Функциональное состояние и параметры апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью при гестозе
На правах рукописи
Мамалыга Ирина Николаевна
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ И ПАРАМЕТРЫ АПОПТОЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ КЛЕТОК С ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРИ ГЕСТОЗЕ
14.00.36 – аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Научный руководитель:
Заслуженный врач РФ
доктор медицинских наук,
профессор
Наталья Юрьевна Сотникова
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук,
профессор
Марина Александровна Стенина
Заслуженный деятель науки РУз
доктор медицинских наук,
профессор
Фируз Юсуфович Гариб
Ведущая организация:
ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И.Кулакова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
Защита состоится «21» октября 2009 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1
Автореферат разослан «17» сентября 2009 года
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат медицинских наук, доцент Т.Е.Кузнецова
Актуальность научного исследования
Гестоз является одним из наиболее грозных осложнений беременности, представляющих опасность для матери и плода [Кулаков, В.Н. и др., 2005; Савельева, Г.М. и др., 2005]. Несмотря на постоянное внимание к проблеме гестоза во всем мире, до настоящего времени вопросы этиологии и механизмы развития данной акушерской патологии остаются спорными.
Накопленные к настоящему времени сведения дают возможность полагать, что важную роль в патогенезе гестоза играет иммунный компонент [Сухих, Г.Т. и др., 1997; Сотникова Н.Ю. и др., 2005; Sargent, I.et. al., 2004; Xia, Y., 2007; Zhou, L.L. et. al., 2008], причем клеткам, обладающим цитотоксическими свойствами, отводится ведущая роль в этих процессах [Соколов Д.И., и соавт., 2007; Bachmayer, N. et. al., 2006; Dimitrakova-Dzhambazova, E. et. al.,, 2005; Mahmoud, F. et. аl., 2003].
Имеющиеся данные об изменениях в содержании цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и NК клеток в периферической крови женщин с гестозом носят весьма противоречивый характер [Bachmayer, N. et. al., 2006; Borzychowski, A.M. et. al., 2005; Dimitrakova-Dzhambazova, E. et. al., 2005; Paeschke, S. et. al., 2005; Van Wijk M.J. et. al., 2001]. Вклад ЦТЛ и NК клеток в суммарную продукцию цитокинов при гестозе остается мало изученным. Имеются лишь отдельные сведения об отсутствии достоверных различий в характере продукции IL-2 и IFN цитотоксическими Т-лимфоцитами при неосложненной беременности и гестозе, и о повышенной продукции IFN CD16+ клетками у женщин с гестозом [Darmochwal-Kolarz, D. et. al., 2002]. Ряд авторов не отметили изменений в относительном содержании IFN+ и IL-2+ NК у женщин с неосложненным течением беременности и с преэклампсией [Van Nieuwenhoven, A.L. et. al., 2008].
В литературе имеются противоречивые сведения об экспрессии рецептора к IL-2 ЦТЛ при гестозе [Астраух, Н.В., 2002; Abe, E. et. al., 2003; Darmochwal-Kolarz, D. et. al., 2007; Hu D, et. al., 2008; Paeschke, S. et. al., 2005] и практически полностью отсутствуют данные об экспрессии рецепторов к IFN на поверхности клеток с цитотоксической активностью. Остаются неизученными вопросы, касающиеся продукции цитолитических молекул как при неосложненном течении беременности, так и при гестозе. Также немногочисленны работы, посвященные изучению процессов апоптоза клеток с цитотоксической активностью и роли самих цитотоксических лимфоцитов в регуляции Fas-индуцированного апоптоза при гестозе. Таким образом, сведения об особенностях функционального состояния клеток с цитотоксической активностью, а так же параметрах апоптоза периферических цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллеров при гестозе малочисленны и достаточно противоречивы. В то же время, изучение роли данных популяций клеток в развитии характерных для гестоза осложнений, поможет лучше понять патогенез данной акушерской патологии.
Цель научного исследования:
На основании определения особенностей активации, апоптоза, продукции и рецепции цитокинов, экспрессии Granzyme B периферическими лимфоцитами с цитотоксической активностью при беременности установить особенности их функционирования при гестозе.
Задачи научного исследования:
- Установить особенности содержания и активации периферических клеток с цитотоксической активностью у женщин с гестозом.
- Оценить спонтанную и стимулированную внутриклеточную продукцию Granzyme B периферическими клетками с цитотоксической активностью при гестозе.
- Выявить особенности продукции и рецепции IFN и IL-2 периферическими клетками с цитотоксической активностью при гестозе.
- Оценить особенности параметров Fas-зависимого апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью у женщин с гестозом.
Научная новизна исследования:
- Выявлены новые иммунные механизмы развития гестоза, заключающиеся в накоплении клеток с повышенной цитотоксической активностью, включая ЦТЛ, NК и NК-Т, активно продуцирующих IFN, IL-2 и GranzymeB, обладающих повышенной апоптоз-индуцирующей способностью.
- Впервые установлены особенности ранней активации периферических клеток с цитотоксической активностью у женщин с гестозом, характеризующиеся усилением экспрессии CD69 и CD11b молекул на поверхности NК клеток с фенотипом CD56+.
- Впервые выявлены особенности спонтанной и стимулированной внутриклеточной продукции GranzymeB периферическими клетками с цитотоксической активностью при гестозе, проявляющиеся увеличением содержания в крови женщин CD8+GrB+ лимфоцитов и усилением стимулированной GranzymeB -продуцирующей способности CD8+ и CD16+ клеток.
