Регуляция иммунного гомеостаза при трансплантации аутологичных клеток костного мозга кардиохирургическим больным
На правах рукописи
НИКОЛЬСКАЯ АЛЛА ОЛЕГОВНА
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА
ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ АУТОЛОГИЧНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
КАРДИОХИРУРГИЧЕСКИМ БОЛЬНЫМ
14.01.24. – Трансплантология и искусственные органы
14.03.09. – Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна
кандидат медицинских наук Габриэлян Нина Индзаровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Дементьева Инна Иосифовна
доктор медицинских наук, Захаревич Вячеслав Мефодьевич
Ведущее учреждение: Научный Центр Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН.
Защита состоится «___» января 2011г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.055.01 при ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 123182, Москва, ул. Щукинская, дом 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ
Автореферат разослан: «___»_____________2010г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор Шевченко Ольга Павловна
Актуальность темы.
В последние годы в клинике для регуляции восстановительных процессов в повреждённых органах (печень, кишечник, миокард) стали проводить трансплантацию клеток аутологичного костного мозга (Шумаков В.И., и др. 2003; Orlic D. et al. 2001; Perin E.C. et al. 2003; Vassilopoulos G. et al. 2003; Terai S. et al. 2006). Полагают, что важным механизмом коррекции органных дисфункций при трансплантации клеток костного мозга служит продуцирование этими клетками различных регуляторных пептидов, в том числе пептидов иммунной системы т.к. костный мозг является центральным органом иммуногенеза в организме и играет ведущую роль в восстановлении иммунного гомеостаза. Тем не менее в клинике для профилактики и лечения иммунной недостаточности, сопровождающейся развитием гнойно-воспалительных и септических осложнений используются фармакологические методы антибактериальной терапии (Горская Е.М. и др. 2009; Габриэлян Н.И. и др. 2009; Бокерия Л.А., Белобородова Н.В. 2007; Белобородова Н.В. 2009; Hayashi M.S., Wilson S.E. 2009; Kinross J. et. al. 2009), а также широкий спектр иммуномодулирующих и иммунокорригирующих препаратов (Земсков В.М. 1995; Романцев М.Г. 2001; Маремшаов А.М. 2001; Бунятян К.А. 2007; Быстрых О.А. 2007; Козлова М.Н. 2009). Оптимизация эффективности этих методов иммунокоррекции достигается путем индивидуального подбора иммуномодуляторов (Темнова В.В. 2006, Темнов А.А. 2008), что предполагает наличие широкого спектра препаратов в распоряжении врача. Для иммунокоррекции применяется также метод экстракорпоральной иммунофармакотерапии (метод адоптивного переноса), при котором в организм больного вводятся его лейкоциты, предварительно ex vivo активированные одним из цитокиновых иммунокорригирующих препаратов (Черных Е.Р. и др.1997; Никонов С.Д. 1999; Ушакова Н.Д. и др. 2004), чтобы избежать нежелательных побочных реакций на применяемый препарат. Между тем, несмотря на начавшееся применение клеточных технологий в клинике метод экстракорпоральной иммунотерапии аутологичными культивированными клетками костного мозга без использования иммунофармакологических препаратов не производился.
Известно, что реконструктивные операции на сердце, обычно сопровождаются иммунным дисбалансом, который создает фон для возникновения гнойно-септических осложнений и органных дисфункций, существенно снижающих результативность проведенных операций (Горбачёва Е.В. и др. 2003; Бокерия Л.А., Белобородова Н.В. 2007; Бунятян К.А. 2007;). Особенно велика опасность развития этих осложнений у кардиохирургических больных, оперированных в условиях искусственного кровообращения (ИК), которое обычно проводится у больных с уже предсуществующим иммунодефицитом (Rauchhaus M. et al. 2000; Ермакова Л.П. 2001; Шевченко О.П. и др. 1996, 2001; White M et al. 2006) и которое само по себе вызывает резкую полисистемную дизадаптацию организма (Шумаков Д.В. 2000; Бузиашвили Ю.И и др. 2003; Бунятян К.А. 2007; Винницкий Л.И. и др. 2000., 2007; Сускова В.С. и др. 2009).
Следствием суммирующего воздействия иммуносупрессивных факторов у этих больных становится снижение резистентности тканей и естественных тканевых барьеров к транслокации бактерий (особенно из желудочно-кишечного тракта) с повышением процента гнойно-септических осложнений, а также возникновение различных проявлений органной недостаточности в послеоперационном периоде, существенно повышающих опасность неблагоприятного исхода (Костюченко А.Л. и др. 2000; Spelman D., et al. 2000; Попов Д.А. и др. 2006; Бунятян К.А. 2007; Белобородова Н.В. и др. 2004, 2009; Бокерия Л.А., Белобородова Н.В. 2007).
С 2003 по 2008 годы в ФГУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ проводилось изучение возможности индукции восстановительной регенерации миокарда путём интраоперационного применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга у больных при операциях аортокоронарного шунтирования (Шумаков В.И., и др. 2009). Между тем, возможность регуляции иммунного гомеостаза и профилактики при этом иммунозависимых осложнений с помощью культивированных мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга у этих больных не были изучены и подобных работ в литературе мы не обнаружили.
Цели и задачи исследования
Цель настоящей работы – оценить влияние применения культивированных мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга на состояние иммунного гомеостаза у больных после операций аортокоронарного шунтирования.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
- Выявить нарушения иммунного статуса у больных ишемической болезнью сердца в предоперационном периоде, предрасполагающие к развитию иммунозависимых осложнений (инфекционных осложнений и полиорганной недостаточности).
- Установить роль фактора культивирования мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга на их иммунорегуляторную активность.
