Способов локальнойиммунокоррекции с использованиеммиелопида и no-терапии в комплексном лечениигнойных ран
На правах рукописи
Халилов МаксудАбдуразакович
КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯЭФФЕКТИВНОСТЬ
СПОСОБОВ ЛОКАЛЬНОЙИММУНОКОРРЕКЦИИ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕММИЕЛОПИДА И NO-ТЕРАПИИ
В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИГНОЙНЫХ РАН
14.03.09 - клиническаяиммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соисканиеучёной степени
доктора медицинскихнаук
Курск- 2010
Работа выполнена вГосударственном образовательномучреждении высшего профессиональногообразования «Орловский Государственныйуниверситет»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук,профессор СнимщиковаИрина Анатольевна;
Заслуженный деятельнауки РФ,
доктор медицинских наук,профессор ЗатолокинВасилий Данилович.
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,профессор ЮдинаСветлана Михайловна;
Заслуженный деятельнауки РФ,
доктор медицинских наук,профессор ЗемсковАндрей Михайлович;
Заслуженный деятельнауки РФ,
доктор медицинских наук,профессор ВинницкийЛеонид Ильич.
Ведущее учреждение:ГОУ ВПО «Российскийгосударственный медицинский университетРосздрава», г. Москва
Защита диссертации состоится «___»____________2010 г. в «___» часов на заседаниидиссертационного совета Д 208.039.01. приГосударственном образовательномучреждении высшего профессиональногообразования «Курский государственныймедицинский университет Федеральногоагентства по здравоохранению исоциальному развитию» по адресу: 305041, г.Курск, ул. К. Маркса, 3.
С диссертацией можно ознакомиться вбиблиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава
Автореферат разослан «___» ________________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д.м.н.,профессорКалуцкий П.В.
ОБЩАЯХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальностьпроблемы.Гнойно-воспалительные заболеванияразличной локализации до настоящеговремени остаются одной из актуальныхпроблем современной медицины, чтообусловлено их распространённостью,тенденцией к хроническому течению,недостаточной эффективностьютрадиционных методов лечения (СавельевВ.С., Гостищев В.К., 2009; Pulgar S., Mechra M., 2008).
В общей структурехирургических заболеваний хирургическаяинфекция наблюдается у 35-45% больных ипротекает наиболее часто в виде раневойинфекции, а около 30% летальных исходовпосле хирургических вмешательств связанос гнойными осложнениями (Федоров В.Д., 2005;Светухин А.М., 2008; Войновский Е.А., 2009; Falanga V.,2007). Эти данные свидетельствуют обактуальности и нерешённости проблемыхирургической инфекции, приобретающей всёбольшую социально-экономическуюзначимость.
Результаты лечениягнойных заболеваний мягкихтканей ираневой инфекции, несмотря на применениесовременных методов и достигнутыеопределенные успехи, не удовлетворяютполностью хирургов (Толстых П.М., 2007;Гостищев В.К., 2009; Coutts P.,Sibbald R.G. 2008).Длительное лечение, значительныематериальные затраты, частые осложнения,косметические изъяны – это все требуетизыскания новых путей, совершенствованияуже имеющихся способов терапии даннойгруппы больных. И если тактикахирургического лечения гнойных ран внастоящее время определена, то рядфакторов дополнительного воздействия нараневую поверхность постоянно развиваетсяи совершенствуется.
Сложный патогенезраневого процесса обусловливаетнеобходимость комплексного воздействия наразличные его фазы (Земляной А.Б., Сажин А.В.,2009; Rice L.B., Grandmann H., 2006). Так как раневаяинфекция является одной из основных причиннеудовлетворительных исходов веденияоткрытых повреждений мягких тканей,актуальность оптимизации местной терапиигнойных ран не вызывает сомнений.
В последние годы всебольшее внимание клиницистов привлекаютперспективы использованияпри лечении воспалительных процессовоксида азота. В эксперименте иклинике доказан ранозаживляющий эффектпри обработке гнойных ран газовым потоком,содержащим оксид азота,что заложило основы новогонаправления в медицине - NO-терапии ран ираневой инфекции. Важным преимуществомNO-терапии, в отличие от большинствафизических и медикаментозных факторов,является воздействие полифункциональногоNO на все фазы раневого процесса (Шехтер А.Б., 2005, 2008; ШулуткоА.М., 2006). Вместе с тем недостаточноизучено влияние экзогенногооксида азота на параметры системного илокального противоинфекционногоиммунитета, дисбаланс которых при раневойинфекции ограничиваетвозможности иммунной системы всвоевременном распознавании и уничтожениимикробных возбудителей, а такжеспособствует хронизации раневогопроцесса.
Изучению роли нарушенийиммунного ответа при гнойных ранахпосвящены многочисленные исследования(Ковальчук Л.В, 2004, 2008; Винницкий Л.И., 2005, 2008;Braff M.H., Bardan,A., 2005; Harder J., 2007).
Однако закономерностидисрегуляции компонентов врождённогоиммунитета прираневой инфекции изучены недостаточно иявляются дискутабельными, а механизмы формированияиммунодефицита при данной патологиинуждаются в уточнении.До настоящего времени неопределены диагностические ипрогностические иммунологическиекритерии неблагоприятного течения гнойных ран, нетединого мнения о значимости показателейлокальногоиммунитета при проведении местноголечения.
Посколькугнойно-воспалительные заболеваниясопровождаются нарушением факторовиммунной защиты (Караулов А.В., Земсков А.М., 2006,2008; M. Carretero, M.Escamez, 2007), тоодним из адекватных способов комплексноголечения представляется иммунотерапияпрепаратами системного и топическогодействия. Работами ряда авторов показано,что локальная иммунокоррекцияпрепаратами иммунорегуляторных пептидовпри гнойных заболеванияхмягких тканей и раневойинфекции, способствует снижениюпродолжительности лечения и частотырецидивов (Симбирцев А.С., Варюшина Е.А., 2008;Fucumoto K., 2005; Jacobsen F., 2007). В литературевстречаются единичные данные о совместномлокальном использованиииммуномодуляторов и NO-терапии (Луцевич О.Э.,Шехтер А.Б., 2008). Однако, недостаточносведений о патогенетическомобосновании их дифференцированногоназначения в конкретной клиническойситуации, не изучены эффекты их взаимноговлияния при сочетанном применении.
В связи с этим приобретаетактуальность оптимизация лечения гнойныхран с включением в программы комплексноговедения больных способов локальнойиммунокоррекции с использованиемпрепаратов иммунорегуляторных пептидов иNO-терапии, атакже необходимость дальнейшего изучениямеханизмов их противовоспалительнойактивности, расширения показаний к назначению иразработки оптимальных схем лечения.
Цель работы. Повышениеэффективности лечения больных с гнойнымиранами путём разработки и примененияспособов локальной иммунокоррекции сиспользованием миелопида иNO-терапии.
Задачиисследования.
1. Провести комплексноеклинико-иммунологическое обследованиебольных с гнойными ранами различнойэтиологии и локализации для выявлениямаркёроввысокого риска реализации затяжного ихронического течения раневойинфекции.
2. Изучить in vitroантимикробную активность препаратамиелопид и его влияние на продукцию противомикробныхпептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина,миелопероксидазы), воспалительных ипротивовоспалительных цитокинов, оксида азота иметаболитов кислорода, экспрессию TOLL2-рецепторовмононуклеарными фагоцитамипериферической крови больных с гнойнымиранами.
3. Сравнить динамику иособенности заживления экспериментальнойгнойной раны при различных вариантахиспользования NO-терапии и миелопида.
4. Разработать способылокальной иммунокоррекции сиспользованием миелопида и NO-терапии в комплексном лечениибольных с гнойными ранами и оценить ихклиническую эффективность всравнении с традиционным лечением.
5. Исследовать влияниевариантов местного применения препаратамиелопид,NO-терапии и ихкомбинации на динамику показателейлокального и системного иммунного статуса больных сгнойными ранами.
Научная новизна. Получены данные об изменении пригнойных ранах продукции антимикробныхпептидов (кателицидина LL-37, -дефенсина,лактоферрина,миелопероксидазы, гепсидина), экспрессииTOLL2-рецепторов фагоцитарнымиклетками, которые расширяют представленияо роли дисфункции компонентов врождённогоиммунитета в патогенезе раневого процесса.
Впервые показана диагностическая и прогностическаязначимость комплексной оценки в раневой жидкостипри гнойных ранах уровней кателицидина LL-37, -дефенсина,метаболитов NO, матрикс металлопротеиназы – 3 и числа TOLL2+ клеток.
Впервые выявлена прямаяантимикробная активность препарата миелопид в отношенииStaphylococcus aureus, Streptococcuspyogenеs, Escherichia coli, Proteus vulgaris,Klebsiella pneumoniae,Сandida albicans (Патент № 2333765).
Установлено in vitro иммуномодулирующее влияниепрепарата миелопид на продукцию антимикробныхпептидов (кателицидина LL-37, лактоферрина,миелопероксидазы), воспалительных ипротивовоспалительных цитокинов, метаболитовкислорода и оксида азота, экспрессиюTOLL2-рецепторов мононуклеарнымифагоцитами периферической крови больныхгнойными ранами.
Впервые проведена сравнительнаяоценка изменений патоморфологических показателей ираневой микрофлоры при заживленииэкспериментальной гнойной раны в условияхместного использования вариантов NO-терапии ипрепарата миелопид.
Впервые разработаны ивнедрены в клиническую практику способы локальной иммунокоррекции пригнойных ранах с использованием препаратамиелопид и NO-терапии в сочетании с миелопидом(Патент № 2326678), проведена оценка их эффективности всравнении с традиционным лечением иместнымприменением NO-содержащего газовогопотока.
Выявлено положительноевлияние способов локальнойиммунокоррекции с использованием миелопида иNO-терапии надинамику показателей системного и локального иммунитета больных с гнойнымиранами.
Практическая значимостьработы. В результатепроведенных исследований экспериментально обоснованолокальное применение препарата миелопид и NO-терапии всочетании с миелопидом в комплексномлечении гнойных ран.
Полученные данные обантимикробной активности препарата миелопидобосновываютвозможность его местногоиспользования при гнойныхранах и раневой инфекции, вызванныхS. аureus, S. рyogenеs, E. coli, P. vulgaris, K. pneumoniae, С. albicans.
Разработаны критериибалльной оценки тяжести течения гнойныхран с учётомклинико-иммунологических показателей иопределены маркёры высокого риска реализации затяжного ихронического течения раневойинфекции.
По результатамсравнительной оценки клиническойэффективности местного лечения больных с гнойнымиранами показано, что сочетанное применение локальнойиммунокоррекции с использованиемпрепарата миелопид и NO-терапии позволяетболее быстро купировать воспалительныйпроцесс втканях раны, ускорить заживление идеконтаминацию, сократить времяподготовкиран к хирургическому закрытию, срокии стоимость лечения.
Положения, выносимые назащиту.
1. Одним из факторовразвития иммунной дисфункции у больных сгнойными ранами является дисбаланскомпонентов антиинфекционного иммунитета: продукцииантимикробных пептидов (кателицидина LL-37,дефенсина 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы,гепсидина) иэкспрессии TOLL2-рецепторовфагоцитарными клетками.Маркёрами неблагоприятного течениягнойных ран являются значительноеповышение или снижение в раневой жидкостиуровня кателицидина LL-37, повышениеконцентрации дефенсина, матрикс металлопротеиназы-3,снижение числа TOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.
2. Препарат миелопидобладает противомикробнойактивностью и оказываетиммуномодулирующее влияние на продукциюантимикробных пептидов, цитокинов,метаболитов кислорода иоксида азота, экспрессию TOLL2-рецепторовмононуклеарными фагоцитамипериферической крови больных с гнойнымиранами.
3. Комбинированноеиспользование при экспериментальныхгнойных ранах миелопида и NO-терапиисопровождается более быстрой санациейпатологического очага и укорочениемсроков заживления, по сравнению с изолированнымприменением миелопида, антисептикагипохлорита натрия и его сочетания сNO-содержащимгазовым потоком.
4. Использование в комплексном лечениигнойных ран локальной иммунокоррекциипрепаратом миелопид и, особенно, NO-терапии в сочетании с миелопидом, ускоряеткупирование воспалительного процесса,сроки заживления и деконтаминации,сокращает продолжительностьстационарного лечения.
5. Локальноеприменение препарата миелопид, NO-терапии, а также ихсочетания у больных гнойными ранамиприводит к восстановлению исходно нарушенныхпоказателей иммунногостатуса.
Внедрения впрактику.Способы локальнойиммунокоррекции препаратом миелопид, NO-терапии в сочетании с миелопидом; способопределения динамики поверхностныхраневых процессов внедрены в практикуработы ОГУЗ «Орловская областнаяклиническая больница», МЛПУЗ «Больницаскороймедицинской помощи им. Н.А. Семашко» г. Орла,МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г. Орла,ОГУЗ «Белгородская областная клиническаябольница»,ГУП НИИ Новых медицинских технологийТульской области, Тульского отделенияакадемии медико-технических наук РФ.Полученные результаты используются вучебном процессе кафедр иммунологии испециализированных клинических дисциплин; общейхирургии; анатомии, оперативной хирургии с курсомфакультетской хирургии медицинскогоинститута ГОУ ВПО «Орловскийгосударственный университет».
Связь с планом НИР.
Работа проведена всоответствии с планом НИР ГОУ ВПО«Орловский государственный университет»(номер госрегистрации комплексной темы14.00.03).
Апробация работы. Основные положения работыпредставлены, доложены и обсуждены на 2 Российскойнаучно-практической конференции «Актуальные проблемыэкологии, экспериментальной и клиническоймедицины» (Орёл, 2001), Межрегиональнойконференции и организационном съездехирургов«Лечение ран и раневой инфекции (Ярославль,2003), Всероссийской конференции «Актуальныевопросы педиатрии и иммунологии»(Санкт-Петербург, 2005), VI Всероссийскомнаучном форуме «Хирургия-2005» (Москва, 2005),Всероссийской конференции «Современныетехнологии в иммунологии: иммунодиагностика ииммунотерапия» (Курск, 2006), VIII и IXВсероссийских научных Форумах с международным участием «Днииммунологии в Санкт-Петербурге» (2006, 2007), VI Российскомконгрессе «Современные технологии впедиатрии и детской хирургии» (Москва, 2007),IVВсероссийской конференцииобщих хирургов с международным участием иПленуме проблемной комиссии «Инфекция вхирургии» (Ярославль. 2007), I Объединенномнаучно-практическом форуме детских врачей(Орёл, 2008), научно-практической конференциихирургов ЦФО РФ, (Орёл, 2009, Белгород, 2010),Национальной конференции«Аллергология и клиническая иммунология–практическому здравоохранению» (Москва,2010), совместном заседаниикафедриммунологии и специализированныхклинических дисциплин, оперативной и факультетскойхирургии, внутренних болезней, общейхирургии и анестезиологии, микробиологии иинфекционных болезней МИ ОГУ (Орёл, 2010).
Работа выполнялась прифинансовой поддержке федеральной целевойпрограммы «Научные инаучно-педагогические кадры инновационнойРоссии» позаявке № 551П/41 «Иммунологический мониторингадаптации человека и его жизнеобеспеченияв условиях действия неблагоприятныхэкзогенных и эндогенных факторов» (2009-2013 гг.).
Публикации. По темедиссертации опубликовано 51 научная работа,в том числе 17 –в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1монография, 3 пособия для врачей.Получено 2 патента на изобретение.
Объем и структурадиссертации. Диссертацияизложена на 257 страницах машинописноготекста, иллюстрирована 37 рисунками, 30таблицами, состоит из введения, обзоралитературы, 4 глав собственныхисследований, заключения, выводов,практических рекомендаций,библиографического указателя,включающего 493 источника, в том числе 277отечественных и 216 зарубежныхавторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ
Моделированиеэкспериментальных гнойных ран проводилосьна 140 крысах «Вистар» обоего пола в равныхколичествах весом 170 ± 30г по (S. Eleck, K. Sommenn(Даценко Б.М., 1995). Всеживотные до начала эксперимента прошликарантинный режим вивария, содержались водинаковых условиях в индивидуальныхклетках на типовом пищевом рационе. При проведении экспериментальныхработ соблюдены принципы Европейскойконвенции (Страсбург, 1986) и Хельсинкскойдекларации Всемирной медицинскойассоциации о гуманном обращении сживотными (2000), требования приказа №267МЗ РФ от 19.06.2003 «Правила по обращению,содержанию, обезболиванию и умерщвлениюэкспериментальных животных».