- Установлены закономерности изменений спонтанной внутриклеточной продукции и рецепции IFN и IL-2 периферическими лимфоцитами у женщин с гестозом, проявляющиеся повышением содержания IFN-продуцирующих цитотоксических Т-лимфоцитов, IL-2-продуцирующих CD8+ и CD56+ клеток, количества CD8+ и CD16+ клеток, экспрессирующих рецепторы к IL-2, и снижением уровня CD16+ и CD56+ NК клеток, экспрессирующих рецепторы к IFN.
- Установлено, что при гестозе стимуляция ФМА и иономицином через 5 часов инкубации индуцирует усиленную внутриклеточную продукцию IFN CD8+, CD16+ и CD56+ клетками, через 24 часа - IL-2 цитотоксическими Т-лимфоцитами.
- Выявлено, что при гестозе повышается апоптоз индуцирующая активность CD16+ и CD56+ NК клеток, усиливается готовность ЦТЛ и CD16+ NК клеток к апоптозу, увеличивается содержание CD16+ и CD56+ NК клеток вступивших в апоптоз, но при этом возрастает количество аннексин-негативных клеток с цитотоксической активностью всех типов.
Практическая значимость исследования:
- Получены новые нормативные данные о содержании клеток с цитотоксической активностью, продуцирующих Granzyme B при гестозе.
- Уточнена роль клеток с цитотоксической активностью в патогенезе гестоза.
Реализация результатов работы:
Нормативные данные функционального состояния и параметров апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью при гестозе используются в работе врачей аллергологов-иммунологов КДП ФГУ«Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и в учебном процессе на кафедре акушерства, гинекологии и медицинской генетики ГОУ ВПО «Ив ГМА Росздрава».
Апробация работы:
Основные положения работы доложены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» - Новосибирск, 2008; 13 Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту:
Иммунные механизмы развития гестоза связаны с накоплением клеток с повышенной цитотоксической и апоптоз-индуцирующей активностью на фоне нарушения их элиминации путем апоптоза. В периферической крови беременных женщин с гестозом повышено содержание активированных цитотоксических лимфоцитов, NК и NК-Т, активно продуцирующих IL-2, IFN и GranzymeB, экспрессирующих молекулы адгезии. Для гестоза характерно изменение рецепции цитокинов, проявляющееся увеличением содержания CD25 позитивных ЦТЛ и CD16+ NК и снижением NK-клеток, экспрессирующих рецепторы к IFN. У женщин с гестозом наблюдается усиленный ответ клеток с цитотоксической активностью на стимуляцию ФМА и иономицином.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем и структура диссертации:
Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 3 глав собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 255 источников отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 19 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследования проводились на базе акушерской и гинекологической клиник Федерального государственного учреждения «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (директор – заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Посисеева Л.В.).
Обследованы: 141 женщина в III триместре гестации, в том числе - 63 беременных женщины, у которых течение гестационного процесса не было осложнено развитием гестоза (контрольная группа) и 78 беременных женщин с гестозом.
Иммунологические исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» (зав. лабораторией заслуженный врач РФ, д.м.н., профессор Сотникова Н.Ю.).
Материалом для исследования у женщин служила периферическая венозная кровь.
Для проведения иммунологических исследований выделяли обогащенную популяцию лимфоцитов периферической крови стандартным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078).
Поверхностный фенотип лимфоцитов и внутриклеточную экспрессию цитокинов определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ). Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgG1-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Исследования методом проточной цитометрии производили в лимфоцитарном гейте. При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-. В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "LYSYS II".
Фирма-производитель и клон, использованных в исследовании мАТ, указаны в таблице 1.
Таблица 1.
Характеристика моноклональных антител, использованных в работе
| МАТ | Клон | Фирма-производитель | Флюорохром |
| CD3 | ICO-90 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC, PE |
| CD8 | ICO-31 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC, PE |
| CD16 | ICO-116 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC, PE |
| CD56 | ICO186 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC |
| CD56 | MEM-188 | «Caltag Laboratories», США | PE |
| CD69 | TP1.55.3 | «Immunotech», Франция | PE |
| CD25 | ICO-124 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC |
| CD95, Fas | ICO-160 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC |
| CD95L, FasL | Alf-2.1 | «Caltag Laboratories», США | FITC |
| CD119 | 92101 | «R&D Systems», США | FITC |
| CD11b | ICO-GM1 | НПЦ «МедБиоСпектр», Россия | FITC |
| CD11c | HCl-3 | «Becton Dickinson», США | PE |
| Recombinant Annexin V | - | «Caltag Laboratories», США | FITC |
Для определения количества клеток, вступивших в апоптоз, проводили тест с одновременным окрашиванием клеток моноклональными АТ анти-CD16+, анти-CD56+ или анти-CD8+ и Annexin V. Для этого на первом этапе проводили стандартную процедуру окрашивания клеток моноколональными антителами к соответствующей популяции. После 30 минутной инкубации клетки отмывали центрифугированием в 1 мл PBS. Клетки ресуспендировали в 50 мкл PBS, добавляли 5 мкл Annexin V, коньюгированного с FITC, инкубировали 15 мин в темноте. Затем добавляли 200 мкл стабилизирующего буфера (CALTAG Laboratories, США), и не более, чем в течение 30 мин анализировали на проточном цитофлюориметре.
