43,0 74,2 0,571 0,456- 0,685 | 4,1ЕД/мл 50,7 55,6 0,453 0,321- 0,584 | 2,2 ЕД/мл 42,3 61,1 0,388 0,261- 0,515 | |
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 6 и7 группой сравнения для расчета операционных характеристик тестов являлись больные СКВ.
ниже соответствующих показателей по верхней границе нормы (М+5SD), что сопровождалось увеличением ДЧ и уменьшением ДС при сходных значениях ОППР и ОПОР данных тестов. При “сut off” 40 GPL/MPL наоборот отмечалось уменьшение ДЧ и увеличение ДС на фоне повышения ОППР до 4,15 для IgG аКЛ и 6,75 для IgM аКЛ. Сравнительная оценка точности ИФА аФЛ по верхней границе нормы (M+5SD) и с помощью ROC-кривых выявила совпадение значений “сut off” (24,0-25,0 GPL), ДЧ и ДС для IgG аКЛ. По данным ROC-анализа у IgM аКЛ, IgG/IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ показатели “сut off” и ДС были ниже, а ДЧ – выше, чем соответствующие параметры, рассчитанные относительно верхней границы нормы (M+5SD). В целом при всех рассмотренных уровнях позитивности IgG а2 – ГП I являлись наиболее специфичными, IgG аКЛ – наиболее чувствительными, а IgG/IgМ аПТ – не имеющими пользы серологическими маркерами АФС. Площадь под ROC-кривой (AUC) при тестировании IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I была примерно одинаковой, превосходя таковую у IgM аКЛ (p<0,001 в обоих случаях) и IgМ а2 – ГП I (p<0,001 в обоих случаях), что свидетельствует о наибольшей эффективности ИФА IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I для диагностики АФС. У IgG/IgМ аПТ диагностическая эффективность при АФС отсутствовала (AUC<0,5).
При анализе по верхней границы нормы (M+5SD) полезными маркерами для диагностики тромбозов (ОППР>2 и 5) являлись IgG аКЛ, IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I, среди которых более высокой чувствительностью обладали IgG аКЛ (p<0,001 и p<0,01 по сравнению с IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I соответственно), а специфичностью – IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I (p<0,001 и p<0,01 по сравнению с IgG аКЛ соответственно) (табл. 6). Тестирование IgM а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ не имело диагностического значения (ОППР<1 и ОПОР >1) в отношении тромбозов. При оценке точности ИФА аФЛ для диагностики тромбозов с использованием 99-ого процентиля нормы единственным полезным тестом оказалось определение IgG а2 – ГП I (ОППР – 3,24; ОПОР – 0,60), в то время как у IgG/IgM аКЛ уменьшение “сut off” сопровождалось понижением ОППР <2. При “сut off” 40 GPL/MPL у IgG аКЛ и IgM аКЛ одновременно с уменьшением ДЧ (48,4% -
22,5%) отмечалось повышение ДС до 85,3-95,3% и ОППР - до 3,32-4,79 относительно тромбозов. По данным ROC-анализа IgG аКЛ, IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I имели сходную ДС для диагностики тромбозов, при этом IgG аКЛ проявляли наибольшую ДЧ. AUC у IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I превышала данный показатель у IgM аКЛ
(p<0,001 в обоих случаях), что указывает на более высокую диагностическую информативность определения IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I относительно тромбозов по сравнению с IgM аКЛ. У IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ диагностическая эффективность при тромбозах, ассоциирующихся с АФС отсутствовала (AUC<0,5).
Таблица 6
Диагностическая точность и прогностическое значение иммуноферментного анализа аФЛ относительно тромбозов
| Тип аФЛ | аКЛ | а2 – ГП I | аПТ | ||||
| IgG | IgM | IgG | IgM | IgG | IgM | ||
| Анализ по верхней границе нормы (M+5SD) | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 25,0 GPL 61,3 71,6 64,8 68,4 2,16 0,54 4,0 2,67-6,06 | 24,7 MPL 34,1 85,6 66,7 60,5 2,37 0,77 3,08 1,88-5,01 | 15,3ЕД/мл 44,5 85,7 81,3 52,5 3,11 0,52 10,55 5,53-20,33 | 17,0ЕД/мл 7,5 88,2 63,1 28,3 0,64 1,05 0,69 0,19-2,51 | 10,0ЕД/мл 14,3 84,2 76,9 21,1 0,91 1,01 0,89 0,22-3,56 | 10,0ЕД/мл 7,1 89,5 71,4 20,7 0,68 1,04 0,65 0,12-3,64 | |
| Анализ по умеренной и высокой степени позитивности (40,0 GPL и 40,0 MPL) | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 40,0 GPL 48,4 85,3 73,8 66,0 3,32 0,6 5,4 3,46-8,51 | 40,0 MPL 22,5 95,3 80,7 59,2 4,79 0,81 5,94 2,92 12,08 | - | - | - | - | |
| Анализ по 99-му процентилю | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 16,3 GPL 73,1 57,3 59,4 71,4 1,71 0,47 3,65 2,41-5,48 | 15,3 MPL 41,8 76,0 59,3 60,6 1,74 0,77 2,25 1,46-3,46 | 12,0ЕД/мл 49,6 84,7 81,9 54,6 3,24 0,60 5,45 2,86-10,50 | 13,1ЕД/мл 9,6 85,3 61,5 27,9 0,65 1,06 0,62 0,19-2,06 | - | - | |
| Анализ по ROC-кривым | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) AUC ДИ (95%) OШ ДИ (95%) | 18,6 GPL 69,9 79,8 0,817 0,780- 0,854 4,0 2,67-6,06 | 13,4 MPL 46,7 80,5 0,634 0,581- 0,688 2,53 1,68-3,82 | 7,2 ЕД/мл 62,0 82,6 0,751 0,695- 0,808 6,78 3,67-12,45 | 3,2 ЕД/мл 39,8 64,8 0,498 0,413- 0,583 1,01 0,44-2,29 | 6,4ЕД/мл 31,4 68,4 0,406 0,279- 0,532 0,99 0,33-2,98 | 2,2 ЕД/мл 41,4 57,9 0,368 0,245- 0,491 0,97 0,36-2,46 | |
Положительные результаты тестирования IgG/IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I ассоциировались с увеличением риска развития тромботических осложнений, причем прогностическое значение данных антител относительно тромбозов возрастало вместе с повышением “cut off”. Наиболее эффективным тестом для прогнозирования тромбозов являлось определение IgG а2 – ГП I относительно верхней границы нормы (M+5SD) (ОШ 10,55; 5,53 - 20,33; ДИ 95%) Риск развития тромбозов при положительных результатах тестирования IgG а2 – ГП I был в 2,6 раза выше, чем у IgG аКЛ (ОШ 4,0; 2,67-6,06; ДИ 95%; p<0,01) и в 3,4 выше, чем у IgM аКЛ (24,7 MPL; ОШ 3,08; 1,88-5,10; ДИ 95%; p< 0,001). IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ не являлись факторами риска тромботических осложнений при АФС.
