Феномен криоглобулинемии, прогностическая и функциональная значимость криоглобулинов при ишемическом инсульте
На правах рукописи
Еремин Илья Игоревич
«ФЕНОМЕН КРИОГЛОБУЛИНЕМИИ, ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ КРИОГЛОБУЛИНОВ ПРИ ИШЕМИЧЕСКОМ ИНСУЛЬТЕ»
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Нэлли Александровна Константинова
Научный консультант: член-корреспондент
Российской академии медицинских наук, профессор
Вероника Игоревна Скворцова
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Галина Алексеевна Игнатьева,
Российский государственный медицинский университет Росздрава
доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич,
ММА им. И.М. Сеченова.
Ведущая организация:
ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава.
Защита состоится 15 декабря 2008 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1).
Автореферат разослан 14 ноября 2008 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Проблема церебрального ишемического инсульта сохраняет чрезвычайную медицинскую и социальную значимость в связи со значительной частотой его развития, высоким процентом инвалидизации и смертности.
В последние годы сосудистые заболевания головного мозга вышли в России на второе место после кардиоваскулярных заболеваний среди всех причин смерти населения, при этом ишемические поражения головного мозга занимают доминирующее положение в структуре цереброваскулярной патологии, составляя до 80% всех сосудистых заболеваний.
На основании проведенных работ доказана отсроченность необратимых повреждений мозга от момента развития острого нарушения мозгового кровообращения (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). В то же время, процессы, индуцированные в первые часы сохраняют свою значимость и в более поздние сроки, особенно при обширных размерах области ишемического поражения. Они индуцируют и поддерживают другие «отдаленные последствия ишемии»: реакцию генома с включением молекулярных программ, изменения астро- и микроглиального клеточных пулов и связанные с ними иммунные сдвиги, локальное воспаление в очаге ишемии, нарушения микроциркуляции и гематоэнцефалического барьера (Back T., 1994; Devuyst G., 1999).
Особо важное значение в отсроченном повреждении церебральной ткани имеют процессы апоптоза (программированной клеточной смерти) (Potaman V.N., 1991). Механизмы апоптоза обусловливают «доформирование» инфаркта мозга за счет распространения повреждения зоны пенумбры от центра ишемии к периферии, а также долговременные генерализованные изменения нейроиммунноэндокринной системы. Длительность периода «доформирования» инфарктных изменений окончательно не установлена и, по-видимому, индивидуальна. Современные иммунногистохимические и нейровизуализирующие методы свидетельствуют о возможности выживания ткани пенумбры в течение как минимум 48-72 часов после сосудистого инцидента, а возможно и дольше. Одним из ключевых механизмов является также аутоиммунная агрессия против собственных нейротрофинов и нейроспецифических белков, которая становится возможной в результате нарушения функции гематоэнцефалического барьера при ишемическом повреждении (Горбунов В.И., 1996), что усугубляет трофическую дисрегуляцию, приводя к дальнейшему повреждению ткани мозга и нарастанию размеров очага инфаркта. Современные представления о развитии ишемического инсульта подчеркивают актуальность изучения реакций аутоиммунитета и связанные с ними одним патогенетическим звеном нарушения реологических свойств крови. Результаты исследований последних лет указывают на значимое и достоверное влияние высоких концентраций аутоантител на течение острых сосудистых состояний. Длительная выработка антител запускает процессы их элиминации путем модификации строения, присоединения сигнальных молекул с изменением иммунологической реактивности, одним из таких механизмов аутоагрессии может быть выработка криоглобулинов – аутоантител с аномальными температурными свойствами, большая концентрация которых приводит к развитию криоглобулинемии (Константинова Н.А., Скворцова В.И., 2005).
В настоящее время криоглобулинемия сопровождает заболевания самой различной этиологии, однако участие и роль этих белков в патогенезе острой ишемии мозга остается невыясненной до сих пор.
Внимание к проблеме криоглобулинемии появилось в результате поисковых исследований, выполненных на кафедрах РГМУ, указавших на присутствие аномальных иммуноглобулинов с криосвойствами в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми и церебро-васкулярными заболеваниями.
Таким образом, особую актуальность приобретает иммунобиохимический и гемореологический мониторинг функциональной активности не только нервно сосудистой, но и иммунной системы в динамике, включающий в себя оценку криоглобулинов, их количество и состав, а также определение активности факторов, отвечающих за их клиренс. Проводимый с первых часов ишемии, такой мониторинг позволяет объективизировать тяжесть состояния больного, прогнозировать дальнейшее течение инсульта, оценить эффективность применяемых средств для коррекции нарушенных функций, а также индивидуализировать подход к терапии в остром периоде заболевания.
Все это определяет актуальность настоящей работы, ее цель и задачи.
Работа выполнена на базе кафедры экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, под руководством доктора биологических наук, профессора, зав. кафедрой экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета РГМУ Н.А.Константиновой.
Цель работы: Изучить феномен криоглобулинемии у больных с острой ишемией головного мозга и оценить прогностическую и функциональную значимость криоглобулинов при различных патогенетических вариантах инсульта и схемах проводимой терапии.
Задачи исследования:
- Определение содержания криоглобулинов в сыворотке крови больных с ишемическим инсультом в зависимости от его патогенетического варианта.
- Изучение динамики изменения уровня криоглобулинов в сыворотке крови больных с различными патогенетическими вариантами инсульта на протяжении всего острого периода заболевания.
- Оценка влияния селективного плазмафереза на выраженность криоглобулинемии при различных вариантах инсульта.
- Определение качественного и количественного состава криоглобулинов при различных вариантах инсульта и схемах проводимой терапии.