Стимулированную внутриклеточную продукцию цитокинов исследовали в клеточной суспензии инкубировавшейся при 370С и 5%СО2 в течение 5 и 24 часов в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 2 mM L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина, 10 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА) (Sigma, США), 1M иономицина (Sigma, США) в присутствии 2 M моненсина (Sigma, США). Затем клетки отмывали от препаратов физиологическим раствором центрифугированием при 1500 об/мин 5 мин. В качестве контроля использовали показатели исходного уровня клеток внутриклеточно продуцирующих IL-2, IFN и GranzymeB в периферической крови. Подсчет концентрации и жизнеспособности лимфоцитов до и после инкубации показал, что гибель клеток во всех случаях составила менее 8%.
Внутриклеточную процедуру окрашивания клеток-продуцентов IFN, IL-2 и GranzymeB проводили в соответствии с инструкциями фирмы-производителя, используя коммерческий набор FIX & PERM cell permeabilization kit (CALTAG Laboratories, США) для пермеабилизации клеточной мембраны.
Характеристика моноклональных антител, использованных для определения внутриклеточной продукции цитокинов, представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Характеристика моноклональных антител, использованных для определения внутриклеточного содержания цитокинов
| МАТ | Клон | Фирма-производитель | Флюорохром |
| Анти-IL-2 | MQ1-17H12 | CALTAG Laboratories, США | PE |
| Анти- GranzymeB | GB-12 | CALTAG Laboratories, США | PE |
| Анти-IFN | B27 | CALTAG Laboratories, США | PE |
Внутриклеточный синтез цитокинов и GranzymeB оценивали в популяции CD8+, CD16+, CD56+ лимфоцитов (CD8+GrB+, CD16+GrВ+, CD56+GrВ+, CD8+IL-2+, CD16+IL-2+, CD56+IL-2+, CD8+IFN+, CD16+ IFN+, CD56+IFN+ клетки). При проведении процедуры окрашивания клетки сначала инкубировали с мАТ к поверхностным маркерам клеток в соответствии со стандартным протоколом. Затем клетки фиксировали в течение 15 мин в 100 мкл фиксирующего буфера А из набора FIX & PERM cell permeabilization kit. Клетки отмывали от фиксирующего буфера в 2 мл PBS центрифугированием в течение 5 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость сливали. Отмытые клетки инкубировали со 100 мкл пермеабилизирующего буфера В и с мАТ для внутриклеточного окрашивания.
Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000 и программы STUD BAT из комплекта «Statistica». Достоверность различий сравниваемых показателей определялась по t-критерию Стьюдента.
Результаты работы и их обсуждение
Для уточнения особенностей функционального состояния при гестозе нами была проведена оценка особенностей функционального состояния и параметров апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью.
Исследование содержания в периферической крови беременных женщин клеток с цитотоксической активностью выявило достоверное повышение при гестозе уровня всех популяций исследуемых клеток, включая цитотоксические Т-лимфоциты (p<0,001), NК-Т клетки (p<0,001) и NК клетки с фенотипом CD16+ (p<0,02) и CD56+ (p<0,001). Вероятно, увеличение этого пула NK-T клеток происходило за счет увеличения популяции CD16+CD56-, поскольку в периферической крови женщин с гестозом отмечалось достоверное повышение лишь этой популяции. Отмеченное нами повышение уровня цитотоксических лимфоцитов в периферической крови женщин с гестозом могло быть обусловлено высоким уровнем сывороточного содержания провоспалительных цитокинов, которое отмечается большинством авторов при гестозе [Лукина Н.С. и др., 2005; Медвинский, И.Д., 2004; Пелевина М.И. и др., 2006; Сотникова Н.Ю. и др., 2007; Чистякова, Г.Н. и др., 2006; Lpez-Jaramillo, P. et. al., 2008 ].
Важную информацию о функционировании клеток дает степень их активации [Ярилин, А.А., 1999].
Данные, характеризующие функциональное состояние лимфоцитов с цитотоксической активностью, приведены в таблице 3.
Таблица 3.
Сравнительная характеристика функционального состояния периферических клеток с цитотоксической активностью у женщин с физиологической беременностью и гестозом
| Показатель | ФБ n=19 | Гестоз n=35 |
| CD56+CD69+ | 1,24±0,10 | 1,82±0,19*** |
| CD56+CD11b+ | 2,03±0,40 | 4,47±0,67* |
| CD56+CD11b+ | 2,03±0,40 | 4,47±0,67* |
| GrВ+ | 19,71±1,19 | 23,22±0,79* |
| CD8+Gr В+ | 6,39±0,3 | 10,15±0,83**** |
| IL-2+ | 16,99 ±0,80 | 23,38±1,28**** |
| CD8+IL-2+ | 4,80±0,67 | 7,84±1,23* |
| CD56+IL-2+ | 1,90±0,16 | 2,56±0,27* |
| IFN+ | 16,83±0,69 | 22,48±1,46*** |
| CD8+IFN+ | 2,97±0,67 | 5,89±0,83** |
| CD25+ | 5,52±0,11 | 7,16±0,34**** |
| CD8+CD25+ | 0,62±0,07 | 1,04±0,18* |
| CD16+CD25+ | 0,27±0,02 | 0,55±0,07**** |
| CD119+ | 11,05±0,94 | 6,86±0,64**** |
| CD16+CD119+ | 2,18±0,13 | 1,14±0,17**** |
| CD56+CD119+ | 2,08±0,33 | 1,27±0,16* |
*- коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с показателями у женщин с ФБ (*- p<0,05, ** - p<0,02, *** - p<0,01**** - p<0,001).
