Характеристика и механизмы иммун ных нарушений у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией
На правах рукописи
Селедцова Наталья Владимировна
характеристика и механизмы иммунных нарушений У БЕРЕМЕННЫХ С НАДПОЧЕЧНИКОВОЙ ГИПЕРАНДРОГЕНИЕЙ
14.00.36 – Аллергология и иммунология
14.00.01 – Акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Новосибирск 2009
Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Черных Елена Рэмовна
доктор медицинских наук, профессор Пасман Наталья Михайловна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Скосырева Галина Александровна
доктор медицинских наук, профессор Гайдуль Константин Валентинович
Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий
Защита состоится « » 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН по адресу: 6300099, г. Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН
Автореферат разослан « » 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна
Общая характеристика работы
В последнее время гиперандрогении (ГА) надпочечникового генеза уделяется большое внимание в связи с широкой распространенностью данной патологии среди женщин репродуктивного возраста. Наличие ГА рассматривается как один из факторов риска ранних гестационных осложнений (Сидельникова В.М., 2005). В то же время особенности течения второй половины беременности и родов у женщин с данной патологией исследованы недостаточно. Кроме того, неизученным остается вопрос о механизмах гестационных осложнений при ГА, особенно аспектах патогенеза, касающихся иммуно-эндокринных взаимодействий.
Как известно, физиологическое течение беременности происходит на фоне супрессорной перестройки иммунной системы, направленной на формирование и поддержание иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Важная роль в этом процессе отводится смещению цитокинового баланса в сторону доминирования Th2/противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13), а также увеличению количества естественных регуляторных СD4+CD25+ Т-лимфоцитов (Шмагель К.В., 2003; Сотникова Н.Ю. 2005; Сидельникова В.М., 2005, Saito S., 2007; Zhao J.X., 2007). Кроме того, определенное иммунорегуляторное влияние могут оказывать NK- клетки (Kitaya K., 2008; Vacca P., 2008). Нарушение супрессорной перестройки приводит к развитию осложнений, в частности, невынашиванию беременности и гестозу (Хонина Н.А., 2006; Raghupathy R, 2001; Quenby S., 2002; Xia X.Y., 2008; Yang H., 2008; Faridi R.M., 2009).
Данные о состоянии иммунитета у беременных c ГА надпочечникового генеза в литературе практически отсутствуют. В то же время хорошо известно, что течение беременности требует согласованного взаимодействия иммунной и эндокринной систем. Циркулирующие гормоны при беременности играют важную роль в формировании гестационной иммуносупрессии (Сидельникова В.М. 2002, Szekeres-Bartho J., 2001), и нарушение гормональной регуляции может приводить к развитию иммунных дисфункций.
Поскольку дегидроэпиандростерон и его сульфатированная форма (ДГЭАС) активируют цитотоксическую функцию NK-клеток (Solerte S.B., 2005), пролиферативный ответ Т-лимфоцитов (Pahlavani M.A., 1995) и продукцию Th1- цитокинов (Hernndez-Pando R., 2005), повышение концентрации данного гормона может негативным образом сказываться на формировании иммуносупрессии и приводить к развитию осложнений беременности.
Согласно данным литературы, стимулирующее влияние ДГЭАС на Т-клетки и NK-клетки реализуется через специфические рецепторы (Okabe Т.,1995). В то же время не исключено, что действие гормона может опосредоваться через другие разновидности иммунокомпетентных клеток, например, дендритные клетки (ДК). Известно, что ДК обладают выраженной регуляторной активностью и могут не только активировать, но и подавлять иммунный ответ, в том числе индуцировать толерантность к аллоантигенам (Yamazaki S., 2007; Dolganiuc A., 2008). Кроме того, ДК способны участвовать в регуляции NK -клеток (Laskarin G., 2008).
Свойства ДК при беременности у человека исследованы недостаточно, а данные, характеризующие влияние ДГЭАС на ДК практически отсутствуют. Между тем, исследование влияния ДГЭАС на дифференцировку/созревание и функциональную активность ДК представляет большой интерес как в фундаментальном, так и практическом аспектах, поскольку раскрытие механизмов иммунорегуляторной активности ДГЭАС является основой для более полного осмысления иммуно-эндокринных взаимодействий и разработке новых подходов к диагностике, профилактике и лечению осложнений беременности, связанных с эндокринными дисфункциями.
Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.
Цель исследования. На основе клинико-иммунологического анализа и оценки влияния дегидроэпиандростерона сульфата на созревание/функции ДК in vitro изучить роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе осложнений гестации у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.
Задачи исследования.
- Провести сравнительный анализ параметров клеточного звена иммунитета и продукции Th1/Th2-цитокинов в группах беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.
- Исследовать влияние ДГЭАС на созревание/дифференцировку (фенотип) и функциональную активность дендритных клеток беременных (способность индуцировать пролиферацию Т-клеток в СКЛ, стимулировать Th1 и Th2- ответ, влиять на активированные NK-клетки) в культуре in vitro.
- Охарактеризовать дендритные клетки беременных (фенотип, продукцию цитокинов, аллостимуляторную и Th1/Th2 - стимулирующую активность) с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС в крови.
- Провести ретроспективный анализ частоты поздних осложнений беременности и родов в группах с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.
Научная новизна.
Впервые охарактеризованы параметры иммунитета у беременных с надпочечниковой ГА. Установлено, что по сравнению с физиологической гестацией беременные с ГА характеризуются повышенной пролиферативной активностью Т-клеток в ответ на стимуляцию a-CD3мАТ и аллоантигенами партнера, сниженным относительным содержанием естественных регуляторных Т-клеток (СD4+CD25+) и повышенным содержанием активированных (СD3-СD16+CD56+) NK-клеток. Также продемонстрировано, что течение беременности, осложненной ГА, ассоциировано с усилением КонА-индуцированной продукции IFN-, TNF-, GM-CSF клетками крови. При этом между выраженностью иммунных дисфункций и уровнем ДГЭАС в сыворотке крови выявлена достоверная взаимосвязь.