Животные в зависимостиот серии исследований и применяемогометода лечения были распределены на 5групп: животные, не получавшие лечения (1 -контрольная группа); животные 2 группы -сравнения (с применением раствора натриягипохлорита 600 мг/л) и основные группыживотных, получавшие оптимизированноелечение с использованием растворамиелопида (3000 мкг/мл) – 3 группа, комплекса NО-терапии ираствора натрия гипохлорита (600 мг/л) – 4 группа, а такжесочетания NО-терапии и миелопида (3000 мкг/мл)– 5 группа. Примоделировании гнойной раны, послепредварительной обработки кожи, васептических условиях, под эфирныммасочным наркозом, на выбритом от шерстиучастке спины в межлопаточной области уживотных иссекалась кожа с подкожнойклетчаткой в виде квадрата 2
2 см (400 мм2) по контуру, предварительнонанесенным трафаретом. Края и дно раныраздавливали зажимом Кохера. В ранувносили марлевый тампон весом 0,5 грамм свзвесью суточной культуры золотистогостафилококка (фаготип 3А/3С/55/71) в дозе 1 млрд.микробных тел в 1 мл физиологическогораствора. Рану ушивали наглухо. На 5-е суткина спине в межлопаточной области уживотных формировался абсцесс со всемихарактерными признаками гнойноговоспаления. Отмечался отек и гиперемиякожи в области нанесения раны, припухлость,у некоторых животных между швами выделялсягной. При пальпации определялась местнаягипертермия и флюктуация. После снятияшвов и разведения краев раны удалялсямарлевый тампон, выделялось большоеколичество гноя, а сформированная у животных ранаимела все основные черты гнойноговоспаления, позволяющие считать ееадекватной моделью гнойной раны учеловека. Дляпредупреждения контракции раны за счетэластичности, а также для стандартностиусловий лечения, к краям раны подшиваласьметаллическая рамка, соответствующаяразмерам раны, с «крышкой» для удержанияперевязочного материала в ране ипредупреждения высыхания раневойповерхности. Лечение начинали схирургической обработки гнойной раны,включающей эвакуацию гноя, удалениенекротической ткани и промыванием ееантисептиком. На раневую поверхностьежедневно во время перевязок при сменемарлевых салфеток проводили сеансы NO-терапии, наносили лекарственные средствасогласно делению животных на группы дозаживления раны.
Для оценкивлияния исследуемых факторов назаживление ран проводились клинические,планиметрические, микробиологические,цитологические (по М.Ф. Камаеву) игистологические методы исследованийна 1, 3, 5, 7, 10 и 14 сутки от началалечения. Скорость уменьшения раневойповерхности определяли по методу Л.Н.Поповой, для оптимизации которого былаиспользована программа анализа динамикиран (Мошкин А.С., 2008).
В клинической частиработы была оценена эффективность лечения198 больных с гнойными ранами. Все больные поспособу лечения были разделены на 4 группы:I – контрольнуюгруппу составили 60 пациентов, получавшихтрадиционное лечение; во II группу вошли 39больных, которым на фоне традиционноголечения проводилась локальнаяиммунокоррекция препаратом миелопид; втретью группу были включены 39 пациентов,получавших местную NO-терапию; IV группусоставили 60 больных, которые получалилокальную иммунокоррекцию препаратоммиелопид в сочетании с NO-терапией. Больныевсех групп были сопоставимы по возрасту,полу и характеру патологического процессав мягких тканях, распределение в них былослучайным. Средний возраст больныхсоставил 41,5±3,9 лет.
Программа диссертационногоисследования утверждена на заседанииЭтического комитета медицинскогоинститута ГОУ ВПО «Орловскийгосударственный университет (протокол № 2от 16. 03.2005г.) в соответствии стребованиями Основ законодательства РФ«Об охране здоровья граждан». Отчет попроделанной работе заслушан на заседанииЭтического комитета (протокол № 4 от 21мая 2009 года).
Местное лечение во всехнаблюдаемых группах начинали с проведенияхирургической обработки гнойного очага ссоблюдением общепринятых принципов:рассечение повреждённых тканей сиссечением девитализированных структур,полная ликвидация гнойных затёков,проведение тщательной ревизии иадекватного дренирования гнойного очага,санация её растворами антисептиков. Вгруппе больных, где применялосьтрадиционное лечение, для закрытияраневой поверхности примененяласьмногокомпонентная мазь наполиэтиленгликолевой основе (левомеколь) впервой фазе и метилурациловая мазь вовторой фазе раневого процесса.
Алгоритм лечениябольных четвёртой группы (патент наизобретение №2326678 от20.06.2008г.) включалхирургическую обработку раны и санацию еёрастворами антисептиков; воздействие нараневую поверхность воздушно-плазменнымпотоком, содержащим оксид азота,генерируемым с помощью аппарата «Плазон»(длительность воздействия на одну зонуразмером 1х1см составляла 8-9 секунд срасстояния 20-25 см от выхода плазмотрона,общее время соответствовало площади раны);локальное применение раствора миелопида(3000 мкг/мл), которым обрабатывали раневуюповерхность 1 раз в сутки как в первой, так иво второй фазах раневого процесса. Соответственно местное лечение пациентоввторой и третьей групп включалоиспользование раствора миелопида или оксидаазота по выше приведённой схеме.
Критериями исключенияпациентов из проводимого исследованияслужили: возраст пациентов меньше 18и старше 65 лет,сопутствующие соматические заболевания встадии обострения или декомпенсации,беременность, тяжелый сепсис,иммуносупрессия вследствиеновообразований или ВИЧ-инфекции, активныйвирусный гепатит, индивидуальная непереносимость илиаллергическая реакция больного напрепараты, используемые для терапии.
Эффективность леченияоценивали в баллах по разработанным намикритериям. При этом учитывали: характер иколичество раневого отделяемого, наличиеинфильтрации и отёка в области гнойногоочага, нарушение функции поражённойанатомической зоны, сроки появлениягрануляций и выполнения ими раны, времяначала краевой эпителизации, степеньперифокальной гиперемии, клеточный составмазков-отпечатков с поверхности раны,степень микробной обсеменённости,скорость сокращения площади раны (мм2 в сутки), показателилокального иммунного статуса (табл. 1),которые оценивали на 1, 3, 6, 9 сутки и привыписке больного.
Таблица 1
Лабораторныепоказатели оценки выраженности локальноговоспалительного процесса при раневой инфекции.
| Показатель | 0баллов | 1 балл | 2балла | 3балла |
| ИЛ-1 | 50-100пг/мл | 101-150пг/мл | 151-250пг/мл | >250пг/мл < 30пг/мл |
| ФНО- | 30-50пг/мл | 51-100пг/мл | 101-150пг/мл | >150пг/мл < 15пг/мл |
| ТФР- | 2000-2500пг/мл | 2510-3000пг/мл | 3001-4000пг/мл | >4000пг/мл <1000пг/мл |
| ИЛ-10 | 5-10пг/мл | 10-15пг/мл | 16-20пг/мл | >20пг/мл |
| -дефенсин | 0,5-0,75мкг/мл | 0,76-1,0мкг/мл | 1,1-1,5мкг/мл | >1,5 мкг/мл |
| LL-37 | 1,5-3,0мкг/мл | 3,1-6,0мкг/мл | 6,1-10,0мкг/мл | >10,0мкг/мл < 0,5мкг/мл |
| MMP-3 | 1,0-5,0нг/мл | 5,1-10,0нг/мл | 10,1-15,0нг/мл | >15нг/мл |
| Оксидазота | 2,5-3,0мкмоль/л | 3,1-5,0мкмоль/л | 5,1-6,5мкмоль/л | >6,5мкмоль/л <1,0 мкмоль/л |
Для определенияисходного состояния иммунного статуса, сравнительной динамики теченияраневого процесса у больных с различнымипричинами возникновения гнойных ран идля выявления маркёроввысокого риска реализации затяжного и хроническоготечения раневой инфекции были дополнительно обследованы145 больных(средний возраст 42,7±3,5 лет), получавшихтрадиционное лечение: 65 - сранами после вскрытия абсцессов и флегмонмягких тканей; 20 - с послеоперационными ранами, 30- с посттравматическими ранами; 30 - сфлегмонозно-некротической формой рожи.
Мононуклеарыпериферической крови (МНК) здоровых лиц ибольных с раневой инфекцией выделяли сиспользованием метода дифференциальногоцентрифугирования в градиенте плотностификолл-верографин (Фримель Г., 1980).Разделение суммарной фракциимононуклеаров на моноциты и лимфоцитыосуществляли посредством избирательнойадгезии моноцитов к пластику (Тотолян А.А.,2000).
С целью определенияспособности клеток к продукцииантимикробных пептидов (кателицидина LL-37,лактоферрина, миелопероксидазы),цитокинов метаболитов оксида азота иликислорода взвесь мононуклеарных фагоцитов(МНФ) в концентрации 2 млн./мл инкубировали втечение 1,5 часов в сывороточной средеRPMI-1640 при 37°Сс препаратом миелопид (композит свиныхмиелопептидов; НПЦ Медицинскаяиммунология, Россия) в атмосфере 5% СО2. Вкачестве индуктора синтеза цитокиновиспользовали ФГА (фитогемагглютинин, «Difco»,США) в концентрации 10 мкг/мл. По окончании инкубации клетки в планшетахтрижды отмывали средой 199,ресуспендировали в полной среде RPMI-1640 в объеме 100 мкли культивировали в стандартных условиях втечение 18 часов (22 часа приопределения NO). Для исследованиябрали супернатанты клеток, полученныепутем 10-минутного центрифугированиякультуральной смеси при 1500 об./мин, которые переносилив лунки 96-луночного планшета.
Интенсивностькислородного метаболизма МНФ кровиопределяли по восстановлению нитросинеготетразолия в формазан. Приоценке индуцированного НСТ-теста в лунки вносилизимозан в концентрации 0,2 мг/мл и инкубировали при37С в течение1 часа. Реакцию учитывали на планшетномфотометре для ИФА при длине волны 540 нм(Тотолян А.А., 2000).
Продукциюмиелопероксидазы оценивали по методикеАзнабаевой Л.Ф. с соавт. (2002 г.) с расчетомпоказателя пероксидазной активностиисследуемой биологической жидкости (ПОА).Определение концентрации кателицидина LL-37и лактоферрина в супернатантах клеток,сыворотке крови и раневом экссудатепроводилось методом твердофазного ИФА спомощью набора реагентов Hbt(Нидерланды), ЗАО “Вектор-Бест” (Россия).
Содержание NO впробах оценивали спектрофотометрически при длине волны 540 нм спомощью реактива Грисса. Результатрассчитывалипо кривой с использованием стандартныхрастворов нитрита натрия (Голиков П.П., 2004). Уровень цитокиновопределяли методом ИФА с помощью наборареагентов ООО “Протеиновый Контур”, ООО«Цитокин» (Санкт-Петербург) и DRG (Germany).
Для определения влиянияпрепарата миелопид на экспрессию TOLL-2рецепторов мононуклеарными фагоцитамикрови, МНФ в концентрации 2 млн./млинкубировали 90 минут в сывороточной средеRPMI-1640 с миелопидом (600, 750, 1500, 3000 мкг/мл) влунках 96-луночных планшетов при 37°С ватмосфере 5% СО2. По окончании инкубации клетки впланшетах трижды отмывали от препаратасредой 199, ресуспендировали в полной средеRPMI-1640 в объеме 100 мкл и культивировали встандартных условиях в течение 22 часов,после чего планшет центрифугировалипри 2000 об./мин. 3 минуты, удалялисупернатанты и трижды отмывали клеткисредой 199. Оценка экспрессии TOLL-2 рецепторовпроизводилась путем подсчёта CD282+ клеток спомощью моноклональных антител Hbt(Нидерланды) непрямым иммунопероксидазнымметодом.
Оценку уровня дефенсина и гепсидина всыворотке крови и раневом экссудате (РЭ)проводили методом ИФА с использованиемтест-систем Hbt (Нидерланды) и IBL (Германия).
Для получения РЭиспользовали стерильные марлевые тампоны,которые помещали в рану с экспозицией на20-30 секунд. После аппликации пропитанныйтампон вносили в пробирку с 0,2 мл 0,9%раствора натрия хлорида на 30 минут споследующим его удалением послецентрифугирования в течение 5 минут при 1500об./мин.
С целью оценкипоказателей системного иммунитета больныхосуществлялся забор периферической кровидо лечения, в процессе и после лечения, приэтом изучали уровень иммуноглобулинов A, M,G, антимикробных пептидов и цитокиновИЛ-1, ИЛ-1Ra, ИЛ-6,ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-,ТФР-1 в сыворотке крови, функциональнуюактивность МНФ.
Фенотип клетокопределяли непрямым иммунопероксидазнымметодом с использованием моноклональныхантител (ТОО «Сорбент», г. Москва; Hbt,Нидерланды), согласно прилагаемыминструкциям и рекомендациям.Концентрацию иммуноглобулинов оценивалиметодом радиальной иммунодиффузии спомощью стандартных планшетов «Реафарм»(Москва). Фагоцитарную активность МНФопределяли с помощью реагентов фирмы«ДиаэМ» (г.Москва).
Для определенияиммунологических показателей, принимаемыхза физиологическую норму, были обследованы20 здоровых лиц (средний возраст 45,1±0,5 лет) для выявления у них фоновыхпоказателей иммунного статуса и ихсравнения с данными иммунограмм у больныхс раневой инфекцией.
Антибактериальноедействие миелопида определяли методомдиффузии в агар по степени задержки ростамикроорганизмов в зоне нанесенияпрепарата. В качестве тест-культур былииспользованы штаммы микроорганизмов изколлекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а такжеклинические изоляты бактерий (E. coli, P. vulgaris,K. pneumoniae, P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes, C. albicans).
Иммунологическиеисследования выполнялись на кафедреиммунологии и специализированныхклинических дисциплин медицинскогоинститута ОГУ. Бактериологическиеисследования выполнены на кафедремикробиологии и инфекционных болезнеймедицинского института ОГУ, вбактериологической лаборатории МУЗ«Городская СЭС» и МЛПУЗ «Городскаябольница им. С.П. Боткина» г. Орла всоответствии с методическимирекомендациями МЗ СССР (1985 г.).
Статистическуюобработку результатов исследованияпроводили с помощью программногокомплекса Microsoft Excel XP на компьютере «Pentium IV».Исследование корреляционной взаимосвязимежду показателями выполнялись поПирсону.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙИ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результатыэкспериментальных исследований.
По современнымпредставлениям одним из ключевых звеньевпатогенезагнойных ран является развитие иммуннойдисфункции, что приводит к нарушениюнормального заживления тканей на одной иболее стадиях развития раневого процесса изамедляет репарацию (Долгушин И.И., 2009; Galkowska, H., 2005;SteinstraesserL., 2008).Вместе с тем, исследованиямеханизмов формирования иммуннойнедостаточности у больных гнойными ранамидостаточнофрагментарны и посвящены преимущественноизучению состояния Т-, В- звеньев иммунитета ифагоцитарной системы (Смирнов В.С., 2004; Сарвин А.Г., 2005; Варганов М.В., 2006). Приэтом закономерности дисрегуляции системных и локальных компонентовпротивоинфекционного иммунитета у больных гнойными ранамиявляются дискутабельными инуждаются в уточнении для разработки адекватныхспособов местной иммунокоррекции.
В настоящее времяособый интерес вызывает возможностьприменения для лечения заживления ранпрепаратов иммунорегуляторных пептидов(цитокинов,факторов роста и др.), которые благодаряширокому спектру биологическойактивности регулируют все этапывоспалительного процесса(Симбирцев А.С., Ковальчук Л.В.,2008; Юдина С.М., Снимщикова И.А., 2010; Heilborn J. D.,2005; Jacobsen F.,2007). Однако одной из основныхпроблем, связанных с патогенетическимобоснованием локального примененияиммунорегуляторных пептидов, являетсянеобходимость изучения их плейотропногодействия на различные клетки-мишени и тефакторы, которые определяют развитиеиммунной дисфункции при гнойных ранах ираневой инфекции.
Учитываявышеизложенное, представляло интересизучить у больных с гнойными ранамиособенности факторов, обеспечивающихпротивомикробную защиту при остром,затяжном и хроническом течении раневогопроцесса и возможности регуляции ихпродукции препаратом миелопид. Для решениязадач исследования нами были обследованы145 пациентов с гнойными ранами различнойэтиологии и локализации. При этом насистемном и локальном уровне проводиласьоценка продукции антимикробных пептидов ибелков (АМП), активных метаболитовкислорода и азота, цитокинового статуса,экспрессии TLR2 – рецепторовфагоцитами.