- Изучение роли фибронектина, как фактора опосредующего клиренс криоглобулинов.
- Оценка прогностической значимости определения концентрации криоглобулинов среди стандартно определяемых клинико-лабораторных параметров. Построение математических моделей, позволяющих прогнозировать тяжесть состояния больных с ишемическим инсультом.
Научная новизна:
- Впервые выявлена повышенная концентрация криоглобулинов в сыворотке крови больных с ишемическим инсультом.
- Впервые проведена комплексная оценка концентрации, качественного и количественного состава криоглобулинов на протяжении всего острого периода заболевания в зависимости от типа инсульта и проводимой терапии.
- Впервые исследовано влияние селективного плазмафереза на концентрацию и состав криоглобулинов у больных с различными вариантами ишемического инсульта.
- Установлена взаимосвязь между долей фибронектина в составе криокомплекса и концентрацией криоглобулинов в сыворотке крови.
- Предложен оригинальный подход к статистической обработке данных, включающий в себя математическое моделирование и определение информативности стандартно определяемых клинико-лабораторных параметров. Показана исключительная прогностическая значимость параметра концентрации криоглобулинов для прогноза степени тяжести состояния больных на протяжении всего острого периода инсульта.
Практическая значимость работы.
- Установленная взаимосвязь между концентрацией криоглобулинов и тяжестью состояния больных позволяет использовать исследование концентрации криоглобулинов в сыворотке крови больных на 1-е сутки инсульта как дополнительный тест, объективизирующий тяжесть церебральной ишемии и выраженность аутоиммунных нарушений.
- Разработаны математические модели, позволяющие дифференцировать стандартно определяемые клинико-лабораторные параметры по степени их прогностической значимости и предсказывать тяжесть состояния больных на протяжении всего острого периода инсульта.
- Предложено внесение изменений в стандартно применяемую схему проведения селективного плазмафереза для больных с кардиоэмболическим инсультом, а именно: назначение 1-2 дополнительных процедур на 2-3 неделе от дебюта ишемии.
Внедрение в практику
Результаты настоящего исследования применяются в работе неврологических отделений 20 ГКБ г. Москвы.
Основные положения, выносимые на защиту
- Острая фокальная ишемия головного мозга сопровождается появлением в крови больных криоглобулинов, концентрация которых коррелирует с тяжестью состояния больных.
- Уровень криоглобулинов в сыворотке крови больных зависит от патогенетического варианта инсульта.
- Применение селективного плазмафереза на фоне стандартной медикаментозной терапии по предложенной схеме при атеротромботическом варианте инсульта достоверно снижает выраженность криоглобулинемии, что приводит к улучшению состояния больных и приросту балла самообслуживания.
- Криокомплексы гетерогенны по своему составу независимо от типа инсульта. Динамика изменения состава криокомплексов существенно зависит от патогенетического варианта инсульта.
- Концентрация криоглобулинов в сыворотке крови обратно пропорциональна доли фибронектина в их составе.
- Концентрация криоглобулинов при атеротромботическом варианте инсульта имеет исключительную прогностическую значимость для прогноза степени тяжести состояния и функционального восстановления.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры экспериментальной и теоретической физики МБФ и кафедры фундаментальной и клинической неврологии с курсами нейрохирургии, функциональной и лабораторной диагностики ГОУ ВПО «РГМУ» Росздрава (протокол №115 от 15 мая 2007 года).
Основные результаты были доложены на научных конференциях кафедры экспериментальной и теоретической физики МБФ РГМУ; 10-м, 11-м, 13-м, 14-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»; I Российском международном конгрессе: «Цереброваскулярная патология и инсульт» 24 сентября 2003 г.; II Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии 1-3 февраля 2005 г.; Российском национальном конгрессе аллергологов и иммунологов 11-14 сентября 2006 г.
По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них 9 в центральной печати.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 23 рисунка и 5 таблиц. Работа написана по классическому плану и включает в себя введение, литературный обзор, описания материалов и методов исследования, собственные результаты и их обсуждение, статистическую обработку и математическое моделирование, заключение, выводы, практические рекомендации. Список литературы представлен 174 публикациями, из которых 111 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Общая характеристика больных и методы исследования
В основу работы положены результаты обследования 70 больных в возрасте от 45 до 84 лет (муж – 35, жен – 35) в остром периоде впервые развившегося каротидного ишемического инсульта, поступивших в первые 24 часа от момента заболевания в отделение неврологии 20 ГКБ и 15 практически здоровых людей (доноров) сравнимого пола и возраста.
В группу обследуемых больных не включались лица, страдающие наследственно-дегенеративными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями, заболеваниями периферической нервной системы, а также пациенты, перенесшие в анамнезе нарушения мозгового кровообращения. Из группы исключались лица, имеющие спорные характер и локализацию инсульта
Все пациенты были разделены на две группы по патогенетическому варианту инсульта: группа с атеротромботическим инсультом – 38 человек (муж – 26, жен – 12; средний возраст 63,3±6,38), группа с кардиоэмболическим инсультом – 32 больных (муж – 14, жен – 18; средний возраст 64,7±5,32). На фоне базисного лечения 34 больным, отобранным методом простой рандомизации, независимо от патогенетического варианта инсульта проводили лечебный селективный плазмаферез на 2-е, 4-е и 6-е сутки от дебюта инсульта.
Для стандартизации обработки клинического материала и проведения статистического анализа тяжесть состояния больных оценивали по шкале Оргогозо (J.M.Orgogoso, 1986 г.) на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки от развития ишемического инсульта. Степень функционального восстановления оценивали по шкале Бартел (D. Barthel, 1965) на 1-е и 21-е сутки инсульта.