Установлено, что генерация интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток (ИФН-ДК) в культуре in vitro в присутствие ДГЭАС сопровождается увеличением содержания зрелых (CD83+) и активированных (CD25+) ДК и усилением их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток. При этом ДГЭАС усиливает способность ДК стимулировать продукцию Т-клетками IFN-, ингибирует способность Т-клеток к продукции IL-4 и подавляет способность ИФН-ДК индуцировать апоптоз активированных NK-клеток.
Впервые продемонстрировано, что у беременных с ГА ИФН-ДК характеризуются более высоким содержанием клеток с маркерами зрелых и активированных ДК (CD83 и CD25), причем возрастание CD83-позитивных клеток обусловлено увеличением как зрелых миелоидных ДК (CD83+CD14-), так и CD83+ -клеток, ко-экспрессирующих маркер моноцитов/макрофагов (CD83+CD14+). Кроме того, по сравнению с физиологической беременностью ИФН-ДК беременных с ГА отличаются более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4, а также более высокой способностью стимулировать МНК к пролиферации и продукции IFN- в СКЛ.
В процессе клинического анализа получены новые данные о повышенной частоте встречаемости поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабость родовой деятельности, несвоевременное излитие околоплодных вод) при ГА. Установлено, что у беременных с ГА регистрируется раннее появление симптомов гестоза, и чаще встречаются классические варианты гестоза.
Теоретическая и практическая значимость.
Сравнительный анализ параметров иммунитета у беременных с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС позволил охарактеризовать иммунные дисфункции, свидетельствующие о нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с ГА.
Выявленные в культуре in vitro стимулирующие эффекты ДГЭАС на дифференцировку/созревание, аллостимуляторную активность и Th1-стимулирующую активность ДК беременных раскрывают новые механизмы иммуностимулирующего действия ДГЭАС, опосредованные ДК. Впервые установлен новый механизм негативной регуляции активированных NK-клеток со стороны ИФН-ДК и продемонстрировано ингибирующее действие ДГЭАС на способность ИФН-ДК стимулировать активационно-индуцированный апоптоз CD56+CD16+ NK-клеток. Полученные новые данные об особенностях фенотипических и функциональных свойств ДК при физиологической беременности (признаки незрелости, низкая аллостимуляторная активность, доминирование Th2-стимуляторной активности) и выраженных изменениях ДК у беременных с ГА (более зрелый фенотип, появление Th1-стимуляторной активности) свидетельствуют о вовлечении ДК в процессы перестройки иммунной системы при физиологической гестации и участии ДК в опосредованных ДГЭАС иммунных нарушениях при надпочечниковой ГА.
Практическая значимость работы заключается в выявлении иммунологических маркеров, которые могут служить критериями нарушений гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой ГА. Обнаруженные в результате проведенного клинического анализа факты о повышенной частоте встречаемости тяжелых форм гестоза и более раннем возникновении данного осложнения у беременных с надпочечниковой ГА позволяют отнести этих женщин в группу риска по развитию гестоза.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Повышенный уровень дегидроэпиандростерона сульфата является причиной дефекта гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.
- Иммунотропные эффекты дегидроэпиандростерона сульфата в культуре in vitro и in vivo реализуются с участием дендритных клеток.
- Беременные с повышенным уровнем дегидроэпиандростерона сульфата составляют группу риска по развитию поздних гестационных осложнений, в первую очередь тяжелых форм гестоза.
Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Материал изложен на 146 страницах машинописного текста, включающего 15 таблиц и 6 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 285 литературных источника (245 иностранных).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва - 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск -2005), ежегодном конкурс - конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2006» (Новосибирск - 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск - 2007), XIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург - 2009). Апробация диссертации состоялась 02 июля 2009 года на расширенном семинаре НИИ КИ СО РАМН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 11 статей, из которых 10 опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК, для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.
Материалы и методы исследования
Характеристика женщин, включенных в исследование.
Диссертационная работа основана на результатах иммунологического обследования женщин репродуктивного возраста и беременных, наблюдавшихся в женских консультациях МБУЗ КДЦ им.А.П.Гумилевского, МУЗ ДСКБ№5, МУЗ ГКБ№11, №3 за период 2004-2008 годы. Обследование проводилось на базе лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ КИ СО РАМН (руководитель д.м.н., профессор Е.Р. Черных).
В исследование были включены 142 небеременные женщины, 190 беременных с физиологическим течением гестации и 101 беременная с надпочечниковой ГА. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, срокам беременности (14,2±0,2 и 15,1±0,1 недель гестации, соответственно) и соматическому статусу. Венозную кровь у небеременных забирали в фолликулярную фазу менструального цикла, у беременных - в сроки 9 - 20 недель.
Дополнительно проводили ретроспективный анализ сплошной выборки историй беременности женщин, наблюдавшихся в женской консультации МУЗ ДСКБ №5 г. Новосибирска в 2002-2004 годы (n=690). Для оценки степени тяжести гестоза использовали классификацию и критерии, разработанные кафедрой акушерства и гинекологии НГМИ 1990 г., дополненные в 1996 г (Серов В.Н. и др., 2001).
Иммунологические исследования. МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований (0,1 х 106 клеток на лунку в 0,15 мл культуральной среды). Для стимуляции клеток использовали растворимые моноклональные анти-CD3 антитела (aCD3 ICO-90, ТОО «Медбиоспектр», Москва, 1 мкг/мл). В отдельной серии экспериментов пролиферативный ответ клеток исследовали в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), где в качестве стимуляторов использовали лимфоциты партнера, инактивированные в течение 40 минут митомицином С (Serva, 40 мкг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа (анти-CD3 -индуцированные культуры МНК) или 120 часов (СКЛ) по включению метки 3Н-тимидина.
Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм2 (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (2-5 х 106/мл) в присутствии 10% сыворотки крови АВ(IV). ДК генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК в течение 3 сут в среде RPMI-1640, дополненной 10% сыворотки плодов коровы (БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (1000 Ед/мл, Leucomax, Шеринг-Плау, Швейцария) и IFN- (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием с липополисахаридом (10 мкг/мл, ЛПС Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich) 24 ч.
Для оценки продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили 1:4 средой RPMI-1640, дополненной 100 мкг/мл гентамицина, и стимулировали конканавалином А (Кон А, Sigma, 15 мкг/мл) в течение 24 ч. Содержание цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 9-Plex. В ряде случаев концентрацию цитокинов в супернатантах и уровень ДГЭАС в сыворотке крови определяли методом ИФА, используя тест-системы производства «Вектор-Бест», г. Новосибирск (IFN-), «Протеиновый контур», г.Санкт-Петербург (IL-4) и «ООО Хема-Медика», г. Москва (ДГЭАС).
Определение субпопуляций клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные APC анти-CD3 и анти-СD11с мАТ (BD PharMingen, США), фикоэритрином (PE)-меченные анти-CD4 и анти-СD14 мАТ (“ЗАО Сорбент-сервис”, г. Москва), анти-CD56, анти-СD1а, анти-СD123 мАТ (Phar-Mingen, США) и меченные FITC анти-CD25, анти-СD83 мАТ (BD PharMingen, США), анти-CD16 мАТ («Сорбент», Москва).
Определение фаз клеточного цикла и уровня апоптоза проводили с помощью окрашивания клеток Aсtinomycin D, 7-Amino (Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Оценку экспрессии внутриклеточных цитокинов проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FASC Clibur, Becton Dickinson). Для этого МНК здоровых доноров, истощенные от прилипающих клеток, культивировали в присутствии и отсутствие ИФН-ДК в соотношении 10:1 в течение 5 сут. Затем проводили рестимуляцию аналогичными ИФН-ДК в течение 48 ч (вторичная СКЛ). За 18 ч до конца инкубации в культуру добавляли 10 мкг/мл брефелдина (ISN). МНК обрабатывали APC-меченными анти-CD3 мАТ и фиксировали 1% раствором параформальдегида. Пермеабилизацию клеток проводили с использованием 0,2% раствора Твин-20. Для идентификации внутриклеточных детерминант цитокинов клетки обрабатывали FITC-меченными анти-IFN- мАТ и PE-меченными анти-IL-4 мАТ (Becton Dickinson, США).
Аллостимуляторную активность ИФН-ДК оценивали в СКЛ при культивировании МНК доноров в присутствии ИФН-ДК небеременных и беременных с отсутствием и наличием ГА (10:1, 5 суток).
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0».
Результаты и обсуждение
Характеристика параметров иммунитета у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией
Исследование параметров иммунитета показало, что по сравнению с небеременными, женщины с физиологической беременностью характеризовались снижением пролиферативного ответа МНК в aCD3-стимулированных культурах (табл.1). У беременных с ГА пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию aCD3 мАТ был снижен, однако в гораздо меньшей степени и достоверно превышал таковой при физиологической беременности. При этом между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и интенсивностью пролиферации Т-клеток в аCD3-стимулированных культурах в группе беременных выявлялась прямая корреляционная связь (rS=0,41, p<0,05, n=23).
Анализ ответа Т-клеток на стимуляцию аллоантигенами выявил резкое снижение уровня пролиферации у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами (табл.1). В то же время у беременных с ГА уровень пролиферации в СКЛ значимо превышал таковой у женщин с физиологической беременностью. Интенсивность ответа в СКЛ также находилась в прямой корреляционной зависимости от концентрации ДГЭАС в крови беременных (rS=0,53, p<0,01, n=24).
Относительное содержание регуляторных СD4+CD25+Т-клеток при физиологической беременности в 3 раза превышало количество этих клеток у небеременных (табл.2). В группе с ГА содержание СD4+CD25+Т-клеток было достоверно ниже, чем у беременных с отсутствием ГА. При этом количество регуляторных Т-клеток у беременных обратно коррелировало с уровнем ДГЭАС (rS=-0,57, P<0,001). Аналогичные изменения были выявлены в отношении CD4 -позитивных клеток с высоким уровнем экспрессии CD25-антигена (CD4+CD25high). Количество этих клеток при физиологической беременности в среднем в 2,5 раза превышало аналогичный показатель у небеременных.
Таблица 1 | |||
Характеристика пролиферативного ответа Т-клеток у небеременных женщин, беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | |||
Стимулированный пролиферативный ответ Т-клеток | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины | Беременные ГА (-) | Беременные ГА (+) | |
- аCD3мАТ | 34710 ± 6420 n=29 | 14840 ± 2060* n=17 | 27630±3140# n=22 |
- МНК партнера | 12818 ± 607 n=11 | 2131 ± 234* n=17 | 7284±1087#* n=12 |
Примечание: *PU<0,01-достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #PU<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
Таблица 2 | |||
Регуляторные Т-клетки в периферической крови у небеременных женщин, беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | |||
Содержание регуляторных Т-клеток | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины | Беременные ГА (-) | Беременные ГА (+) | |
CD4+CD25+ (%) | 4,4 ±0,4 (n=25) | 12,9 ±1,4*(n=20) | 7,6 ± 0,7#(n=26) |
CD4+CD25+ high | 0,9 ± 0,1 (n=12) | 2,4 ± 0,3*(n=12) | 1,1 ± 0,2#(n=11) |
Примечание: *PU<0,001 -достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #PU<0,01- по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) |
В то же время у беременных с ГА содержание CD4+CD25high Т-клеток практически не отличалось от такового у небеременных женщин (табл. 2).
Оценка количественного содержания различных субпопуляций клеток с естественной цитотоксической активностью показала, что беременные с ГА, так же как и женщины с физиологической беременностью, характеризовались сходным с небеременными количеством СD3-СD16-CD56+, однако отличались от женщин с физиологической беременностью 2-кратным возрастанием количества активированных NK-клеток (СD3-СD16+CD56+) (рис.1). Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием СD3-СD16+CD56+ - NK-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (rS=0,6; pU <0,01; n=24).