Анализ по верхней границе нормы (M+5SD) показал, что полезными маркерами для диагностики ПНБ по уровню ОППР (>2 и 5) являются IgМ а2 – ГП I, по уровню ОПОР (>0,2 и 0,5) – IgG аКЛ, причем IgG аКЛ обладают более высокой чувстви- тельностью (p<0,001), а IgМ а2 – ГП – специфичностью (p<0,001) (табл. 7). IgG а2 – ГП I и IgM аКЛ оказались менее полезными маркерами ПНБ (ОППР2 и ОПОР>0,5). IgG/IgМ аПТ не имели диагностического значения при ПНБ. Результаты оценки точности ИФА аФЛ для диагностики ПНБ с использованием 99-ого процентиля нормы в целом совпадали с данными, полученными при анализе операционных характеристик по верхней границе нормы (M+5SD). При “сut off” 40 GPL/MPL у IgG аКЛ и IgM аКЛ на фоне снижения ДЧ (53,0% -23,1%) отмечалось повышение ДС до
77,8 - 91,0% и ОППР - до 2,39 - 2,57 относительно ПНБ. Оценка точности ИФА аФЛ для диагностики ПНБ с помощью ROC-кривых выявила одинаковые значения “сut off” (25,0 GPL), ДЧ и более высокий уровень ДС у IgG аКЛ по сравнению с соответствующими параметрами, рассчитанными по верхней границе нормы (M+5SD). У IgM аКЛ, IgG/IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ по данным ROC-анализа показатели “сut off” были ниже, ДЧ – выше, а ДС –
ниже (в случае IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ) или примерно равны (в случае IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I) при сопоставлении с результатами изучения диагностической точности тестов относительно ПНБ по верхней границе нормы (M+5SD). AUC для
IgG аКЛ относительно ПНБ превышала данный показатель у IgM аКЛ (p<0,001), IgG а2 – ГП I (p<0,001) и IgМ а2 – ГП I (p<0,001). У
Таблица 7
Диагностическая точность и прогностическое значение иммуноферментного анализа аФЛ относительно ПНБ
| Тип аФЛ | аКЛ | а2 – ГП I | аПТ | ||||
| IgG | IgM | IgG | IgM | IgG | IgM | ||
| Анализ по верхней границе нормы (M+5SD) | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 25,0 GPL 69,7 63,9 37,1 87,3 1,93 0,47 4,21 2,34-7,62 | 24,7 MPL 35,4 79,5 34,8 79,9 1,73 0,81 2,14 1,21-3,78 | 15,3ЕД/мл 52,3 72,8 51,1 73,8 1,92 0,66 2,90 1,35-6,18 | 17,0ЕД/мл 21,2 92,5 63,6 65,2 2,83 0,85 3,30 0,85-12,7 | 10,0ЕД/мл 13,0 88,9 37,5 66,6 1,17 0,98 1,2 0,28-5,21 | 10,0ЕД/мл 0 88,9 0 63,5 0 1,12 0 - | |
| Анализ по умеренной и высокой степени позитивности (40,0 GPL и 40,0 MPL) | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 40,0 GPL 53,0 77,8 42,2 84,4 2,39 0,6 3,94 2,23-6,97 | 40,0 MPL 23,1 91,0 44,1 79,3 2,57 0,85 3,04 1,42-6,50 | - | - | - | - | |
| Анализ по 99-му процентилю | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) ПЦПР (%) ПЦОР (%) ОППР ОПОР OШ ДИ (95%) | 16,3 GPL 75,8 52,3 32,7 87,6 1,59 0,46 3,42 1,90-6,18 | 15,3 MPL 47,7 70,5 33,3 81,3 1,62 0,74 2,17 1,22-3,82 | 12,0ЕД/мл 54,5 69,1 49,0 73,7 1,79 0,66 2,67 1,25-5,70 | 13,1ЕД/мл 21,2 90,6 58,3 64,9 2,25 0,87 2,74 0,8-9,41 | - | - | |
| Анализ по ROC-кривым | |||||||
| Cut off ДЧ (%) ДС (%) AUC ДИ (95%) OШ ДИ (95%) | 25,1 GPL 69,7 80,3 0,809 0,753- 0,864 4,21 2,34-7,62 | 13,3 MPL 55,4 76,5 0,648 0,565- 0,730 2,77 1,57-4,86 | 8,4 ЕД/мл 61,4 75,6 0,678 0,576- 0,779 2,56 1,2-5,48 | 3,2 ЕД/мл 54,5 63,3 0,603 0,490- 0,716 2,0 0,83-4,81 | 4,1ЕД/мл 52,2 52,2 0,516 0,370- 0,662 1,25 0,46-3.39 | 2,2 ЕД/мл 47,8 56,5 0,476 0,325- 0,627 1,25 0,46-3,39 | |
IgG/IgМ аПТ диагностическая эффективность в отношении ПНБ практически отсутствовала (AUC около 0,5). Полученные результаты указывает на более высокую диагностическую информативность определения IgG аКЛ относительно ПНБ при АФС по сравнению с другими субтипами аФЛ. Положительные результаты тестирования IgG/IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I ассоциировались с увеличением риска развития акушерской патологии. При уровне позитивности, установленном по верхней границе нормы (M+5SD), определение IgG аКЛ (ОШ 4,21; 2,34-7,62; ДИ 95%) было более эффективным тестом для прогнозирования ПНБ по сравнению с IgM аКЛ (ОШ 2,14; 1,21-3,78; ДИ 95%; p<0,05) и, в меньшей степени, по сравнению с IgG а2 – ГП I (ОШ 2,90; 1,35-6,18; ДИ 95%; p>0,05). IgМ а2 – ГП I и IgG/IgМ аПТ не имели прогностического значения в отношении ПНБ при АФС.
Полученные результаты хорошо согласуются с материалами других авторов о диагностической точности аФЛ и их роли в оценке прогноза АФС (Cabiedes J. и соавт., 1995; Amengual O. и соавт., 1996; Horbach D.A. и соавт., 1996; Roubey R.A., 1996; Tsutsumi A. и соавт., 1996; Guerin J. и соавт., 1997; Detkova D. и соавт., 1999; Reddel S.W., Krilis S.A., 1999; Helbert M. и соавт., 2001; Wasmuth J.C. и соавт., 2002; Campos L.M. и соавт., 2003; Lopez L.R. и соавт., 2004). По данным литературы чувствительность ИФА IgG аКЛ для диагностики АФС составляет 45-68%, IgM аКЛ – 35-69%; специфичность – 71-75% и 72-81% соответственно. Наиболее высокие показатели ДЧ (83%) и ДС (99%) а2-ГП I были получены J.Guerin и соавт. (1997). По данным R. Roubey и соавт. (1996) IgG аКЛ и IgG a2-ГП I обладают одинаковой чувствительностью (57,0%) для диагностики АФС, однако в большинстве исследований тестирование IgG а2 – ГП I и IgM а2-ГП I имеет большую ДС (83-91% и 87% соответственно) и меньшую ДЧ (23-60% и 23-32% соответственно) при АФС по сравнению с IgG и IgM аКЛ. J. Musial и соавт. (2003) показано, что при тромбозах AUC у IgG аКЛ (0,660; 0,580-0,740; ДИ 95%) и IgG а2 – ГП I (0,620; 0,530-0,700; ДИ 95%) сопоставима с таковой у IgM аКЛ (0,630; 0,540-0,710; ДИ 95%), а при ПНБ значения AUC у IgG а2 – ГП I (0,720; 0,570-0,860; ДИ 95%) и IgG аКЛ (0,700; 0,560-0,850; ДИ 95%) примерно равны и несколько выше, чем у IgM аКЛ (0,650; 0,500-0,800; ДИ 95%). Вместе с тем по данным литературы наиболее ценными прогностическими маркерами АФС являются IgG аКЛ и IgG а2 – ГП I, при обнаружении которых относительный риск развития тромботических осложнений составляет 2,49-6,42 и 2,4-9,8, акушерской патологии – 5,06-19,0 и 7,0 - 27,0 соответственно (Amengual O. и соавт., 1996; Finazzi G. и соавт., 1996; Tsutsumi A. и соавт., 1996; Cucurull E. и соавт., 1999; Reddel S.W., Krilis S.A., 1999; Galli M. и соавт., 2003; Musial J. и соавт., 2003).
Результаты изучения диагностической точности и прогностического значения ИФА аКЛ и а2 – ГП I зависят от выбранного уровня позитивности. Верхняя граница нормы для IgG аКЛ в сыворотке крови варьирует от 4,0 до 30,0 GPL; IgM аКЛ – от 3,0 до 20,0 MPL; IgG/IgM а2 – ГП I - от 4,0 до 20,0 ЕД/мл (Reddel S.W., Krilis S.A., 1999; Tincani A. и соавт., 2000; Helbert M. и соавт., 2001; Wasmuth J.C. и соавт., 2002; Bertolaccini M.L. и соавт., 2005; Erkan D. и соавт., 2005). Согласно международным критериям диагностики АФС 2006 года (Miyakis S. и соавт., 2006) верхняя граница нормальной концентрации IgG/IgM аКЛ в сыворотке крови должна составлять 40 GPL/MPL, что соответствует умеренно и высоко позитивным результатам определения этих антител, или 99 процентилей, IgG/IgM а2 - ГП I – 99 процентилей. В нашей работе уровни позитивности относительно 99-го процентиля нормы для IgG/IgM аКЛ и IgG/IgМ а2 – ГП I оказались ниже соответствующих показателей по верхней границе нормы (М+5SD), что сопровождалось увеличением ДЧ и уменьшением ДС при снижении ОППР и ОПОР данных тестов относительно диагностики тромботических осложнений АФС. При “сut off” 40 GPL/MPL, наоборот, отмечалось уменьшение ДЧ и увеличение ДС на фоне повышения ОППР для IgG аКЛ и IgM аКЛ. Сравнительная оценка точности ИФА аФЛ по верхней границе нормы (M+5SD) и с помощью ROC-кривых выявила совпадение значений “сut off” (24,0-25,0 GPL) у IgG аКЛ для диагностики АФС и акушерской патологии. Прогностическое значение положительных результатов тестирования IgG/IgM аКЛ и IgG а2 – ГП I относительно тромбозов и акушерской патологии возрастало вместе с повышением “cut off” и было наиболее выраженным при использовании верхней границы нормы M+5SD. Все это вместе взятое свидетельствует о том, что установленные значения “cut off” (M+5SD) у IgG аКЛ (25,0 GPL), IgM аКЛ (24,7 MPL), IgG а2 - ГП I (15,3 ЕД/мл) и IgM а2 - ГП I (17,0 ЕД/мл) отражают оптимальное соотношение операционных характеристик лабораторных тестов (ДЧ, ДС, ОППР, ОПОР) и ОШ для диагностики АФС и оценки риска развития тромбозов и акушерской патологии.