Выделение криоглобулинов из сыворотки крови проводили по методу Kalovidoris A.E. в модификации. Концентрация криоглобулинов оценивалась спектрофотометрически на спектрофотометре Cary-50 Bio (США) в динамике на 1-е, 2-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки инсульта. Нормативное содержание криоглобулинов в сыворотке крови исследовалось у 15 практически здоровых испытуемых и составило 60-80 мкг/мл, что соответствовало показателям нормы, полученным в работах Ferri C., Zignego A.L. с соавт. (2002).
Качественный состав криопреципитатов определялся методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях на приборе Mini-Protean 3, BioRad, США с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым R-250. Регистрацию гелей проводили с помощью системы гель-документации Vilber Lourmat, Франция.
Количественный состав криоглобулинов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, используя тест системы и реагенты “Biosours”, США; “Вектор-бест”, Россия и “Bender MedSystems”, США в динамике: на 1-е, 2-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки заболевания. Определялась концентрация иммуноглобулинов класса A, M, G, фибронектина, суммарного ревматоидного фактора и ревматоидного фактора класса М.
В динамике острого периода инсульта исследовались основные биохимические показатели, а также показатели свертываемости и реологии. Всем пациентам до начала лечения, на 7-е сутки и по окончании курса плазмафереза проводилось исследование системы гемостаза, включающее исследование коагуляционного звена (АЧТВ, ПВ, фибриноген), фибринолитического (XIIa-эуглобулиновый фибринолиз) и клеточного звена (спонтанная и АДФ-индуцировваннная агрегация тромбоцитов), вязкость цельной крови по стандартным методикам с последующим сравнением с концентрацией криоглобулинов.
Для верификации ишемического характера инсульта в каротидной системе и измерения объема ишемического повреждения головного мозга всем пациентам проводилась магнитно-резонансная томография (МРТ) головного мозга и МР-морфометрия на 1-е, 3-и и 7-е сутки от развития инсульта. Исследования выполнялись на магнитно-резонансном томографе “ЭЛЛИПС” ТМП-150 с напряженностью поля 0.15 Тл, производства НПФ “Аз” (Россия).
Статистический анализ был выполнен на персональном компьютере – “Pentium-4” с использованием пакета статистических программ BIOSTAT и STATISTIСA – 6.0. Статистическая обработка материала включала применение параметрических и непараметрических методов: использовались критерии Стьюдента, Фридмана, U-тест Манна-Уитни, r-коэффициент ранговой корреляции. Корреляционному анализу были подвергнуты значения прироста суммарных клинических баллов по использованным шкалам, а также показатели динамики содержания исследованных соединений. Летальность оценивали с помощью теста Фишера. Различие между показателями признавалось существенным при 5% уровне во всех проведенных сравнениях. Для прогнозирования степени тяжести состояния больных и определения наиболее значимых из определяемых параметров использовался метод множественной пошаговой линейной регрессии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что у всех больных имеется достоверное повышение уровней криоглобулинов в среднем на 106,5% уже в первые сутки от момента заболевания.
Проведенный корреляционный анализ выявил обратную взаимосвязь между исходным содержанием криоглобулинов и приростом клинического балла к 7-м и 21-м суткам инсульта по клинической шкале Оргогозо для тяжелобольных пациентов (r= 0,56, p=0,07 и r= 0,53, p=0,052) и пациентов средней степени тяжести (r=0,64;p=0,02 и r=0,48;p=0,01).
Агрегация тромбоцитов и вязкость крови были достоверно повышены у пациентов с выраженной криоглобулинемией (r=0,56; p=0,048 и r=0,6; p<0,05 соответственно по сравнению с пациентами, имевшими уровень криобелков < 100 мкг/мл), особенно у пациентов в тяжелом состоянии (r=0,7; p<0,05 и r=0,74; p<0,05 соответственно).
Особенно тесной связь между вязкостью цельной крови и концентрацией криоглобулинов была у больных с атеротромботическим вариантом инсульта (r=0,8; р=0,005), в тоже время у больных с кардиоэмболическим вариантом инсульта показатель вязкости цельной крови не всегда соотносился с уровнем криобелков (r=0,4; р=0,065).
Была установлена достоверная прямая зависимость между размерами сформированного к 5-7 суткам инфаркта мозга и уровнем криоглобулинов на 7-е сутки (r=0,45, р<0,05): более высокому содержанию криоглобулинов соответствовал наибольший объем инфарктных изменений при сопоставимой локализации сосудистого поражения и размерах ишемизированной зоны в 1-е сутки.
Обнаружение уже в первые часы ишемии в сыворотке крови высоких концентраций криоглобулинов позволило предположить наличие доинсультной сенсибилизации ткани мозга к нейроантигенам, что подтверждается исходно максимальной представленностью аутоиммунных изменений при атеротромботическом варианте инсульта. Показано, что у пациентов с атеротромботическим вариантом исходно концентрация криоглобулинов была на 16,4% выше, чем в подгруппе с кардиоэмболическим вариантом ишемического инсульта. Полученные результаты по составу криобелков можно сопоставить с данными экспериментальных исследований с моделированием “прорыва” гематоэнцефалического барьера, обнаружившими максимальный иммунный ответ (фаза накопления антител) к мозгоспецифическим белкам в случаях повторного повреждения гематоэнцефалического барьера на 3-7 сутки, а не на 21-25-е сутки заболевания, как в случаях первичного прорыва гематоэнцефалического барьера (Скворцова В.И., Шерстнев В.В., Константинова Н.А., 2005). Аутоиммунные реакции in vivo и значимость их в патогенезе ишемического инсульта у больных были показаны в работах проведенных проф. В.И. Скворцовой и Н.М. Ефремовой (20002003 гг.), указавших на сравниваемые, с синтезом криоглобулинов, временные сроки образования первичных и вторичных аутоантител к трофическим факторам и структурным компонентам нейронов. Титры антител к основным нейроспецифическим структурным белкам S100b и основному белку миелина (ОБМ) в сыворотке крови уже в первые часы инсульта оказались высокими, по сравнению с нормой, причем динамика антителообразования была различна в зависимости от патогенетического варианта инсульта (при медленно прогрессирующем атеротромботическом варианте уровни антител в первые часы и сутки заболевания были достоверно выше, чем при кардиоэмболии), а относительно низкий титр антител свидетельствовал о «свежести» антителообразования. Анализ концентрации ОБМ в цереброспинальной жидкости и динамики образования антител к ОБМ в сыворотке крови позволяли судить о возможном объеме и локализации очага ишемического поражения.