- Изучить влияние трансплантации культивированных аутологичных клеток костного мозга, на состояние иммунного статуса больных ишемической болезнью сердца и на регуляцию их противомикробной резистентности в послеоперационном периоде.
- Изучить влияние культивированных мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга на частоту и риск возникновения иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде.
Настоящее исследование было проведено в рамках государственного контракта № 02.435.11.3019 от «02» сентября 2005 г. «Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы», а также в соответствии с Приказом Минздравсоцразвития РФ от 20.05.2009г. №257 по теме НИР «Научное обоснование и разработка клеточных трансплантационных технологий для применения в медицинской практике», зарегистрированной в ВНТИЦ (регистрационный № 0120.0 505699, от 08.06.05) по теме «Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности». Срок выполнения работы 01. 2005 – 12. 2010 годы.
Научная новизна
Разработан новый метод иммунокоррекции, эффект которого реализуется путём активации адаптивно-приспособительных реакций больного в предоперационном периоде (во время забора костного мозга) и усиления этих реакций путем адоптивного переноса культивированных мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга больному во время операции. Показано, что культивирование мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга перед применением является важным этапом повышения их иммунорегуляторной активности, о чём свидетельствует накопление в культуральной среде противовоспалительных цитокинов (TGF-, G-CSF и IL-10), изменение фенотипического состава этих клеток и повышение их антистрессорной устойчивости, измеренной хемилюминесцентным методом.
Впервые теоретически обоснована и клинически доказана целесообразность интраоперационного применения культивированных аутологичных клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) для профилактики иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных без индивидуального подбора иммунокорректоров (патент на изобретение № 2326679 «Способ профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных в послеоперационном периоде», зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.06.2008), т.к. по результатам иммунологического обследования в предоперационном периоде до 85% кардиохирургических больных имеют выраженный дефицит противоинфекционной защиты, а 57,2% - 85% больных имеют выраженный дефицит функциональной активности клеточного звена иммунитета. Показано, что применение клеток костного мозга сопровождается снижением количества и рисков развития послеоперационных иммунозависимых осложнений, а также длительности госпитального периода.
Установлено, что при осложненном течении послеоперационного периода (инфекционные осложнения и органные дисфункции) применение мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга у оперированных больных способствует коррекции иммунного статуса: нормализации показателей клеточного звена иммунитета (особенно Т-клеточного звена) и показателей фагоцитоза.
Установлено, что при интраоперационном введении клеток костного мозга повышалась противоинфекционная резистентность тканей организма и это выражалось в снижении спектра высеваемых микробных клеток, а также в снижении степени контаминации раневых поверхностей и клинически значимых субстратов (кровь, отделяемое трахеи).
Высказана гипотеза, что активизация процессов восстановительной регенерации в поврежденных органах, возникающая при использовании стволовых/прогениторных клеток костного мозга, а также коррекция иммунного гомеостаза происходят за счёт восстановления иммунной регуляции этих процессов.
Практическая значимость работы
Предложен новый немедикаментозный метод иммунокоррекции, основанный на активации адаптивно-приспособительных реакций организма с помощью современных клеточных технологий. Показано, что этот метод эффективен для профилактики послеоперационных иммунозависимых осложнений (инфекционных осложнений, полиорганной недостаточности) и его целесообразно осуществлять используя культивированные мононуклеарные клетки аутологичного костного мозга.
Применение клеток костного мозга способствует повышению противоинфекционной защиты организма, что выражается в уменьшении спектра высеваемых микробных клеток и степени контаминации раневых поверхностей, а также в повышении чувствительности флоры к антибиотикам. Коррекция иммунного статуса при этом достигается за счёт восстановления показателей клеточного звена иммунитета, показателей фагоцитоза и за счёт позитивной динамики некоторых показателей гуморального иммунитета, которые начинают проявляться уже в раннем послеоперационном периоде и предопределяют гладкое течение послеоперационного периода, а также сокращение сроков пребывания больных в стационаре.
При использовании предложенного метода иммунокоррекции необходимо осуществлять предварительное культивирование мононуклеарных клеток костного мозга (до 5 – 7 суток) больного, в процессе которого, происходит восстановление их сниженной иммунорегуляторной активности, обусловленной предсуществующим вторичным иммунодефицитом.
Апробация диссертации
Апробация диссертации состоялась 16 июня 2010г. на заседании объединённой научной конференции клинических, экспериментальных отделений и лабораторий ФГУ «ФНЦ ТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ.
Материалы и основные положения работы доложены и обсуждены: на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, ноябрь 2004г.); на XII Всероссийском съезде сердечно-сосудистых хирургов (Москва, 2006г.); на Ежегодных Всероссийских и международных научных конференциях «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва май 2006г, май 2007г.); на III Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», (Москва, ЦИТО, апрель 2007г.); на IV Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, ноябрь 2008г.); на Всероссийской конференции «Инфекции в трансплантологии» (Москва, декабрь 2009г.); на V Всероссийском съезде трансплантологов, (Москва, октябрь 2010г)
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рецензируемых ВАК, и глава в коллективной монографии. Получен патент на изобретение № 2326679 «Способ профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных в послеоперационном периоде», зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.06.2008.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава I), характеристики больных и методов исследования (Глава II), результатов собственных исследований (Глава III), обсуждения (Глава IV), выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 231 источников, из них 113 отечественных и 118 зарубежных авторов. Работа представлена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 26 таблицами и 15 рисунками. Имеет приложение на 40 страницах, в котором содержится 8 рабочих таблиц и 12 рисунков.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Общая характеристика клинического материала и методов исследования.