Клиническое значение маркеров дисфункции эндотелия
при антифосфолипидном синдроме
Результаты определения концентрации рКМА и ФВАг в сыворотках больных ПАФС, ВАФС, СКВ и доноров представлены в табл. 8, корреляционные связи между маркерами дисфункции эндотелия и клинико-лабораторными проявлениями АФС – в табл. 9.
Таблица 8
Уровни рКМА и ФВАг в сыворотках больных ПАФС, ВАФС, СКВ и здоровых доноров, Ме (ИР)
| Показатель | Группы обследованных | |||
| ПАФС | ВАФС | СКВ | Доноры | |
| рVCAM-1 (нг/мл) | 820 (635-1290)* n=21 | 1053 (695-1600)* n=50 | 1369 (937-1964)* n=84 | 615 (560-760) n=37 |
| рICAM-1 (нг/мл) | 294 (160-358) n=11 | 270 (170-374) n=15 | 282 (242-384) n=25 | 290 (244-232) n=17 |
| рР-селектин (нг/мл) | 103 (80-162) n=24 | 123 (92-182) n=38 | 168 (122-210)* n=25 | 112 (78-144) n=30 |
| рЕ-селектин (нг/мл) | 54 (40-68)* n=15 | 44 (34-58) n=30 | 62 (42-74)* n=17 | 40 (25-49) n=8 |
| ФВАг (МЕ/мл) | 1,85 (1,35-2,60)* n=20 | 3,20 (1,60-4,20)* n=31 | 3,20 (2,10-4,70)* n=63 | 1,06 (0,80-1,24) n=69 |
П р и м е ч а н и е. *р<0,05 относительно доноров.
Таблица 9
Достоверные корреляционные связи (r) между серологическими маркерами дисфункции эндотелия и клинико-лабораторными проявлениями АФС (p<0,05)
| Признаки | рVCAM-1 | рР-селектин | рЕ-селектин | ФВАг |
| SLEDAI ECLAМ Тромбоциты анДНК Протеинурия | 0,3 (128)** 0,6 (74)** 0,6 (82)** | 0,3 (66)** 0,4 (53) 0,3 (66)** | 0,4 (29)* | 0,3 (31)* 0,4 (27)* |
П р и м е ч а н и е. * - коэффициент корреляции (r) у больных ВАФС, ** - у больных СКВ с и без АФС; в скобках указано число больных, у которых проведено измерение данного показателя.
Растворимая сосудистая молекула адгезии VCAM-1
Уровень рVCAM-1 в сыворотках больных ПАФС и ВАФС значительно превышал данный показатель у здоровых доноров (р<0,0001), но был ниже, чем у больных СКВ (р<0,01 и р<0,02). Увеличение концентрации рVCAM-1 отмечено у 43% больных ПАФС, 62% больных ВАФС и 79% больных СКВ. Сходные результаты получены G. Kaplanski и соавт. (2000), при этом наиболее выраженное повышение уровня рVCAM-1 обнаружено авторами у больных АФС с тяжелыми рецидивирующими тромбозами, тромбоцитопенией и тромботическим поражением почек. Показано, что при CКВ с и без АФС уровень рVCAM-1 положительно коррелирует с SLEDAI (p<0,001), ECLAM (p<0,001) и титрами анДНК (p<0,0001). Эти результаты подтверждаются исследованиями других авторов, в которых уровень рVCAM-1 отражал активность патологического процесса у больных СКВ (Janssen B.A. и соавт., 1994; Spronk P.E. и соавт., 1994; Ikeda Y. и соавт., 1998; Kaplanski G. и соавт., 2000).
Растворимая межклеточная молекула адгезии ICAM-1
Медиана концентрации рICAM-1 у больных ПАФС, ВАФС и СКВ не отличалась от таковой у доноров. Повышение уровня рICAM-1, выявленное у 36% больных ПАФС, 27% больных ВАФС и 36% больных СКВ, не ассоциировалось с признаками АФС. В литературе имеются сходные данные об отсутствии выраженной гиперпродукции рICAM-1 при СКВ (Janssen B.A. и соавт., 1994; Spronk P.E. и соавт., 1994).
Растворимый Р-селектин
Сывороточный уровень рР-селектина у больных ПАФС и ВАФС не отличался от данного показателя у доноров и был достоверно ниже, чем у больных СКВ (p<0,0001), что совпадает с результатами F.M.K. Williams и соавт. (2000). Увеличение концентрации рР-селектина отмечено нами у 13% больных ПАФС, 29% больных ВАФС и 47% больных СКВ. Наличие прямой корреляции уровня рР-селектина с числом тромбоцитов (p<0,01) может свидетельствовать об активации тромбоцитов при АФС. При СКВ с и без АФС повышение уровня рР-селектина коррелировало с увеличением SLEDAI (p<0,05) и суточной протеинурией (p<0,05). В отличие от наших данных в работе I. Takeda и соавт. (1994) четкой связи уровня рР-селектина с активностью СКВ не прослеживалось.
Растворимый Е-селектин
Повышение сывороточного уровня рЕ-селектина по сравнению с донорами установлено при ПАФС (p<0,05) и СКВ (p<0,01). При ВАФС медиана концентрации рЕ-селектина была в пределах нормы (p>0,05). Гиперэкспрессия рЕ-селектина имела место у 60% больных ПАФС, 40% больных ВАФС и 65% больных СКВ. При ПАФС наиболее выраженное увеличение продукции рЕ-селектина выявлено у 4 больных с венозными тромбозами и 6 больных с акушерской патологией в анамнезе – 63 (51-71) нг/мл и 67 (54-76) нг/мл (p<0,05 и p<0,01 соответственно по сравнению с донорами). При ВАФС уровень рЕ-селектина положительно коррелировал с SLEDAI (p<0,05). В работе G. Kaplanski и соавт. (2000) статистически значимых различий по уровню рЕ-селектина в сыворотках больных ПАФС, СКВ с АФС и доноров не выявлено.
Антиген фактора Виллебранда
Сывороточный уровень ФВАг у больных ПАФС, ВАФС и СКВ был выше такового у доноров (р<0,0001). При ПАФС выявлена более низкая концентрация ФВАг, чем при ВАФС (р<0,03) и СКВ (р<0,001). Повышение уровня ФВАг отмечено у 30% больных ПАФС, 58% ВАФС и 65% больных СКВ. У 15 больных ВАФС с венозными тромбозами наблюдалось достоверное увеличение концентрации ФВАг по сравнению с данным показателем у 4 больных ВАФС с сочетанными тромбозами – 4,10 (2,70-5,20) МЕ/мл и 1,60 (1,05-2,35) МЕ/мл соответственно (р<0,05). При ПАФС уровень ФВАг в сыворотках 5 больных с поражением клапанов сердца (3,6; 2,3-3,6 МЕ/мл) в 2 раза превышал соответствующий показатель у 13 больных без признаков поражения клапанов сердца (1,8; 1,3-2,4 МЕ/мл, p<0,03). При ВАФС повышение концентрации ФВАг коррелировало с увеличением SLEDAI (p<0,002) и ECLAM (p<0,02). Полученные результаты подтверждают данные других авторов о гиперпродукции ФВАг при СКВ с и без АФС (Woolf A.D. и соавт., 1987; Mackworth-Young C.G. и соавт., 1995; Баранов А.А., 1998; Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шилкина Н.П., 1998). Наряду с этим впервые выявлено увеличение концентрации ФВАг при ПАФС.