Раннее (в первые 2-3 часа) появление антител к нейроспецифическим белкам в периферической крови больных с инсультом указывает на наличие предшествующей сенсибилизации ткани мозга к белку S100, фенциклидин-связывающему белку NMDA рецепторов и ОБМ, т.е. на существование «фоновых» доинсультных повреждений нейрональных мембран и изменений гематоэнцефалического барьера.
Динамическое мониторирование криоглобулинемии на протяжении всего острого периода инсульта в группах с различными патогенетическими вариантами инсульта, выявило неадекватность изменения их концентрации в сыворотке крови в зависимости от времени наблюдения (рис. 1). В обеих группах больных было выявлено снижение концентрации криоглобулинов на 2-е сутки инсульта и значительное ее возрастание на 3-и сутки. К концу острого периода заболевания наблюдалось снижение концентрации криобелков в крови больных с 158,3±78,6 мкг/мл до 124,8±50,8 мкг/мл в группе с атеротромботическим вариантом инсульта и с 132,4±82,2 мкг/мл до 117,3±63,9 мкг/мл группе с кардиоэмболическим инсультом.
Согласно существующей теории об аутоиммунном повреждении гематоэнцефалического барьера, обнаруженное снижение уровня криоглобулинов на 2-е сутки могло быть связано с их фиксацией в микроциркуляторном русле в результате взаимодействия с нейроантигенами и развитием иммунокомплексного воспаления. В то время как повышение содержания криоглобулинов в сыворотке крови на третьи сутки может быть вызвано как выходом их в циркуляцию из мест депонирования или фиксации, так и развитием вторичного иммунного ответа (Константинова Н.А., Скворцова В.И., 2005). Этот факт подтверждаются рядом работ по экспериментальному моделированию ишемии (Ганнушкина И.В., 1994; Горбунов В.И., Лихтерман Л.Б., Ганнушкина И.В., 1996).
 |
| Рис. 1. Концентрация криоглобулинов в группе без плазмафереза. |
При оценке влияния криоглобулинемии на реологические свойства крови выявлена устойчивая отрицательная корреляция с показателями коагуляционного звена на первые сутки наблюдения (АЧТВ r=0,61;p=0,01, агрегация тромбоцитов r= 0,51; p=0,06, вязкость r= 0,43; p=0,065) с усилением связи к 7м суткам инсульта (АЧТВ r=0,64;p=0,007; ПВ r= 0,53;p=0,03; ФГ r= 0,44;p=0,08), что свидетельствовало об участии криоглобулинов в нарушениях реологии крови.
У всех больных, независимо от типа инсульта, получавших комплексную унифицированную терапию, уровень криоглобулинов в сыворотке крови к концу острого периода оставался повышенным в среднем на 71%. Что свидетельствует о недостаточной эффективности стандартной схемы терапии в коррекции криоглобулинемии.
С целью уменьшения выраженности криоглобулинемии и коррекции реологических свойств крови 34-м пациентам, отобранным методом простой рандомизации проводился селективный плазмаферез. Уже после первой процедуры плазмафереза (на 2-е сутки) у большинства больных достоверно уменьшалась общемозговая симптоматика и нарастал уровень бодрствования по сравнению с аналогичными пациентами, получавшими стандартную медикаментозную терапию. Повышение клинического балла по шкале Оргогозо и степени функционального восстановления по шкале Бартела достоверно превалировало в группе больных, леченных плазмаферезом.
Исследование динамики концентрации криоглобулинов при использовании селективного плазмафереза в сыворотке крови больных при атеротромботическом и кардиоэмболическом вариантах инсульта показало наличие сходных изменений их содержания (рис. 2). Так было отмечено достоверное снижение концентрации криоглобулинов после каждой процедуры плазмафереза и повышение их количества после первого сеанса (“rebound”-effect). К концу острого периода инсульта в группе больных с атеротромботическим вариантом, которым проводился плазмаферез, было выявлено достоверное снижение концентрации криоглобулинов по сравнению с группой леченной по стандартной схеме. В этой подгуппе больных сывороточные концентрации криоглобулинов на 21-е сутки инсульта приближались к нормальным значениям (60-80 мкг/мл) и составляли в среднем 90 мкг/мл. Полученные данные свидетельствуют об эффективой эллиминации криоглобулинов из организма больных с атеротромботическим инсультом в результате проведения 3-х процедур селективного плазмафереза по предложенной схеме. Уменьшение выраженности криоглобулинемии в этой подгруппе коррелировало с снижением тяжести состояния больных, приростом балла самообслуживания и нормализацией реологических показателей крови. Заслуживает внимания также факт отсутствия летальности в группе пациентов, получивших лечение селективным плазмаферезом.
 |
| Рис.2. Динамика концентрации криоглобулинов в группе с селективным плазмаферезом. |
В подгруппе больных с кардиоэмболическим инсультом на 21-е сутки острого периода концентрация криоглобулинов в сыворотке крови оставалась повышенной на 55,7% и составляла в среднем 109 мкг/мл. Полученный результат дает основания предполагать значительно более низкую эффективность предложенной схемы коррекции криоглобулинемии путем проведения 3-х последовательных процедур селективного плазмафереза на 2-е, 4-е и 6-е сутки от дебюта инсульта в группе больных с кардиоэмболией.