Нами проведено исследование особенностей экспрессии маркера ранней активации CD69 на поверхности ЦТЛ и NК у беременных женщин с гестозом по сравнению с аналогичными показателями женщин с нормально протекающей беременностью. Выраженные изменения при гестозе мы отметили только в популяции CD56+ NК, где наблюдалось достоверное увеличение количества CD69-позитивных клеток (р<0,01).
У женщин с гестозом по сравнению с таковым у женщин с физиологически протекающей беременностью было выявлено увеличение общего количества лимфоцитов, экспрессирующих CD11b молекулу, (p<0,05). При этом в крови женщин с гестозом достоверно выше, чем при неосложненной беременностью, был уровень естественных киллеров с фенотипом CD56+, экспрессирующих CD11b (p<0,05).
Известно, что молекулы адгезии участвуют в реализации межклеточных взаимодействий по типу клетка-клетка и клетка-межклеточный матрикс, вовлекаясь, таким образом, в осуществление процессов миграции клеток и взаимодействие цитотоксических клеток с клетками-мишенями [Пальцев, М.А., 1995]. Взаимодействие CD11b-позитивных NК клеток с клетками мишенями приводит к усилению продукции различных цитокинов и цитолитических веществ, которые опосредуют цитотоксическую активность NК клеток [Пальцев, М.А., 1995], что может играть непосредственную роль в развитии системного воспалительного иммунного ответа у женщин с гестозом.
Поскольку в основе развития любого иммунного ответа, в том числе и материнского иммунного ответа на развивающийся плод, лежит цитокиновая регуляция [Ковальчук Л.В. и др., 2001], мы предположили, что изучение продукции важнейшего провоспалительного цитокина IFN, а также IL-2, отвечающего за пролиферативный ответ иммунокомпетентных клеток, представляет несомненный интерес.
Установлено, что для гестоза характерно значительное увеличение количества периферических лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-2 по сравнению с таковым при нормально протекающей беременности (p<0,001). Повышение содержания IL-2 позитивных клеток при гестозе происходило за счет увеличением пула ЦТЛ и CD56+ NК (p<0,05 в обоих случаях).
Известно, что IL-2 является цитокином, активирующим пролиферативный и дифференцировочный ответы Т-лимфоцитов [Ковальчук Л.В. с соавт., 2001; Белоцкий, С.М. с соавт., 2008]. IL-2 индуцирует экспрессию перфорина и GranzymeB ЦТЛ, усиливая цитотоксическую активность CD8+лимфоцитов [Белоцкий, С.М. с соавт., 2008] и увеличивает экспрессию антиапоптотического гена Bcl-2, оказывая угнетающее влияние на апоптоз клеток [Akbar, A.N. et.al., 1996; Gupta, S. et.al., 2005]. Это позволяет предположить, что повышение продукции IL-2 цитотоксическими лимфоцитами свидетельствует о важной регуляторной функции клеток с цитотоксической активностью при гестозе.
Одновременно при гестозе повышалось содержание IFN-синтезирующих лимфоцитов по сравнению с аналогичным параметром женщин с неосложненной беременностью (p<0,01) за счет увеличения пула IFN-позитивных ЦТЛ (p<0,02).
Известно, что IFN- оказывает потенциально опасное воздействие на беременность за счет индукции апоптоза трофобласта [Aban, M. et.al., 2004] и активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клетки-мишени [Tobias, M. et.al., 2007]. IFN непосредственно стимулирует экспрессию рецепторов к ангиотензину II в стенке кровеносных сосудов [Fernandez-Castelo, S. et. al., 1987; Horiuchi M. S. et.al., 2000], что может провоцировать развитие гипертензии, которая является характерным симптомом гестоза. В работах последних лет было показано, что при преэклампсии повышается сывороточная концентрация IFN-индуцибельного протеина CXCL10/IP-10, обладающего не только провоспалительными, но и выраженными анти-ангиогенными свойствами [Gotsch, F. et.al., 2007]. Одновременно с этим доказана способность IFN стимулировать адгезию клеток на поверхности эндотелия [Белоцкий, С.М. с соавт., 2008]. Повышение IFN-продуцирующей способности клеток с цитотоксической активностью у женщин с осложненным течением гестационного процесса, вероятно, может обуславливать клинические проявления гестоза.