Клинико-иммунологическая оценка высокочувствительного
анализа С-реактивного белка при антифосфолипидном
синдроме
Сывороточный уровень вч-СРБ у больных ПАФС (n=34; 2,69; 1,35-10,54 мг/л), ВАФС (n=40; 3,68; 1,05-11,99 мг/л) и СКВ (n=119; 3,21; 1,07-7,75 мг/л) был значительно выше данного показателя у доноров (n=64; 0,81; 0,30-1,97 мг/л) (р<0,001). Достоверных различий по уровню вч-СРБ между группами больных ПАФС, ВАФС и СКВ не выявлено. Концентрация вч-СРБ <1,0 мг/л, соответствующая низкому кардиоваскулярному риску (КВР), чаще выявлялась в контрольной группе (в 53% случаев), чем у больных ПАФС, ВАФС и СКВ (в 21%, 25% и 21% случаев соответственно; p<0,05). Уровень вч-СРБ от 1,0 до 3,0 мг/л, характеризующийся умеренным КВР, наблюдался примерно с одинаковой частотой при ПАФС (32%), СКВ (27%) и в контрольной группе (33%), несколько реже – при ВАФС (18%). Увеличение концентрации вч-СРБ в диапазоне от 3,0 до 10 мг/л, ассоциирующееся с субклиническим «low grade» воспалением и высоким КВР, встречалось при ПАФС (21%), ВАФС (30%) и СКВ (34%) более часто по сравнению с контрольной группой (14%), однако статистически значимые различия регистрировались только между больными СКВ и донорами (p<0,05). Повышение уровня вч-СРБ >10 мг/л, связанное с системным персистирующим «high grade» воспалением и еще более ускоренным КВР, отмечено у 26% больных ПАФС, 27% больных ВАФС, 18% больных СКВ и не выявлено в контрольной группе. Наиболее высокий уровень вч-СРБ наблюдался в сыворотках у 7 больных ВАФС (10,0; 6,77-39,12 мг/л) и 14 больных АФС (6,94; 2,61-10,0 мг/л) с артериальными тромбозами в анамнезе (p<0,05 по сравнению с данным показателем у 18 больных ВАФС и 30 больных АФС с венозными тромбозами – 2,34; 0,82-3,9 мг/л и 2,34; 0,78-7,0 мг/л соответственно). Вместе с тем повышение уровня вч-СРБ при ПАФС отрицательно коррелировало с титрами IgG а2 – ГПI (табл. 12, p<0,05). У 9 больных ПАФС с кожными язвами медиана концентрации вч-СРБ (10,54; 2,63-22,58 мг/л) была в 4 раза выше, чем у 23 больных ПАФС без поражения кожи (2,58; 1,09-9,41 мг/л; р<0,05), что в ряде случаев могло быть вызвано присоединением вторичной инфекции.
Полученные результаты совпадают с предыдущими данными и работами других авторов о повышении базального уровня вч-СРБ у больных СКВ с и без АФС (Клюквина Н.Г. и соавт., 1997; Barnes E.V. и соавт., 2005; Szalai A.J. и соавт., 2005). Различия с полученными ранее результатами о положительной корреляции уровней СРБ и аФЛ (IgG аКЛ) в крови при СКВ у мужчин (Клюквина Н.Г. и соавт., 1997) могут быть связаны с использованием в настоящей работе высокочувствительного иммунонефелометрического метода определения СРБ вместо ИФА и подбором групп больных. Согласно исследованиям E.V. Barnes и соавт. (2005) увеличение концентрации вч-СРБ при СКВ является предиктором кардиоваскулярной патологии и не связано с активностью болезни и поражением отдельных органов. По нашим данным в объединенной группе больных СКВ с и без АФС повышение уровня вч-СРБ коррелировало с увеличением ECLAM (n=148; r=0,2; p<0,02) и SLICC (n=150; r=0,2; p<0,05). Вместе с тем при ВАФС связь вч-СРБ с активностью заболевания и тяжестью органного повреждения отсутствовала.
Клиническое значение маркеров активации клеточного
иммунитета при антифосфолипидном синдроме
Результаты измерения маркеров активации клеточного иммунитета в сыворотках больных ПАФС, ВАФС, СКВ и доноров представлены в табл. 10, корреляционные связи между маркерами активации клеточного иммунитета и клинико-лабораторными проявлениями АФС – в табл. 11.
Интерлейкин-6
Концентрация ИЛ-6 у больных ВАФС и СКВ была выше, чем у доноров (p<0,001), а при ПАФС соответствовала ее нормальному уровню, что не совпадает с результатами R.R. Forastiero и соавт. (2005) об увеличении синтеза ИЛ-6 при этом заболевании. Повышение уровня ИЛ-6 отмечено у 18% больных ПАФС, 64%
Таблица 10
Уровни маркеров активации клеточного иммунитета в сыворотках больных ПАФС, ВАФС, СКВ и здоровых доноров, Ме (ИР)
| Показатель | Группы обследованных | |||
| ПАФС | ВАФС | СКВ | Доноры | |
| ИЛ-6 (пг/мл) | 0,42 (0,07-1,23) n=34 | 2,50 (0,80-5,70)* n=33 | 1,65 (0,79-3,53)* n=124 | 0,41 (0,22-0,72) n=27 |
| ФНО (пг/мл) | 3,52 (1,97-4,42)* n=39 | 3,72 (2,48-7,26)* n=41 | 3,79 (1,94-6,42)* n=139 | 0,41 (0,28-0,89) n=20 |
| рФНО-РI (нг/мл) | 2,23 (1,71-3,22)* n=31 | 3,80 (2,12-6,25)* n=53 | 2,76 (2,08-4,50)* n=164 | 1,74 (1,28-2,16) n=54 |
| ИЛ-10 (пг/мл) | 0,01 (0,01-0,01) n=22 | 0,01 (0,01-4,00)* n=22 | 0,01 (0,01-3,80)* n=103 | 0,01 (0,01-0,01) n=20 |
| ИЛ-18 (пг/мл) | 199 (78-318)* n=23 | 358 (185-636)* n=22 | 302 (160-558)* n=102 | 86 (78-163) n=20 |
| рCD40 лиганд (нг/мл) | 0,99 (0,53-4,38) n=20 | 5,40 (3,30-11,60)* n=33 | 7,55 (4,67-12,30)* n=159 | 4,00 (0,80-5,85) n=36 |
| Неоптерин (нмоль/л) | 8,6 (4,5-14,1)* n=27 | 11,0 (8,6-21,2)* n=28 | 11,2 (6,9-18,8)* n=128 | 5,6 (4,0-7,4) n=30 |
П р и м е ч а н и е. *р<0,05 относительно доноров.
больных ВАФС и 52% больных СКВ. Выявлена отрицательная корреляция уровня ИЛ-6 с количеством тромбоцитов (p<0,01) у больных ПАФС, указывающая на возможное участие этого цитокина в развитии тромбоцитопении при АФС. При СКВ с и без АФС увеличение концентрации ИЛ-6 связано с повышением SLEDAI (p<0,001), ECLAM (p<0,001) и титров анДНК (p<0,001) в крови, что соответствует результатам М. Linker-Israeli и соавт. (1999) и Yu. Asanuma и соавт. (2006).
Фактор некроза опухоли
Уровень ФНО в сыворотках больных ПАФС, ВАФС и СКВ был примерно одинаковым и значительно превышал таковой у доноров (p<0,001). Увеличение сывороточной концентрации ФНО отмечено у 74% больных ПАФС, 76% больных ВАФС и 68% больных СКВ. Другими авторами получены сходные результаты о повышении уровня ФНО при ПАФС (Forastiero R.R. и соавт., 2005) и ВАФС (Бородин А.Г. и соавт., 2002; 2004). В отличие от данных А.Г. Бородина и соавт. (2002) не выявлено достоверных различий по уровню ФНО между группами больных СКВ с и без АФС. Показано, что при ПАФС концентрация ФНО у 19 больных с повреждением клапанов сердца (4,04; 2,56-5,20 пг/л) и у 16 боль-
Таблица 11
Достоверные корреляционные связи (r) между сывороточными маркерами активации клеточного иммунитета и клинико-лабораторными проявлениями АФС (p<0,05)
| Признаки | ИЛ-6 | ФНО | рФНО-РI | ИЛ-10 | ИЛ-18 | рCD40 лиганд | Неопте- рин |
| Количество тромбозов в анамнезе SLEDAI ECLAМ SLICC Тромбоциты анДНК Протеинурия Триглицериды Холестерин липопротеидов высокой плот- ности | 0,3*** (147) 0,4*** (143) - 0,5* (28) 0,4*** (145) | 0,4** (35) 0,4** (31) 0,4** (41) | 0,3** (52) 0,5** (39) 0,4** (37) 0,4** (49) | -0,4 (44) 0,4** (22) 0,4** (22) - 0,7** (22) 0,4** (22) 0,5** (22) | 0,3** (22) 0,3** (22) 0,5** (20) 0,6 (35) - 0,4 (22) | 0,5* (20) 0,4** (33) - 0,4** (33) - 0,7** (30) | 0,6** (27) 0,4** (27) 0,5** (28) |
П р и м е ч а н и е. * - коэффициент корреляции (r) у больных ПАФС, ** - у больных ВАФС, *** - у больных СКВ с и без АФС; в скобках указано число больных, у которых проведено измерение данного показателя.
ных с патологией ЦНС (3,97; 3,54-6,09 пг/мл) была выше, чем у 16 больных без поражения сердца (2,97; 1,87-3,69 пг/мл; р<0,05) и у 21 больного без поражения ЦНС (2,72; 1,97-3,64 пг/мл, p<0,01). При ВАФС уровень ФНО положительно коррелировал с увеличением SLEDAI (p<0,01), ECLAM (p<0,05) и уровня анДНК ( p<0,01).