Полученные нами данные об исходных концентрациях криоглобулинов при рассматриваемых патогенетических вариантах инсульта, а также о различной эффективности проводимых процедур селективного плазмафереза говорят об отличиях в составе и свойствах криоглобулинов в зависимости от типа инсульта. С этой целью нами впервые были изучены составы более 300 образцов криопреципитатов, выделенных из сыворотки крови исследуемых больных на протяжении всего острого периода заболевания. Нами впервые были показаны специфические отличия динамики изменения иммуноглобулиновой составляющей криобелков в зависимости от типа инсульта.
В составе криопреципитатов больных с инсультом были определены в 100% случаев иммуноглобулины классов G и М, фибронектин; в 11% иммуноглобулины класса А; в 6, 25% - IgM, обладающий активностью ревматоидного фактора.
Динамическое исследование состава криокомплексов при атеротромботическом инсульте выявило снижение содержания IgG и IgM на 2-е и 3-и сутки от дебюта ишемии, что согласно предложенной концепции патогенеза инсульта, связано с фиксацией криоглобулинов в микроциркуляторном русле в зоне ишемии с проявлением аутоиммунной агрессии против эндотелия и/или вещества головного мозга. На 7-е сутки заболевания было выявлено повышение содержания IgG на 4,3% и достоверное повышение IgM на 19,4% относительно первоначального уровня. К 21-м суткам наблюдения происходило восстановление первоначальных концентраций IgM и подъем концентрации IgG на 10,7% относительно исходного уровня. Повышение содержания антител на 7-е сутки может быть связано с развитием вторичного иммунного ответа на повторный выход мозговых антигенов вследствие прорыва гематоэнцефалического барьера в результате инсульта. В отдельных случаях увеличение концентрации IgG и IgM относительно их уровня на 2-е сутки происходило уже к 3-м и 5-м суткам наблюдения. Это согласуется с полученными ранее данными И.В. Ганнушкиной, которая показала на животных моделях ишемии, что для образования антител в случаях предшествующей сесибилизации животных экстрактом вещества мозга требуется крайне незначительное время – 4-5 мин. Различие в концентрациях IgM и IgG к 21-м суткам связано с различиями во времени их синтеза. Так по классическим представлениям пик титра сыворотчных IgM достигатся на 5-6 сутки, а IgG на 10-12-е и высокое содержание этих антител сохраняется до 20-25 суток.
Проведение процедур селективного плазмафереза в группе больных с атеротромбозом вызывало «принудительное» снижение как общего содержания криоглобулинов, так и их иммуноглобулиновой составляющей на 2-е сутки наблюдения. После первого сеанса плазмафереза наблюдался эффект отдачи в виде повышения содержания IgG и IgM на 3-и сутки инсульта. Дальнейшие процедуры плазмафереза снижали абсолютную концентрацию криоглобулинов в циркуляции и их иммуноглобулиновую составляющую. К концу острого периода было выявлено снижение концентрации на 30,3% для IgM и на 19,5% для IgG, что достоверно коррелировало со снижением концентрации криобелков в циркуляции (r=0,95 для IgG и r=0,98 для IgM, р<0,05). Это сопровождалось улучшением общего состояния больных, повышением клинического балла по шкале Оргогозо (r=-0,6; p<0,05) и степенью функционального восстановления по шкале Бартела (r=0,5; p<0,05).
Таким образом, предложенная тактика проведения плазмафереза для больных с атеротромботическим вариантом инсульта эффективно удаляет криоглобулины из организма.
Полученные нами результаты о динамике изменения и состава криоглобулинов при кардиоэмболическом инсульте, позволяют предположить их большую гетерогенность по составу и свойствам, а, следовательно, и их «не чисто» нейрогенное происхождение. Так обнаруженные изменения содержания иммуноглобулинов классов G и М (возрастание концентрации IgM к 7-м суткам заболевания, а IgG к 21-м), дают основания предполагать развитие криоглобулинемии, при данном типе инсульта, сходное по механизмам с первичным иммунным ответом. Наличие исходно повышенного количества криобелков при кардиоэмболии, в большей степени может быть связано не только с повреждением гематоэнцефалического барьера при гипертонических кризах, но и с постояннопротекающими в организме таких больных процессами тромбообразования и тромболизиса, а, следовательно, и гиперактивностью свертывающей и противосвертывающей систем крови.
В группе с кардиоэмболическим вариантом инсульта снижение криоглобулинемии в результате проводимого плазмафереза было определено лишь на 7-е сутки наблюдения, что коррелировало с некоторым улучшением тяжести состояния (баллом по шкале Оргогозо) больных этой группы к концу первой недели r=-0,49, р<0,03. Но эти изменения носили лишь временный характер. К 21-м суткам инсульта было выявлено возрастание содержания IgG и IgM в составе криобелков, что соотносилось со значительно более низкими показателями по приросту балла самообслуживания, чем в группе с атеротромботическим инсультом.
На основании выше рассмотренного и результатов математического моделирования с оценкой прогностической значимости параметра концентрации криоглобулинемии было предложено внесение изменений в стандартную схему проведения плазмафереза для больных с кардиоэмболией, а именно: назначение 1-2 дополнительных процедур плазмафереза на 2-3-й неделе заболевания.