Как известно, особоеместо среди продуктов активированныхфагоцитов занимают АМП, являющиеся, с одной стороны, естественнымиэндогенными антибиотиками, а с другой–сигнальными молекулами, вовлечёнными впроцессыактивации клеток иммунной системы ирепарации тканей. Внастоящее время охарактеризованы сотниэндогенных АМП различных групп, одни изкоторых имеют большую молекулярную массу ипредставлены литическими ферментами,белками, содержащими сайты противспецифических макромолекул и др.,большинство других - являются катионными,гранулы-ассоциированными полипептидами(Кокряков В.Н., 2006; Ковальчук Л.В., 2007; Bowdish D.J., 2005; Braff M.H.,2004-2006; Hancock R.E.,2006-2008; HarderJ., 2007-2009). Предположив, чтонарушение синтеза АМП может быть одной изпричин иммунной дисфункции при гнойныхранах, были изучены особенности ихсистемной и локальной продукции, а такжевозможности её регуляции in vitro препаратомимунорегуляторных пептидовмиелопид.
На сегодняшний деньбелок LL37 (hCAP18) является единственнымидентифицированным человеческимкателицидином, проявляющимиммунорегуляторное действие иантимикробную активность противграм-отрицательных и грам-положительныхбактерий, а также грибов и вирусов(Ковальчук Л.В., 2007; Barlow P. G., 2006; Zanetti M., 2007;Steinstraesser L., 2008).Как показали результаты исследований, вострую стадию раневого процесса быловыявлено повышение содержания LL37 в РЖ(рис.1), по сравнению со стандартнымизначениями для биологических жидкостей, спиком продукции на 5-6 сутки, что,по-видимому, имеет срочный компенсаторныйхарактер. Позитивная динамика течениялокального патологического процессасопровождалась последующим снижениемуровня LL37 (hCAP18) в раневой жидкости до1,2-2,5 мкг/мл к 11-14 суткам лечения. Даннаяиммунологическая картина имела местопреимущественно у пациентов с раневымипроцессами после вскрытия абсцессов ифлегмон мягких тканей (52 пациента – 35,9% из общего числаобследованных больных и 80% из даннойкатегории пациентов). У больных спосттравматическими и послеоперационнымиранами аналогичные показателирегистрировались в 4,1% (у 6 больных из 30) и в7,6% (у 11 пациентов из 20) случаев из общегочисла пациентов, соответственно.
Иная динамика местнойпродукции LL37была характерна для пациентов снеблагоприятным течением и исходомраневой инфекции. Так, затяжной раневойпроцесс протекал на фоне стабильно высокихконцентраций кателицидина. Начиная с первых днейлечения, в гнойной ране таких больныхнаблюдалосьповышение уровня LL37 более 10 мкг/мл. Данная динамика выявлялась преимущественно упациентов спослеоперационными и посттравматическимиранами – 6,2% (у 9 больных из 20)и 4,8% (у 7 больных из 30), соответственно. Кроме того, установлено, что резкоекратковременное повышение исследуемогопоказателя, как правило, на 7-8 сутки на фонеблагоприятного течения раневого процессасочеталось с развитием инфекционныхосложнений ирегистрировалось в 7,6% случаев у пациентов с гнойными ранами послевскрытия абсцессов и флегмон мягкихтканей. При этом пиксодержанияLL37 в РЖопережаллихорадочную реакцию на 1-2 дня.
Следует отметить, что враневом экссудате при хронических ранахвыявлялосьзначительное снижение концентрации LL37,который у большинства пациентовопределялся в минимальных и «следовых» количествах.Показано, что снижение кателицидина ниже 1,1- 0,5 мкг/мл в раневой жидкости регистрировалось на всехстадиях раневого процесса у всех больных сфлегмонозно-некротическойформой рожи и у 17 из 30 пациентов (56,7%) спосттравматическими ранами.
При изучении содержанияhCAP18 в сыворотке крови больных былаустановлена широкая вариабельностьзначений LL37: от «нулевых» до 5-10 кратногоповышения (1,3±0,2 мкг/мл у здоровых лиц). Какправило, динамика этих изменений былааналогична тем, что выявлялись у больных сразличным течением гнойной раны в раневойжидкости. Однако пиков продукцииисследуемого АМП в течение гнойной ранывыявлено не было. Средние концентрации LL37 всыворотке крови у больных с типичнымтечением раневого процесса до леченияколебались от 1,7 до 4,7 мкг/мл, составив всреднем 4,1±0,8 мкг/мл. К 11-12 суткамрегистрировалось снижениепоказателя до 3,1±0,7 мкг/мл. Как правило,обширные и хронические раны протекали нафоне более низких концентраций LL37(в среднем 1,1±0,4 мкг/мл), которые при этомпрактически не отличались от показателейздоровых лиц, что можетсвидетельствовать об угнетении эндогеннойпродукции АМП и снижении резервных возможностейклеток-продуцентов в ответ набактериальную стимуляцию.
 |  |
| Рис.1. Концентрация LL37 в раневой жидкостибольных с типичным (I) и затяжным (II)течением гнойных ран. | Рис.2. Концентрация дефенсина (HNP 1-3) враневой жидкости больных с типичным (I) изатяжным (II) течением гнойных ран. |
Примечание: на рис. 1 ирис. 2, 3, 8 - p<0,05 между показателями вгруппах на 1, 5; 1 и 7 сутки.
Как известно, наряду скателицидином LL37 к катионным АМП относятся дефенсины и (Ковальчук Л.В., 2007;Будихина А.С., Пинегин Б.В., 2008; Bowdish D.J., 2006; Wang G.,2008). В этой связи заслуживают вниманияданные об изменении продукциидефенсина (HNP 1-3)(рис. 2), который являясь уникальным маркёромнейтрофилов (в меньшейконцентрации обнаруживаются в Т-, В-лимфоцитах,моноцитах/макрофагах),проявляет микробицидное, хемотаксическое действие, атакже иммуномодулирующую и цитотоксическуюактивность (Braff M.H., 2007; Buck C.B.,2007; Steinstraesser L., 2008). Установлено,что в острую фазу раневого процесса у всехбольных гнойными ранами повышеноколичество HNP1-3 в раневой жидкости (до 1,8±0,1 мкг/мл) иплазме крови(до 0,95±0,1 мкг/мл). В плазме кровиздоровых лицуровень HNP 1-3варьировал от 48 до 105 нг/мл.Снижениечисла раневыхнейтрофилов в РЖ коррелировало суменьшением уровня дефенсина (r=0,95;p>95%). Так, при благоприятном течениираневого процесса снижение HNP 1-3 враневой жидкости отмечалось, как правило, с5 дня и достигало в среднем уровня 0,625±0,125мкг/мл к 9-10 суткам. На фонезатяжного, хронического течения раневого процесса идефицита эпителизации отмечалось сохранениеповышенного уровня HNP 1-3 в раневомочаге (более 1,5±0,25мкг/мл).
В последние годы впатогенезе инфекционно-воспалительныхзаболеваний различной локализации активнообсуждается роль гепсидина, которыйвыполняя роль АМП, подобно белкам остройфазы, синтезируется в печени, а такжеучаствует в регуляции транспортажелеза в различных компартментахорганизма, включая клетки эпителия,макрофаги и др. (Nemeth E., 2003; Dallalio G., 2003; Meldrum D.R.,2007). Установлено, что в РЖгепсидин определялся лишь в 6,2% случаев итолько у больных с обширными (более 100см2) гнойными ранами.Повышение концентрации гепсидина всыворотке крови (до 215,3±38,2 нг/мл, посравнению с показателями здоровых лиц -87,4±16,8 нг/мл) регистрировалось у 18%,преимущественно у больных с осложненнымтечением заболевания на фонесопутствующей патологии (сахарный диабет,патология желудочно-кишечноготракта).
Рис. 3. Концентрация лактоферрина враневой жидкости больных с типичным (I) изатяжным (II) течением гнойных ран.
Исследование в раневомэкссудате уровня железосвязывающегокатионногопептида –лактоферрина, обладающегоантибактериальной, противовирусной иантиоксидантной активностью, а такжеучаствующего в регуляции роста идифференцировки клеток фагоцитарногоряда (ТотолянА.А., 2003; Orsi N.,2005; Baker H.M.,2006), выявило повышение егосодержания (до 148±12 нг/мл) вРЖ у большинства больных (55,9%) в острую фазураневого процесса. Последующая динамикалактоферрина зависела как отобширности поражения, так и сопутствующей патологиибольных. Так, благоприятное, т.е. типичное течение гнойнойраны,протекало на фоне постепенного сниженияконцентрациилактоферрина (с формированием практически полного «плато» на3-5 сутки) доуровня 100-110 нг/мл к 7 дню. Затяжное и хроническоетечениераневой инфекции сопровождалось болеенизкой концентрацией лактоферрина (рис. 3). Определениесодержания лактоферрина в раневом экссудатебольныххроническимиранами выявило максимальное его снижение(до 4,5±1,2 нг/мл) на 18 день лечения. Уровеньлактоферрина в сыворотке крови здоровыхлиц и больных составил 448±51,4 нг/мл и 936±62,2нг/мл, соответственно.
Учитывая возможныйсинергический эффект действиялактоферрина и миелопероксидазы вфагосомной вакуоли в процессе фагоцитоза,а также внеклеточно в очаге воспаления (Кокряков В.Н., 2008;Klebanoff S.J., 2005; SoehnleinO. A.,2008), представляло интерес оценитьпродукцию миелопероксидазы на местном исистемном уровне.
 |  |
| Рис.4. Влияние препарата миелопид напродукцию LL37 МНФ крови здоровых лиц ибольных с гнойными ранами. | Рис.5. Влияниепрепарата миелопид на продукциюлактоферрина МНФ крови здоровых лиц ибольных с гнойными ранами. |
Примечание: на рис.4-7, 9, 10- К – контроль(внесены клетки, необработанныепрепаратом). I – больные с типичнымтечением раневого процесса;II – больные схроническими ранами; 1 – миелопид 600 мкг/мл; 2– миелопид750 мкг/мл; 3 –миелопид 1500 мкг/мл; 4 – миелопид 3000 мкг/мл; p<0,01 посравнению с контролем.
Анализ результатовпоказал,что у пациентов в острую фазузаболевания,как при типичном течении раневогопроцесса, так и при хронической раневой инфекции,уровень миелопероксидазы в раневомэкссудате и в сыворотке крови (680±115 у.ед. и 1550±195 у.ед.,соответственно) был значительно выше, чем уздоровых лиц (665±105 у.ед. в сывороткекрови), что свидетельствует окомпенсаторном характере повышенияданного гликопротеина и согласуется с даннымилитературы (Ashcroft G.S., 2005;Baker E.A.,2006).
На наш взгляд,заслуживают внимания данные опрогрессивном снижении концентрации миелопероксидазы(до 115±25 у.ед.) в РЖ больных с обширными ихроническими гнойными ранами, котороерегистрировалось в период с 5 по 15-е сутки. При этом темпснижения уровня миелопероксидазы враневом экссудате при благоприятномтечении раневого процесса был значительно ниже(максимальное снижение до 378±105 у.ед.), чтоможно трактовать как реакцию адаптации,направленную на оптимизацию репаративныхпроцессов взоне повреждения.
Исследованиеконцентраций изучаемых антимикробныхпептидов в супернатантах МНФбольных, посравнению со здоровыми лицами, выявило снижение продукции кателицидина LL37, лактоферрина имиелопероксидазы у 51,7%, 47% и 35% пациентов,соответственно. При этом«нулевые» значения уровня LL37выявлялись в 13,96% случаев,снижение концентрации LL37 илактоферрина было отмечено у15,1% пациентов, LL37,лактоферрина и миелопероксидазырегистрировались в 11,63% образцов.
Вероятно, дисбаланс АМПвыявляемый, как правило, при хроническихранах или затяжном течении раневойинфекции, свидетельствует, с одной стороны,о повышенной востребованности этихмедиаторов для завершения локальноговоспалительного процесса, а с другой– об истощенииих локальной продукции и снижениирезервных возможностей фагоцитарныхпродуцентов АМП. Кроме того, высокийуровень этих медиаторов на ранних стадияхраневого процесса, по всей видимости,необходим для обеспечения определенногоуровня защиты от инфекционных агентов вочаге воспаления.
 |  |
| Рис. 6.Влияние препарата миелопид напродукцию миелопероксидазы МНФ кровиздоровых лиц и больных с гнойными ранами. | Рис.7. Влияниепрепарата миелопид на экспрессию CD282+МНФ крови здоровых лиц и больных с гнойнымиранами. |
Таким образом,нарушение продукции АМП можетрассматриваться как один из механизмовразвития иммунной дисфункции у больныхгнойными ранами, что является основанием дляразработки адекватных способовлечения.
Учитываявышеизложенное, было изучено влияниемиелопида на продукцию АМПмононуклеарными фагоцитами крови здоровыхлиц и больных с гнойными ранами. Врезультате проведенных исследованийустановлено, что внесение препарата вкультуру МНФ крови здоровых лицсопровождалось усилением продукцииизучаемых эндогенных пептидов. Как видноиз рис. 4-6, эффект препарата был болеевыражен при использовании миелопида вдозах 1500 мкг/мл и 3000 мкг/мл (750 и 3000 мкг/мл– длялактоферрина). При сравнительном изученииуровня АМП в супернатантах клеток больныхпосле их инкубации с препаратами (рис.4-6),было установлено иммуномодулирующеедействие миелопида на мононуклеарныефагоциты крови: повышение исходносниженной продукции и снижение - исходноповышенной, что может иметь важноезначение для купирования локальногоинфекционно-воспалительного процесса приранах и раневой инфекции. Полученные in vitroданные указывают на возможностьнаправленного изменения синтезаэндогенных противомикробных пептидов поддействием миелопида у больных с гнойнымиранами.
В последние годыустановлено, что секреция АМП инициируетсяпосле связывания патогенов с рецепторами,распознающими «патоген-ассоциированныемолекулярные образы» (PRR- pattern-recognition receptors), которые выполняют интегрирующуюфункцию между врождённой и адаптивной иммуннойсистемой (Хаитов Р.М., 2009; Liew F.Y., 2005; Trinchieri G.,2007). Среди PRR Toll-подобныерецепторы рассматриваются как ключевыерецепторы, опосредующие реализациюврождённого иммунитета на микробныепатогены. Наиболее широким спектромспецифичности среди всехидентифицированных TLR обладает TLR2,связывающий липопротеиныграмположительных и грамотрицательныхбактерий, пептидогликан и липотейхоевуюкислоту грамположительных бактерий,грибковый зимозан (Bellocchio S., 2004, Gantner B. N.,2005; Roeder A.,2005; TakedaK., 2007). В связи с этимпредставляло интерес изучить уровеньэкспрессии TLR2 клетками раневого экссудатаи МНФ крови здоровых лиц и больных.
Результатыпроведенных исследований показали, что у 76%больных с гнойными ранами в течениепервых 6 суток, определялся более высокийуровеньэкспрессии TLR2 клетками раневогоэкссудата (повышение числа CD282+ клеток до74,5±1,5%), по сравнению сМНФ кровиздоровых лиц и больных (42,5±2,5% и 61,4±4,5%,соответственно), что, вероятно,связано с повышенной концентрацией микробныхпатогенов в зонеинфекционно-воспалительного процесса.Вероятно, такой высокий уровеньэкспрессии TLR2 индуцирует выработкуантимикробных пептидов, что согласуется сранееполученными данными. При неосложнённомтечении раневого процесса уровеньэкспрессии TLR2 клеточных рецепторов, какправило, снижался к 9 суткам. Вместе стем, у 24% пациентов регистрировалсянизкое (ниже 40%) содержание в РЖ CD282+клеток, экспрессирующих TLR2, что можетбыть связано, с одной стороны, со«сбрасыванием» этих иммунорегуляторныхмолекулгиперактивированными клетками очагавоспаления, а с другой – с генетическимидефектами экспрессии TLR2 фагоцитами. Даннаядинамика была характерна лишь для больныхс обширными и хроническими гнойнымиранами.Как правило, из гнойных ран у этихпациентов высевался золотистыйстафилококк (52% случаев) или его ассоциации(41%). При этом наличие у данной категориибольных высоких показателей уровнядефенсина в раневой жидкости может бытьобусловлено другими сигнальными путямиактивацииего продукции (в т.ч. через рецепторыIL-1Rs).