Растворимый рецептор фактора некроза опухоли I типа
Концентрация рФНО-РI у больных ПАФС, ВАФС и СКВ достоверно превышала таковую у доноров (p<0,001), однако при ПАФС медиана рФНО-РI была ниже, чем при ВАФС и СКВ (p<0,05). Увеличение сывороточного уровня рФНО-РI отмечено у 29% больных ПАФС, 59% больных ВАФС и 48% больных СКВ. При ВАФС концентрация рФНО-РI у больных с тромбоцитопенией (n=4; 6,52; 5,57-12,40 нг/мл) была выше, чем у больных без тромбоцитопении (n=49; 3,66; 2,09-5,62 нг/мл; р<0,05). Уровень рФНО-РI при ВАФС положительно коррелировал с SLEDAI (p<0,05), ECLAM (p<0,001) и суточной протеинурией (p<0,01). Ранее наличие тесной взаимосвязи между увеличением концентрации рФНО-РI и повышением иммуновоспалительной активности заболевания было продемонстрировано у больных СКВ без АФС (Studnicka-Benke A. и соавт., 1996; Gabay C. и соавт., 1997; Lacki J.K. и соавт., 1997; Davas E.M. и соавт., 1999).
Интерлейкин – 10
Сывороточный уровень ИЛ-10 у больных ВАФС и СКВ был выше данного показателя у доноров (p<0,05), а при ПАФС не отличался от нормы. Увеличение концентрации ИЛ-10 отмечено у 18% больных ПАФС, 36% больных ВАФС и 39% больных СКВ. При АФС повышение уровня ИЛ-10 коррелировало с уменьшением количества случаев тромбозов в анамнезе (p<0,02), а при ВАФС – со снижением SLICC (p<0,001). Учитывая имеющиеся данные о способности ИЛ-10 подавлять клеточные иммунные реакции Th1 типа (Westerweel P.E. и соавт., 2007), можно предположить, что этот цитокин является протективным фактором в отношении развития тромботических осложнений и тяжелых органных повреждений при АФС. С другой стороны при СКВ с АФС гиперпродукция ИЛ-10 стимулирует гуморальный иммунный ответ Th2 типа в виде активации В-лимфоцитов и усиления синтеза анДНК, индуцируя повышение иммуновоспалительной активности заболевания (Llorente L. и соавт., 1993). Об этом свидетельствует положительная корреляция уровня ИЛ-10 с SLEDAI (p<0,05), ECLAM (p<0,05), титрами анДНК (p<0,01) и суточной протеинурией (p<0,01) у больных ВАФС. Сходные результаты, указывающие на связь повышенных значений ИЛ-10 с клинико-лабораторными параметрами активности СКВ, приводят другие авторы (Hossiau F.A., 1995; Grondal G. и соавт., 2000; Capper E.R. и соавт., 2004).
Интерлейкин – 18
Сывороточный уровень ИЛ-18 у больных ПАФС, ВАФС и СКВ был выше данного показателя у доноров (p<0,05), однако при ПАФС выявлена более низкая концентрация ИЛ-18, чем при ВАФС и СКВ (p<0,02). Увеличение концентрации ИЛ-18 отмечено у 39% больных ПАФС, 59% больных ВАФС и 63% больных СКВ. При ПАФС уровень ИЛ-18 у 5 больных с кожными язвами ног (477; 318-507 пг/мл) значительно превышал таковой у 16 больных без признаков поражения кожи (136; 78-257 пг/мл; р<0,001). В группе больных ВАФС повышение уровня ИЛ-18 коррелировало с увеличением SLEDAI (p<0,02), ECLAM (p<0,03) и продукции анДНК (p<0,02). Сходные данные о связи гиперпродукции ИЛ-18 с активностью патологического процесса при СКВ представлены другими исследователями (Wong C.K. и соавт., 2000; Amerio P. и соавт., 2002; Park M.C. и соавт., 2004). У больных АФС обнаружена положительная корреляция значений ИЛ-18 с концентрацией триглицеридов (p<0,001) и отрицательная – с уровнем холестерина липопротеидов высокой плотности (p<0,01), что указывает на возможное участие ИЛ-18 в развитии атеросклеротических нарушений при АФС.
Таким образом, при ПАФС установлено повышение уровня Th1 цитокинов и их растворимых рецепторов (ФНО, рФНО-РI, ИЛ-18), а при ВАФС – увеличение концентрации как Th1, так и Th2 цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-10).
Растворимый CD40 лиганд
Сывороточный уровень рCD40 лиганда у больных ВАФС и СКВ превышал данный показатель у доноров (p<0,01), а при ПАФС достоверно не отличался от нормы. Увеличение концентрации рCD40 лиганда отмечено у 15% больных ПАФС, 39% больных ВАФС и 51% больных СКВ. При ВАФС у больных с венозными тромбозами (n=19; 7,25; 4,10-12,05 нг/мл) наблюдался более высокий уровень рCD40 лиганда по сравнению с таковым у больных с артериальными тромбозами (n=5; 3,45; 3,30-4,25 нг/мл; p<0,05). При ПАФС и ВАФС обнаружена прямая корреляционная связь между увеличением концентрации рCD40 лиганда и количеством случаев тромбозов в анамнезе (p<0,05). При ВАФС повышение уровня рCD40 лиганда коррелировало со снижением ECLAM (p<0,01) и титров анДНК (p<0,0001). Полученные результаты совпадают с данными литературы о гиперэкспрессии рCD40 лиганда при ВАФС и СКВ (Kato K. И соавт., 1999; Vakkalanka R.K. и соавт., 1999; Ferro D. и соавт., 2004; Illei G.G. и соавт., 2004), однако в отличие от других исследователей, мы, а также M.Bijl и соавт. (2001), не обнаружили связи между увеличением концентрации рCD40 лиганда и повышением активности СКВ. В работе D. Ferro и соавт. (2004) усиление синтеза рCD40 лиганда у больных СКВ сопровождалось гиперпродукцией аФЛ и наличием тромбозов в анамнезе. По нашим данным повышение уровня рCD40 лиганда при АФС отрицательно коррелирует с концентрацией аКЛ (табл. 12), но ассоциируется с увеличением количества случаев тромботических осложнений и наличием венозных тромбозов в анамнезе, что подтверждает важную роль рCD40 лиганда в развитии тромботической васкулопатии при АФС.
Неоптерин
Уровень неоптерина в сыворотках больных ПАФС и ВАФС был выше, чем у доноров (p<0,05) и не отличался от такового у больных СКВ (p>0,05). Увеличение концентрации неоптерина отмечено у 37% больных ПАФС, 43% больных ВАФС и 47% больных СКВ. У 21 больного ПАФС и ВАФС с поражением клапанного аппарата сердца концентрация неоптерина (18,1; 9,3-30,1 нмоль/л) была в 2 раза выше, чем у 30 больных АФС без признаков поражения сердца (9,1; 6,5-11,8 нмоль/л; р<0,001). При ВАФС повышение уровня неоптерина коррелировало с увеличением SLEDAI (p<0,002), ECLAM (p<0,02) и титров анДНК (p<0,01), что соответствует данным других авторов о положительной корреляции значений неоптерина с активностью СКВ (Samsonov M.Y. и соавт., 1995; Mahmoud R.A. и соавт., 2005).
Корреляционные связи между лабораторными
биомаркерами антифосфолипидного синдрома
Корреляционные связи между лабораторными биомаркерами АФС представлены в табл. 12. Уровень IgM аКЛ при АФС положительно коррелировал с концентрацией ФНО в крови (p<0,03). Гиперпродукция IgG аПТ сопровождалась повышением уровней ФНО (p<0,02), ИЛ-6 (p<0,05) и неоптерина (p<0,01). Увеличение концентрации IgM аПТ в сыворотках больных АФС коррелировало с повышением значений рP-селектина (p<0,05), ФНО (p<0,02) и ИЛ-10 (p<0,01).
При АФС отмечена положительная корреляция между уровнями рVCAM-1, рЕ-селектина (p<0,05) и рICAM-1 (p<0,01) в крови. Кроме того, у больных АФС гиперпродукция рVCAM-1 положительно коррелировала с уровнями рФНОРI (p<0,01) и ИЛ-18 (p<0,0001), а рР-селектина - с увеличением концентрации ФНО (p<0,01) в крови. Установлена прямая корреляция ФВАг с вч-СРБ при ПАФС (p<0,01) и рФНОРI при АФС (p<0,01).
При АФС выявлена положительная корреляционная связь ИЛ-6 с ФНО (p<0,001), рФНОРI (p<0,001), ИЛ-18 (p<0,01) и неоптерином (p<0,001). Гиперпродукция ФНО при АФС коррелировала с повышением уровня неоптерина (p<0,001) и ИЛ-10 (p<0,01), при ВАФС – с увеличением концентрации ИЛ-18 (p<0,05). Отмечена положительная корреляция между рФНО-РI и ИЛ-18 (p<0,01) при АФС, рCD40 лигандом (p<0,04) – при ПАФС. У больных АФС имела место положительная корреляция ИЛ-10 и ИЛ-18 с неоптерином (p<0,05).