Изучение эффективности профилактики иммунозависимых осложнений с помощью аутологичных клеток костного мозга проводилось нами на основании анализа данных историй болезни больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) и хронической сердечной недостаточностью (ХСН) (n=130), которым выполнялась операция аортокоронарного шунтирования (АКШ) в отделении коронарной хирургии и трансплантации сердца ФГУ «ФНЦ ТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития РФ за период с 2004 по 2007 гг (зав. отделением профессор Казаков Э.Н.).
Среди больных основной группы было 126 мужчин и 4 женщины в возрасте от 38 до 77 лет, средний возраст составил 57,6±0,7 лет с ХСН II-III функционального класса (ФК) сердечной недостаточности (СН) по NYHA. По степени выраженности СН по NYHA: у 68,8% больных был II ФК, у 26,3% больных – III ФК; по степени выраженности стенокардии распределение больных было следующим: безболевая ишемия – 10,5%, III ФК – 57,8%, IV ФК – 31,5%; по степени выраженности хронической недостаточности кровообращения (НК) – 1-2А-2Б стадий, а именно НК1 – 10 %, НК2А – 56,6% и НК2Б – 33,4%.
Все больные были разделены на две группы.
В состав I группы вошло 78 больных, из них 76 мужчин и 2 женщины. Средний возраст этих больных составил 56,2±0,97 лет. Им выполняли операцию АКШ в сочетании с интрамиокардиальным введением мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга (ККМ) в количестве 300 – 500*106 клеток: группа АКШ+ККМ.
В состав II группы (группа сравнения к I группе) вошло 52 больных, из них 50 мужчин и 2 женщины. Средний возраст этих больных составил 59,6±0,9 лет. Им выполняли операцию АКШ без применения мононуклеарной фракции аутологичных ККМ: группа АКШ.
Таблица 1.
Сравнительная характеристика исходного состояния больных и операционных факторов, влияющих на течение послеоперационного периода в группах АКШ + ККМ и АКШ.
| Показатель | АКШ+ККМ, n=78 | АКШ, n=52 | р |
| Возраст, лет | 56,2±0,9 | 59,6±0,9 | 0,019 |
| Пол, n (%) муж. жен. | 76 (97,4) 2 (2,6) | 50 (96,2) 2 (3,8) | >0,05 |
| Сопутствующие заболевания n (%) Очаги хронической инфекции n (%) | 75 (96) 59 (75,6) | 51 (98) 33 (63,5) | >0,05 >0,05 |
| ФК СН по NYHA | 2+0,6 | 2+0,7 | >0,05 |
| ФК стенокардии | 3+0,8 | 2,5+0,8 | >0,05 |
| Время ИК>180 мин. n (%) | 8 (10,3) | 10 (19,2) | >0,05 |
| Время ИК, мин. | 134,7±3,6 | 146,2±5,9 | >0,05 |
| Время пережатия аорты, мин. | 84,1±2,9 | 92,9±4,6 | >0,05 |
Эти две группы больных достоверно не различались по полу, основному заболеванию, сопутствующим хроническим заболеваниям, по функциональному классу ХСН, функциональному классу стенокардии, а также по типу оперативного вмешательства (в I группе 5 больным дополнительно было выполнено протезирование клапанов сердца, однако различия по этому критерию были недостоверны), продолжительности ИК и ишемии миокарда (таблица 1).
Однако больные в сравниваемых группах различались по возрасту и это потребовало при сравнении частотных и числовых показателей в сравниваемых группах и степени достоверности их различий – рассчитывать не только коэффициент корреляции номера группы с числовыми показателями, но и частный коэффициент корреляции под контролем возраста. Результаты обработки полученных данных в этих группах не подтвердили их зависимость от несбалансированности групп по возрасту.
В пред и послеоперационном периоде у всех больных проводилось клиническое обследование, которое включало: общеклинические, лабораторные, инструментальные и специальные (кардиологические) методы исследования.
Общеклинические исследования включали клинический анализ крови и мочи, изучение свертывающей системы крови и развернутый анализ биохимических показателей.
Микробиологические исследования включали: посев культур из носоглотки, крови и мочи на бактериальную, вирусную и грибковую микрофлору.
Инструментальные методы исследования включали: рентгенографическое исследование органов грудной клетки, гастроскопическое исследование, ультразвуковое исследование печени, желчного пузыря, поджелудочной железы и почек.
Методы оценки кардиологического статуса больных включали: электрокардиографическое, эхокардиографическое и доплер-эхокардиографическое исследование; зондирование правых и левых отделов сердца, коронарографию, рентгеноконтрастную вентрикулографию, радиоизотопные исследования сердца и др.
Методы иммунологического исследования клеток крови и костного мозга больных включали: проведение стандартных тестов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения (Петров Р.В., и др. 1992), которые выполнялись в соответствии с разработанной схемой иммунологического обследования, адекватной для диагностики типа и степени вторичной иммунной недостаточности у больных.
Состояние клеточного звена иммунитета оценивали по количественному содержанию лейкоцитов, относительному (%) и абсолютному (в 1 мкл) содержанию лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3+-клетки), их иммунорегуляторных субпопуляций Т-хелперов (CD4+-клетки) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+-клетки), иммунорегуляторному индексу (ИРИ=СD4+/CD8+), а также относительному содержанию натуральных киллеров (CD16+/56+-клетки) с использованием комбинации моноклональных антител (МКАТ), меченных FITC и фикоэритрином (РЕ) (НПЦ «МедБиоСпектр» и «Сорбент»).
Функциональная активность клеточного звена иммунитета оценивалась по количеству Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор к интерлейкину-2 (CD25+-клетки) и антигены II класса гистосовместимости HLA-DR (HLA-DR+-клетки), а также по числу пролиферирующих клеток (CD71+-клетки). Определяли также CD95+-клетки, экспрессирующие ранний маркер апоптоза (FAS APO I). Иммунофенотипирование проводили на проточном цитофлуориметре FACScan фирмы Becton Dickinson (США) (Пинегин Б.В., Ярилин В.А., 2001) и с помощью проточного цитофлуориметра Cytomics FC 500 фирмы Beckman Coulter США.