У большинствабольных с затяжной и хронической раневой инфекцией(64,5%) число CD282+МНФ периферической кровисоответствовало показателям здоровых лиц, т.е. былоснижено по сравнению с количествомCD282+ клетокпри благоприятном течении раневогопроцесса, что, по-видимому, свидетельствует онеполноценности механизмовпротивомикробной защиты и сниженииадаптационных возможностей у даннойкатегории пациентов. При этом повышение числаTLR2+клеток периферической кровирегистрировалось у 39,5% пациентов сзатяжными и хроническимигнойными ранами. Следует отметить, что уздоровых лиц в 10%случаев отмечалось исходное повышение экспрессииCD282+мононуклеарами крови, по-видимому,связанное с физиологической гетерогенностью в даннойгруппе.
Значительный интерес вэтой связи представляют полученныенами данные о влиянии миелопида наэкспрессию TLR2 МНФ крови. Так, внесениеизучаемого препарата в культуру клетокздоровых лиц и больных с «нормальными»показателями приводило к повышению числаCD282+ МНФ и кснижению -исходно повышенной экспрессии TLR2. Каквидно из рис. 7, наиболее выраженный эффект наблюдалсяпри использовании препарата в дозах 1500и 3000 мкг/мл.
Известно, что приактивации TLR2 запускается сигнальныйкаскад, приводящий к выработкевоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12,ФНО-), хемокинов и др. регуляторных молекул(Ковальчук Л.В., 2008; Baker H.M.,2006; Barton G. M.,2009). Одной из адапторныхмолекул, продуцируемых клетками в ответ наактивацию TLR2 агонистами, является оксидазота, оказывающий мультимодальноедействие на различные клетки-мишени(Ганковская Л.В., 2007; Trinchieri G.,2008). Анализрезультатов показал (рис.8), что при типичном течении раневогопроцесса пик суммарной продукции нитритови нитратов в биологических жидкостяхприходится на 1-2 сутки со снижением к 5-7 дню.
При проведенииклинико-иммунологических параллелей междуизменениемпродукции NOпри типичном, затяжном и хроническомтечении раневого процесса было показано, что увсех пациентов с вялотекущей ихроническойраневой инфекцией оксид азота в экссудатеиз раны регистрировался в более низкихконцентрациях (1,1±0,05 мкмоль/л и 0,3±0,03мкмоль/л, соответственно), что может иметь важноезначение в развитии осложнений. Болеенизкий уровень метаболитов NO был выявлен такжепри хронических гнойных ранах в сыворотке крови исупернатантах МНФ крови. Следует отметить,что резкое нарастание концентрации NO (более 6,5 мкмоль/л)в РЖ, какправило, на7-8 сутки на фоне благоприятного теченияраневого процесса сопровождалосьпоследующим развитием инфекционныхосложнений.
Обработка клеток in vitro препаратоммиелопид оказывала дозозависимое действие на продукциюметаболитов NO в культуральной среде, повышаясниженные и снижая повышенные показатели.Как видно из рис. 9, максимальный эффект проявлялся прииспользовании миелопида в дозе 3000мкг/мл.
 |  |
| Рис. 8.Динамика уровня NO в раневой жидкости исыворотке крови больных с типичнымтечением гнойных ран. | Рис.9. Влияниепрепарата миелопид на продукцию NO МНФкрови здоровых лиц и больных с гнойнымиранами. |
Известно, что вобеспечении противоинфекционной защитыорганизма, наряду с NO, важное значение имеет продукцияАФК (Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2006; Lucas T., 2010) Результаты проведённыхисследований показали, что фагоциты большинствабольных (92,4%), по сравнению с клеткамиздоровых лиц, обладают повышеннойпродукцией АФК, что, вероятно, является результатом избыточногопрайминга МНФ под действием медиаторов взоне воспаления. У 8%пациентов с затяжным течением раневойинфекции регистрировалось снижение показателейспонтанного и стимулированного НСТ (до 0,1 и0,18 ед.опт. плотности, соответственно), чтосвидетельствует о снижениимикробицидного потенциала фагоцитов уданной группы больных и согласуется сданными литературы (Ashcroft G.S.,2005; Falanga V., 2006).
Рис. 10.Влияние препаратамиелопид на показатели спонтанного истимулированного НСТ здоровых лиц ибольных с гнойными ранами.
Примечание: по левой осиординат –показатели больных; по правой – здоровыхлиц.
При этом установлено,что внесение препарата миелопид в культуруклеток здоровых лиц приводило к усилениюспонтанной и стимулированной продукцииАФК. Вместе с тем, у больных с гнойнымиранами отмечено дозозависимое снижение(до показателей здоровых лиц) АФК. Наиболеевыраженный эффект наблюдался прииспользовании дозы миелопида – 1500 и 3000 мкг/мл (рис.10).
Учитывая то, что цитокинобразующаяфункция макрофагов значительно расширяетих эффекторный потенциал и во многомопределяет течение и исход репаративногопроцесса (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В.,2004-2008; Lucas T., 2010),нами исследован локальный и системныйцитокиновый статус у больных с ранами ираневой инфекцией.
Анализ полученныхрезультатов позволил выявить у пациентовтри типа реагирования организма налокальный гнойно-воспалительный процесс:первый тип, сопровождающийся увеличениемсинтеза воспалительных цитокинов и«активным» течением заболевания (при типичном течении раневогопроцесса), второй - убольных с хронической формой раневойинфекции, сопровождающийсягиперпродукцией воспалительных ипротивовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-1Ra,ТФР-1) цитокинов и третий – со снижениемпродукции ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО- на фоне затяжного теченияпатологического процесса в мягкихтканях.
Так, исследованияконцентраций воспалительных цитокинов вРЭ в острую фазу раневого процесса выявилиповышение их уровня по сравнению состандартными значениями для биологическихжидкостей в 87% случаев. При этом повышеннаяпродукция ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-отмечалась у 42% больных,ИЛ-1 и ИЛ-8– у 49%,ИЛ-1 – у 9% больных,соответственно.
Рис. 11. Концентрацияцитокинов в раневой жидкости больных стипичным течением раневого процесса (1), сзатяжным течением раневой инфекции (2),хроническими ранами (3).
Примечание: приведеныпоказатели цитокинового статуса РЭ,полученного на 7 сутки у больных (1) и (2)течением раневого процесса, на 14 день -(3).
В фазу образованиягрануляционной ткани имело местотранзиторное повышение на 25-35% от исходного уровня ИЛ-10и ИЛ-1Ra, атакже ТФР-1 (на 56-147%), который регулируетосновные функции фибробластов иэпителизацию ран (Симбирцев А.С., 2008; Baker Е. A., 2006; Zhou L.J., 2008).
Как видно из рис. 11, болеевысокие концентрации в раневой жидкостиотмечены для ИЛ-1 и ИЛ-8 при хроническом течениираневой инфекции. Кроме того, всыворотках крови 66% данных пациентовопределялся повышенный уровень ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-, а у 15% - ИЛ-1. Полученныерезультаты согласуются с даннымилитературы о том, что хронические раны какбы «застревают» в фазе воспаления (Panuncialman J., Falanga V., 2009-2010).Концентрации ИЛ-10, ИЛ-1Ra и ТФР-1 в раневой жидкости,полученной из длительно незаживающих ран,значительно превышали (на 20-45%) уровниданных противовоспалительных цитокинов взаживающих ранах, что свидетельствует оважности баланса между позитивными инегативными цитокиновыми регуляторами враневом очаге. Следует отметить, чтопоказатели продукции ИЛ-1и ФНО- в очаге воспаления были выше ихконцентрации в сыворотке крови, тогда какИЛ-8 ни в одном из случаев (как у больных, таки у здоровых лиц) в ней не определялся.
Третий тип реагированияорганизма на локальныйгнойно-воспалительный процесс,сопровождающийся снижением уровняцитокинов ИЛ-1 (до 16,25±2,85 пкг/мл), ИЛ-8 (до 28,55±3,45 пкг/мл), ФНО- (до 22,15±5,15 пкг/мл), ИЛ-6 (до10,15±5,15 пкг/мл) вочаге воспаления, наблюдался в 13% случаев,что у большинства больных сочеталось сугнетением цитокинпродуцирующей функцииМНФ крови. При этом на фоне затяжноготечения патологического процесса в мягкихтканях снижение концентрации ИЛ-1 в РЭотмечалось у 72% больных; ИЛ-1и ИЛ-8 – у 17%; ИЛ-1 и ФНО- – у7%; ИЛ-1, ИЛ-8, ФНО-. – у 4%пациентов, соответственно.
Таблица 2
Влияние препаратамиелопид на спонтанную иФГА-индуцированную продукцию цитокиновМНФ крови больных гнойными ранами.
| Показатель пкг/мл | Пациенты с гнойнымиранами | |||||
| К1 | К2 | I | II | III | IY | |
| ИЛ-1 | 195,5±10,2 | 324,5±30,5** | 565,5±12,8* | 440,5±10,5** | 293,3±20,5* | 254,5±23,3** |
| 36,4±5,5 | 49,8±10,5* | 76,4±6,5** | 82,4±5,5** | 90,4±13,5* | 96,6±18,2** | |
| ИЛ-8 | 177,5±10,5 | 248,5±14,5** | 308,3±9,4** | 300,9±5,6** | 199,5±15,1** | 175,4±14,2** |
| 45,4±4,2 | 54,5±9,8* | 86,4±6,2** | 104,5±13,5** | 115,2±15,1** | 120,4±15,2** | |
| ФНО- | 89,4±6,6 | 167,8±16,4** | 188,5±13,3* | 172,8±13,2** | 114,2±12,1* | 86,5±13,5** |
| 35,2±4,1 | 43,5±8,6* | 70,4±6,2** | 76,8±4,8** | 88,6±5,4** | 99,8±8,2** | |
| ИЛ-6 | 55,8±6,2 | 94,6±10,2** | 116,6±9,4** | 105,6±15,8** | 77,5±12,1* | 75,4±13,2* |
| 10,15±5,15 | 16,5±5,5 | 28,7±6,5* | 34,5±4,5* | 48,5±9,5* | 50,5±14,5 | |
| ИЛ-10 | 31,3±5,1 | 54,2±8,6* | 66,3±5,5** | 72,5±3,5** | 50,2±11,5* | 46,6±5,2* |
| 9,5±2,5 | 15,4±3,5* | 24,7±5,5* | 37,8±7,5* | 46,5±8,5* | 48,8±10,4* | |
| ТФР-1 | 7856±75,5 | 14225±129,5* | 16345±115,5* | 15112±89,1* | 8055±78,5* | 7985±145,5* |
| 2650±55,8 | 3231±60,5* | 3685±52,8* | 4055±50,8* | 4455±80,5* | 4512,3±40,5* | |
Примечание: I – миелопид 600 мкг/мл;II – миелопид750 мкг/мл; III –миелопид 1500 мкг/мл; IV– миелопид 3000 мкг/мл. К1 – контроль (клетки,необработанные препаратом, без ФГА; К2 -контроль (клетки, необработанныепрепаратом с внесением ФГА); * p<0,05,** - p<0,01по сравнению с К2; между К1 и К2.Приведены исходно повышенные (n =15) исниженные показатели (n =15)уровня цитокинов всупернатантах МНФ.
При сравнительномизучении уровня цитокинов в супернатантахклеток после их инкубации с препаратом(табл.2), было установленоиммуномодулирующее действие миелопида наМНФ крови: снижение исходно повышеннойпродукции и повышение – исходно сниженной,что может иметь важное значение дляускорения процессов миграции,пролиферации и дифференцировки клеток взоне репарации. При этом более низкиеконцентрации миелопида (600 и 750 мкг/мл)оказывали преимущественно стимулирующеедействие на ФГА-индуцированный синтезцитокинов МНФ крови. Следуетотметить, что значимой дозовой зависимости прииспользовании миелопида в концентрациях1500 и 3000 мкг/мл установлено не было (табл. 2).
Помимо анализаконцентраций цитокинов в биологическихжидкостях у больных с исследуемойпатологией проводилась оценка частотывыявляемости цитокинов, что, согласноданным литературы, служит дополнительнымпрогностическим критериемцитокинопосредованности патологии итяжести её течения (Ковальчук Л.И.,Ганковская Л.В., 2008). Надо отметить, что враневой жидкости при хронических ранахнаиболее часто выявлялся ИЛ-1, ИЛ-8 и ТФР-1, апри типичном течениираневого процесса - ИЛ-1, ИЛ-8, ИЛ-6 и ФНО-,что, как правило, сочеталосьс повышением их концентрации. Крометого, следует отметить, что измененияпродукции ряда цитокинов быливзаимосвязаны. Наиболее выраженной былазависимость между уровнями ИЛ-1 и ИЛ-10 (r=0,93; p>95%),ИЛ-8 и ТФР-1((r=0,92; p>95%).
Обобщая полученныенами данные по исследованиюпротивоинфекционного иммунитета у больныхгнойными ранами, можно сказать, чтоизбыточнаяили недостаточная продукция антимикробныхпептидов и белков, метаболитов кислорода и оксидаазота, значительное повышение или снижениевоспалительных и противовоспалительныхцитокинов, нарушение экспрессии TLR2 фагоцитамираневой жидкости более чем в 80% случаевприводит к неблагоприятному течению раневойинфекции, проявляющемуся в затяжном ихроническом течении заболевания, развитииинфекционных осложнений.
При этом наиболеезначимыми критериями неблагоприятногозатяжного и хронического течения раневогопроцесса было снижение или повышение(менее 0,5 мкг/мл или более 10 мкг/мл) в раневойжидкости уровня LL-37, повышение (выше 1,5 мкг/мл) содержания дефенсина,снижение уровня оксида азота (ниже 1мкмоль/л) и числа TLR2 позитивных фагоцитов (менее40%).
Таблица 3
Антибактериальнаяактивность препарата миелопид.
| Дозапрепарата миелопид | Степень задержки ростатест-культуры (в баллах) | ||||||
| S.aureus | S.pyogenes | P.аеruginosa | E.coli | P.vulgaris | K.pneu-moniae | С. аlbicans | |
| 3000мкг/мл | 3,04±0,28** | 3,11±0,26** | 1,37±0,61 | 3,29±0,2** | 2,8±0,2** | 3,3±0,3** | 3,6±0,58** |
| 1500 мкг/мл | 3,01±0,26** | 3,02±0,28** | 0 | 3,43±0,3** | 2,75±0,1** | 3,2±0,2** | 3,64±0,5** |
| 750мкг/мл | 2,98±0,28** | 3,01±0,26** | 0 | 3,24±0,4** | 2,7±0,2** | 3,2±0,2** | 3,62±0,8** |
| Контроль | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
Примечание: контроль – физиологическийраствор; **p<0,01 по сравнению сконтролем
Известно, что впоследние годы отмечается ростустойчивостимикроорганизмов-возбудителейинфекционно-воспалительных заболеваний кприменяемым в клинической практикеантибиотикам и антисептикам (Толстых П.М.,2007; Блатун Л.А., 2009; Deepak V., 2006). Изучениесвойств препаратов природныхантибиотических пептидов человека иживотных и разработка на их основе новыхподходов к лечению инфекций - один изперспективных путей преодолениярезистентности (Heilborn J.D. 2003-2006; Steinstraesser L., 2008). В связи с этимпредставляло интерес изучить возможноепротивомикробное действие препаратасвиных миелопептидов - миелопида (табл. 3).Проведенные эксперименты показали, чтопрепарат миелопид активен в отношении всехисследуемых микроорганизмов, кроме P.aеruginosa. Каквидно из представленных результатов, небыло выявлено достоверных различий прииспользовании миелопида в дозах 750, 1500 и 3000мкг/мл.
Таким образом, препаратмиелопид обладает не толькоиммунорегуляторным действием, но ипротивомикробной активностью. Данныелитературы и наши наблюдения позволяютпредположить, что прямое антимикробноедействие миелопида опосредовано входящимив его состав гетерологичными АМП, чтопозволяет его рассматривать какэндогенный антибиотик животногопроисхождения и свидетельствует овозможности клинического использования вкачестве антимикробного средства(Патент № 2333765).