По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-, TNF-, GM-CSF) клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).
Рис.1. Субпопуляции киллерных клеток периферической крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении. Количество человек в каждой группе - 12; *- PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с нормальным уровнем ДГЭАС, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.
Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием СD3-СD16+CD56+ - NK-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (rS=0,6; pU <0,01; n=24).
По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-, TNF-, GM-CSF) клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).
Таблица 3 | |||
Продукция цитокинов КонА-стимулированными клетками цельной крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | |||
Цитокины (пкг/мл) | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины (n=8) | Беременные ГА (-) (n=6) | Беременные ГА (+) (n=11) | |
IFN- | 183,5 ± 58,4 | 35,8 ± 9,7* | 111,6 ± 20,0## |
IL-2 | 131,3 ± 47,6 | 72,2 ± 22,1 | 84,7 ± 18,8 |
TNF- | 264,7 ± 63,2 | 26,9 ± 8,5** | 64,7 ± 21,4* |
IL-12 | 9,0 ± 1,5 | 6,1 ± 1,2 | 8,4 ± 0,6 |
GM-CSF | 13,9 ± 1,5 | 8,5 ± 0,9** | 14,0 ± 1,8# |
IL-4 | 6,5 ± 0,4 | 5,7 ± 0,4 | 5,7 ± 0,5 |
IL-5 | 5,7 ± 0,8 | 6,4 ± 1,9 | 8,6 ± 2,1 |
IL-10 | 70,0 ± 11,6 | 40,2 ± 12,0 | 32,8 ± 10,6* |
IL-13 | 5,4 ± 1,0 | 7,9 ± 3,3 | 8,1 ± 2,9 |
IFN-/IL-4 | 27,7 ± 7,3 | 5,9 ± 1,2* | 16,8 ± 3,7*## |
Примечание.*PU<0,05, **PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #PU<0,05, ##PU<0,01 –по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
У беременных с ГА уровень продукции IFN- и GM-CSF в культурах клеток крови был достоверно выше, чем у женщин с физиологической беременностью. Корреляционный анализ показал наличие прямой взаимосвязи между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови беременных и уровнем продукции IFN- клетками цельной крови (rS=0,73, p<0,01, n=17).
Таким образом, у беременных с надпочечниковой ГА отмечается нарушение гестационной иммуносупрессии, что проявляется усилением пролиферативного ответа в a-CD3 и аллоантиген - стимулированных культурах МНК крови и увеличением доли активированных СD3-СD16+CD56+ NK-клеток. В основе механизмов, приводящих к выявленным изменениям, может лежать сниженное количество естественных регуляторных СD4+CD25+ Т-клеток в циркуляции, а также нарушение Th1-Th2 переключения и сохранение активной продукции Th1/провоспалительных цитокинов. При этом причастность выявленных изменений с повышенным уровнем ДГЭАС у беременных с ГА подтверждается наличием достоверных корреляционных связей между концентрацией гормона и выраженностью изменений анализируемых иммунологических параметров.
Влияние ДГЭАС на дифференцировку/созревание и функциональную активность дендритных клеток в культуре in vitro.
С целью исследования влияния ДГЭАС на дифференцировку и созревание ИФН-ДК оценивали эффект гормона на экспрессию поверхностных маркеров ДК (табл. 4).
Таблица 4 | |||
Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на дифференцировку и созревание ИФН-ДК беременных | |||
Cодержание клеток, экспрессирующих СD маркер (%) | В отсутствие ДГЭАС (n=10) | В присутствие ДГЭАС (10-6М) | |
В течение всего периода генерации ДК (n=10) | На стадии дозревания ДК (n=10) | ||
CD83 | 17,0±2,4 | 17,5±2,8 | 21,5±3,1** |
CD1а | 4,1±0,3 | 4,9±0,7 | 6,3±0,8* |
CD11с | 18,4±2,8 | 19,6±3,0 | 19,3±3,0 |
CD123 | 21,6±3,4 | 23,0±3,8 | 21,5±4,1 |
CD14 | 14,3±2,2 | 12,8±1,9 | 14,4±2,2 |
CD25 | 8,8±2,2 | 9,4±1,6 | 12,0±2,1* |
Примечание: *PU<0,05, **PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК, полученными в стандартных условиях (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах) |
Добавление ДГЭАС с первых суток культивирования достоверно не влияло на количество ДК, экспрессирующих исследуемые маркеры. В то же время, при добавлении ДГЭАС совместно с LPS (за 24 ч до окончания культивирования) регистрировалось увеличение доли как незрелых (CD1a-позитивных), так и зрелых ДК (CD83+), в том числе активированных CD25-позитивных клеток.
Из данных табл. 5 видно, что обработка ДК беременных ДГЭАС (10-6М) повышала их аллостимуляторную активность. Так, интенсивность пролиферации и индекс стимуляции в СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицированными ДК были достоверно выше, чем в культурах, индуцированных интактными ДК.
Таблица 5 | ||
Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на аллостимуляторную активность ИФН-ДК беременных | ||
Клеточные культуры | Пролиферация (имп/мин) | ИВ (усл.ед.) |
МНК | 425 ± 86 | |
МНК+ДК0 (10:1) | 4660 ± 1007 | 13,1 ± 3,7 |
МНК+ДКДГЭАС (10:1) | 9354 ± 1916 * | 25,6 ± 6,0 * |
Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие и в присутствие ДК женщин с физиологической беременностью (n=6), генерированных в стандартных условиях (МНК+ДК0) и с ДГЭАС (МНК+ДКДГЭАС). Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение пролиферативного ответа МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной пролиферации. *PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК0; (U критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах). |
На следующем этапе оценивали влияние ДГЭАС на Тh1- и Th2 -стимулирующую активность ДК беременных. Для этого сравнивали продукцию Т-клетками IFN- и IL-4 в супернатантах вторичной СКЛ, которую индуцировали интактными или ДГЭАС-модифицированными ДК, полученными от 9 женщин c физиологическим течением гестации (табл.6). Проведенные исследования показали, что продукция IFN- в супернатантах СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицированными ДК была в 2,2 раза выше, а концентрация IL-4 - в 1,7 раза ниже, чем в культурах СКЛ, индуцированной интактными ДК (табл.6).