Полученные результаты позволяют предположить, что аФЛ – зависимая активация эндотелиальных клеток, моноцитов и тромбоцитов, сопровождающаяся увеличением сывороточной концентрации рКМА, ФВАг, вч-СРБ, цитокинов, неоптерина и рCD40 лиганда, играет ключевую роль в развитии дисфункции эндотелия, субклинически текущего воспаления и гиперкоагуляции при АФС.
Таблица 12
Достоверные корреляционные связи (r) между аФЛ, маркерами повреждения эндотелия, вч-СРБ и показателями активации клеточного иммунитета при АФС (p<0,05)
Показатель | рVCAM-1 | рICAM-1 | рР- селектин | рЕ- селектин | ФВАг | вч-СРБ | ИЛ-6 | ФНО- | рФНО-РI | ИЛ-10 | ИЛ-18 | рCD40 лиганд | Неоптерин |
| IgG аКЛ | -0,4 (53) | ||||||||||||
| IgMаКЛ | 0,2 (80) | -0,5 (20)* | |||||||||||
| IgG а2 – ГП I | -0,4 (25)* | ||||||||||||
| IgG аПТ | 0,3 (38) | 0,3 (48) | 0,4 (38) | ||||||||||
| IgM аПТ | 0,6 (13) | 0,3 (48) | 0,5 (31) | ||||||||||
| рVCАM-1 | 0,5 (26) | 0,3 (47) | 0,5 (35) | 0,9 (44) | |||||||||
| рICAM-1 | 0,5 (26) | ||||||||||||
| рР-селектин | 0,8 (10) | ||||||||||||
| рЕ-селектин | 0,3 (47) | ||||||||||||
| ФВАг | 0,7 (13) | 0,6 (21) | |||||||||||
| вч-СРБ | 0,7(13)* | ||||||||||||
| ИЛ-6 | 0,5 (57) | 0,6 (48) | 0,4 (40) | 0,5 (42) | |||||||||
| ФНО- | 0,8 (10) | 0,5 (57) | 0,5 (43) | 0,5 (22)** | 0,7 (45) | ||||||||
| рФНО-РI | 0,5 (35) | 0,6 (21) | 0,6 (48) | 0,5 (27) | 0,8 (7)* | ||||||||
| ИЛ-10 | 0,5 (43) | 0,3 (40) | |||||||||||
| ИЛ-18 | 0,8 (11)** | 0,4 (40) | 0,5 (22)** | 0,5 (27) | 0,4 (40) | ||||||||
| рCD40 лиганд | 0,8 (7)* | ||||||||||||
| Неоптерин | 0,5 (42) | 0,7 (45) | 0,3 (40) | 0,4 (40) |
П р и м е ч а н и е. *- коэффициент корреляции (r) у больных ПАФС, ** - у больных ВАФС; в скобках указано число больных, у которых проведено измерение данного показателя.
ВЫВОДЫ
1. Повышение уровня антифосфолипидных антител, обнаруживаемых в сыворотках больных при использовании стандартных методов иммуноферментного анализа, тесно связано с основными клиническими проявлениями АФС. Диагностическими маркерами АФС служат IgG/IgM аКЛ и IgG/IgM а2-ГП I, при этом IgG аКЛ (ДЧ–68,0%; ДС–76,3%) и IgM аКЛ (ДЧ–36,7%; ДС–87,3%) обладают большей чувствительностью (p<0,01 и p<0,001), а IgG а2-ГП I (ДЧ–47,5%; ДС–90,6%) и IgM а2-ГП I (ДЧ–11,6%; ДС–96,8%) – большей специфичностью (p<0,01 и p<0,05). По данным ROC-анализа диагностическая точность определения IgG аКЛ (AUC: 0,798; 0,755-0,842; ДИ 95%) и IgG а2-ГП I (AUC: 0,813; 0,758-0,868; ДИ 95%) выше таковой у IgM аКЛ (AUC: 0,660; 0,605-0,715; ДИ 95%; p<0,001) и IgМ а2-ГП I (AUC: 0,571; 0,456-0,685; ДИ 95%; p<0,001). Иммуноферментный анализ IgG/IgМ аПТ является неэффективным тестом для диагностики АФС.
2. Относительно тромбозов диагностическая точность определения IgG аКЛ (AUC: 0,817; 0,780-0,854; ДИ 95%) и IgG а2-ГП I (AUC: 0,751; 0,695-0,808; ДИ 95%) превышает таковую у IgM аКЛ (AUC: 0,634; 0,581-0,688; ДИ 95%; p<0,001). Риск развития тромбозов при обнаружении IgG а2-ГП I (ОШ 10,55; 5,53-20,33; ДИ 95%) выше, чем у IgG аКЛ (ОШ 4,0; 2,67-6,06; ДИ 95%; p<0,01) и IgM аКЛ (ОШ 3,08; 1,88-5,10; ДИ 95%; p<0,001). Определение IgМ а2-ГП I и IgG/IgМ аПТ не имеет диагностического и прогностического значения при тромбозах, ассоциирующихся с АФС.
3. Относительно акушерской патологии диагностическая точность определения IgG аКЛ (AUC: 0,809; 0,753-0,864; ДИ 95%) превышает таковую у IgM аКЛ (AUC: 0,648; 0,565-0,730; ДИ 95%; p<0,001) и IgG/IgМ а2-ГП I (AUC: 0,678; 0,576-0,779 и 0,603; 0,490-0,716 соответственно; ДИ 95%; p<0,001). Риск привычного невынашивания беременности при обнаружении IgG аКЛ (ОШ 4,21; 2,34-7,62; ДИ 95%) выше, чем у IgM аКЛ (ОШ 2,14; 1,21-3,78; ДИ 95%; p<0,05) и достоверно не отличается от такового у IgG а2-ГП I (ОШ 2,90; 1,35-6,18; ДИ 95%; p>0,05). Уровни IgG/IgМ аПТ не имеют достоверного значения для диагностики, IgМ а2-ГП I и IgG/IgМ аПТ – для оценки риска развития акушерской патологии при АФС.
4. Развитие АФС сопровождается повышением уровней серологических маркеров активации сосудистого эндотелия – растворимых клеточных молекул адгезии и ФВАг. Увеличение концентрации рVCAM-1 отмечено при ПАФС и ВАФС, рЕ-селектина – при ПАФС. Наиболее выраженное повышение уровня рЕ-селектина обнаружено у больных ПАФС с венозными тромбозами и акушерской патологией. Увеличение концентрации ФВАг связано с поражением клапанов сердца при ПАФС и наличием венозных тромбозов при ВАФС. При ВАФС уровни растворимых клеточных молекул адгезии и ФВАг коррелируют с индексами активности SLEDAI и ECLAM.
5. Увеличение базальной концентрации вч-СРБ при АФС ассоциируется с высоким кардиоваскулярным риском и преобладанием артериальных тромбозов в анамнезе.
6. ПАФС характеризуется увеличением сывороточной концентрации Th1 цитокинов и их растворимых рецепторов (ФНО, рФНО-РI, ИЛ-18), ВАФС – Th1 и Th2 (ИЛ-6, ИЛ-10) цитокинов. При ПАФС повышение уровня ФНО ассоциируется с поражением клапанов сердца и ЦНС, ИЛ-18 – с образованием хронических язв ног. Увеличение концентрации рФНО-РI при ВАФС наиболее выражено у больных с тромбоцитопенией. Повышение уровня ИЛ-10 при АФС коррелирует с уменьшением числа случаев тромбозов в анамнезе (r=-0,4; p<0,02), при ВАФС – со снижением индекса повреждения SLICC (r=-0,7; p<0,001), что может иметь протективное значение в отношении развития тромботических осложнений и прогрессирования АФС. Увеличение концентрации ИЛ-18, ассоциирующееся с повышением уровня триглицеридов (r=0,6; p<0,001) и снижением уровня холестерина липопротеидов высокой плотности в крови (r=-0,4; p<0,01), является одним из потенциальных факторов атерогенеза у больных АФС. При ВАФС уровни цитокинов и рФНО-РI положительно коррелируют с индексами SLEDAI и ECLAM.
7. Повышение сывороточного уровня рCD40 лиганда коррелирует с увеличением числа случаев тромботических осложнений у больных ПАФС (r=0,5; p<0,05) и ВАФС (r=0,4; p<0,02) и наличием венозных тромбозов у больных ВАФС, что свидетельствует об участии молекулярных механизмов костимуляции иммунного ответа в развитии тромботической васкулопатии при АФС.
8. Увеличение сывороточной концентрации неоптерина при АФС служит интегральным показателем цитокинзависимой активации Th1 типа иммунного ответа. При ПАФС и ВАФС повышение уровня неоптерина сопровождается поражением клапанов сердца, при ВАФС – положительно коррелирует с индексами активности SLEDAI и ECLAM.