Проведенное исследование выявило значительное влияние селективного плазмафереза на динамику криоглобулинемии в виде последовательного уменьшения концентрации криобелков, после каждой процедуры. Определение вязкости крови доказало ожидаемое снижение вязкости цельной крови к концу курса лечебного плазмафереза у 93,6 % больных в среднем на 76,3±12,02% с достоверностью p<0,05 по сравнению с группой, получавшей стандартную медикаментозную терапию.
Лечебное действие плазмафереза кроме коррекции реологических нарушений крови включает так же противовоспалительный, детоксикационный, иммуномодулирующий эффекты. Кроме того, каждая кровопотеря в количестве 200-500 мл (4-8% ОЦК) вызывает мобилизацию тканевого белка, запасов железа, других пластических материалов, компенсаторные сдвиги между водными пространствами и секторами организма и другие. Селективный плазмаферез ликвидирует блокаду макрофагальной системы (осуществляется деблокирование системы фагоцитирующих мононуклеаров) и тем самым оптимизирует функции элиминации криоглобулинов. Происходит восстановление чувствительности рецепторов к гормонам, деблокирование рецепторного аппарата, связывающегося с лекарственными средствами, чем объясняется повышение чувствительности организма к медикаментозной терапии.
В данной работе впервые была предпринята попытка определения роли фибронектина в механизме клиренса криоглобулинов. Было выявлено исходное различие в концентрациях фибронектина как в сыворотке, так и в составе криобелков при атеротромботическом и кардиоэмболическом инсульте. При атеротромбозе концентрация фибронектина в сыворотке была на 16,3%, а в составе криоглобулинов на 24,1% выше, чем при кардиоэмболии. Такая исходная разница в концентрациях фибронектина, по всей видимости, связана с повышенной нагрузкой на его опсоническую способность при кардиоэмболии в результате постоянно протекающих в организме таких больных процессов тромбообразования и трмболизиса, а значит и гиперактивности свертывающей и пртивосвертывающей систем крови. Изучение динамического изменения концентрации фибронектина показало наличие сильных отрицательных корреляций между уровнем его содержания в составе криоглобулинов и их концентацией в циркуляции. В группе со стандартной терапией без использования селективного плазмафереза при атеротромботическом инсульте эта корреляция составляла r=-0,94; p<0,05, а при кардиоэмболическом - r=-0,87; p<0,05. Таким образом, было получено, что чем больше определялось фибронектина в составе криопреципитата, тем меньшая концентрация криоглобулинов была определена в циркуляции. Это позволило сделать предположение о непосредственном участии фибронектина в процессах клиренса криобелков. В пользу выдвинутого нами предположения свидетельствуют недавно полученные нами данные, по изучению фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении криокомплексов, содержащих различное количество фибронектина и доли фибронектина в составе криокомплекса. Были получены значимые положительные корреляции (r=0.79) между уровнем фибронектина в составе криокомплекса и процентом фагоцитов, поглощающих окрашенные криокомплексы.
При проведении селективного плазмафереза в группе с атеротромботическим вариантом инсульта динамика изменения содержания фибронектина и изменение концентрации криобелков имели сходный характер, т.к. криоаферез в наибольшей степени удаляет из организма, активированный гепарином фибронектин, и нерастворимые на холоду криоглобулины. В результате проведения 3-х процедур плазмафереза уровень фибронектина практически не изменялся и оставался на определенном уровне (90% от первоначальных значений). Это приводило к достоверному прогредиентному снижению концентрации криоглобулинов в циркуляции, коррелирующему с повышением клинического балла по шкале Оргогозо (r=-0,6; p<0,05) и степенью функционального восстановления по шкале Бартела (r=0,5; p<0,05). При проведении селективного плазмафереза в группе с кардиоэмболическим инсультом, также наблюдается значительное снижение доли фибронектина в криопреципитате. Однако, данный эффект имеет место к концу первой недели от дебюта заболевания, т.е. к моменту окнончания всех процедур плазмафереза. Сдвиг по времени падения доли фибронектина в криокомплексе связан с уменьшением нагрузки на опсоническую активность фибронектина за счет проведения селективного плазмафереза и ее возрастанием после окончания этих процедур. В дальнейшем происходит восстановление содержания фибронектина в криокомплексе к концу острого периода заболевания, что приводит к некоторому усилению естественных механизмов выведения криокомплексов и как следствие уменьшению их количества в циркуляции. Однако это снижение было выражено в значительно меньшей степени, чем при атеротромбозе и составляло порядка 12% против 43% соответственно. Значимых корреляций между степенью тяжести состояния или приростом балла функционального восстановления в данной группе больных выявлено не было. На основании собственных данных и имеющихся в литературе данных других авторов можно предполагать отличие в активности при различных патогенетических вариантах инсульта. Однако, решение этого вопроса требует дополнительных исследований. Полученные нами данные, в частности по динамическому определению изменения концентрации фибронектина в циркуляции и в составе криокомплексов подтверждают непосредственное участие фибронектина в процессах элиминации криобелков из организма.
Полученные результаты и имеющиеся литературные данные дают основания предполагать отличия в активности фибронектина при различных патогенетических вариантах инсульта. Данный вопрос сейчас находится в стадии изучения. Таким образом, данные по определению концентрации фибронектина в циркуляции и в составе криопреципитатов подтверждают его непосредственное участие в процессах элиминации криобелков из организма.