Таблица 6 | ||||
Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на Th1/Th2-cтимулирующую активность ИФН-ДК беременных | ||||
Клеточные культуры | IFN- (пкг/мл) | ИВ (расч.ед.) | IL-4 (пкг/мл) | ИВ (расч.ед.) |
МНК | 41,8 ± 28,7 | 1,0±0,0 | ||
МНК+ДК0 | 145,4 ± 79,5 | 6,0±3,4 | 117,0±34,4 | 117,0± 34,4 |
МНК+ДКДГЭАС | 320,1 ± 142,2 * | 15,1±1,8* | 68,1±25,0* | 68,1± 25,0* |
Примечание: ДК0 - ДК женщин с физиологической беременностью (n=9), генерированные в стандартных условиях, ДКДГЭАС - генерированные с ДГЭАС. Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение уровня продукции цитокинов МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной продукции. *PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК0; (U критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах) |
Исследования последних лет показали, что наряду с участием в регуляции Th1/Th2 баланса ДК способны активно взаимодействовать с NK-клетками. В этой связи представлялось важным исследовать влияние интактных и ДГЭАС-модифицированных ДК на активированные NK-клетки. Добавление интактных ДК в культуры МНК не влияло на количество CD56+СD16- NK-клеток (табл.7), однако приводило к достоверному снижению доли активированных CD56+СD16+ NK-клеток.
Уменьшение относительного содержания CD56+СD16+ клеток не было связано со снижением экспрессии СD16, поскольку средний уровень флюорисценции данной молекулы в контрольных культурах МНК и МНК, культивируемых в присутствие ДК, не различался (табл.7).
Таблица 7 | |||
Влияние ИФН-ДК беременных, генерируемых в присутствие и отсутствие ДГЭАС, на относительное количество, пролиферацию и апоптоз NK-клеток | |||
Анализируемые показатели | МНК | МНК+ДК 0 | МНК+ДКДГЭАС |
NK-клетки (%; n=18) - CD56+СD16-клеток - CD56+СD16+ | 3,5±0,3 10,6±0,8 | 3,3±0,3 6,6±0,5* | 3,6±0,4 8,2±0,5*# |
Средний уровень флуоресценции СD16 молекулы в популяции CD56+СD16+ клеток (усл.ед; n=18) | 566±46,7 | 611±51,6 | 633,4±53,6 |
Клеточный цикл в CD56+СD16+ клетках (%; n=10) - G0/G1 - S/G2M | 75,7±11,3 20,2±3,95 | 51,2±8,7* 27,7±4,9 | 57,6±10,1*# 34,8±3,3* |
Содержание апоптотических клеток (%) | 4,1±0,67 | 21,1±5,0* | 7,7±1,1*# |
Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие ДК (МНК), в присутствие ДК, генерированных без добавления ДГЭАС (ДК0) и в присутствие ДК, генерированных с ДГЭАС (ДКДГЭАС). *PU<0,05 –достоверность различий по сравнению с культурой МНК, #PU<0,05- достоверность различий по сравнению с культурой МНК+ДК0; (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах) |
В то же время добавление в культуры МНК интактных ДК сопровождалось уменьшением доли покоящихся (в G0/G1)- и увеличением доли пролиферирующих (в S,G2/M фазах клеточного цикла) CD56+СD16+ клеток и 5-кратным возрастанием уровня апоптоза в данной популяции. Культивирование МНК с ДГЭАС-модифицированными ДК не сопровождалось достоверным снижением относительного содержания CD56+СD16+ клеток, а индукция апоптоза CD56+СD16+ клеток была достоверно ниже, чем в присутствии интактных ДК. Таким образом обработка ДК ДГЭАС достоверно снижала их ингибирующий эффект в отношении активированных NK-клеток. Таким образом, ДГЭАС в культуре in vitro стимулирует дифференцировку и созревание миелоидных ДК и оказывает выраженный эффект на функциональную активность ДК, в частности, усиливает аллостимуляторную- и Th1-стимулирующую активность ДК и подавляет их способность индуцировать апоптоз активированных NK-клеток. Выявленные эффекты гормона на ДК позволяют полагать, что изменение цитокинового баланса в сторону продукции Th1-цитокинов и повышенное содержание активированных CD56+СD16+ - NK-клеток в периферической крови беременных с ГА может быть следствием изменения функциональной активности ДК на фоне повышенного содержания ДГЭАС.
Характеристика дендритных клеток при неосложненной беременности и надпочечниковой гиперандрогении
Сравнительный анализ ИФН-ДК показал, что по сравнению с небеременными женщинами при физиологической беременности относительное количество клеток с фенотипом зрелых (CD83+) и активированных (CD25+) ДК было снижено в два раза (табл.8). Относительное количество CD83+ - и CD25+ - ДК у беременных с ГА было в 2,5 раза выше, чем при неосложненной беременности. Кроме того, беременные с ГА отличались повышенным содержания ДК с маркером моноцитов (CD14+).