Оценка гуморального звена иммунитета включала измерение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов (CD19+-клетки) иммунофлюоресцентным методом, определение концентрации иммуноглобулинов классов G, А, М в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии в геле (Manchini et al., 1965), а также определение уровня низкомолекулярных (осаждение 6% ПЭГ) циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (Новиков Д.К., 1996).
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли стандартным методом с использованием убитой взвеси St.аureus (Фрейдлин И.С., 1986), подсчитывая число фагоцитирующих клеток на 100 нейтрофилов (фагоцитарный индекс, %), количество микробных тел, поглощенных в среднем одним нейтрофилом (фагоцитарное число).
При поступлении перед забором клеток костного мозга и до операции, т.е. через 5-7 суток после забора клеток костного мозга проводилось исследование антистрессорной устойчивости лейкоцитов крови больных, путём измерения индекса стимуляции методом хемолюминесценции по Темнову А.А. и Онищенко Н.А. (2007).
Общий объём выполненных клинических и лабораторных исследований, включённых в статистическую обработку, представлен в таблице 2.
Таблица 2.
Общее количество клинических и лабораторных исследований.
| Вид лабораторных исследований | Количество больных | Количество выполненных исследований |
| 1. Клинические анализы крови: Формула крови Биохимия крови | 130 | Более 1000 |
| 2. Микробиологические исследования (посевы): Из крови Из трахеи Из раны | 12 | 17 20 66 |
| 3. Иммунологическое обследование Кровь больных Кровь здоровых доноров | 47 25 | Более 750 |
| 4. Выделение, культивирование и подготовка ККМ для трансплантации | 78 | 78 |
| 5. Исследование цитокинов в среде после культивирования клеток костного мозга | 10 | 30 |
| Всего | Более 1960 |
Послеоперационные иммунозависимые осложнения у больных, оценивали по следующим показателям: частота развития послеоперационных инфекционных осложнений (ПИО); летальность, ассоциированная с инфекцией (ЛАИ); тяжесть инфекции (ТИ), которая рассчитывалась, как отношение количества больных, умерших от инфекции, к общему числу больных с инфекционными осложнениями; клиническую диагностику развития полиорганной дисфункции/недостаточности (ПОН) проводили по классификации предложенной Чаленко В.В. (1998), которая учитывает 4 степени нарушения функций каждой системы организма (удовлетворительная функция, компенсированная недостаточность, декомпенсированная недостаточность, несостоятельность).
Технология получения, подготовки и применения мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга включала: получение костномозговой взвеси клеток (50-100мл) в предоперационном периоде (за 5-7 суток до операции) из подвздошной кости под местной анестезией в условиях операционной, причём процедура забора клеток костного мозга вызывала модуляцию иммунорегуляторных реакций в организме (повышение и понижение содержания лимфоцитов в крови в среднем на 7,6% и 8,1% соответственно); выделение и культивирование мононуклеарных ККМ в асептических условиях в ламинарном боксе с использованием чашек Петри и посевом клеток в концентрации 2,5-3*106 кл/мл сроком на 5-7 суток; подготовку взвеси аутологичных ККМ для трансплантации больному. О повышении иммунорегуляторной активности культивированных клеток костного мозга судили по накоплению противовоспалительных цитокинов в культуральной среде и по изменению фенотипического состава мононуклеарных клеток после культивирования. Активированные клетки трансплантировали интрамиокардиально и интракоронарно, т.к. изучение иммунокорригирующей активности этих клеток у больных с АКШ проводилось по заказу Минздравсоцразвития РФ (регистрационный номер 0120.0 505699 от 08.06.05) в рамках темы: «Трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности», срок выполнения работы 01. 2005 – 12. 2010 годы.
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ SPSS 11.0.
При статистическом анализе фактических данных рассчитывали частоты встречаемости и достоверность различий частот при помощи критерия «хи-квадрат». Частотные диаграммы приводили с 95% доверительными интервалами (Герасимов А.Н. 2007). Распределение числовых показателей в подгруппах сравнивали при помощи непараметрических критериев Колмогорова-Смирнова и Манна-Уитни. Достоверность различий числовых показателей сравниваемых групп определяли при помощи критериев Стъюдента и дисперсионного анализа.
При недостаточном количестве наблюдений и некомпактности распределения значений, когда использование асимптотических критериев, было неправомочно (Герасимов А.Н. 2007), использовали аналогичные непараметрические методы. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
В связи с тем, что средний возраст в сравниваемых группах был неодинаков, то при оценке различий исследуемых величин между группами рассчитывали не только коэффициенты корреляций числовых показателей с номером группы, но также частный коэффициент корреляции под контролем возраста.
Результаты исследования
Характеристика состояния иммунной системы у больных до и после АКШ. Значение интраоперационного введения ККМ для коррекции иммунного гомеостаза.
Из 130 больных, поступивших на операцию АКШ, предоперационный иммунный статус был изучен у 47 больных. У этих больных исследовали популяционный состав лимфоцитов, состояние клеточного иммунорегуляторного звена, показатели гуморального иммунитета и фагоцитарной активности нейтрофилов. Контролем служили здоровые доноры крови (n=25). Сравнивая популяционный состав лимфоцитов у кардиохирургических больных была обнаружена тенденция к снижению суммарного содержания лимфоцитов, Т и В-лимфоцитов, однако содержание NK –клеток у этих больных было достоверно повышено (29,1±4,3% против 12,7±2,8% у здоровых доноров крови, р<0,011).