Проведенная статистическая обработка результатов, с последующим математическим моделированием, позволила получить распределение стандартно определяемых клинико-лабораторных параметров по степени их прогностической значимости для тяжести состояния больных. Среди более 30 включенных в модель параметров отбирались 5 наиболее значимых, и с их помощью строились уравнения регрессии, позволяющие рассчитать степень тяжести состояния больного на протяжении всего острого периода инсульта в 5 контрольных точках:1-е, 2-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки заболевания. Получено, что для больных с атеротромботическим генезом инсульта, концентрация криоглобулинов по своей значимости занимает ведущие позиции в прогнозе как степени тяжести, так и функционального восстановления. Также была математически подтверждена эффективность предложенной тактики проведения плазмафереза: в группе больных с плазмаферезом после каждой проведенной процедуры значимость параметра концентрации криобелков снижалась, вплоть до полного ее исчезновения в прогнозах на 21-е сутки от дебюта инсульта. В случае кардиоэмболического инсульта такой явной роли криобелков выявлено не было. Параметр их концентрации хаотично присутствовал в уравнениях прогноза как в группе со стандартной терапией, так и в группе с селективным плазмаферезом. Это дополнительно подтверждает выдвинутое нами предположение о низкой эффективности предложенной схемы проведения афферентной терапии для больных с кардиоэмболией.
Достоверность прогноза, рассчитываемого построенными математическими моделями, была проверена двумя способами. Они были повергнуты процедуре «скользящего» экзамена и экзамену на контрольной выборке. Полученные уравнения могут служить последующей базой для написания прикладных программ с внедрением в клинику.
Таким образом, анализ иммунобиохимических показателей в остром периоде каротидного ишемического инсульта установил факт наличия криоглобулинемии в первые дни ишемии и позволил выявить активную роль аутоиммунных реакций в патогенезе фокального ишемического повреждения, проследить динамику изменения концентрации криоглобулинов и их состав в течение всего острого периода инсульта в зависимости от проводимой терапии и их влияние на изменение реологических показателей. Более детальное изучение состава криобелков позволило выявить их большую гетерогенность при кардиоэмболии и раскрыть один из важнейших факторов, опосредующих их клиренс. Была доказана исключительная значимость криоглобулинов в прогнозе тяжести состояния и функционального восстановления. Полученные в данной работе результаты позволили уточнить и дополнить концепцию аутоиммунного повреждения гематоэнцефалического барьера при ишемическом инсульте.
Разработка и внедрение метода селективного плазмафереза в комплексе базисной терапии острого периода каротидного ишемического инсульта, позволили достоверно снизить уровень криоглобулинемии, улучшить микроциркуляцию в ткани головного мозга с помощью нормализации реологических свойств крови и, тем самым, достоверно повысить эффективность терапии, ускорить регресс общемозговых и очаговых проявлений, снизить показатели ранней инвалидизации и смертности больных. Применение селективной методики без использования донорской плазмы позволило удешевить процедуру и избежать опасности гипопротеинемии, вторичного иммунодефицита и инфекционновирусной инвазии.
ВЫВОДЫ
- Комплексное клинико-иммунобиохимическое исследование больных с каротидным ишемическим инсультом установило, что с первых суток инсульта у 100% больных выявлен феномен криоглобулинемии, степень выраженности которой зависит от патогенетического варианта инсульта. При атеротромботическом инсульте концентрация криоглобулинов в сыворотке крови была на 16,4% выше, чем при кардиоэмболическом инсульте, и составляла 125% от нормы против 88% соответственно.
- Показана неоднозначность динамики изменения концентраций криоглобулинов при различных вариантах инсульта, которая свидетельствует в пользу их различного патогенетического происхождения.
- Применение селективного плазмафереза по стандартной схеме в остром периоде ишемического инсульта при атеротромботическом варианте вызывает достоверное снижение концентрации криоглобулинов с нормализацией их уровня к концу острого периода, что сопровождается достоверным улучшением состояния больных и нормализацией реологических показателей крови. В случае кардиоэмболического инсульта достоверного снижения выраженности криоглобулинемии и клинических показателей выявлено не было.
- Впервые полученные данные о составе криоглобулинов и динамике его изменения позволяют говорить о гетерогенности криоглобулинов при обоих вариантах инсульта. Основными компонентами криокомплексов являются IgG, IgM и фибронектин. Динамика изменения состава криокомплексов существенно зависит от типа инсульта.
- Впервые были обнаружены различия в исходных концентрациях плазменного фибронектина и фибронектина входящего в состав криоглобулинов. Получено, что для атеротромботического варианта инсульта первоначальный уровень фибронектина как в циркуляции, так и в составе криокомплекса значительно превышает соответствующие показатели при кардиоэмболии. Установлена достоверная обратная корреляция между регистрируемым уровнем криоглобулинов в циркуляции и долей фибронектина в их составе.
- Показана исключительная прогностическая значимость параметра концентрации криоглобулинов для прогноза степени тяжести состояния больных на протяжении всего острого периода инсульта и степени функционального восстановления на момент выписки пациента. Метод множественной пошаговой линейной регресси может быть использован для прогнозирования тяжести состояния больных ишемическим инсультом. Построенные математические модели могут служить базой для последующего написания прикладных программ для клинических врачей.
- В случае кардиоэмболического инсульта на основании изучения динамики содержания криоглобулинов, их состава и последующей математической обработки предложено внесение изменений в стандартную схему проведения плазмафереза, а именно: назначение 1-2 дополнительных процедур на 2-3 неделе от дебюта ишемии.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Необходимо динамическое исследование концентрации криоглобулинов в остром периоде ишемического инсульта для объективизации прогноза течения и клинического исхода заболевания.