У беременных женщин с гестозом было выявлено значительное увеличение количества лимфоцитов, внутриклеточно экспрессирующих GranzymeB, по сравнению с показателями женщин с неосложненным течением беременности (p<0,05). Достоверно более высокое содержание GranzymeB -позитивных лимфоцитов отмечалось в популяции CD8+ клеток (p<0,001). GranzymeB представляет специфичную к остатку аспарагиновой кислоты сериновую протеазу, принимающую активное участие в гранзим-перфориновом механизме уничтожения клетки-мишени активированными ЦТЛ. Этот механизм подразумевает образование в зоне контакта с клеткой-мишенью трансмембранных каналов с помощью белка перфорина. Через этот канал внутрь клетки поступают гранзимы, представляющие протеолитические ферменты, основным из которых является GranzymeB, превращающий прокаспазу-3 в каспазу-3. Включение последней приводит к разрушению белков цитоскелета и ядра клетки [Белоцкий, С.М. с соавт., 2008]. Можно предположить, что повышение уровня GranzymeB-позитивных ЦТЛ при гестозе ведет к развитию цитотоксических реакций против тканей материнских органов, плаценты и плода, что может обуславливать клинические проявления гестоза. Это предположение согласуется с имеющимися в литературе данными о том, что активированные ЦТЛ могут опосредованно через перфорин-гранзимовый путь повреждения клеток разрушать аутологичные тромбоциты [Zhang, F. et.al., 2006], вызывая характерную для гестоза тромбоцитопению [Zhang, F. et.al., 2006].
Характер продукции цитокинов и цитотоксических молекул цитотоксическими Т-лимфоцитами изменяется в динамике их дифференцировки. Известно, что наивные клетки не способны выполнять эффекторные функции и не способны к высокому уровню продукции цитокинов [Tobias, M. et.al., 2007], тогда как наиболее мощными продуцентами IL-2, IFN- и GranzymeB являются претерминально-дифференцированные и терминально-дифференцированные эффекторные CD8+ клетки памяти [Талаев В.Ю. с соавт., 2005; Maldonado A. et.al., 2003].
По-видимому, при гестозе усилен процесс дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов, и основной пул CD8+ лимфоцитов представлен популяциями эффекторных клеток памяти, способными к быстрому реагированию на повторное поступление антигена усилением цитотоксических реакций.
Изучение особенностей рецепции IL-2 и IFN лимфоцитами с цитотоксической активностью выявило, что у женщин с гестозом по сравнению с аналогичными показателями женщин с нормально протекающей беременностью в целом было значительно повышено содержание лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к IL-2 (р<0,001), за счет CD8+ лимфоцитов (р<0,05) и CD16+ NК (р<0,001).
Повышение количества лимфоцитов с цитотоксической активностью, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы к IL-2, по-видимому, свидетельствует о готовности клеток к быстрому реагированию под влиянием цитокинового сигнала и об активированном состоянии ЦТЛ и NК клеток при гестозе. В качестве такого сигнала может выступать усиленная продукция IFN, способствующая пролиферации и дифференцировке клеток с цитотоксической активностью.
Проведенные исследования показали, что у женщин с гестозом нарушена рецепция IFN, у них было достоверно снижено содержание CD119+ лимфоцитов по сравнению с аналогичными показателями женщин с физиологической беременностью (р<0,001). Кроме того, при гестозе было ниже, чем у женщин с физиологической беременностью, содержание NК клеток с фенотипом CD16+ и СD56+, экспрессирующих рецепторы к IFN (р<0,001 и р<0,05 соответственно), что может способствовать освобождению IFN в среду, не вызывая его последующего повторного связывания с лимфоцитами и, вопреки антипролиферативному действию IFN [Ковальчук Л.В. и др., 2001], усиливать пролиферацию NК клеток в процессе развития иммунного ответа при гестозе.
Наибольшие изменения при гестозе наблюдались в популяции ЦТЛ, и заключались в значительном повышении содержания CD8+ лимфоцитов, продуцирующих провоспалительные цитокины и цитолитические молекулы. Это может быть обусловлено усиленным поступлением в материнский кровоток антигенов плодового происхождения за счет повышения проницаемости плаценты, обусловленной характерным для гестоза усилением апоптоза клеток трофобласта с последующей активацией реакций адаптивного иммунитета [Straszewski-Chavez, S.L. et.al., 2004]. Одновременное увеличение уровня цитотоксических Т-лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IL-2 и экспрессирующих рецепторы к нему, может запускать процесс аутоактивации, поддерживая тем самым высокий уровень пролиферации и дифференцировки клеток с цитотоксической активностью при гестозе.
Увеличение содержания ЦТЛ, внутриклеточно продуцирующих GranzymeB, свидетельствует об их высоком цитолитическом потенциале и усилении активации гранзим-перфоринового механизма уничтожения клеток-мишеней. Повышение цитолитической способности ЦТЛ может обуславливать повреждение клеток организма беременной женщины и вызывать характерные для гестоза проявления полиорганной недостаточности. Увеличение продукции IFN может способствовать развитию гипертензивного синдрома и нарушению функции почек при гестозе. Наблюдавшееся при гестозе повышение содержания CD56+ NК клеток, находящихся на ранних этапах активации и экспрессирующих адгезионные молекулы, может повышать миграционную способность клеток с последующим их участием в нарушении функции эндотелия и развитии полиорганной недостаточности. При гестозе отмечалось также увеличение в крови количества CD16+ NК клеток, экспрессирующих рецепторы к IL-2, на фоне снижения содержания CD16+CD119+ клеток.
Важную информацию о функциональном состоянии клеток дает оценка их способности отвечать на дополнительную стимуляцию. Именно способность к адекватному иммунному ответу определяет характер течения беременности. Для оценки потенциальных возможностей клеток с цитотоксической активностью продуцировать цитокины и цитолитические молекулы клетки инкубировали с неспецифическими стимуляторами ФМА и иономицином в течении 5ч и 24ч, после чего оценивали изменение содержания клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-2, IFN или GranzymeB, в сравнении с их исходным уровнем.