Среди показателей клеточного иммунорегуляторного звена отмечалась тенденция к снижению CD4 и CD8, и к повышению иммунорегуляторного индекса (2,9±0,4 против 1,9±0,1 у здоровых доноров крови, р=0,076 ).
Показатели гуморального иммунитета (В – лимфоциты, IgG, IgA, IgМ,) практически не отличались от контроля, однако содержание циркулирующих иммунных комплексов было достоверно выше – 579±94,5 усл. ед. против 300±10 усл. ед. у здоровых доноров крови, р=0,038.
При изучении фагоцитарной активности нейтрофилов было выявлено достоверное снижение их функциональной активности. Мы установили, что у больных в предоперационном периоде уже снижен фагоцитоз 35,8±5,4% против 75±5% у здоровых доноров крови, р<0,001 т.е. снижено количество нейтрофилов, захватывающих микробные клетки, а также снижен фагоцитарный индекс – 2±0,3 против 5,5±1,5 у здоровых доноров крови, р<0,004, который свидетельствует таким образом о снижении количества микробных клеток в фагоцитах по сравнению с контролем. Полученные данные свидетельствовали о снижении в организме больных в предоперационном периоде, прежде всего, противоинфекционной защиты.
Для выяснения причин отсутствия достоверных различий среди основных показателей клеточного и гуморального звена иммунитета, мы провели исследование этих показателей, разбив их на три группы, чтобы установить процент больных с повышенными, пониженными и нормальными значениями исследуемых показателей.
Было установлено, что среди больных в предоперационном периоде были больные с нормальными, с повышенными, а также с пониженными значениями показателей клеточного и гуморального звена. Наиболее часто встречались больные с повышенными показателями нейтрофилов, NK-клеток, IgG, IgA, ЦИК, IL2R. Наиболее часто пониженные показатели встречались у больных при изучении общих лимфоцитов: Т-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8), ИРИ, В-лимфоцитов, IgМ, фагоцитоза и фагоцитарного индекса. Эти исследования, свидетельствующие о нарушении распределения иммунологических показателей среди больных, заставляют признать, что у оперирующихся больных имеет место не только выраженный дефицит противоинфекционной защиты (до 85% больных), но и выраженный дефицит функциональной активности клеточного звена иммунитета (от 57,2% до 85% больных), что указывает на возможность развития у них органных дисфункций и инфекционных осложнений в послеоперационном периоде, тем более, что сама операция в условиях искусственного кровообращения усугубляет эти нарушения.
Для оценки целесообразности применения ККМ с целью коррекции иммунного статуса у больных нами были изучены особенности иммунного статуса у больных в группах АКШ и АКШ+ККМ в раннем послеоперационном периоде (1–17 сутки), когда отчётливо проявляется возникновение иммунодефицитного состояния, наступает развитие инфекционных осложнений и когда начинает проявляться иммунорегуляторное действие ККМ. Нами анализировались показатели клеточного и гуморального звена иммунитета, а также показатели фагоцитоза у выживших и умерших больных, имеющих осложнённое течение послеоперационного периода (послеоперационные инфекционные осложнения и полиорганная дисфункция). При сравнительном изучении этих двух групп больных особый интерес представляло изучение показателей иммунитета у выживших больных, у которых могли быть выявлены корригирующие механизмы воздействия ККМ на иммунный статус. В таблицах 3 и 4 представлены показатели клеточного иммунитета и фагоцитоза у выживших и умерших больных в группах АКШ и АКШ+ККМ при осложнённом течении послеоперационного периода.
Таблица 3.
Характеристика показателей клеточного звена иммунитета у больных в группах АКШ и АКШ+ККМ при осложнённом течении послеоперационного периода.
| Показатель | После АКШ (группа сравнения 1-17 сутки п/о, n=12) | После АКШ+ККМ (исследуемая группа 1-17 сутки п/о, n=3) | Норма | |||||||
| Выжившие (n=7) | Умершие (n=5) | Выжившие (n=3) | Умершие (n=0) | |||||||
| % | мкл | % | мкл | % | мкл | % | мкл | % | мкл | |
| Лейкоциты | 11440±898* | 9844,4±767 | 7061,1±805 | 0 | 4000-9000 | |||||
| Лимфоциты | 13,1* ±1,47 | 1364 ±184 | 11,2 ±1,34* | 1073,2 ±149 | 28 ±4,5 | 1737,8 ±199 | 0 | 0 | 19-39 | 1800-2500 |
| Т-лф (CD3+) | 35,2 ±3,7* | 486,3 ±88 | 43,1 ±2,5* | 672,9 ±114 | 63,1 ±3,5 | 941,4 ±184 | 0 | 0 | 60-75 | 1100-1700 |
| Тх (CD4+) | 21,3 ±2,3* | 152,7 ±32 | 24,8 ±3* | 267,7 ±96 | 39,8 ±4,4 | 396,8 ±100 | 0 | 0 | 39-50 | 600-700 |
| Тс/ц (CD8+) | 12,2 ±1,6* | 97,7 ±22* | 16,8 ±2,1 | 129,6 ±31 | 24,3 ±0,2 | 270,2 ±59 | 0 | 0 | 29-45 | 270-350 |
| ИРИ (CD4/CD8) | 2,3±0,2 | 1,5±1,3 | 2,1±0,3 | 0 | 1,8-2,0 | |||||
| NK (CD16+) | 7,6 ±2,1 | 105,1 ±37 | 8,1 ±1,7 | 111,8 ±20 | 12,3 ±2,9 | 196,4 ±62 | 0 | 0 | 8-17 | 88-290 |
*- р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у выживших больных в группе АКШ+ККМ
Из таблицы 3 видно, что у больных в группе АКШ+ККМ имеют место достоверно более низкие значения показателей лейкоцитоза, более высокое общее содержание лимфоцитов, Т-лимфоцитов, Тх и Тс/ц, по сравнению с выжившими больными в группе АКШ. Эти результаты указывают на способность мононуклеарных ККМ корригировать клеточное звено иммунитета, которое, как мы полагаем, должно способствовать снижению количества и тяжести органных дисфункций у больных, т.к. Т – клеточное звено иммунитета ответственно за реализацию восстановительных процессов в органах (Бабаева А.Г. 2009).