Таблица 8 | |||
Фенотип ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием надпочечниковой гиперандрогении | |||
Относительное содержание клеток, экспрессирующих СD маркер (%) | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины | Беременные ГА (-) | Беременные ГА (+) | |
CD14+ | 19,9±2,7 (n=20) | 16,7±2,4 (n=33) | 31,1±5,8*# (n=10) |
CD83+ | 25,2±3,0 (n=27) | 10,7±1,2** (n=33) | 25,9±1,8## (n=18) |
CD25+ | 22,7±4,1 (n=17) | 9,3±1,3** (n=18) | 26,9±2,9## (n=13) |
Примечание: *PU<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #PU<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
Чтобы объяснить одновременное возрастание клеток с фенотипом моноцитов и зрелых ДК, в отдельной серии экспериментов была исследована ко-экспрессия CD14 - и CD83 - молекул в популяции ДК. У небеременных популяция ДК содержала небольшое количество клеток, экспрессирующих одновременно молекулы CD14 и CD83. В группе женщин с физиологической беременностью количество CD14+CD83+ - клеток было 2-кратно снижено (4,3±0,9 vs 8,4±1,7% у небеременных, PU<0,05), а у беременных с ГА – достоверно повышено (14,0±2,5 vs 4,3±0,9 % при физиологической беременности, PU<0,01). Характерно, что наряду с возрастанием CD14+CD83+ клеток у беременных с ГА также отмечалось более высокое содержание CD14-CD83+-клеток, представляющих «классические» зрелые миелоидные ДК (10,6±2,5 vs 4,3±0,5% при физиологической беременности). Таким образом, наблюдаемое возрастание CD83+ ДК у беременных с ГА было обусловлено как за счет зрелых ДК, так и за счет популяции CD14+CD83+.
Чтобы выяснить, являются ли изменения ДК при ГА следствием повышенного уровня ДГЭАС в крови, в отдельной серии экспериментов исследовали влияние сывороток крови беременных на экспрессию дифференцировочных маркеров ДК доноров. Для этого ДК небеременных женщин на этапе созревания культивировали либо с сыворотками беременных c неосложненной гестацией, либо беременных с ГА. Концентрация ДГЭАС в сыворотках крови женщин с физиологической беременностью (n=10) составила в среднем 0,63 ± 0,1 мкг/мл, у беременных с ГА (n=10) - 9,3±0,6 мкг/мл. Сыворотки крови женщин с неосложненной беременностью ингибировали созревание ДК, что проявлялось в снижении относительного количества CD83-позитивных клеток (20,2±1,8 против 30,5±4,4% в контроле). В то же время сыворотки беременных с ГА не оказывали ингибирующего эффекта на содержание CD83+ДК и достоверно отличались по влиянию на количество СD25+ДК от сывороток женщин с физиологической беременностью (25,8±3,8 против 18,8±3,4 %, PU<0,05).
Согласно данным литературы, состояние зрелости ДК во многом определяет спектр продуцируемых ими цитокинов. Исследование продукции цитокинов показало, что концентрация IFN- в культурах ДК у женщин с физиологической беременностью была достоверно ниже, а уровень IL-4 - 2-кратно выше, чем в культурах ДК небеременных женщин (табл.9).
Таблица 9 | |||
Содержание IFN- и IL-4 в супернатантах ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении | |||
Цитокин, пкг/мл | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины (n=7) | Беременные ГА (-) (n=8) | Беременные ГА (+) (n=10) | |
IFN- | 340,1±63,2 | 33,6±7,5* | 2303,1±518,0*# |
IL-4 | 92,3±5,2 | 174,1±16,9* | 31,4±8,9*# |
Примечание: *PU<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #PU<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
У беременных с ГА концентрация IFN- в супернатантах ДК была существенно выше, а продукция IL-4 - значимо ниже, чем в группе здоровых беременных.
Анализируемые группы различались также по аллостимуляторной активности ДК. По сравнению с небеременными женщинами ДК женщин с физиологической беременностью обладали более низкой способностью стимулировать пролиферацию МНК в СКЛ (табл.10). В группе беременных с ГА ИВ ДК был достоверно выше, чем при физиологической беременности.
На следующем этапе было проведено исследование Тh1/Тh2-стимулирующей активности ДК. ДК небеременных женщин значимо стимулировали увеличение количества CD3+IFN-+ Т-клеток в СКЛ (Таблица 11). В то же время ДК женщин с неосложненной беременностью не вызывали увеличения CD3+IFN-+ Т-клеток, однако индуцировали увеличение относительного содержания CD3+IL-4+ Т-клеток. ДК беременных с ГА сохраняли способность активировать Т-клетки к внутриклеточной продукции IFN-, хотя стимулирующий эффект был значимо ниже по сравнению с ДК небеременных женщин. Одновременно с этим ДК беременных с ГА индуцировали увеличение доли CD3+IL-4+ Т-клеток.
Таблица 10 | |||
Аллостимуляторная активность ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием надпочечниковой гиперандрогении | |||
Анализируемые показатели | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины (n=8) | Беременные ГА (-) (n=13) | Беременные ГА (+) (n=8) | |
Сп.прол.МНК, имп./мин. | 422±66 | 473±58 | 259±45 |
МНК+ДК, имп/мин | 8600±1033 | 3937±871* | 4173±657* |
ИВ, расч.ед. | 23,7±3,9 | 7,6±0,9* | 21,9±8,7# |
Примечание. ДК культивировали в течение 5-ти суток с МНК доноров, ДК от каждой женщины протестированы в СКЛ на 2-х донорах; *PU<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
Таблица 11 | |||
Относительное количество СD3+IFN-+ и СD3+IL-4+ клеток и уровень продукции IFN- во вторичной СКЛ с ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием гиперандрогении | |||
Анализируемые показатели | Исследуемые группы | ||
Небеременные женщины (n=11) | Беременные ГА (-) (n=8) | Беременные ГА (+) (n=8) | |
СD3+IFN-+, % в МНК МНК+ДК ИВ | 1,5±0,2 5,9±0,6 5,2±0,9 | 1,8±0,5 1,5±0,3** 1,1±0,2** | 1,8±0,5 2,5±0,3**# 2,0±0,4**# |
СD3+IL-4+, % в МНК МНК+ДК ИВ | 1,7±0,1 2,1±0,4 1,3±0,2 | 2,6±0,4 8,6±1,0** 3,5±0,4** | 3,3±0,5 7,4±1,0** 2,4±0,5* |
Уровень продукции IFN-, пкг/мл; МНК МНК+ДК ИВ | 18,2±5,7 353±40 22,2±3,1 | 16,5±2,8 63±27** 3,4±0,9** | 16,0±3,0 218±69*# 13,5±3,1*# |
Примечание. ИВ-индекс влияния (отношение уровня продукции или относительного содержания клеток с внутриклеточным содержанием цитокина в культуре МНК после стимуляции ДК к аналогичному показателю в отсутствие стимуляции). *PU<0,05, **PU<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #PU<0,05 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). |
Наличие Тh1-стимулирующей активности ДК беременных с ГА подтверждалась также более высоким уровнем продукции IFN- в СКЛ, индуцированной этими клетками по сравнению с СКЛ, индуцированной ДК женщин с физиологической беременностью.