Как известно, одним из перспективныхспособов местного лечения гнойных ранявляется сочетанное использование иммуномодуляторов и физических методов (Луцевич О.Э., Шехтер А.Б., 2008).Исследованиямиотечественных авторов показано,что воздушнаяплазма, обогащенная NO, в отличие отбольшинства физических факторов, способнаоказывать стимулирующее действие наместный иммунный ответ, кровоток и напроцесс заживления гнойных ран (Шехтер А.Б.,Кабисов Р.К., 2004-2009). Вместе с тем, открытымостается возможность дополненияNO- терапииместным воздействием иммунорегуляторных пептидов дляулучшения лечебного эффекта. Вдоступной литературе такжеотсутствуют данные о динамикеэкспериментальной гнойной раны приместном воздействии препаратамиелопид. Учитывая это, и полученныеin vitro результаты об иммуномодулирующеми антимикробном действии миелопида, представлялоинтереспровести комплексную оценку динамикитечения экспериментальной гнойной раны приразличных вариантах локальногоиспользования препарата миелопид и NO- терапии. Вкачестве препарата-контроля из числатрадиционных антисептиков был выбран гипохлорит натрия,который, согласно данным литературы, вконцентрациях 300-600мг/л обладаетиммунорегуляторным действием (Долженко С.Н.,1999).
Эксперименты выполненына модели гнойной раны на 140 крысах«Вистар» на основе модели S. Eleck, K. Sommenn.Все животные были распределены на 5 групп: 1(контрольная) группа – 20 животных, не получавших лечения; 2группа (30 крыс) – в которой был использован натриягипохлорит (600 мг/л) и основные группыживотных (по 30 крыс), получавшиеоптимизированное лечение с использованиемраствора миелопида (3000 мкг/мл) – 3 группа, комплексаNО-терапии и натрия гипохлорита (600 мг/л)– 4 группа,сочетания NО-терапии и миелопида (3000 мкг/мл)– 5группа.
На 1-е сутки леченияэкспериментальные гнойные раны во всехгруппах выглядели одинаково: отёчные,инфильтрированные края с выраженнойгиперемией окружающих тканей, дно покрытоналетом фибрина с участками некроза иумеренно выраженным гнойным отделяемым. Увсех животных регистрировался дегенеративно-воспалительный типцитограмм. На3-и сутки данный тип цитограмм сохранялся лишь у животных 1 (контрольной)группы, тогда как во 2-4 группах была отмечена его смена на воспалительный тип. При этом, несмотряна то, что в цитограммах преобладалинейтрофилы, их количество снизилосьс 92,0±1,3% до 89,35±1,25% прииспользовании гипохлоританатрия, до 88,2±1,3 - при лечениимиелопидоми до78,4±2,0% - при сочетаниивоздействия NaOCl и NО-терапии (92,3±1,5% - вконтрольной группе). В 5 группе животныхуже на 3-сутки определялсявоспалительно-регенераторный типцитограмм со значительнымуменьшением числа нейтрофилов (до 51,7±2,5%) и деструктивных формлейкоцитов (до 1,2±3,3%), повышением количества макрофагов (до 11,8±1,4%) и фибробластов (до11,3±2,3%).Сменавоспалительно-регенераторного типацитограмм нарегенераторно-воспалительный регистрировалась на 5 сутки присочетанном использовании миелопида и оксида азота и на 7-е сутки лечения – у животных 2-4групп. Соотношениеклеточных элементов,соответствующее регенераторному типу, наблюдалосьв данных группах на 7 и 10 сутки, соответственно. Приэтом в контрольнойгруппе животных дажена 14 день сохранялся воспалительный типцитограмм.
По даннымпланиметрического исследования, самаявысокая скорость заживления отмечена всерии животных, пролеченных комбинациейоксида азота и раствора миелопида - 14,1±0,28мм/сут. Во 2-4 группах она составила, соответственно, -10,1±0,15;10,4±0,52 и 12,6±0,72мм/сут., а в группеконтроля -6,4±0,34мм/сут. (p<0,05). При сочетанномиспользовании NО-содержащегогазового потока и миелопида на 10-14 суткисокращалось 82-95% раневого дефекта, тогдакак у животных 2 группы - 61-82,5%, 3 группы -59-83%,четвёртой - 67-85%, а у контрольной – лишь 16,5-31%.
Комплексный анализ изучения динамикизаживления ран, включая гистологическоеисследование раневых биоптатов, выявил,что наиболее эффективным явилосьприменение комплекса NO-терапии и миелопида(табл. 4). При этом на 14-15 сутки отмечено полное заживление ранвторичным натяжением с формированиемнежного рубца (средниесроки заживления составили 14,8±1,5 суток). Вконтрольной группе животныхгрануляционная ткань даже к 14 суткамполностью не выполняла раневой дефект, азаживление ран длилось 28,4±3,1 дня. Во 2 - 4основных группах, где изолированноиспользовался миелопид или натриягипохлорит, а также его сочетание с NOдинамика течения раневого процессасущественно не отличалась: на 7-10 суткиусиливались пролиферация фибробластов инеоангиогенез, что сопровождалось быстрымразвитием и созреванием грануляционнойткани. Средние сроки заживления ран в 3группе составили 18,7±1,28 суток, во 2-й -19,7±1,6, в четвёртой - 17,4±1,2 (р<0,05 посравнению с контрольной группой)дней.
Таблица 4.
Динамика теченияраневого процесса у экспериментальныхживотных
| Признаки раневого процесса (сутки) | Группы животных | ||||
| 1группа | 2группа | 3группа | 4группа | 5группа | |
| Срокиочищения ран | 9,17±1,17 | 4,50±1,22* | 4,62±1,34* | 3,85±1,47* | 2,55±1,60** |
| Срокипоявления грануляций | 8,33±1,21 | 4,33±1,21* | 4,17±1,17* | 3,97±1,17* | 3,12±0,81* |
| Срокивыполнения раны грануляциями | 13,00±1,27 | 6,00±1,13* | 6,67±1,33* | 5,98±1,15* | 4,11±0,31** |
| Началокраевой эпителизации | 10,67±1,21 | 6,33±1,21* | 6,03±1,21* | 5,71±1,21* | 4,46±0,84* |
Примечание: * p<0,05; **p<0,01 по сравнению с показателямиконтрольной группы.
Припосеве отделяемого из ран уживотных 5 группы, гдеиспользовалась комбинация растворамиелопида и оксида азота, бактериальная флораопределялась только на1-3сутки,у животных 2, 3 и 4 групп – на 1-5 сутки, вконтроле –даже на 14 день. При этом установлено, чтоNO-терапия усиливала бактерицидноедействие натрия гипохлорита при ихсочетанном применении: на 5 суткибактериальная обсеменённость ранснизилась во второй группе до 2,8±5104КОЕ/г, в третьей и четвёртой группах - до2,2±5104КОЕ/г и до 2,1±5103 КОЕ/г, соответственно.
Таким образом, анализ данных показал, чтоэффективность локального действиямиелопида приэкспериментальных гнойных ранах была аналогична антисептикугипохлориту натрия, бактерицидноедействие которого усиливала NO-терапия, а наилучшие результаты были полученыпри комбинированном использованиимиелопида иNO-содержащего газовогопотока.
Результаты клиническихнаблюдений.
Для изученияособенностей течения гнойных ранразличного генеза нами был проведен клинико-эпидемиологический анализзаболеваемости и лечения пациентов(3475 человек),находившихся в хирургическом отделенииМЛПУЗ«Больница скорой медицинской помощи им.Н.А. Семашко», МЛПУЗ «Больница им. С.П. Боткина» г.Орла в 2001-2008 годах, который показал, что наибольший удельныйвес в структуре гнойных ран занимаютпроцессы, связанные с лечением острыхгнойно-воспалительных заболеваний мягкихтканей (61,15%) и посттравматическиегнойные раны (15,8%), а также раны послехирургического леченияфлегмонозно-некротической рожи (12%). Приэтом в динамике восьмилетнего мониторингабыло установлено, что заболеваемостьгнойными ранами не имеет тенденции кснижению и характеризуется «омоложением»контингента больных (61,4% пациентов ввозрасте 18-35 лет). Кроме того, за период с 2001по 2008 гг. зарегистрировано увеличениесреди пациентов с гнойными ранами числабольных с сахарным диабетом игипертонической болезнью (на 4,1-5,8%),сокращение количества больных с обширнымиранами и пациентов, которым выполненыповторные радикальные хирургическиеобработки гнойно-некротических очагов(на 5,2-6,2% и 2,8-3,8%,соответственно). В этиологической структуре раневойинфекции за восьмилетний периоднаблюдения отмечен рост грамотрицательнойфлоры и микробных ассоциаций, появление C.аlbicans, сохранение ведущей роли S. аureus.
При этом, как правило,больные поступали в стационар послепредшествующего неэффективногоамбулаторного лечения. Несвоевременноеобращение за медицинской помощью исамолечение имели место в 81,4% и 75,9% случаев,соответственно, 46% больных поступали налечение в стационар с сомнительным инеблагоприятным прогнозом, 54% - сблагоприятным прогнозом течениягнойно-воспалительных заболеваний. Изобщего числа пациентов 29,1% имели в анамнезегнойно-воспалительные заболевания(фурункулы, карбункулы, абсцессы и др.), 62,7% -сопутствующую соматическую патологию(сахарный диабет, гипертоническая болезнь,ИБС, хронические заболеванияжелудочно-кишечного тракта игепатобилиарной системы, хроническиенеспецифические заболевания легких и др.),34,5% из общего числа больных страдаличастыми ОРВИ (до 4-6 раз в год). На основанииданных анамнеза, проведённого анализасоматических заболеваний, особенностейтечения гнойно-воспалительного процесса вмягких тканях следует, что у 87,3% больныхимелись существенные факторы риска дляразвития иммунной дисфункции. Полученныеданные не противоречат результатамэпидемиологических исследованийпоследних лет и подчеркивают актуальностьпроблемы гнойной инфекции.
Учитывая это, ив соответствии споставленными задачами исследования проводилосьизучение эффективности лечения 198 больных (мужчин -127; женщин -71) с гнойнымиранами, которые по способу лечения былиразделены на4 группы: Iконтрольную группу составили 60 пациентов(38мужчин,22женщины;средний возраст 41,5±3,9 лет), получавшихтрадиционное лечение; II группу - 39пациентов (25 мужчин, 14 женщин;средний возраст 40,5±3,8 лет),которым проводилась локальнаяиммунокоррекция препаратом миелопид; вIII группубыли включены 39 пациентов(24 мужчин, 15 женщин; средний возраст 39,5±3,5лет), получавших местнуюNO-терапию; вIV группу -60 больных (40 мужчин, 20женщин; средний возраст 42,1±4,5 лет), которые получали локальнуюиммунокоррекцию препаратом миелопид всочетании сNO-терапией.
В этиологическойструктуре гнойных рандоминировали раны послехирургического лечения острых гнойных заболеваний мягкихтканей –108 (54,55%), в т.ч.флегмоны - 86(43,4%), абсцессы - 22 (11,1%). Сфлегмонозно-некротической формой рожи былопролечено 30 больных (15,15%),с послеоперационными ранами - 20 (10,1%), спосттравматическими ранами- 40 (20,2%)пациентов.Большинство раневыхпроцессов имели площадь от 31 до 100 см2 (60,6%).Общее состояние среднейстепени тяжести регистрировалось у 122больных (61,6%), удовлетворительное – у 54 (27,3%),тяжёлое – у22 пациентов (11,1%).
Эффективность леченияоценивали в 4-х балльной системе поразработанным нами критериям на 1, 3, 6, 9сутки и при выписке больного. Совокупнаяоценка выраженностигнойно-воспалительного процесса в 38 иболее баллов соответствовала высокойстепени активности; 37,5-20,5 – умеренной; ниже 20,0 -незначительной. По степени выраженностигнойно-воспалительного процесса пациентыво всех группах распределились примерноодинаково: незначительная степеньактивности гнойно-воспалительногопроцесса отмечался у 20% пациентов группыконтроля, у 20,5% больных второй группы и у 17,9%и 20% пациентов третьей и четвертой групп,соответственно; умеренная степеньактивности – у50%; 51,2%; 49,4% и 46,7%; высокая – у 30%; 28,3%; 30,7% и 33,3%,соответственно.
При поступлениивыраженность клинических симптомов посумме баллов у больных контрольной группысоставляла 37,3,0±0,5 балла, II группы - 36,7±0,8балла, III и IV групп - 37,8±1,1 и 37,5±0,5 баллов,соответственно. Следует отметить, что локальныеобъективные признакигнойно-воспалительного процесса в мягкихтканях до лечения определялись у всехпациентов: инфильтрация, отек в областигнойного очага у 98,5%; гиперемия областипоражения у 96,5%; нарушение функциипораженной области у 97,4% больных. В 27%случаев выявлялся регионарный лимфаденит,в 16% - лимфангиит, у 8,4% больных - наличиеболее одного гнойного очага.
Уже на 3 сутки леченияотмечалась существенная разница в течениевоспалительного процесса по динамикеклинико-лабораторных и инструментальныхданных: у больных, получавших локальнопрепарат миелопид, - снижение до 26,9±0,5баллов; NО –терапию - до 24,5±0,6 баллов; сочетаннуюлокальную иммунокоррекцию миелопидом и NО– до 20,3±0,5баллов в то время как у пациентов первойгруппы сумма баллов оставалась надостаточно высоком уровне (28,4±0,7 балла,соответственно). Следует отметить снижение микробнойобсеменённости раны иулучшение характера цитологическойкартины мазков-отпечатков,в основном за счет снижения числа нейтрофилов, увеличения количествамакрофагов, появления фибробластов (табл. 5),динамика которых была более значимой на фоне сочетаннойлокальной иммунокоррекции.При этом на 5-6 сутки у большинствапациентов IIIи IV группнаблюдалось стихание перифокальноговоспаления, уменьшение количества раневого отделяемого, и изменение егохарактера в сторону серозного илисерозно-гнойного. Начало появлениягрануляционной ткани отмечалось лишь упациентов четвёртой группы. В I контрольной и во II группах динамикапоказателей была менее выражена, аочищения раневой поверхности зарегистрировано небыло.
На девятые суткиу 59% больных второй, 61,5% -третьей и 76,7% -четвертой группотмечалось типичноетечение раневого процесса и почти полное купирование воспалительногопроцесса в ране (13,3±0,4баллов; 9,7±0,8 и 7,45
0,3 баллов, соответственно):очищение от некротическихтканей, отсутствие раневого отделяемого,заполнение раневой поверхностигрануляционной тканью, уменьшение площадираны, снижение (и отсутствие у больных IV группы) числамикробных колоний в мазках-отпечатках иповышение числафибробластов (до 44,3±2,3%),свидетельствующих опроцессе регенерации тканей (табл.5). При этом использованиемиелопида приводило к более быстромукупированию локального воспалительногопроцесса преимущественно у больных с гнойнымиранами размерами до 50см2. Следует отметить, что сочетанноеиспользование NО-терапии и миелопида вчетвертой группе позволило в 23,3% случаев избежатьзатяжного течения раневого процесса, атакже снизить до 8,3%число больных, получавших повторные курсыантибиотикотерапии.
Убольных первой группы положительнаядинамика клинических проявлений по суммебаллов на 9 сутки была менее выражена (19,1±0,4 баллов),а типичное течение раневогопроцесса регистрировалось лишь у 45% пациентов. Купирование воспалительногопроцесса в мягких тканях упациентов Iгруппы на фоне традиционного леченияпроисходило только к 13-14 дню(4,8
0,05 баллов). Общая продолжительность стационарноголечения больных с типичнымтечением раневого процессапри проведении традиционной терапиисоставила 14,3±2,2 дней. У больных основныхгрупп лечебная тактика с локальнымприменением NО- и препаратамиелопид приводила не только кболее быстрой регрессии клиническихсимптомов, но и позволила снизить среднююпродолжительность пребывания больных в стационаре до 10,8±1,9 койко-дней у больных четвёртой группы, до13,2±1,8 и 12,7±2,1 дней -пациентоввторой и третьей групп,соответственно.
Рис. 12. Динамикаоценки эффективности лечения больных стипичным течением раневого процесса вбаллах.
Примечание: I – контрольнаягруппа; II группа – больные, получавшие локальнуюиммунокоррекцию препаратом миелопид; IIIгруппа –пациенты, получавшие NO-терапию; IV группа- больные, которые получали локальнуюиммунокоррекцию препаратом миелопид всочетании с NO-терапией; р<0,05 междупоказателями больных до и после лечения;р<0,01 – I и IVгрупп после лечения.