Анализ полученных результатов показал, что при гестозе неспецифическая стимуляция способствовала более быстрому и значительному повышению содержания всех популяций цитотоксических клеток, внутриклеточно продуцирующих IFN, по сравнению с контрольной группой. При этом наибольшие изменения продукции IFN под влиянием стимуляции при гестозе наблюдались в популяции CD56+ NК клеток.
При физиологической беременности (рис. 1) после инкубации лимфоцитов с ФМА и иономицином уже через 5 часов наблюдалось значительное увеличение количества IFN+ лимфоцитов, в том числе и CD8+IFN+ клеток, по сравнению с исходным уровнем до инкубации (p<0,001 и p<0,05 соответственно). Это увеличение было более выраженным после 24 ч стимуляции (p<0,001 в обоих случаях). Следует отметить, что при неосложненной беременности уровень CD16+IFN+ NК не изменялся после 5 часов инкубации с ФМА и иономицином (p>0,05), но увеличивался через 24 часа стимуляции (p<0,05) по сравнению с исходными значениями до инкубации. Достоверные различия в содержании CD56+IFN+ NК после 5 и 24 часовой инкубации отсутствовали (p>0,05).
Рис.1 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IFN периферическими ЦТЛ и NК при физиологической беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IFN продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IFN продуцирующих клеток после 5- часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
При гестозе (рис.2) только 24-часовая стимуляция ФМА и иономицином приводила к увеличению уровня IFN+ клеток в общей популяции лимфоцитов (p<0,001), но уже через 5 часовой стимуляции возрастало количество всех типов клеток с цитотоксической активностью, внутриклеточно продуцирующих IFN (p<0,02; p<0,05 и p<0,05 соответственно), и оставалось высоким после 24 часов инкубации.
Выявленная нами способность к более раннему ответу NК клеток в виде усиления продукции IFN при гестозе в ответ на дополнительное воздействие может способствовать усилению клинических проявлений гестоза, а так же приводить к более быстрому срыву компенсаторно-защитных механизмов организма беременной женщины с гестозом и повреждению плода под влиянием дополнительной антигенной нагрузки на организм беременной женщины с гестозом.
Рис. 2 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IFN периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IFNпродуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IFN продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Данные по ответу лимфоцитов с цитотоксической активностью на неспецифическую стимуляцию продукцией IL-2 представлены на рисунке 3.
Рис.3 Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IL-2 периферическими ЦТЛ и NК при физиологической беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IL-2 продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IL-2 продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Как видно из рисунка 3., при физиологической беременности после инкубации лимфоцитов с ФМА и иономицином уже через 5 часов наблюдалось значительное увеличение содержания клеток, внутриклеточно продуцирующих IL-2 в общей популяцией лимфоцитов (p<0,001), в популяциях CD8+ и CD16+ клеток (p<0,01 и p<0,02 соответственно) по сравнению с исходным уровнем IL-2 продуцирующих клеток в периферической крови, и оставалось таким же высоким после 24-часовой инкубации. При физиологической беременности в популяции CD56+ клеток продукция IL-2 усиливалась лишь через 24 часа после инкубации с ФМА и иономицином по сравнению с исходным уровнем в периферической крови (p<0,001).
При гестозе наблюдались сходные с физиологической беременностью закономерности ответа клеток на стимуляцию за исключением ЦТЛ, которые медленнее, чем при физиологической беременности, отвечали усилением внутриклеточной продукции IL-2 на неспецифическую стимуляцию (рис.4).
Рис.4. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции IL-2 периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания IL-2 продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания IL-2 продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Показатели содержания CD8+IL-2+ и CD56+IL-2+ после 24 часовой инкубации с ФМА и иономицином при гестозе были достоверно выше, чем при 5 часовой инкубации (p<0,05 в обоих случаях).
Стимулированная GranzymeB-продуцирующая способность клеток с цитотоксической активностью при гестозе была не нарушена, имела сходный характер с таковой при физиологической беременности, но, независимо от длительности стимулирующего воздействия, оставалась всегда более высокой, чем при неосложненной беременности. При физиологической беременности (рис.5) 5 часовая стимуляция ФМА и иономицином достоверно повышала общее количество лимфоцитов, внутриклеточно синтезирующих GranzymeB (p<0,001), а также увеличивала содержание CD8+GrB+ ЦТЛ и CD16+GrB+ NК (p<0,001, p<0,02, соответственно) по сравнению с исходным уровнем.
Рис.5. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции GranzymeB ЦТЛ и NК при физиологической беременности.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания GranzymeB продуцирующих клеток статистически достоверны.
^ - различия между показателями содержания GranzymeB продуцирующих клеток после 5-часовой и 24-часовой стимуляции статистически достоверны.
Повышение содержания GrB+ клеток в общей популяции лимфоцитов, в популяциях CD8+ и CD16+ клеток отмечалось и через 24 часа инкубации по сравнению с исходным уровнем (p<0,001; p<0,001 и p<0,05 соответственно). При физиологической беременности стимуляция ФМА и иономицином не влияла на содержание CD56+ NК клеток, внутриклеточно продуцирующих GranzymeB как после 5 ч, так и после 24 ч инкубации клеток (р>0,05 в обоих случаях).