9. Комплексное изучение антифосфолипидных антител, маркеров дисфункции эндотелия, активации клеточного иммунитета и острофазового ответа свидетельствует о существовании тесной патогенетической взаимосвязи между аутоиммунными реакциями, повреждением эндотелиальных клеток, нарушением Т – клеточной иммунорегуляции и хроническим субклиническим воспалением сосудистой стенки при АФС, что имеет важное значение для углубления представлений о роли иммунопатологических процессов в тромбообразовании, оценки факторов риска кардиоваскулярных осложнений, прогнозирования исходов, разработки новых методов диагностики и лечения АФС.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Обнаружение в сыворотках больных аКЛ и/или а2 - ГП I классов IgG и IgM в концентрации, превышающей M+5SD у доноров (IgG аКЛ 25,0 GPL, IgM аКЛ 24,7 MPL, IgG а2 - ГП I 15,3 ЕД/мл и IgM а2 - ГП I 17,0 ЕД/мл), рекомендуется использовать в качестве лабораторных критериев диагностики АФС. Для диагностики тромбозов наиболее полезными лабораторными тестами являются ИФА IgG аКЛ и ИФА IgG а2 – ГП I, акушерской патологии – ИФА IgG аКЛ. Наиболее полезными прогностическими маркерами тромбозов служат положительные результаты ИФА IgG а2 – ГП I, акушерской патологии – ИФА IgG аКЛ.
2. Повышенные уровни рЕ-селектина, ФВАг, вч-СРБ и рCD40 лиганда в сыворотках больных АФС следует использовать в качестве дополнительных лабораторных маркеров тромботических осложнений данного заболевания.
3. У больных ВАФС определение сывороточной концентрации растворимых клеточных молекул адгезии (рVCAM-1, рЕ-селектина, рР-селектина), ФВАг, цитокинов и их растворимых рецепторов (ИЛ-6, ФНО, рФНО-РI, ИЛ-10, ИЛ-18), неоптерина рекомендуется для оценки иммуновоспалительной активности патологического процесса.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Количественный иммуноферментный метод определения антител к кардиолипину в сыворотке крови / Е.Н. Александрова, Е.Л. Насонов, В.Ю. Ковалев // Клиническая ревматология. – 1995. – №4. – С. 35-39.
2. Методы определения антител к фосфолипидам / Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, В.Ю. Ковалев, Е.Н. Александрова // Патология сосудов при антифосфолипидном синдроме (клиника, диагностика, лечение) / Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина, З.С. Алекберова. – М. – Ярославль, 1995. – С. 104-110.
3. Проявления ИБС и состояние коронарных артерий у больных антифосфолипидным синдромом / Ю.А. Карпов, Е.Л. Насонов, М.Ю. Вильчинская, О.В. Фомичева, М.Г. Творогова, З.С. Алекберова, Е.Н. Александрова, Н.А. Павлов, Л.М. Сергакова, Л.Е. Самойленко, И.В. Савельева, Т.М. Решетняк // Терапевтический архив. – 1995. – №5. – С. 27-31.
4. Антифосфолипидный синдром при системной красной волчанке: оценка диагностических и классификационных критериев / З.С. Алекберова, Т.М. Решетняк, Н.М. Кошелева, Е.Н. Александрова, Л.А. Калашникова, Е.Л. Насонов, В.А. Насонова // Клиническая медицина. – 1996. – №6. – С. 39-42.
5. Артериальная гипертония и антифосфолипидный синдром / Е.Л. Насонов, Ю.А. Карпов, З.С. Алекберова, М.Ю. Вильчинская, О.А. Фомичева, Е.Н. Александрова, Т.М. Решетняк, Н.Г. Клюквина, А.Я. Андреев // Терапевтический архив. – 1996. – №2. – С. 37-47.
6. Ишемические нарушения мозгового кровообращения и поражения клапанов сердца при первичном антифосфолипидном синдроме / Л.А. Калашникова, Е.Л. Насонов, Е.Н. Александрова, Н.М. Кошелева, Т.М. Решетняк, В.В. Борисенко, К.В. Саложин // Клиническая медицина. – 1996. – №6. – С. 46-49.
7. Особенности поражения клапанов сердца при антифосфолипидном синдроме / Л.М. Сергакова, О.А. Фомичева, М.Ю. Вильчинская, З.С. Алекберова, Е.Н. Александрова, Ю.А Карпов, Е.Л. Насонов, О.Ю. Атьков. // Клиническая медицина. – 1996. –№9. – С. 39-42.
8. Антитела к окисленному липопротеину низкой плотности при системной красной волчанке: связь с антителами к фосфолипидам / Е.Л. Насонов, Т.В. Попкова, Е.Е. Ефремов, Т.М.Решетняк, А.М. Каменева, Е.Н. Александрова, О.А. Фомичева, З.С. Алекберова // Клиническая медицина. – 1997. – №9. – С. 49-53.
9. Антиэндотелиальные антитела и поражение клапанов сердца при антифосфолипидном синдроме: анализ патогенетических механизмов / Е.Л. Насонов, К.В. Саложин, О.А. Фомичева, Н.Г. Клюквина, Ю.А. Карпов, М.Ю. Вильчинская, Е.Н. Александрова, З.С. Алекберова, А.А. Баранов, Л.М. Сергакова // Клиническая медицина. – 1997. – №2. – С.17-21.
10. Антифосфолипидный синдром (синдром Hughes): 10 лет изучения в России / Е.Л. Насонов, З.С. Алекберова, Л.А. Калашникова, Т.М. Решетняк, Е.Н. Александрова // Клиническая медицина. – 1998. – №2. – С. 4-11.
11. Новые иммунологические данные о синдроме Снеддона / Л.А. Калашникова, И. Чапман, А. Корчин, Е.Л. Насонов, Е.Н. Александрова, С. Шавит, Т.М. Решетняк, Н.М. Кошелева // Клиническая медицина. – 1998. – №6. – С. 34-38.
12. Современные представления о патогенезе антифосфолипидного синдрома / Е.Л. Насонов, А.Г. Кобылянский, Т.В. Кузнецова, Е.Н. Александрова, М.Е. Палькеева, А.А. Новиков, В.А. Тищенко // Клиническая медицина. – 1998. – №9. – С. 9-14.
13. Лабораторная диагностика системных васкулитов / Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, К.В. Саложин, Т.В. Бекетова, М.Ю. Самсонов, Е.Н. Александрова // Васкулиты и васкулопатии / Е.Л. Насонов, А.А. Баранов, Н.П. Шилкина. – Ярославль.: Верхняя Волга, 1999. – С. 173-245.
14. Levels of soluble VCAM-1, P-selectin and E-selectin in patients with primary antiphospholipid syndrome and systemic lupus erythematosus / A.A. Novikov, E.N. Alexandrova, T.M. Reshetnyak // Annual European Congress of rheumatology: Abstracts. – Annals of the Rheumatic Diseases. – 2001. – Vol. 60. – Suppl. I. – P. 194.
15. Кардиологические аспекты антифосфолипидного синдрома. Часть I. Клапанные поражения сердца при первичном и вторичном антифосфолипидном синдроме и системной красной волчанке / Т.М. Решетняк, Г.П. Котельникова, О.А. Фомичева, Н.Г. Клюквина, Ю.А. Карпов, Е.Н. Александрова, З.С. Алекберова, Л.М. Сергакова, В.А. Насонова, Е.Л. Насонов // Кардиология. – 2002. – №8. – С. 38-43.
16. Кортикостероиды в лечении вторичного антифосфолипидного синдрома / Т.М. Решетняк, Е.Н. Александрова, З.С. Алекберова, Э.С. Мач, Е.Л. Насонов // Клиническая медицина. – 2002. – №6. – С. 17-21.
17. Растворимые молекулы адгезии при антифосфолипидном синдроме, связанном с системной красной волчанкой, и первичном антифосфолипидном синдроме / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Т.М. Решетняк, Н.Г. Клюквина, Д.В. Решетняк, М.Ю. Самсонов, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2002. – №5. – С. 23-27.
18. С-реактивный белок – маркер воспаления при атеросклерозе (новые данные) / Е.Л. Насонов, Е.В. Панюгова, Е.Н. Александрова // Кардиология. – 2002. – №7. – С. 53-62.
19. Антитела к 2-гикопротеину 1 и антитела к кардиолипину при антифосфолипидном синдроме: анализ чувствительности и специфичности / Е.Н. Александрова, А.А Новиков, Т.М. Решетняк, Н.Г. Клюквина, Д.В. Решетняк, Е.Л. Насонов // Клиническая медицина. – 2003. – №9. – С. 25-31.
20. Выживаемость и прогностические факторы риска смерти при антифосфолипидном синдроме: результаты 8-летнего наблюдения / Т.М. Решетняк, З.С. Алекберова, Г.П. Котельникова, Е.Н. Александрова, Э.С. Мач, С.Г. Раденска-Лоповок, Л.А. Калашникова, В.А. Насонова // Терапевтический архив. – 2003. – №5. – С. 46-51.