Таблица 4.
Характеристика показателей фагоцитоза у больных в группах АКШ и АКШ+ККМ при осложнённом течении послеоперационного периода.
| Показатель | После АКШ группа (сравнения 1-17 сутки п/о, n=12) | После АКШ+ККМ (исследуемая группа 1-17 сутки п/о, n=3) | Норма | ||
| Выжившие (n=7) | Умершие (n=5) | Выжившие (n=3) | Умершие (n=0) | ||
| Фагоцитоз % | 38±3,4* | 52,3±5,7 | 59,6±5,9 | 0 | 70-80 |
| Фаг. индекс, микробн. тел | 2,7±0,2 | 2,7±0,2 | 3,4±0,3 | 0 | 4-7 |
| НСТ-спонт., у.е. | 345±65 | 368±140 | 190±98 | 0 | 80-99 |
| НСТ-индуц., у.е. | 349±69 | 452±150 | 218±74 | 0 | 130-152 |
*- р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем у выживших больных в группе АКШ+ККМ
Более низкие значения показателей лейкоцитоза и позитивная динамика показателей фагоцитоза (табл. 4) также должны были служить предикторами снижения частоты развития инфекционных осложнений в группе АКШ+ККМ. Коррекцию показателей фагоцитоза и клеточного звена иммунитета мы связываем с повышением антистрессорной устойчивости лейкоцитов крови больных после введения активированных мононуклеарных клеток костного мозга больным во время операции. У умерших больных в группе АКШ показатели фагоцитоза и клеточного звена иммунитета либо изменялись недостоверно, либо даже ухудшались, что подтверждало выявленную нами у этих больных ареактивность (несостоятельность) иммунной системы. Показатели гуморального иммунитета в двух группах выживших больных достоверно не различались.
Выявленные нами различия в иммунном статусе больных в группе АКШ и АКШ+ККМ с осложнённым течением послеоперационного периода потребовали оценить состояние неспецифической резистентности больных этих двух групп к действию возбудителей инфекционных осложнений.
Характеристика противоинфекционной резистентности больных после АКШ (в группах АКШ и АКШ+ККМ)
Достоверное повышение показателей фагоцитоза и улучшение показателей клеточного звена иммунитета, у больных в группе АКШ+ККМ по сравнению с больными в группе АКШ позволило предположить, что забор и введение активированных клеток костного мозга должно вести к формированию в организме противоинфекционной резистентности и это должно найти отражение: в меньшей частоте высевов микробных клеток из клинически значимых субстратов (кровь, трахея, рана), в меньшем спектре высеваемых возбудителей, а также в меньшем количестве высевов каждого возбудителя из клинически значимых локусов.
Таблица 5.
Возбудители послеоперационных инфекционных осложнений, высеваемые из организма больных в группах АКШ и АКШ+ККМ
| Возбудители \ Группа | Количество наблюдений | р | ||
| АКШ+ККМ n=78 | АКШ n=52 | Всего n=130 | ||
| S. aureus* | 0 | 4 | 4 | 0,024 |
| S. epidermidis | 1 | 4 | 5 | >0,05 |
| S. saprophyticus | 0 | 1 | 1 | >0,05 |
| S. haemolyticus | 0 | 1 | 1 | >0,05 |
| COS | 0 | 2 | 2 | >0,05 |
| Micrococcus spp | 0 | 1 | 1 | >0,05 |
| Streptococcus spp | 1 | 2 | 3 | >0,05 |
| Streptococcus mitis | 1 | 0 | 1 | >0,05 |
| Enterococcus spp | 0 | 1 | 1 | >0,05 |
| Enterococcus faеcalis* | 0 | 5 | 5 | 0,009 |
| Candida | 1 | 2 | 3 | >0,05 |
| Pseudomonas aeruginosa* | 0 | 4 | 4 | 0,024 |
| Flavimonas oryzihabitans | 0 | 1 | 1 | >0,05 |
| НФГОБ | 0 | 2 | 2 | >0,05 |
| Кол-во высевов всего | 4 | 30 | 34 | <0,001 |
Проведенные микробиологические исследования у всех больных с инфекционными осложнениями в послеоперационном периоде (n=12) подтвердили, что из большого перечня возбудителей (таблица 5) в группе АКШ (n=9) возбудители инфекционных осложнений высевались до 30 раз, тогда как в группе АКШ+ККМ (n=3) возбудители инфекционных осложнений высевались только 4 раза.
Подтверждением меньшей частоты и степени инфицирования клинически значимых локусов при использовании ККМ служит также сужение спектра высеваемой микрофлоры (таблица 6), снижение количества высеваний микрофлоры на каждого инфицированного больного из клинически значимых локусов (кровь, трахея и рана), а также более низкая степень контаминации раневой поверхности и сниженная потребность в назначении антибиотиков у больных в группе АКШ+ККМ по сравнению с группой АКШ.
Таблица 6.