При гестозе наблюдалась сходная динамика изменений показателей в процессе стимуляции клеток ФМА и иономицином. (рис.6). В группе с гестозом после инкубации клеток с ФМА и иономицином увеличивалось общее содержание лимфоцитов, а также ЦТЛ и CD16+ NК клеток, внутриклеточно продуцирующих GranzymeB по сравнению с исходным уровнем и после 5 часовой стимуляции клеток (p<0,001, p<0,02 и p<0,001 соответственно) и после 24 часовой стимуляции клеток (p<0,001, p<0,01 и p<0,01 соответственно). Стимуляция ФМА и иономицином не влияла на содержание CD56+ NК, внутриклеточно продуцирующих GranzymeB, как после 5 часовой, так и после 24 часовой инкубации клеток по сравнению с исходным уровнем до инкубации (р>0,05 в обоих случаях).
Рис. 6. Сравнительная характеристика спонтанной и индуцированной внутриклеточной продукции GranzymeB периферическими ЦТЛ и NК при гестозе.
* - различия между показателями исходного и стимулированного ФМА и иономицином содержания GranzymeB продуцирующих клеток статистически достоверны.
Таким образом, неадекватность иммунного ответа у женщин с гестозом, по нашим результатам, заключается в усилении цитотоксических реакций со стороны ЦТЛ и NК клеток под влиянием стимуляции, о чем свидетельствует выявленное нами повышение уровня цитотоксических лимфоцитов, внутриклеточно продуцирующих IFN и GranzymeB.
Клетки осуществляют свою цитотоксическую функцию, в том числе и за счет индукции апоптоза. О способности индуцировать апоптоз свидетельствует экспрессия молекул FasL, которая осуществляет запуск Fas-зависимого пути апоптоза [Ярилин А.А., 2000; Nagata, S., 1999]. В литературе имеются данные, что процесс взаимодействия Fas-FasL сопровождается секрецией провоспалительных цитокинов TFN, IFN и IL-1 [Rescigno, M.et. al., 2000]. Кроме того, взаимодействие Fas и FasL может способствовать активации нейтрофилов, развитию нейтропении и повреждению сосудистого эндотелия, которые наблюдаются при гестозе [Nagata, S., 1999; Waring, P., 1999].
Данные по изучению апоптоза клеток с цитотоксической активностью приведены в таблице 4. При гестозе было выявлено повышение уровня лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности FasL молекулу (p<0,01), а также FasL экспрессирующих клеток в популяции NК с фенотипом CD16+ (p<0,05) и CD56+ (p<0,05) по сравнению с аналогичными показателями у женщин с нормально протекающей беременностью. Повышение при гестозе уровня периферических CD16+FasL+ и CD56+FasL+ NК может быть обусловлено высокой концентрацией в крови женщин с гестозом IL-2 [Lpez-Jaramillo, P. et. al.,2008; Madazli, R. et. al.,2003]. Известно, что IL-2 индуцирует экспрессию Bcl-2 генов и способствует усилению поверхностной экспрессии FasL [Xiao S. et. al., 1999], препятствуя развитию апоптоза [Akbar, A.N. et. al., 1996]. Эти результаты также хорошо согласуются с выявленным нами снижением уровня NК клеток как с фенотипом CD56+, так и с фенотипом CD16+, экспрессирующих рецепторы к IFN, который является одним из индукторов апоптоза [Tobias, M. et. al.,2007].
Экспрессия Fas молекул свидетельствует о готовности самих клеток к вступлению в апоптоз. [Waring, P. et. al., 1999]. Повышение при гестозе уровня клеток, готовых к апоптозу мы наблюдали только в популяции CD16+ NК (p<0,01). Учитывая, что в целом при гестозе содержание CD16+ NК было повышено, увеличение количества Fas-позитивных CD16+ NК можно расценивать как естественный процесс элиминации активированных клонов клеток. Отсутствие накопления CD16+ NК клеток может свидетельствовать о менее значимой роли данной популяции клеток в патогенезе гестоза.
Таблица 4.
Особенности параметров апоптоза у женщин с гестозом
| Показатель | ФБ n=22 | Гестоз n=31 |
| CD95+ | 17,21±1,31 | 21,95±1,49 ** |
| CD16+CD95+ | 3,73±0,66 | 7,33±1,08*** |
| CD95L+ | 18,59±1,40 | 24,38±1,24 *** |
| CD16+CD95L+ | 5,54±0,68 | 8,24±0,84* |
| CD56+CD95L+ | 5,09±0,54 | 7,68±0,95* |
| CD8+AnnexinV- | 17,08±0,54 | 21,88±1,70* |
| CD16+AnnexinV+ | 3,06±0,19 | 4,69±0,44*** |
| CD16+AnnexinV- | 7,56±0,62 | 12,49±1,35*** |
| CD56+AnnexinV+ | 4,32±0,53 | 6,33±0,66* |
| CD56+AnnexinV- | 7,04±0,92 | 11,10±1,07** |
*- коэффициент достоверности разности результатов по сравнению с показателями у женщин с ФБ (*- p<0,05, ** - p<0,02, *** - p<0,01**** - p<0,001).
С целью определения уровня апоптирующих клеток, мы оценивали параметры аннексинового теста. Как известно, наличие молекул аннексина на поверхности клетки свидетельствует о том, что клетка вступила в апоптоз.