Анализ результатовлечения показал, что затяжное ихроническое течение гнойных ранрегистрировалось у 78 (39,4%) человек из общегочисла больных (198 пациентов). Необходимоотметить, что динамика гнойных ран убольных с затяжным течением раневогопроцесса, главным образом у пациентов сфлегмонозно-некротической формой рожи,посттравматическими ипослеоперационными ранами, отличаласьот таковой при типичном течении: очищениераневой поверхности наблюдалось притрадиционном лечении не ранее 12-13 дня (на 8-10сутки у больных IV группы), появление грануляций – не ранее 14-16 суток(на 10-11 день - в IV группе), а начало эпителизации отмечалосьлишь к 16-17 дню (на 11-12 сутки - в IV группе). При этом срокистационарного лечения больных сзатяжным течением гнойных ран составили:23,2±2,4 дней в первой, 21,2±1,9 - во второй, 21,3±1,4 -в третьей группах, соответственно. Вчетвёртой группе, у пациентов с затяжнымтечением раневого процесса, использованиепредложенного сочетания препаратамиелопид и NО-терапии позволилосократить сроки стационарного лечения до17,3±1,7 суток.
Обширность и глубинапоражения мягких тканей у больных гнойнымиранами определяла необходимость раннегохирургического закрытия раневойповерхности. Восстановительные операциибыли произведены у 62% больных. Прирассмотрении данных времени подготовкиран к хирургическому закрытию понозологиям, установлено, что приприменении комплекса миелопида иNО-терапии выигрыш во времени составил притипичном течении раневого процесса 2,3-3,2дня, а в случае затяжного течения и болеетяжёлых поражений, таких, какфлегмонозно-некротическая рожа, от 5,4 до 6,3суток.
Учитывая полученныеданные, представляло интерес изучитьвозможные экономические преимуществаиспользования в комплексном лечениигнойных ран (при типичном течении)клинически наиболее эффективного способалокальной иммунокоррекции с применением миелопида и NO-терапии в сравнении с традиционнойтерапией. Стоимость лечения 1 больного встационаре по данной схеме была ниже на 24,4%,чем при традиционном лечении.
Таким образом,результаты проведённых исследованийпоказали высокую клиническуюэффективность локальной иммунокоррекции убольных с гнойными ранами, приводящую кболее быстрому, по сравнению страдиционным лечением, купированиюлокального воспалительного процесса, атакже сокращению сроков и стоимостилечения. Оценкаэффективности предложенных способовместного лечения у больных с затяжным ихроническим течением гнойных ран свидетельствует обольшей целесообразности сочетанногоиспользования в программаххирургического лечения миелопида иNО-терапии.
Характеристикаиммунологических показателей и их оценка
в эффективностилокальной иммунокоррекции.
Учитывая полученные вэкспериментальных исследованиях in vitro и invivo данные о противовоспалительном иантибактериальном эффектах препарата миелопид иNО-терапии, нами исследована динамикапоказателей иммунного статуса больныхгнойными ранами на фоне локальнойиммунокоррекции.
Как известно, заживлениеран является динамичным процессом, вкоторый вовлечены клетки крови,соединительной ткани и эпителия,внеклеточный матрикс, а также различныерастворимые медиаторы (Ковальчук Л.В., 2008;Земсков А.М., 2008; Cochrane C.,Walker M., 2006).Исследование цитограмм раневой жидкости,взятой интраоперационно, а также вдинамике лечения больных с благоприятным(типичным) течением раневого процессапоказало, что изменения клеточного составаРЖ имели определенную закономерность(табл.5). Так, в первые часы после вскрытия идренирования гнойно-воспалительного очагау всех больных в ране преобладалнейтрофильный цитоз со снижением числажизнеспособных клеток (91,4±1,5% и 21,15±1,75% клеток,соответственно). На 3 сутки в цитограммах РЖбольных II-IV групп наблюдалась сменаклеточных популяций: снижение числанейтрофилов, повышение – макрофагов илимфоцитов, а также количества «живых»клеток. К 6 суткам применения локальнойиммунотерапиивоспалительно-регенераторный ирегенераторный тип цитограммрегистрировался у большинства пациентов.Это сопровождалось значительным снижениемколичества деструктивных формнейтрофилов, ростом числа макрофагов изрелых фибробластов.
При этом использование у больныхчетвёртой группы комбинированного лечения(миелопид и NО-терапии) позволило получитьболее выраженный противовоспалительный ипрорегенеративный эффекты, чем приизолированном применении обоих способов(табл. 5). После курса локальной терапии сприменением миелопида, NО- и их сочетания увсех пациентов отмечались не толькостатистически достоверные измененияклеточного состава РЖ, но также фенотипа ифункциональной активности раневыхфагоцитов.
Так, в процессе проведенияпредложенного лечения, по сравнению страдиционной терапией, наблюдалосьулучшение показателей спонтанного изимозан-индуцированного НСТ-теста (табл. 6),снижение исходно повышенной экспрессииСD95+, СD11b+, СD282+ антигенов и повышениепула HLA-DR+, CD16+ клеток (рис. 13).Кроме того, у пациентоввторой и третьей групп по даннымцитологического исследования к 8-9 суткамзарегистрировано значительное снижениемикрофлоры в ране. У больных четвертойгруппы на 9 день лечения микрофлора вотпечатках с раневой поверхности невыявлялась.
Таблица 5.
Динамика показателейцитограмм на фоне лечениябольных с благоприятным (типичным) течением раневогопроцесса.
| Показатель, % | 1 сутки | 3сутки | 6сутки | 9сутки | |
| Нейтрофилы | Iгруппа | 53±1,5 | 49,9±1,2** | 45,6±0,9* | 35,5±0,9* |
| IIгруппа | 53,5±1,2 | 49,5±1,2* | 45±1,4* | 35,1±1,1* | |
| IIIгруппа | 54,2±1,1 | 49,4+3,3* | 45,6+2,5** | 35,6+1,8* | |
| IVгруппа | 53,2+0,4 | 45+3,4* | 40,8+1,5* | 29,6+1,2** | |
| «Деструктивные» нейтрофилы | Iгруппа | 18,7+1,2 | 13,9+0,4* | 5,5+0,2* | - |
| IIгруппа | 17,8+1,2 | 13,7+0,5** | 5,4+0,3* | - | |
| IIIгруппа | 17,9+1,2 | 13,8+0,1* | 5,5+0,4** | 0,5+0,3** | |
| IVгруппа | 18,5+1,2 | 11,2+3,3* | - | - | |
| Фагоцитоз | Iгруппа | 8,1+2,3 | 7,3+1,1* | 5,9+0,2* | 2,3+0,5** |
| IIгруппа | 8,0+2,3 | 6,9+0,1** | 6,0+0,3* | 2,2+0,2** | |
| IIIгруппа | 7,9+2,3 | 7,1+0,2* | 6,1+0,1** | 2,4+0,5* | |
| IVгруппа | 8,0+2,3 | 6,2+1,5* | 5,4+1,0* | - | |
| Макрофаги | Iгруппа | 16,8±1,3 | 20,3±0,9** | 20,1±1,5* | 18±0,9 |
| IIгруппа | 17,2±1,1 | 21±1,1* | 20,7±0,8* | 19±0,7* | |
| IIIгруппа | 16,7±1,3 | 20,7±0,9** | 20±0,8* | 18,2±0,7* | |
| IVгруппа | 16,9+1,2 | 24,8+1,4** | 21,4+0,6* | 13,4+0,8* | |
| Лимфоциты | Iгруппа | 3,4+0,7 | 8,6+0,5* | 6,6+0,1* | 13+0,3** |
| IIгруппа | 3,5+0,8 | 8,9+0,3* | 6,5+0,7** | 13,8+1,3** | |
| IIIгруппа | 3,3+0,7 | 8,9+0,1* | 6,6+0,4** | 12,8+1,3* | |
| IVгруппа | 3,4+0,7 | 6,5+0,3* | 7,8+0,6* | 12,7+0,4* | |
| Фибробласты | Iгруппа | - | - | 15,4+1,9* | 30,7+3,1* |
| IIгруппа | - | - | 15,6+3,0* | 30,4+2,0* | |
| IIIгруппа | - | - | 15,7+2,5* | 30,5+3,0** | |
| IVгруппа | - | 6,3+2,3* | 24,6+2,5* | 44,3+2,3* | |
| СD95+клетки | Iгруппа | 29,5±1,1 | 31,5,5±1,5* | 27,3±1,1* | 21,2±0,5* |
| IIгруппа | 28,9±1,4 | 25,5±1,1* | 18,2±0,5* | 14,8±0,6* | |
| IIIгруппа | 29,1±0,8 | 25,8±1,4* | 15,4±0,6* | - | |
| IVгруппа | 28,7±1,3 | 24,9±1,5* | 13,5±1,2* | - | |
| СD282+ клетки | Iгруппа | 72,9±1,5 | 69,4±1,2* | 62,5±1,5* | 57,2±2,7* |
| IIгруппа | 73,4±1,8 | 64,5±1,5* | 53,1±2,5* | 44,1±3,5* | |
| IIIгруппа | 74,1±1,3 | 62,4±1,5* | 46,4±4,5* | - | |
| IVгруппа | 74,5±1,5 | 63,9±0,5* | 43,9±3,8* | - | |
Примечание: Iгруппа –контрольная; II группа – локальнаяиммунокоррекция с миелопидом; III группа – NO-терапия; IVгруппа –миелопид+NO-терапия ; *р<0,05; **р<0,01 по сравнению с интраоперационнымипоказателями (1 сутки).
В группе контроляраневой процесс по цитологическим даннымхарактеризовался медленным очищением раныот патогенной микрофлоры (на 11-13 сутки), чтоприводило к сохранению воспалительныхявлений и тормозило наступлениепролиферативной фазы раневого процесса.
Следует отметить, чтопри сравнении основныхпараметров цитограмм больных сзатяжным и хроническим течением раневогопроцесса более неблагоприятныеизменения динамики цитологическихпоказателей имели место у больных сфлегмонозно-некротической формойрожи. В цитограммах такихпациентов выявлялся высокий процент дистрофическихформ нейтрофилов (более 20%)и нежизнеспособных клеток,СD95+клеток (выше 30%), снижение числа СD282+ (менее 40%), отсутствие в очаге воспалениялимфоцитов на 6 сутки лечения, снижениестимулированного НСТ-теста(до 32,7±3,25%), при сохраненииего высокогоспонтанного уровня(51,5±4,5%).
Рис. 13. Динамикапоказателей раневой жидкости больных стипичным течением гнойных ран на фонелечения.
Примечание: 1 – показатели в I группе до лечения; 2 -– показателив I группе после лечения; 3 - показатели во IIгруппе до лечения; 4 - показатели во II группепосле лечения; 5 - показатели в III группе долечения; 6 - показатели в III группе послелечения; 7 - показатели в IV группе долечения; 8 - показатели в IV группе послелечения; p<0,01 по сравнению с показателямидо лечения у больных II, III и IV групп; p<0,05– в Iгруппе.
Таблица 6.
Динамика показателейНСТ-теста раневых фагоцитов на фонелечения больных с типичным течениемраневого процесса.
| Показатель | Группабольных | Долечения | Послелечения |
Спонтанный НСТ (%) | I группа(n=20) | 62,8±6,25 | 50,2±4,4 * |
| II группа(n=15) | 63,2±6,4 | 32,6±3,8** | |
| III группа(n=15) | 65,1±5,5 | 26,5±3,1* | |
| IV группа(n=15) | 64,1±5,1 | 21,8±3,8** | |
| Стимулированный НСТ (%) | I группа(n=20) | 83,3±10,2 | 53,2±6,3* |
| II группа(n=15) | 84,5±11,7 | 45,7±4,9* | |
| III группа(n=15) | 82,5±10,3 | 42,5±7,6* | |
| IV группа(n=15) | 81,9±10,5 | 44,1±5,4* |
Примечание: * p<0,05; **p<0,01 по сравнению с показателями долечения.
При этом в первыедвое суток течения раневогопроцесса (при благоприятном инеблагоприятном течении) существеннойразницы в показателях цитограмм, заисключением числа TOLL-2+ клеток (70-75% и 34-38%,соответственно), не отмечалось. Наиболеевыраженные отличия в данных цитограммрегистрировались у большинства пациентов стипичным и неблагоприятным течениемгнойных ран на 7-12 сутки, а улучшениеуказанных показателей на фоне традиционноголечения при хроническом и затяжномхарактере раневого процесса наблюдалось не ранее 18-20дня. Позитивная динамика цитограмм уэтой категории больных прииспользовании локальной иммунокоррекцииимела место уже на 9-12 сутки и была болеевыражена при сочетанном применении миелопида иNО-терапии.Особо следует отметить на фоне леченияповышение в интервале 9-12суток в цитограммах раневого экссудатаколичества клеток, экспрессирующих TOLL-2рецепторы (до 43,4±2,5% -в I группе; до 46,1±1,5% – во II; до 47,05±1,5%и 58,3±1,5% - в III и IV группа, соответственно. При этом болеевысокий «темп» прироста СD282+ клеток сочеталсяс болееблагоприятной клинической динамикойраневого процесса.
Оцениваяиммунологическую эффективностьпредложенных способов локальнойиммунокоррекции на цитокиновый статус,следует отметить более выраженнуюположительную динамику при сочетанномиспользовании NO-терапии и миелопида (табл.7), как у больных с благоприятным, так инеблагоприятным течением раневогопроцесса. Так, на фоне локальнойиммунотерапии у всех больных после лечениянаблюдалось улучшение показателей исходнонарушенного локального и системногоцитокинового статуса с нормализациейпоследних у 66,7% пациентов II группы (у 43,8% - сзатяжным течением гнойных ран), 61,5% и 70,1% - IIIи IVгрупп (53,3% и 71,4% - с затяжным течениемраневого процесса), соответственно.
Таблица 7.
Динамика уровнейцитокинов раневых экссудатов на фонелечения у больных с гнойными ранами при благоприятном течениираневого процесса.
| Уровень цитокина, пкг/мл | Долечения | Послелечения | |
ИЛ-1 | I группа(n=20) | 328,63±21,35 | 118,2±10,8** |
| II группа(n=20) | 345,48±33,15 | 88,5±12,7** | |
| III группа(n=20) | 335,65±29,15 | 57,1±3,65** | |
| IV группа(n=20) | 350,55±39,5 | 49,85±4,25** | |
| ИЛ-8 | I группа(n=20) | 357,6±25,95 | 78,55±15,45** |
| II группа(n=20) | 361,61±35,95 | 56,8±15,12** | |
| III группа(n=20) | 360,35±25,9 | 35,2±12,5** | |
| IV группа(n=20) | 349,55±22,5 | 39,45±16,5** | |
| ФНО- | I группа(n=20) | 159,85±12,15 | 59,6±5,45* |
| II группа(n=20) | 157,15±10,5 | 38,1±8,25** | |
| III группа(n=20) | 160,85±14,05 | 20,45±6,25** | |
| IV группа(n=20) | 168,85±13,6 | 22,5±6,25** | |
| ИЛ-6 | I группа(n=20) | 69,85±14,15 | 57,6±5,45* |
| II группа(n=20) | 66,15±10,5 | 38,1±7,25** | |
| III группа(n=20) | 71,85±18,05 | 20,45±5,25** | |
| IV группа(n=20) | 72,35±21,6 | 22,5±6,25** | |
| ИЛ-10 | I группа(n=20) | 29,85±12,15 | 9,6±5,45* |
| II группа(n=20) | 28,15±10,5 | 38,1±1,25** | |
| III группа(n=20) | 27,85±14,05 | 20,45±5,25** | |
| IV группа(n=20) | 29,65±13,6 | 22,5±2,25** | |
| ТФР- | I группа(n=20) | 3299,85±97,5 | 2759,6±85,5* |
| II группа(n=20) | 3376,15±100,5 | 2338,1±90,25** | |
| III группа(n=20) | 3401,85±124,5 | 2108,45±75,25** | |
| IV группа(n=20) | 3198,85±123,6 | 2017,5±82,5** | |
| ИЛ-1Ra | I группа(n=20) | 99,85±12,15 | 47,6±15,4* |
| II группа(n=20) | 96,15±10,5 | 33,1±10,5** | |
| III группа(n=20) | 101,85±14,05 | 25,5±7,5** | |
| IV группа(n=20) | 98,85±13,6 | 26,5±8,25** | |
Примечание: * p<0,05; **p<0,01 по сравнению с показателями до лечения.
Вместе с тем, послекурса традиционной терапии уровниИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8,ФНО-, ИЛ-1Ra, ИЛ-10 и ТФР-1 достоверноизменялись (в зависимости от исходногосодержания), однако, значений нормы враневом экссудате и сыворотке кровидостигали лишь у 25% и 35% больных,соответственно. Позитивная динамикауровня цитокинов в РЖ при затяжных ихронических гнойных ранах имела место лишьк 14-16 суткам лечения. У 92% больных былоустановлено сочетание положительнойклинической динамики течения раневогопроцесса и улучшения до нормальныхзначений показателей локальногоцитокинового статуса.