Таким образом, по сравнению с ДК женщин с физиологической беременностью популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой ГА содержит большее количество зрелых, активированных клеток и характеризуется более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать Th1- ответ. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать Th1- ответ.
Сравнительная характеристика особенностей течения и исходов беременности у женщин с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.
Ретроспективный анализ историй беременности и родов выявил, что синдром надпочечниковой ГА, подтвержденный наличием лабораторных признаков (повышенное содержание в крови ДГЭАС), встречался у 17,2% (119/690) беременных.
Оценка частоты развития наиболее значимых клинических осложнений беременности и родов, влияющих на перинатальные исходы, показала, что у женщин с ГА беременность достоверно чаще осложнялась угрозой прерывания, фетоплацентарной недостаточностью, гестозом, преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты, синдромом задержки развития плода (табл.12, 13,14).
Таблица 12 | ||||
Частота развития гестационных осложнений у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | ||||
Осложнение беременности | Исследуемые группы | |||
Беременные ГА (-) (n=517) | Беременные ГА (+) (n=119) | |||
n | % | n | % | |
Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты | 8 | 1,5 | 10 | 8,4* |
Задержка внутриутроб. развития плода | 15 | 2,9 | 23 | 19,3* |
Угрожающий самопроизвольный аборт | 93 | 18 | 101 | 84,8** |
Преждевременные роды | 31 | 6 | 30 | 25,2* |
Истмико-цервикальн. недостаточность | 10 | 1,9 | 46 | 38,6* |
Примечание: n-количество женщин с осложнением, % рассчитан по отношению к количеству беременных в данной группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Р2= 0,01, **Р2= 0,001 – достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой |
Таблица 13 | |||||
Частота развития и особенности течения гестоза у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | |||||
Параметры, характеризующие особенности течения гестоза | Исследуемые группы | ||||
Беременные ГА (-) | Беременные ГА (+) | ||||
n=517 | n=119 | ||||
n | % | n | % | ||
Гестоз средней степени | 105 | 19,9 | 69 | 57,9* | |
Гестоз тяжелой степени | 2 | 0,4 | 18 | 15,1** | |
Преэклампсия | 0 | 0,0 | 3 | 2,5* | |
Вариант гестоза: отечный отечно-протеинурический отечно-гипертензивный классический | n=59 | n=44 | |||
39 19 1 0 | 66 32,2 1,8 0 | 18 9 4 13 | 40,9 20,45 9,1* 29,55** | ||
Срок беременности на котором развился гестоз, нед. | 29,2±0,5 | 25,9±0,8** | |||
Вес новорожденных от беременностей, осложненных гестозом Вес<2800 г | 3537±45,4 | 3002±91,4** | |||
n=2 | 3,3% | n=12 | 27,3%** | ||
Примечание: n-количество беременных в группе, достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Р2= 0,01, ** Р2= 0,001 – достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой |
Примечательно, что в контрольной группе не было зарегистрировано ни одного случая преэклампсии, тогда как при ГА данное осложнение регистрировалось достоверно чаще, в частности, имело место у 3 беременных (2,5%). При ГА отмечено раннее появление клинических симптомов гестоза, диагностированных в большинстве случаев до 25 недель гестации и преобладание классического варианта (триады Цонгемейстера).
Одним из индикаторов показатели тяжести гестоза является масса новорожденного при рождении (табл.13). Вес новорожденных, рожденных от беременных с гестозом на фоне ГА был достоверно ниже, чем в группе сравнения (гестоз в отсутствие ГА).
У рожениц с ГА в 4 раза чаще встречалась слабость родовой деятельности, в 3 раза чаще несвоевременное излитие околоплодных вод, в 8 раз чаще интранатальная гипоксия плода (< 7 баллов по шкале Апгар на 5-ой минуте). Относительное количество оперативных родов (кесарево сечение) при ГА также было достоверно выше, чем при физиологической беременности. Подводя итог клинико-иммунологическому исследованию можно заключить, что, ассоциированные с повышенным уровнем продукции ДГЭАС иммунные нарушения приводят к развитию гестационных осложнений – формированию первичной плацентарной недостаточности и, как следствие, нарушению кровоснабжения плода и спонтанным выкидышам. При сохранении гестации в данной группе женщин на фоне плацентарной недостаточности во второй половине беременности развивается гестоз. Высокая частота гестационных осложнений при надпочечниковой ГА диктует необходимость разработки мероприятий проведения их эффективной профилактики с ранних сроков беременности и на этапе предгравидарной подготовки.
Таблица 14 | ||||
Частота развития патологии родов у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении | ||||
Осложнения родов | Исследуемые группы | |||
Беременные ГА (-) (n=517) | Беременные ГА (+) (n=119) | |||
n | % | n | % | |
Слабость родовой деятельности | 29 | 5,6 | 33 | 27,7* |
Несвоевременное излитие околопл. вод | 62 | 12 | 48 | 40,3* |
Интранатальная гипоксия плода | 9 | 1,7 | 24 | 13,9* |
Оперативные роды (кесарево сечение) | 102 | 19,7 | 50 | 42,0* |
Примечание: n-количество женщин с осложнением родов, % рассчитан по отношению к количеству родильниц в группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Р2= 0,01, ** Р2= 0,001 – достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой |
ВЫВОДЫ
- Беременные с гиперандрогенией надпочечникового генеза отличаются повышенным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток на стимуляцию a-CD3мАТ и аллоантигенами партнера, возрастанием относительного содержания активированных (СD3-СD16+CD56+) NK-клеток и снижением количества естественных регуляторных Т-клеток (СD4+CD25high), а также усилением КонА-индуцированной продукции Th1 - цитокинов (IFN-, TNF-, GM-CSF) клетками цельной крови, что свидетельствует о нарушении клеточно-и цитокинопосредованных механизмов гестационной иммуносупрессии у беременных с повышенным уровнем ДГЭАС.