21. Антиген фактора Виллебранда при системной красной волчанке и антифосфолипидном синдроме / А.А. Новиков, Е.Н. Александрова, Т.В. Попкова, Т.М. Решетняк, Н.Г. Клюквина, Д.С. Новикова, И.Б. Штивельбанд, А.А. Баранов // Научно-практическая ревматология. – 2004. – №4. – С. 35-38.
22. Высокочувствительные методы определения С-реактивного белка (обзор литературы) / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Е.Л. Насонов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. – №11. – С. 16-18.
23. Иммунологические маркеры кардиоваскулярной патологии при ревматических заболеваниях / Е.Л. Насонов, Е.Н. Александрова // Научно-практический симпозиум «Прогрессивные аналитические технологии и доказательная лабораторная медицина».:Тезисы докладов. – Клиническая лабораторная диагностика. – 2004. – №9. – С. 12-13.
24. Клиническое значение антифосфолипидных антител / Е.Л. Насонов, Е.Н. Александрова//Антифосфолипидный синдром / Е.Л. Насонов. – М.: Литтерра, 2004. – С. 208-248.
25. Клиническое значение растворимых рецепторов фактора некроза опухоли у больных системной красной волчанкой / О.А. Кричевская, Н.Г. Клюквина, Е.Н. Александрова, М.Ю. Самсонов, Е.Л. Насонов // Клиническая медицина. – 2004. – №10. – С. 51-55.
26. Клинико-иммунологические проявления первичного и вторичного антифосфолипидного синдрома / Т.М. Решетняк, Г.Н. Котельникова, Л.А. Калашникова, Т.А. Лисицина, И.Б. Штивельбанд, Э.С. Мач, Е.Н. Александрова, З.С. Алекберова, Т.Л. Тихонова, А.В. Волков, В.А. Насонова, Е.Л. Насонов // Научно-практическая ревматология. – 2004. – №4. – С. 15-23.
27. Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Д.С. Новикова // Научно-практическая ревматология. – 2004. – №4. – С. 47-52.
28. The antiphospholipid syndrome: immunological and clinical aspects / T.M. Reshetnyak, E.N. Alexandrova, I.B. Shtivelband, L.V. Kondrateva, A.A.Novikov, L.A. Kalashnikova, Т.А. Lisitsyna, I.E. Shirokova, Z.S. Alekberova, E.L. Nassonov // Thrombosis Research. – 2004. – Vol. 114. – P. 610.
29. Атеросклеротическое поражение сосудов при системной красной волчанке у мужчин: связь с концентрацией С-реактивного белка / А.Е. Ильина, Н.Г. Клюквина. Е.Н. Александрова, Т.В. Попкова, А.А. Новиков, Э.С. Мач, О.В. Булгакова, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2005. - №6. – С. 61-65.
30. Иммунологическая характеристика антифосфолипидного синдрома / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Т.М. Решетняк // Научно-практический симпозиум «Роль лабораторной информации в диагностике и контроле за лечением ревматологических заболеваний».: Тезисы докладов. – Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. - №9. – С. 12-13.
31. Катастрофический антифосфолипидный синдром: диагностика и терапия / Т.М. Решетняк, Е.Н.Александрова, И.Б. Штивельбанд, С.Г. Раденска-Лоповок // Терапевтический архив. – 2005. - №5. – С. 41-47.
32. Разновидности антифосфолипидных антител у больных системной красной волчанкой и первичным антифосфолипидным синдромом / Т.М. Решетняк, Я. Забек, З.С. Алекберова, Е.Н. Александрова, И. Войцеховска // Научно-практическая ревматология. – 2005. – №5. – С. 11-18.
33. Растворимый лиганд CD40 при аутоиммунных заболеваниях и атеросклерозе / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2005. - №12. – С. 91-95.
34. Фактор некроза опухоли и его растворимые рецепторы при ревматических заболеваниях: клиническое и патогенетическое значение / О.А. Кричевская, Н.Г. Клюквина, Е.Н. Александрова, Р.Т. Алекперов, Е.Л. Насонов // Научно-практическая ревматология. – 2005. – №2. – С. 43-46.
35. Diagnostic accuracy of the anticardiolipin and antibeta2-glycoprotein I antibody assay for antiphospholipid syndrome / E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, T.M. Reshetnyak, D.S. Novikova, E.L. Nasonov // Annual European Congress of rheumatology: Abstracts. – Annals of the Rheumatic Diseases. – 2005. – Vol. 64. – Suppl. III. – P. 250.
36. Soluble CD40L in systemic lupus erythematosus / E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, Т. V. Popkova, D.S. Novikova, N.G. Klukvina, E.L. Nasonov // Там же. – P. 134.
37. Von Willebrand factor antigen in systemic lupus erythematosus and antiphospholipid syndrome / A.A. Novikov, E.N. Alexandrova, Т. V. Popkova, T.M. Reshetnyak, D.S. Novikova, A.A. Baranov, E.L. Nasonov // Там же. – P. 251.
38. Растворимый лиганд CD40 при системной красной волчанке и антифосфолипидном синдроме / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Т.В. Попкова, Т.М. Решетняк, Д.С. Новикова, Н.Г. Клюквина, А.Е. Ильина, Э.С. Мач, А.В. Волков, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2006. - №6. – С. 35-39.
39. Растворимые рецепторы -фактора некроза опухолей: связь с атеросклеротическим поражением сосудов при системной красной волчанке у мужчин / А.Е. Ильина, Н.Г. Клюквина, Е.Н. Александрова, Т.В. Попкова, А.А. Новиков, Д.С. Новикова, Э.С. Мач, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2006. - №6. – С. 20-24.
40. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. Клинические рекомендации / Е.Л. Насонов, Е.Н. Александрова. – М.: ЗАО «БиоХимМак», 2006. – 71 с.
41. Association between soluble CD 40 ligand and subclinical atherosclerosis in patients with systemic lupus erythematosus / E.L. Nassonov, T.V. Popkova, A.E. Ilina, N.G. Klioukvina, T.A. Panafidina, E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, D.S. Novikova, E.S. Mach // Annual European Congress of rheumatology: Abstracts. – Annals of the Rheumatic Diseases. – 2006. – Vol. 65. – Suppl. II. – P. 462.
42. High-sensitivity C-reactive protein in antiphospholipid syndrome / E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, T.M. Reshetnyak, Т. V. Popkova, D.S. Novikova, L.N. Denisov, E.L. Nasonov // Там же. – P. 452.
43. Inflammatory markers in women with systemic lupus erythematosus / T.A. Panafidina, T.V. Popkova, Z.S. Alekberova, E.S. Mach, D.S. Novikova, A.A. Novikov, E.N. Alexandrova, E.L. Nasonov // Там же. – P. 355.
44. The level of protrombin and antiprotrombin antibodies in patients with the antiphospholipid syndrome / L.V. Kondratyeva, T.M. Reshetnyak, E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, N.A. Lipatova, A.B. Dobrovolskiy, E.L. Nassonov // Там же. – P. 627.
45. Клинико-иммунологическая оценка высоко-чувствительного метода определения С-реактивного белка при антифосфолипидном синдроме / Е.Н. Александрова, А.А. Новиков, Т.М. Решетняк, Т.В. Попкова, З.С. Алекберова, Н.В. Середавкина, Н.Г. Клюквина, Д.С. Новикова, Э.С. Мач, Л.Н. Денисов, Е.Л. Насонов // Научно-практическая ревматология. – 2007. – №1. – С. 9-15.
46. Elevated serum neopterin levels in antiphospholipid syndrome / E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, Т. V. Popkova, T.M. Reshetnyak, N.G. Klioukvina, N.V. Seredavkina, E.L. Nasonov // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2007. – Vol. 66. – Suppl. II. – P.582.
47. Лабораторная диагностика / Е.Н. Александрова // Ревматология: национальное руководство / Под ред. Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – С. 35-62.
48. Cytokine serum levels in antiphospholipid syndrome / E.N. Alexandrova, A.A. Novikov, T.M. Reshetnyak, T.V. Popkova, N.V. Seredavkina, M.V. Cherkasova, L.N. Denisov, E.L. Nasonov // Annals of the Rheumatic Diseases. – 2008. – Vol. 67. – Suppl. II. –
P. 590.
49. Растворимый CD40-лиганд при системной красной волчанке: связь с атеросклеротическим поражением сосудов / Т.В. Попкова, Т.А. Панафидина, Е.Н. Александрова, Д.С. Новикова, А.А. Новиков, З.С. Алекберова, Э.С. Мач, Е.Л. Насонов // Терапевтический архив. – 2008. – №5. – С. 37-41.
50. Интерлейкин -18 при системной красной волчанке: связь с клиническими проявлениями заболевания и атеросклеротическим поражением сосудов / Т.А. Панафидина, Т.В.Попкова, З.С. Алекберова, Э.С. Мач, Е.Н. Александрова, Е.Л. Насонов // Там же. – С. 41-46.