- Необходимо внесение изменений в стандартно применяемую схему проведения селективного плазмафереза для больных с кардиоэмболическим инсультом, а именно: назначение 1-2 дополнительных процедур на 2-3 неделе от дебюта ишемии.
Список научных трудов, опубликованных по теме диссертации
- Константинова Н.А., Скворцова В.И., Комаров А.Н., Еремин И.И. Криоглобулинемия при ишемическом каротидном инсульте. Применение криоплазмафереза для лечения данной патологии. // Тез. докл. 10 Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва. - 7-11 апреля. - 2003.– с.273.
- Константинова Н.А., Скворцова В.И., Комаров А.Н., Еремин И.И. Криоглобулинемия и криоплазмаферез при ишемии головного мозга. // Материалы 6-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей. - С.-Петербург. – 2003. – с.82-83.
- Скворцова В.И., Константинова Н.А., Комаров А.Н., Зеленкина Л.И., Еремин И.И. Селективный плазмаферез в структуре ургентной терапии острейшего периода ишемического инсульта. // Сб. тезисов международной конференции «Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению нейродегенеративных заболеваний». – Новосибирск. - 5-7 декабря. - 2003. - с.88-89.
- Скворцова В.И., Константинова Н.А., Комаров А.Н., Зеленкина Л.И., Еремин И.И.. Лечебный плазмаферез как способ коррекции криоглобулинемии в патогенезе острого ишемического инсульта. // Консилиум. - спец. выпуск. «Проблемы цереброваскулярной патологии и инсульта». - Москва. - 2003. - с.33-35.
- Комаров А.Н., Константинова Н.А, Еремин И.И., Скворцова В.И. Селективный плазмаферез при ишемическом инсульте. // Вестник службы крови России. - Москва. - 2004. - №1. – с.23-25.
- Комаров А.Н., Константинова Н.А., Еремин И.И., Скворцова В.И. Селективный плазмаферез в ургентной терапии ишемического инсульта. // Сб. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. - Санкт-Петербург. – 2004. – с.18.
- Еремин И.И., Карандашов Е.Н. Определение прогностической значимости параметра концентрации криоглобулинов у больных с ишемическим инсультом. // тез. докл. II международного конгресса по иммунологии и реабилитологии. – Москва. - ИБХ им. Шемякина. -13-15 ноября. - 2004. – с.235.
- Скворцова В.И., Константинова Н.А, Зеленкина Л.И., Комаров А.Н., Еремин И.И., Шамалов Н.А. Криоглобулинемия и ее коррекция при остром ишемическом инсульте. // Неврология и психиатрия им Корсакова. – 2004. - №10. – Москва. - с.47-54.
- Скворцова В.И., Константинова Н.А., Комаров А.А., Еремин И.И. Аутоиммунные нарушения в патогенезе острой фокальной ишемии. // Сб. тез. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 18-22 апреля. – 2005. - с.241.
- Константинова Н.А. Скворцова В.И., Комаров А.А., Еремин И.И. Экстракорпоральная коррекция гемореологических нарушений при тяжелом ишемическом инсульте. // Сб. тез. XII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 18-22 апреля. – 2005. - с.547.
- Константинова Н.А., И.И. Еремин, Комаров А.Н., Скворцова В.И. Уровень криоглобулинов у больных ишемическим инсультом и влияние на него селективного плазмафереза. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2005. – том 139. - №5. – с. 582-584.
- Константинова Н.А., Еремин И.И., Скворцова В.И., Киликовский В.В. Использование статистических методов в прогнозировании состояния больных ишемическим инсультом. // Мед. Физика. - 2005. - №1. - с.62-65.
- Константинова Н.А., Скворцова В.И., Еремин И.И., Константинова Е.В., Комаров А.Н. Аутоиммунные механизмы при ишемии. // Иммунология. – 2005. – том 6. - №2. – с. 147-149.
- Карандашов Е.Н., Еремин И.И., Комаров А.Н. Электрокинетические свойства криоглобулинов при ишемическом инсульте и влияние на них плазмафереза. // Тезисы докладов международной конференции «IMMUNE MEDIATED DESEASES From Theory To Therapy». – Москва. - 3-8 октября. – 2005. - с.104-105.
- Константинова Н.А., Скворцова В.И., Еремин И.И., Константинова Е.В., Комаров А.Н. Аутоиммунные механизмы при ишемии. // Сб. тез. 2 Российской конференции по иммунотерапии и иммунореабилитологии с международным участием. – Москва. - 1-3 февраля. - 2005г.- с.312.
- E.V. Konstantinova, L.V. Kovalchuk, I.I. Eremin. Plasms interleukins in patients with acute Q-wave myocardial infarction. // Abs. Congress Immune-mediated deseases. From theory to therapy. – Moscow. – 2005. - p.91.
- Еремин И.И., Константинова Н.А., Скворцова В.И., Комаров А.Н., Константинова Е.В. Использование статистических методов в прогнозировании состояния больных с острой церебральной и коронарной ишемией. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – том 142. - №11. – с. 594-597.
- Константинова Е.В., Ковальчук Л.В., Еремин И.И., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н. Уровни циркулирующих интерлейкинов у больных в острый период инфаркта миокарда. // Вестник РГМУ. - №1(48). – 2006. – с.5-9.
- Еремин И.И., Константинова Н.А., Скворцова В.И., Комаров А.Н., Константинова Е.В. Криоглобулины – маркеры аутоиммунных нарушений. Использование статистических методов для оценки диагностической и прогностической значимости криоглобулинов при острой ишемии. // Сб. тез. Российского национального конгресса аллергологов и иммунологов. - Аллергология и иммунология. – 2006. - том.7. - №3. - с. 255.