Как уже отмечалось,развитие гнойных ран сопровождаетсязначительными нарушениями локальнойантимикробной защиты поврежденных тканей.В процессе проведения предложенногокомплексного лечения у94,2% больных с типичнымтечением гнойных ран к 9-12 суткам отмечалось значительное улучшение показателей продукцииантимикробных белков ипептидов в целом болеевыраженное у пациентов второй и четвертойгрупп (рис. 14, 15, 17). У больных первой группыположительная динамика регистрироваласьтолько к 14-16 дню в 45% случаев.
При затяжном ихроническом течении гнойных ран болеепозитивные изменения выявлялись присочетанном использовании NO-терапии имиелопида.Так, уровень LL-37 в раневойжидкости у больных I, II,III и IV групп послелечениясоставил, соответственно, 3,45±0,75 мкг/мл,2,38±0,35 мкг/мл,2,27±0,25 мкг/мл и 1,45±0,15 мкг/мл. Снижениеконцентрации дефенсина в раневойжидкости регистрировалось к окончанию леченияпри затяжном течении процессау пациентов всех групп: до1,15±0,02 мкг/мл в I группе, до 0,98±0,01 мкг/мл – во второй, до0,85±0,02 и 0,26±0,01 мкг/мл в третьей и четвертой группах,соответственно. Положительная динамика нафоне лечения была характерна и дляпродукции лактоферрина: повышение враневой жидкости его уровня до 22,6±5,5нг/мл, 34,5±6,45 нг/мл, 36,5±6,5нг/мл и 48,6±5,5 нг/мл у больных I - IV групп, соответственно.
 |  |
| Рис.14. Динамика уровня дефенсина враневой жидкости и плазме крови больных стипичным течением гнойных ран. | Рис.15. Динамикауровня LL-37 враневой жидкости и сыворотке крови больныхс типичным течением гнойных ран. |
Примечание: 1 – показателисыворотки крови до лечения; 2 – после лечения; 3-показатели РЖ до лечения; 4 – показатели РЖпосле лечения.
Аналогичнаязакономерность наблюдалась в отношенииуровня миелопероксидазы с повышением егоконцентрации от исходно сниженной (до115±25 у.ед.) на 26%, 27,5%, 34% и 54%, в исследуемыхгруппах, соответственно. При этом у больныхс типичным течением раневого процессарегистрировалось снижение исходноповышенного уровня миелопероксидазы.Однако, статистически значимых различий,как в её системной, так и в локальнойпродукции на фоне различных способовлечения установлено не было.
При затяжном течениигнойных ран в сыворотке крови большинствабольных (71%)II - IV группнормализация уровней АМП наблюдалась к 14-16суткам, при использовании традиционноголечения –лишь к 20-21 суткам у 36,4% пациентов.
Следует отметить, что нафоне лечения происходило «выравнивание» враневом экссудате и сыворотке кровиконцентрации метаболитов оксида азота:снижение исходно повышенных показателей иповышение исходно сниженных (рис.16). Приэтом динамика указанных параметров убольных третьей и четвёртой групп былаболее выражена при исходно сниженныхпоказателях, что, очевидно, связано свведением экзогенного оксида азота враневой очаг. Нормализации уровня NО упациентов, получавших традиционноелечение, зарегистрировано не было.
Рис. 16.Динамика уровня NО в раневой жидкостии сыворотке крови больных с гнойнымиранами.
Примечание: 1 – показателисыворотки крови до лечения; 2 – после лечения; 3-показатели РЖ до лечения; 4 – показатели РЖпосле лечения; А – пациенты с исходно высокимипоказателями; В – пациенты с исходно низкимипоказателями.
В настоящее времябольшое внимание уделяется изучениюматриксных металлопротеиназ как белков тканевогоремоделирования в развитииряда патологических состояний (Ковальчук Л.В.,2007; Levy М.М.,2005). Однако их роль врегуляции процессов репаративнойрегенерации тканей изучена недостаточно и остаетсядискутабельной. Известно, что матриксметаллопротеиназа-3 (ММР-3) катализирует деградациюмногих компонентов соединительнойткани, включая протеогликаны, коллагентипов II,IV, IX, XI, Э ламинин ифибронектин, а также оказываетопосредованное действие на деградациюэкстрацеллюлярного матрикса черезактивациию проколлагеназы-1(Соболева Г.М., Сухих Г.Т., 2007;Antiopi V., Allison J., 2006;Liew F.Y., Brint E.K.,2005).
При анализепоказателей ММР-3 до лечения в сывороткекрови и РЖ больных (рис. 18)было выявлено повышение ееконцентрации (до 28,4±7,8 нг/мл в РЖ и до 16,7±2,5нг/мл – всыворотке крови). Вероятно,данные изменения носят адаптивный характер инаправлены на ликвидацию последствийповреждения и стабилизацию репарации.У здоровых лиц уровень ММР-3составил 0,8±0,5 нг/мл.При этом существеннаяразница в концентрации ММР-3 в РЖ больных с различнымивариантами течения гнойных ранфиксировалось, как правило, между 5-ми и 7-мисутками, а уровень ММР-3 в раневойжидкостивыше 15 нг/мл после 7 дня был характерен лишьдля пациентов с затяжным и хроническим течениемраневого процесса. Анализ динамики ММР-3 у больных гнойнымиранами в процессе лечения показал, чтовосстановление показателя матрикс металлопротеиназы-3при неосложнённом течении раневого процессаначинается с 5-7 суток и завершается к 10-13суткам лишь у 52% больных при традиционном лечениигнойных ран.
 |  |
| Рис.17. Динамика уровня лактоферрина в раневойжидкости и сыворотке крови больных стипичным течением гнойных ран. | Рис.18. Динамикауровня ММР-3в раневой жидкости исыворотке крови больных с типичнымтечением гнойных ран. |
Примечание: по левойоси ординат - уровень лактоферрина (нг/мл) всыворотке крови, по правой – в раневойжидкости.
После примененияоптимизированного комплексного лечениязначимое снижение концентрации ММР-3 отмечалось уже к 8-9 суткам у больных с благоприятным течением раневогопроцесса и не ранее 12-14 дня– призатяжном и хроническом течении (рис. 18). Так, после традиционноголечения флегмонозно-некротической формы рожи ипосттравматических ран концентрацияММР-3 ниже 5нг/мл в сыворотке крови и менее 10 нг/мл в РЖрегистрировались в среднем на 21,5±2,4 день лишь у21,2% и 15,2% больных,соответственно. Тогда как вгруппах сравнения показатели ММР-3 нафоне лечения изменялись статистически более значимо уже на10-11 сутки, а в концентрациях ниже 5 нг/мл, какв раневойжидкости, так и в сыворотке крови послелечения (на 17- 19 сутки) определялись у63,3%пациентов II - IV групп.
Полученные результатыпозволили нам рассматривать показатель ММР-3более 15 нг/мл в качестве одного из важных критериев развития затяжного и хроническоготечения раневого процесса при гнойныхранах. Какпоказали результаты, комбинация из трёх иболее приведенных лабораторныхпоказателей (табл. 8) с высокой долейвероятности (92,6%) свидетельствовала оразвитии у больных затяжного и/илихронического течения гнойной раны.
Таблица 8.
Показатели прогнозазатяжного и/или хронического теченияраневой инфекции у больных гнойными ранамиразличного генеза.
| № п/п | Показатель | Значенияпоказателя |
| 1. | КателицидинLL-37 | < 0,5 мкг/млили >10 мкг/мл |
| 2. | дефенсин | >1,5 мкг/мл |
| 3. | NO | <1 мкмоль/л |
| 4. | TLR2+клетки | < 40% |
| 5. | ММР-3 | >15 нг/мл |
Оценка исходного состояния системногоиммунитета показала наличие у 77,8%больных гнойными ранами после вскрытия абсцессов и флегмонмягкихтканей признаков иммунной дисфункции. При этом выявленодостоверное снижение числаCD4 (29,9±1,6%), CD8 (17,1±1,2%), CD19(9,1±1,2%) – позитивных клеток, атакже нарушение функциональной активностиТ- лимфоцитов в видеснижения экспрессии ранних (CD25 -до 2,6±0,3%; CD71- до 24,9±1,1% ) и поздних(HLA-DR – до 20,9±1,15%)индуцибельных маркеров. Приэтом у больных, раневой процесс которыххарактеризовался неблагоприятным течением,было отмечено более выраженное снижениесодержания CD4+ и CD25+субпопуляций на 42% и 38% от вышеприведенных данных. В целом признаки иммуннойдисфункции, по экспрессиииммунорегуляторных молекул, у даннойкатегории пациентов регистрировались в88,5% случаев.Кроме того, иммунныенарушения у 68,3% больных с благоприятным течением раневойинфекции проявлялисьповышением фагоцитарной активности (ФА) МНФ крови(до 88,7±1,7%),гиперэкспрессией CD95 рецепторов, отражающих процесс негативной активацииклеток. Снижение ФА (до 30,5±1,5%) было выявлено у 22%пациентов лишь с неблагоприятным течениемраневой инфекции. При этом следует отметить, чторазброс данных системного иммунитета припослеоперационных ранах был достаточноширок, поскольку чаще всего они являютсяследствием какого-либо заболевания,требующего хирургического лечения, в связи с чемнаибольшую значимость имело определениепоказателей локального иммунногостатуса.
На фоне лечения убольных всех групп наблюдалосьдостоверное повышение числа лимфоцитов, экспрессирующихстабильные (CD4+, CD8+) и активационныемаркеры (CD25+,CD71+, HLA-DR+).Приблагоприятном течении раневого процесса регулирующее влияние NО-терапии и еёсочетанного использованияс миелопидом было болеевыраженным и имело место у всех больных (более чем у 90% -II и IIIгрупп,соответственно).При затяжном и хроническомтечении гнойных ран восстановлениепоказателей Т-системы иммунитетарегистрировалось к окончанию лечения в68,8% случаевпри использовании миелопида, в 73,3% - NО-терапии и в85,7% - присочетанном применении миелопида иэкзогенного оксида азота.В контрольной группеизмененияпоказателей Т- звена иммунитета были менеевыражены, а полная нормализация числа CD25+, CD71+, CD95+, HLA-DR+ -клеток наблюдалось у59% больных стипичным течением раневой инфекции и лишьу 45,5% - сзатяжными ихроническими гнойными ранами. Аналогичнаязакономерность отмечалась и в отношении ФА МНФ периферической крови,восстановление которой (снижение показателей до 57,8±7,8%) регистрировалось к 9-10 суткам увсех больныхII-IV групп приблагоприятном течении гнойных ран и толькоу 67% Iгруппы.При осложненном течении раневого процессанормализация исходно сниженной ФА (повышение до51,7±4,2%)имела место лишь приместномприменении сочетания миелопида иэкзогенного NО.
Кроме того, у больных стипичным течением раневого процессаотмечалосьснижение на фоне лечения исходноповышенного числа CD95+ иCD282+клеток. Принеблагоприятном течении гнойных ранвосстановление числа CD95+клеток периферической кровинаблюдалось у всех больных четвертойгруппы и у большинства пациентов второй(68,8%) итретьей (80%)групп. Следует отметить, что уменьшениечисла МНФ, экспрессирующихTLR2-рецепторы, в среднем с70,5±7,4% до48,3±3,5% регистрировалось увсех пациентов хроническими гнойнымиранами при их исходномповышении, однако достоверныхразличий по группам установлено небыло.
Достовернаяположительная динамика послепредложенного лечения отмечалась также вотношении В-лимфоцитов (CD19+ клеток) исочеталась свосстановлением исходно нарушеннойпродукции IgG,которая регистрировалась на протяжении всего раневогопроцесса у больных посттравматическимиранами (повышение IgG от+53% до +78%) и при флегмонозно-некротическойформе рожи (снижение IgG на44% - 52%). При этомзначительных различий по сравнению страдиционным лечением установлено не было. На фоне лечения происходило восстановление вРЖ концентрации IgG (повышенной до1,15±0,33 г/л при типичномтечении ран,сниженной до «следовых» значений – принеблагоприятном). Указаннаядинамика была более значимана фоне комбинированноголечения препаратом миелопид и NО (восстановление уровня IgG в Iгруппе до 0,7±0,03 г/л; во II - до 0,55±0,05 г/л; в III и IVгруппах до0,5±0,09 и0,45±0,05 г/л,соответственно; p< 0,05).
Полученные данные показаливыраженное положительное влияние локальногоприменения препарата миелопид, NО-терапии,а также их комбинации на восстановлениеиммунологической реактивности больных с гнойнымиранами, приводящее к значительномуулучшению, а в ряде случаев к нормализации показателейиммунитета. При этомдостоверно лучший клинический эффект,подтвержденный лабораторными данными, былполучен при сочетанном применениипрепарата миелопид и NО-терапии: восстановлению показателейлокального и системного иммунитета на 9-12день при типичном течении раневого процесса ина 14-16 сутки – при затяжных и хроническихгнойных ранах.
Таким образом, анализрезультатов проведенных исследованийпозволяет сделать заключение оперспективности применения в программаххирургического лечения гнойных ранлокальной иммунокоррекции сиспользованием миелопида и NО-терапии.
ВЫВОДЫ
1. Развитие гнойных рансопровождается значительными нарушениямикомпонентовврождённого противоинфекционногоиммунитета: дисбалансом продукцииантимикробных пептидов (LL-37, дефенсина 1-3, лактоферрина, миелопероксидазы игепсидина) и экспрессии TLR2 фагоцитами кровии раневойжидкости.
2. Критерияминеблагоприятного течения гнойных ранявляются значительное повышение или снижение враневой жидкости уровня кателицидина LL-37,повышение концентрации дефенсина, матриксметаллопротеиназы-3, снижение числаTOLL2+ клеток и уровня метаболитов оксида азота.
3. Препарат миелопидобладает прямой антибактериальной иантикандидозной активностью и оказывает in vitroиммуномодулирующее влияние на продукциюантимикробных пептидов (кателицидина LL-37,лактоферрина, миелопероксидазы), воспалительных ипротивовоспалительных цитокинов,оксида азотаи метаболитов кислорода, экспрессию TOLL2-рецепторовмононуклеарными фагоцитами периферическойкрови больных с гнойными ранами.
4. Экспериментальноеисследование на модели гнойных ран у крыспоказало,что эффективность локального действиямиелопида по срокам заживления ран иснижению бактериальной обсеменённостианалогична антисептику гипохлоритунатрия, аNO-терапия усиливаетбактерицидное действие натрия гипохлоритапри их сочетанном применении. Наилучшиерезультаты получены при комбинированномлокальном использовании миелопида и NO-терапии, чтосопровождалось дополнительным ускорениемв 1,5-2 раза санации патологического очага исроков заживления гнойных ран.
5. Установлена болеевысокая клиническая эффективность способалокальнойиммунокоррекции с сочетаннымиспользованием миелопида и NO-терапии вкомплексном лечении больных с гнойнымиранами в сравнении с традиционным лечением,местным применением NO-содержащегогазового потока, препарата миелопид.
6. Комбинированноелокальное применениев комплексном лечениигнойных ран препарата миелопид и NO-содержащегогазового потока ускоряет купированиевоспалительного процесса в тканях раны,сроки заживления и деконтаминации,уменьшает время подготовки ран кхирургическому закрытию (на 2,3-3,2 дня притипичном и на 5,4-6,3 - при затяжном ихроническом течении), что позволяетсократить на 3-4 дня (на 5-6дней при затяжном ихроническомтечении) продолжительность и на 24,4%стоимость стационарного лечения.
7. Применение вкомплексном лечении гнойных ранкомбинации локальной иммунокоррекциипрепаратом миелопид и NO-терапии, посравнению с другими предложенными вариантамилечения, приводит у большинства больных на9-12 сутки (на 14-16 суткипри затяжных и хронических гнойных ранах) квосстановлению в периферической кровичисла CD4+,CD8+, CD19+, CD25+, HLA-DR+, CD71+, CD95+, CD282+клеток,улучшению показателей системного и локальногоцитокинового статуса, уровня оксидаазота, антимикробных пептидов, Ig G (в раневойжидкости), матриксной металлопротеиназы-3,а также функциональной активностимононуклеарных фагоцитов крови и раневой жидкости.
ПРАКТИЧЕСКИЕРЕКОМЕНДАЦИИ
1. Длявыбора тактики лечения идифференцированного применения способовлокальной иммунокоррекции у больных сгнойными ранами рекомендуется использовать разработанную шкалубалльной оценки ипрогностические маркёры высокого риска развитиязатяжного и хронического течения раневойинфекции.