- Обработка ИФН-ДК беременных ДГЭАС in vitro приводит к увеличению содержания CD1а+, CD83+ и CD25+ дендритных клеток, а также усилению их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток и продукцию IFN- и подавлению способности индуцировать продукцию IL-4 в СКЛ, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/ созревание, антигенпрезентирующую и Th1 - стимуляторную активность дендритных клеток наряду с ингибирующим действием на Th2-стимуляторную активность.
- Культивирование ИФН-ДК беременных с МНК сопровождается усилением апоптоза и снижением количества CD56+СD16+ NK-клеток. При этом ДГЭАС на этапе созревания дендритных клеток ингибирует их апоптоз-индуцирующую активность, что является одним из возможных механизмов повышенного содержания CD56+СD16+ NK-клеток у беременных с гиперандрогенией.
- Популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (по сравнению с дендритными клетками женщин с неосложненной беременностью) характеризуется повышенным содержанием CD83+ и CD25+ дендритных клеток, более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4, и способностью стимулировать Т-клетки к продукции IFN-, что свидетельствует о более зрелом фенотипе дендритных клеток и наличии у них Тh1-стимулирующей активности.
- Иммунные дисфункции у беременных с гиперандрогенией ассоциированы с повышенной частотой развития гестоза, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, задержки внутриутробного развития плода, что подтверждает важную роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе поздних гестационных осложнений.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Высокая встречаемость синдрома надпочечниковой гиперандрогении, ассоциированная с повышенной частотой осложнений беременности, диктует необходимость скринингового исследования уровня ДГЭАС в крови на этапе планирования беременности или постановки беременной на учет в женскую консультацию. При выявлении повышенного уровня ДГЭАС в крови целесообразна профилактика не только ранних, но и поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабости родовой деятельности, несвоевременного излития околоплодных вод).
- Проведение иммунологического исследования у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией позволяет оценить эффективность гестационной иммуносупрессии. Повышение пролиферативного ответа в a-CD3 и аллоантиген - стимулированных культурах МНК, увеличение относительного содержания СD3-СD16+CD56+ NK-клеток и снижение количества СD4+CD25high Т-клеток свидетельствует о нарушении гестационной иммуносупрессии и высокой вероятности осложнений, что диктует необходимость проведения мероприятий по их профилактики.
Список статей, опубликованных по теме диссертации.
- Черных Е.Р., Семенова Н.В, Н.М. Пасман Н.М., Хонина Н.А., Дударева А.В., А.В. Дробинская А.Н.. Особенности иммунного статуса и диагностическая ценность определения некоторых показателей иммунитета при гестозе // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. - 2004. - Т. 2. - В.4. - С.82-89.
- Пасман Н.М., Черных Е.Р., Останин А.А, Дударева А.В., Дробинская А.Н, Хонина Н.А, Опарина М.П., Семенова Н.В. Роль дидрогестерона в профилактике гестационных осложнений // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2004. -№3. -С.21-25.
- Пасман Н.М., Дударева А.В., Демина С.Г., Семенова Н.В., Бухановская И.Р. Опыт применения поливитаминного комплекса "Элевит Пронаталь" в предгравидарной подготовке и во время беременности с целью профилактики гестационных осложнений при гиперандрогенных состояниях // Гинекология. - Том 07.- N 1. -2005. - С.1-6.
- Селедцова Н.В., Хонина Н.А., Дударева А.В., Тихонова М.А, Останин А.А, Пасман Н.М, Черных Е.Р. Нарушение иммунорегуляторных механизмов у беременных с гиперандрогенией // Бюллетень СО РАМН. - №1(119), - 2006, стр. 35-40.
- Хонина Н.А., Дударева А.В., Пасман Н.М., Поздняков И.М., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Романовский Д.М., Останин А.А., Черных Е.Р. Влияние дидрогестерона на иммунный статус женщин с высоким риском преждевременного прерывания беременности // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2006, №4.–С.20-25.
- Селедцова Н.В., Хонина Н.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Роль дегидроэпиандростерона в регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток // Бюллетень СО РАМН. – 2007.-№1. – стр.40-46.
- Селедцова Н.В., Хонина Н.А., Дударева А.В., Тихонова М.А, Останин А.А., Пасман Н.М, Черных Е.Р. Характеристика естественных цитотоксических клеток и регуляторных Т-лимфоцитов у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией // Иммунология. – 2007. - т.28. - №3. - стр.151-155.
- Селедцова Н.В., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Останин А.А, Пасман Н.М., Черных Е.Р Возможная роль дендритных клеток в нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией // Вестник НГУ.–2007.-в.3. - стр.91-94.
- Селедцова Н.В., Хонина Н.А., Тихонова М.А., Останин А.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на фенотип и функции дендритных клеток in vitro // Мед.иммунология. – 2007. -Т.9. -№6. - стр. 589- 596.
- Селедцова Н. В., Хонина Н. А., Тихонова М. А., Пасман Н. М., Останин А. А., Черных Е. Р. Взаимодействие NK-клеток с дендритными клетками, модифицированными дегидроэпиандростерона сульфатом // Иммунология. – 2008. - №2. - стр.80-84.
- Леплина О.Ю., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Останин А.А., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на Th1/Th2-стимуляторную активность дендритных клеток. Вестник НГУ, серия: биология, клиническая медицина.- 2009.- Т.7, выпуск 2.- с.3-9.