Спектр выделяемой микрофлоры из разных биосубстратов у больных в группах АКШ и АКШ+ККМ
| Группы | Кровь | Трахея | Рана |
| АКШ+ККМ | S. mitis | Candida | S. epidermidis, Streptococcus spp |
| АКШ | Pseudomonas aeruginosa, S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus, Micrococcus spp. Streptococcus spp, E. faеcalis, Candida | Pseudomonas aeruginosa, Flavimonas oryzihabitans, НФГОБ, S. epidermidis, E. faеcalis, Enterococcus spp, Candida, Bacillus cereus | Pseudomonas aeruginosa, НФГОБ, S. aureus, S. epidermidis, COS, Streptococcus spp, E. faеcalis |
Коррекция иммунного статуса и выраженное повышение противоинфекционной резистентности больных в группе АКШ+ККМ привели к позитивным изменениям в клиническом состоянии этих больных, что выразилось достоверным снижением числа иммунозависимых осложнений (послеоперационные инфекционные осложнения и полиорганная недостаточность) в группе больных с интраоперационным введением клеток костного мозга.
Характеристика иммунозависимых осложнений у больных после АКШ (без и с введением ККМ)
В анализируемой нами общей группе больных (n=130) иммунозависимые осложнения в послеоперационном периоде возникли у 15 больных (11,5%), а суммарное количество иммунозависимых осложнений составило 20 (15,4%) Среди 15 больных с осложнённым течением послеоперационного периода 5 больных умерло, из них у 2 больных имела место полиорганная недостаточность, которая сочеталась с инфекционными осложнениями, а у 3 больных была только полиорганная недостаточность. Причём во всех наблюдениях гибель больных наступала на фоне развития несостоятельности иммунной системы (р=0,017).
При изучении эффективности использования клеток костного мозга для профилактики развития иммунозависимых осложнений нами был проведен раздельный анализ этих осложнений в группах АКШ и АКШ+ККМ.
Было установлено, что послеоперационные иммунозависимые осложнения (инфекционные осложнения, полиорганная недостаточность и их сочетание) развивались в обеих группах, но в группе АКШ+ККМ их возникновение было достоверно ниже (р=0,012 и р=0,06 соответственно). Проведенный расчёт относительных рисков развития иммунозависимых осложнений в обеих группах также подтверждает их достоверное снижение в группе АКШ+ККМ. Между тем, различия в летальности, ассоциированной с инфекцией, и различия по тяжести инфекции у больных в этих двух группах отсутствовали.
Сравнивая средние сроки пребывания выживших больных в стационаре в группах АКШ и АКШ+ККМ мы установили, что у больных в группе АКШ+ККМ, сроки пребывания с стационаре были достоверно меньше, чем у больных в группе АКШ и составили 14,6±0,58 суток, против 21,36±2,24 суток (р<0,05) соответственно.
Достоверно более длительные средние сроки пребывания в стационаре выживших больных после АКШ мы связали с большей частотой развития у этих больных иммунозависимых осложнений, таких как полиорганная недостаточность и послеоперационные инфекционные осложнения. В связи с этим мы провели анализ сроков пребывания больных в стационаре в группах АКШ и АКШ+ККМ в зависимости от развития у них этих осложнений в послеоперационном периоде.
Сравнивая влияние развития полиорганной недостаточности на среднюю длительность пребывания выживших больных в стационаре, было установлено, что при развитии полиорганной недостаточности средняя продолжительность госпитального периода в группе АКШ составила 28,5±4,5 суток, а в группе АКШ+ККМ – 14 суток (р=0,004). У больных с развитием послеоперационных инфекционных осложнений длительность госпитального периода в группе АКШ составила 38,7±5,73 суток, а в группе АКШ+ККМ – 22,7±7,7 суток (р<0,001). Длительность пребывания больных в стационаре в сравниваемых группах без полиорганной недостаточности составила в группе АКШ – 21,02±2,3 суток, а в группе АКШ+ККМ – 14,57±0,58 суток (р<0,001); без послеоперационных инфекционных осложнений средняя длительность госпитального периода в группе АКШ составила 18,2±2,8 суток, а в группе АКШ+ККМ – 14,24±0,51 суток (р=0,018).
Выявленное нами достоверное снижение иммунозависимых осложнений (послеоперационные инфекционные осложнения и полиорганная недостаточность) в группе АКШ+ККМ, а также достоверное снижение сроков госпитального периода в этой группе позволяют нам предположить, что этот эффект в группе АКШ+ККМ достигается за счёт повышения резистентности больных к операционному стрессу путём регуляции иммунного гомеостаза, в том числе путём повышения противоинфекционной резистентности организма этих больных.
Выводы
1. У больных с ишемической болезнью сердца в предоперационном периоде отмечаются нарушения показателей клеточного и гуморального иммунитета, а также показателей фагоцитоза различной степени выраженности, которые могут являться предикторами развития иммунозависимых осложнений (послеоперационных инфекционных осложнений, полиорганной недостаточности) в послеоперационном периоде.
2. Повышение иммунорегуляторной активности клеток костного мозга, используемых для коррекции иммунитета у больных с ишемической болезнью сердца, достигается их предварительным культивированием в течение 5-7 суток и выражается в изменении спектра цитокинов выделяемых ими в культуральную среду и их фенотипического состава.
3. При трансплантации культивированных клеток костного мозга во время операций аортокоронарного шунтирования, отмечается нормализация показателей фагоцитоза, клеточного и гуморального звеньев иммунитета, стабилизация иммунорегуляторного индекса и повышение противоинфекционной резистентности: (достоверное сужение спектра высеваемых возбудителей и снижение степени контаминации раневых поверхностей), что клинически подтверждает коррекцию нарушений иммунного гомеостаза.
4. Коррекция иммунного статуса создаёт условия для более благоприятного течения госпитального периода у больных после аортокоронарного шунтирования, что проявляется в достоверном сокращении длительности госпитального периода на 4,9 суток, в снижении частоты развития послеоперационных инфекционных осложнений на 13,5% и полиорганных дисфункций на 12,2%.