2. С цельюускорения купирования воспалительногопроцесса в очаге поражения и сокращения сроковзаживления при лечениигнойных ран (размерами до 50 см2), как в первую, таки во вторую фазу раневого процесса, рекомендуется использоватьлокальную иммунокоррекцию препаратоммиелопидом (3000 мкг/мл)с первого дня лечения1 раз в суткидо полной эпителизации раневойповерхности.
3. Оптимальнымвариантом локальной иммунокоррекции вкомплексном лечении гнойных ран (как притипичном, так и при неблагоприятномтечении) является разработаннаякомбинация местного использованиямиелопида и NO-терапии, которуюпроводят с первого дня лечения 1 раз в день,во время перевязки. Сочетанное воздействиецелесообразно прекратить послехирургического закрытия раневого дефектаили заживления раны.
4. Методика локальнойиммунокоррекции с сочетаннымиспользованием миелопида и NO-терапиидолжна включать воздействие на раневуюповерхность (в первую и вторую фазыраневого процесса) воздушно-плазменнымпотоком, содержащим оксид азота,генерируемым с помощью аппарата «Плазон»(длительность воздействия на одну зонуразмером 1х1см составляет 8-9 секунд срасстояния 20-25 см от выхода плазмотрона,общее время соответствует площади раны) иместное применение раствора миелопида (3000мкг/мл).
СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Халилов, М.А. Гнойнаярана: особенности течения в зависимости отгенеза / М.А. Халилов // Пособие для врачей.-Орёл, 2001. - 44 С.
2. Халилов, М.А. Оценкаантибиотикотерапии в комплексном лечениибольных с гнойными заболеваниями / М.А.Халилов, А.С. Муковников, Л.Н. Долинская //Актуальные вопросы научно-практическоймедицины. - Орёл, 2002. - С. 300-303.
3. Новые подходы ккомплексному лечению больных сгнойно-воспалительными заболеваниямимягких тканей / И.А. Снимщикова, А.И.Медведев, М.А. Халилов и др. // Материалывторого Российского конгресса«Современные технологии в педиатрии идетской хирургии». - Москва, 2003. -С.516-517.
4. Эффективностьлокальной иммунокоррекции в сочетании сультразвуковой кавитацией пригнойно-воспалительных заболеваниях / И.А.Снимщикова, А.И. Медведев, М.А. Халилов и др.// Тезисы V Российской конференции«Современные проблемы антимикробнойхимиотерапии». - Москва, 2003. - С.64.
5. Снимщикова, И.А.Некоторые аспекты локальнойиммунокоррекции при гнойно-воспалительныхзаболеваниях мягких тканей / И.А.Снимщикова, М.А. Халилов, А.И. Медведев //Вклад земляков - орловцев в развитие истановление российской науки, культуры иобразования: Материалы научнойконференции. - Орёл, 2003. - С. 66-67.
6. Комплексныйметод лечения больных сгнойно-воспалительными заболеваниямимягких тканей. / И.А. Снимщикова, В.И.Круглый, М.А. Халилов и др. // Материалы68-й межвузовской научной конференции.– Курск, 2003. часть 1. -С.59.
7. Халилов, М.А.Локальная иммунокоррекция в леченииэкспериментальных гнойных ран / М.А.Халилов, И.А. Снимщикова // Актуальныевопросы медицины и образования. Учёныезаписки, том 3. - Орёл, 2004. - С.16-21.
8. Халилов, М.А. Некоторыевопросы профилактики и лечения гнойныхосложнений в амбулаторной хирургии / М.А.Халилов, В.Д. Затолокин, М.С. Новиков //Материалы VI Всероссийского научногофорума «Хирургия-2005». - Москва, 2005. -С.54.
9. Халилов, М.А.Экспериментальное обоснованиетопического примененияиммунорегуляторных пептидов пригнойно-воспалительных процессах / М.А.Халилов, И.А. Снимщикова, И.А. Молдованов //Сборник статей, посвященный 85-летиюОрловской городской больницы скороймедицинской помощи им. Н.А.Семашко. - Орёл,2006. - С. 198-202.
10. Затолокин,В.Д. Воздействие оксида азота илокальной цитокинотерапии в лечениираневых осложнений экспериментальногоперитонита / В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, С.И.Долгов // Актуальные вопросы хирургии.Сборник научно-практических работ,посвященный 90-летию кафедры общей хирургииРостГМУ. - Ростов-на-Дону, 2006. -С.186-187.
11. Новыеподходы к локальному применениюпрепаратов иммунорегуляторных пептидов /И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, Е.И. Лялюхина идр. // Russian Journal of Immunologi. – 2006. - V.9,S.3. - С. 152.
12. Халилов,М.А. Использование миелопида в локальнойиммунокоррекции экспериментальныхгнойных ран / М.А. Халилов // Материалы VIIмеждународной научно-практическойконференции «Здоровье и образование в XXIвеке. - Москва, 23-25 ноября 2006 г. - С.528-529.
13. Новыеподходы к локальному применениюпрепаратов иммунорегуляторных пептидов впедиатрической практике / И.А. Снимщикова,М.А. Халилов, Е.И. Лялюхина и др. //Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, №2-3. - С. 464.
14. Халилов,М.А. Экзогенный оксид азота в комплексномлечении гнойно-воспалительных заболеваниймягких тканей / М.А. Халилов, А.С. Мошкин //Вестник развития науки и образования. -Москва, 2007. - №1 - С.20-21.
15. Халилов,М.А. Обоснование эффективности и сроковвоздействия экзогенного оксида азота влечении гнойно-воспалительных заболеваниймягких тканей / М.А. Халилов, А.С. Мошкин //Научная жизнь. - Москва, 2007. - №1. - С. 22-23.
16. Халилов,М.А. Влияние внутрибольничной инфекции надинамику гнойного процесса прииспользовании NО-терапии / М.А. Халилов //Журнал микробиологии, эпидемиологии ииммунобиологии. - 2007. - №4. - С.112.
17. Халилов,М.А. Иммунологические и микробиологическиеизменения в гнойно-воспалительных ранахпри локальном воздействии миелопида / М.А.Халилов // Сб. материалов VI Всероссийскойуниверситетской научно- практическойконференции молодых ученых по медицине. -Тула, 2007. - С. 251-252.
18. Халилов,М.А. Эффективность топической терапии приинфекционно- воспалительных процессах /М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, И.А. Молдованов// Сб. материалов VI Всероссийскойуниверситетской научно- практическойконференции молодых ученых по медицине. -Тула, 2007. - С. 252-253.
19. Халилов,М.А. Локальное воздействиеиммунорегуляторных пептидов в лечениигнойных ран / М.А. Халилов // Раны и раневаяинфекция: материалы IV Всероссийскойконференции общих хирургов РФ смеждународным участием и Пленумапроблемной комиссии «Инфекция в хирургии».- Ярославль, 2007. - С. 207-209.
20. Затолокин,В.Д. Некоторые аспектызаживления гнойных ран в эксперименте /В.Д. Затолокин, М.А. Халилов, А.С. Мошкин //Раны и раневая инфекция: материалы IVВсероссийской конференции общих хирурговРФ с международным участием и Пленумапроблемной комиссии «Инфекция в хирургии».- Ярославль, 2007. - С. 115-116.
21.Экспериментальное обоснование примененияиммунорегуляторных пептидов пригнойно-воспалительных процессах / И.А.Снимщикова, М.А. Халилов, И.А. Шманева и др. //Раны и раневая инфекция: материалы IVВсероссийской конференции общих хирурговРФ с международным участием и Пленумапроблемной комиссии «Инфекция в хирургии».- Ярославль, 2007. - С. 185-188.
22.Возможности и перспективы локальногоприменения препаратов иммунорегуляторныхпептидов / И.А. Снимщикова, В.С. Анцупова, М.А.Халилов и др. // Актуальные вопросыохраны репродуктивного здоровьянаселения: материалы межрегиональнойконференции, посвящённой юбилеюОрловского областного родильного дома истолетию акушерско-гинекологическойслужбы области. - Орёл, 2007. - С.286-289.
23.Эффективность локальной иммунокоррекции вкомплексном лечении спаечных процессоворганов малого таза / И.А. Снимщикова, В.С.Анцупова, М.А. Халилов и др. // Russian Journal ofImmunologi. - 2007. - V.9, S.4. - С. 63-70.
24.Экспериментальное обоснование примененияпрепарата миелопид при иммунодефицитах /И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, В.В. Красникови др. // Russian Journal of Immunologi. – 2007. - V.9, S.4. - С. 149-150.
25.Экспериментально - морфологическоеобоснование применения различныхлекарственных форм миелопида прибактериальных инфекциях / М.А. Халилов, В.В.Красников, О.В. Ильина, и др. // Медицинскаяиммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С.169.
26.Перспективные направления леченияинфекционно-воспалительных процессов кожии слизистых / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов,И.А. Молдованов и др. // Медицинскаяиммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С.355.
27. Халилов,М.А. Применение различных лекарственныхформ миелопида при бактериальныхинфекциях / М.А. Халилов, В.В. Красников,И.А. Молдованов // Сборникнаучно-практических статей посанитарно-эпидемиологическим вопросам. -Орёл, 2007. - С. 382-384.
28. Участиеэндогенных антимикробных пептидов врегуляции инфекционно-воспалительныхпроцессов / И.А. Снимщикова, И.А. Шманева, М.А.Халилов и др. // Вестник РоссийскогоГосударственного медицинскогоуниверситета. – 2008. -№4 (63). - С. 50.
29.Перспективы топической иммунокоррекциипри кандидозных поражениях кожи ислизистых / И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, В.С.Анцупова и др. // Вестник РоссийскогоГосударственного медицинскогоуниверситета. – 2008. -№4 (63). - С. 50.
30.Современные подходы к диагностике илечению гнойно-воспалительных заболеванийи раневой инфекции / И.А. Снимщикова, М.А.Халилов, А.И. Медведев и др. // ВестникРоссийского Государственногомедицинского университета. – 2008. - №4 (63). - С. 95-98.
31. Рольэндогенных антимикробных пептидов врегуляции воспалительных процессов / И.А.Снимщикова, И.А. Шманева, М.А. Халилов и др. //Российский иммунологический журнал.– 2008. - Т. 2 (11), №2-3. - С.187.
32. Халилов, М.А. Опытприменения программного метода анализаран в эксперименте / М.А. Халилов, А.С. Мошкин// Морфологические ведомости. Клиническаяанатомия и экспериментальная хирургия.– Вып. 8, 2008. -С. 290-291.
33. Затолокин,В.Д. Водные дисперсии оксидныхнаноструктур металлов при местном лечениираневых процессов / В.Д. Затолокин, М.А.Халилов, А.С. Мошкин // Учёные запискиОрловского Государственного Университета.– 2008. - №4. - С. 50-54.
34. Халилов, М.А.Клинические и экспериментальные аспектылокальной иммунокоррекции в лечениигнойных ран / М.А. Халилов // Актуальныевопросы хирургии: материалынаучно-практической конференции хирурговЦФО РФ. – Орёл,2009. – С.193-194.
35. Течение раневогопроцесса при воздействии оксида азота / В.Д.Затолокин, М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др. //Актуальные вопросы хирургии: материалынаучно-практической конференции хирурговЦФО РФ. – Орёл,2009. – С.62-63.
36. Новая методика влечении хирургической инфекции / В.Д.Затолокин, М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др.// Актуальные вопросы хирургии: материалынаучно-практической конференции хирурговЦФО РФ. – Орёл,2009. – С.64-65.
37. Товаченков, В.И.Хирургическая тактика пригнойно-некротических поражениях стоп убольных сахарным диабетом / В.И. Товаченков,М.А. Халилов // Актуальные вопросы хирургии:материалы научно-практической конференциихирургов ЦФО РФ. - Орёл, 2009. - С.188-189.
38. Халилов, М.А.Эффективность использования экзогенногооксида азота в лечении раневой инфекции /М.А. Халилов, Д.Б. Марков // Ход реализациинационального проекта «Здоровье» в МЛПУЗ«Г.Б. им. С.П. Боткина»: материалы сборниканаучно-практических работ, посвященных40-летию МЛПУЗ «Г.Б. им. С.П. Боткина». - 2009. -С.188-192.
39. Халилов, М.А. Вопросыоптимизации местного лечения гнойных ран /М.А. Халилов // Курский научно-практическийвестник «Человек и его здоровье». - 2009. - №3. -С. 31-37.
40. Халилов, М.А.Использование топической иммунокоррекциив лечении гнойных ран / М.А. Халилов //Вестник новых медицинских технологий.– 2009. - Т. XVI, №4.- С. 165-168.
41. Халилов, М.А. Рольфакторов врождённого иммунитета впатогенезе и диагностике воспалительныхзаболеваний кожи / М.А. Халилов, И.А.Снимщикова, Е.И. Лялюхина // Вестник новыхмедицинских технологий. – 2009. - Т. XVI, №4. - С.174-176.
42. Халилов, М.А.Коррекция нарушений иммунного статуса влечении гнойных ран / М.А. Халилов // Пособиедля врачей. - Орёл, 2009. - 68 С.
43. Халилов, М.А. Лечение ипрофилактика иммунных нарушенийосложнённого раневого процесса / М.А.Халилов // Методические рекомендациидля врачей - хирургов. - Орёл, 2009. - 32С.
44. Снимщикова, И.А.Теория и практика иммунокоррекции пригнойно –воспалительных процессах мягких тканей /И.А. Снимщикова, М.А. Халилов // Монография. – Орёл, 2009. – 108 С.
45. Нарушение балансацитокинов при ранах и раневой инфекции /М.А. Халилов, И.А. Снимщикова, Е.В. Митяева идр. // Российский аллергологический журнал.– 2010. - №1, вып.1. - С. 184-185.
46. Лечениеэкспериментальных гнойных ран сиспользованием топическойиммунокоррекции / М.А. Халилов, И.А.Снимщикова, А.В. Молчанова и др. //Российский аллергологический журнал.– 2010. - №1, вып.1. - С. 185-186.
47. Халилов, М.А. Изучениеиммунного статуса больных гнойными ранамина фоне локальной иммунокоррекции / М.А.Халилов, И.А. Снимщикова // Вестник новыхмедицинских технологий. – 2010. - Т. XVII, №1. - С.101-104.
48. Халилов, М.А. Опытиспользования локальной иммунокоррекции влечении гнойных ран / М.А. Халилов, И.А.Снимщикова // Медицинская иммунология. - 2010.- Т. 12, №3. - С. 227-234.
49. Характеристикатечения раневого процесса при воздействииэкзогенного оксида азота / В.Д. Затолокин,М.А. Халилов, В.Ф. Мурадян и др. // Актуальныевопросы хирургии. Материалынаучно-практической конференции хирурговЦФО РФ. - Белгород, 2010. - С. 63-64.
50. Снимщикова,И.А. Сравнительная характеристика способовтопической иммунокоррекции в комплексномлечении гнойных ран / И.А. Снимщикова, М.А.Халилов // Учёные записки ОрловскогоГосударственного Университета. – 2010. - №2(36). - С. 201-207.
51. Халилов,М.А. Особенности течениягнойной раны в условиях локальнойиммунокоррекции с использованиеммиелопида и оксида азота / М.А. Халилов //Учёные записки ОрловскогоГосударственного Университета. – 2010. - №2 (36). - С. 217-222.
Изобретения
1. Халилов, М.А.Способ лечения гнойно-воспалительныхзаболеваний мягких тканей / М.А. Халилов,И.А. Снимщикова, Е.И. Лялюхина // Патент наизобретение № 2326678.
2. Средство,обладающее антикандидозной активностью /И.А. Снимщикова, М.А. Халилов, Е.И. Лялюхина,А.И. Молдованов // Патент на изобретение №2333765.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
| АМП АФК ИЛ ИЛ-1Ra ИФА ЛФ ММР-3 МНС МНФ НСТ ПОА РЖ РЭ ТФР ФГА ФНО CD HLA HNP 1-3 Ig LL37 NO Th TLR | Антимикробныепептиды Активные формыкислорода Интерлейкин Рецепторный антагонистИЛ-1 Иммуноферментныйанализ Лактоферрин Металлопротеиназа-3 Главный комплексгистосовместимости Мононуклеарныефагоциты Нитросинийтетразолий Пероксидазнаяактивность Раневая жидкость Раневой экссудат Трансформирующий факторроста Фитогемагглютинин Фактор некрозаопухолей Кластердифференцировки Человеческийлейкоцитарный антиген Дефенсин (1-3) Иммуноглобулин Кателицидин LL37 Оксид азота Т-хелперы Толл-лайкрецепторы |