5. Трансплантация культивированных аутологичных клеток костного мозга достоверно снижает риск возникновения инфекционных осложнений и полиорганных дисфункций в послеоперационном периоде по сравнению с больными без применения клеток, что позволяет рассматривать её в качестве альтернативного способа иммунокоррекции и профилактики иммунозависимых осложнений.
Практические рекомендации
1. Для прогнозирования возможности развития иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде - в предоперационном периоде должна быть проведена оценка иммунного статуса больных.
2. У больных с признаками предсуществующего вторичного иммунодефицита показана иммунокоррекция, которая может быть осуществлена путём применения аутологичных клеток костного мозга во время операции.
3. Для восстановления сниженного иммунорегуляторного потенциала аутологичных клеток костного мозга необходимо осуществлять их предварительное культивирование (активирование) в течение 5-7 суток.
4. Контроль эффективности иммунокоррекции при использовании аутологичных клеток костного мозга необходимо осуществлять, ориентируясь на динамику показателей Т-клеточного звена иммунитета, фагоцитоза и антимикробного потенциала.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Шумаков В.И, Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Темнов А.А., Остроумов Е.Н., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Никольская А.О., Шумаков Д.В. Клеточная трансплантация.// Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», 2006г., №4, с. 94-102.
2. Темнов А.А., Габриэлян Н.И., Никольская А.О., Савостьянова О.А., Сускова В.С., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Васильев К.Н., Сухачев А.А., Сибякина А.А. Транспозиция культивированных клеток аутологичного костного мозга способствует профилактике и лечению иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных.// Ж. «Патологическая физиология и экспериментальная терапия», 2007г., №2, с.7-9.
3. Онищенко Н.А., Темнов А.А., Никольская А.О. Участие системы крови и иммунной системы в формировании адаптационной стратегии организма. (Глава 1) в монографии – Биологические резервы клеток костного мозга и коррекции органных дисфункций. Под редакцией академика Шумакова В.И., профессора Онищенко Н.А. – М.: Лавр, 2009г., – с. 15-48.
4. Темнов А.А., Шумаков В.И., Никольская А.О., Габриэлян Н.И., Савостьянова О.А., С.В.Гуреев, Онищенко Н.А. Трансплантация аутологичных клеток костного мозга снижает частоту осложнений у больных после операции аортокоронарного шунтирования.// Ж. «Бюллетень НЦССХ им. А.Н.Бакулева РАМН», 2006г., Том VII, №3 с. 48
5. Темнов А.А., Никольская А.О., Габриэлян Н.И., Савостьянова О.А., С.В. Гуреев, Онищенко Н.А., Васильев К.Н., Сухачев А.А. Использование аутологичных клеток костного мозга для профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных.// Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», Москва 24-25 мая 2006г. с. 83.
6. Темнов А.А., Артамонов С.Д., Никольская А.О., Новиков В.К., Башкина Л.В., Онищенко Н.А. Трансплантация мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга восстанавливает взаимосвязь иммунного статуса, соматического состояния и качества жизни больных с хроническими заболеваниями внутренних органов.// Сборник тезисов с Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», Москва 24-25 мая 2006г. с. 84.
7. Темнов А.А., Никольская А.О., Башкина Л.В., Гуреев С.В., Онищенко Н.А., Сухачев А.А., Васильев К.Н. Предварительная иммунокоррекция и культивирование клеток костного мозга повышают функциональную активность и изменяют фенотипический состав мононуклеарной фракции клеток костного мозга у больных с хронической патологией.// Сборник тезисов Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении»; Москва 30-31мая 2007г., с.109-110
8. Никольская А.О., Габриэлян Н.И., Темнов А.А., Онищенко Н.А., Гуреев С.В.
Интрамиокардиальное введение аутологичных клеток костного мозга снижает частоту иммунозависимых осложнений и повышает качество жизни больных после операции аортокоронарного шунтирования.// Материалы III Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, ЦИТО, 25-26 апреля 2007г., с. 177-178.
9. Никольская А.О., Савостьянова О.А., Спирина Т.С., Онищенко Н.А., Темнов А.А., Гуреев С.В., Габриэлян Н.И. Интраоперационное применение аутологичных клеток костного мозга снижает частоту и тяжесть инфекционных осложнений у больных при аортокоронарном шунтировании в послеоперационном периоде.// IV Всероссийский съезд трансплантологов памяти академика В.И. Шумакова Москва, 9-10 ноября 2008г., с. 261
10. Никольская А.О., Савостьянова О.А., Спирина Т.С., Башкина Л.В., Онищенко Н.А., Темнов А.А., Гуреев С.В., Габриэлян Н.И., Сускова В.С.
Интрамиокардиальное применение аутологичных культивированних клеток костного мозга корригирует иммунный статус и снижает частоту инфекционных осложнений у больных при аортокоронарном шунтировании.// Материалы Всероссийской конференции «Инфекции в трансплантологии», Москва 3 – 4 декабря 2009г. Ж. «Вестник трансплантологии и искусственных органов», Том XI, Приложение с. 119-120.
11. Никольская А.О., Савостьянова О.А., Спирина Т.С., Башкина Л.В., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Габриэлян Н.И., Сускова В.С.
Интраоперационное введение культивированных клеток аутологичного костного мозга стимулирует противоинфекционную резистентность кардиохирургических больных и снижает частоту иммунозависимых осложнений в послеоперационном периоде.// Материалы V Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 8-10 октября 2010г. с. 256-257.
Патент:
«Способ профилактики и лечения иммунозависимых осложнений у кардиохирургических больных в послеоперационном периоде».// Патент на изобретение № 2326679. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.06.2008.