Анализ полученных результатов показал, что при гестозе, наряду с повышением уровня CD16+ и CD56+Аннексин+ NК (p<0,01 и p<0,05 соответственно), наблюдалось увеличение содержания Аннексин-негативных лимфоцитов с цитотоксической активностью в популяциях ЦТЛ (p<0,05), CD16+ (p<0,01) и CD56+ NК (p<0,02).
Таким образом, развитие гестоза сопровождается накоплением в периферической крови беременных женщин ЦТЛ, NК и NК-Т клеток, активно продуцирующих IFN, IL-2 и GranzymeB, и обладающих повышенной апоптоз-индуцирующей способностью, что свидетельствует о высоком уровне их цитотоксической активности. Это может обуславливать непосредственное участие данных популяций лимфоцитов в развитии синдрома полиорганной и эндотелиальной дисфункции у женщин с гестозом. Отличительной чертой системного материнского иммунного ответа при беременности, осложненной гестозом, являлось наличие более выраженных изменений со стороны реакций адаптивного иммунитета. Именно в популяции ЦТЛ значительно возрастало число клеток, внутриклеточно продуцирующих IFN, IL-2 и GranzymeB. СD56+ NК при гестозе, по-видимому, выполняют в большей степени регуляторные функции, однако, именно данная популяция клеток может способствовать развитию эндотелиальной дисфункции, о чем свидетельствует усиление экспрессии адгезионных молекул. Было отмечено, что при гестозе периферические цитотоксические Т-лимфоциты и NК способны отвечать резким усилением функциональной активности в ответ на дополнительную антигенную нагрузку. Выявленные нами нарушения параметров апоптоза при гестозе свидетельствуют о накоплении в периферической крови беременных женщин с гестозом клеток, обладающих высоким цитотоксическим потенциалом, что способствует пролонгированию патологического иммунного ответа.
Выводы
- В развитии гестоза важную роль играет накопление клеток с цитотоксической активностью с повышенным цитотоксическим потенциалом при одновременном усилении их апоптоз-индуцирующей способности и функциональной активности в ответ на неспецифическую стимуляцию.
- Установлено, что при гестозе в периферической крови повышается содержание клеток с цитотоксической активностью, включая ЦТЛ, ЕК и ЕК-Т. Для женщин с гестозом характерно высокое содержание CD56+ ЕК, экспрессирующих молекулы CD69 и CD11b.
- Выявлено, что при гестозе в крови повышается количество CD8+ клеток, продуцирующих GranzymeB. Стимуляция ФМА и иономицином в равной степени усиливает GranzymeB-продуцирующую способность CD8+ и CD16+ лимфоцитов как при неосложненной беременности, так и при гестозе, но при гестозе повышение уровня GranzymeB - продуцирующих клеток более выражено.
- Установлено, что у женщин с гестозом усиливается спонтанная внутриклеточная продукция IFN периферическими цитотоксическими Т-лимфоцитами и IL-2 CD8+ и CD56+ клетками, при этом рецепция IFN CD16+ и CD56+ ЕК снижена, а рецепция IL-2 CD8+ и CD16+ клетками повышена по сравнению с показателями неосложненной беременности.
- Установлено, что при гестозе неспецифическая стимуляция ФМА и иономицином уже через 5 часов индуцирует усиленный внутриклеточный синтез IFN всеми типами исследованных клеток с цитотоксической активностью, тогда как при неосложненной беременности повышение IFN-продуцирующей способности CD16+ NК клеток наблюдается только после 24-часовой стимуляции. Внутриклеточная продукция IL-2 CD8+ лимфоцитами при гестозе в отличие от неосложненной беременности, усиливается только через 24 часа инкубации.
- При гестозе повышается готовность CD16+ NК клеток к апоптозу, одновременно увеличивается апоптоз-индуцируюшая активность CD16+ и CD56+ NК клеток, возрастает количество аннексин-негативных клеток с цитотоксической активностью всех типов, при этом повышение количества клеток, вступивших в апоптоз, отмечается только в популяциях CD16+ и CD56+ NК.
Практические рекомендации.
- Дополнительно к стандарту иммунологического обследования беременной женщины с гестозом рекомендуется проводить оценку параметров активации и апоптоза периферических клеток с цитотоксической активностью.
-Врачам аллергологам-иммунологам рекомендуется определять содержание периферических цитотоксических лимфоцитов, продуцирующих GranzymeB и использовать результаты в комплексной оценке цитолитического потенциала иммунной системы женщин с гестозом.
Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.
- Фенотип лимфоцитов с цитотоксической активностью у беременных женщин с гестозом и возможности цитокинотерапии [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова., И.А. Панова, Н.Г. Коряковская // Медицинская иммунология.- 2005. – Том 7. - № 2-3. – С.310-311.
- Особенности влияния препарата «Суперлимф» на фенотип лимфоцитов с цитотоксической активностью in vitro у беременных женщин с гестозом [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова., И.А. Панова, Н.Г. Коряковская // Russian Journal of Immunology.- 2005.-V. 9, Suppl. 2.- P.242-243.
- Параметры активации периферических естественных киллеров при гестозе [Текст] / Н.Ю. Сотникова., И.Н. Мамалыга, Н.Г. Коряковская, И.А. Панова, А.В Кудряшова // Russian Journal of Immunology.- 2007.-V. 9, Suppl.4.- P.100
- Продукция и рецепция IL-2 и IFN естественными киллерами при гестозе [Текст] / Н.Ю.Сотникова, А.В.Кудряшова, И.Н.Мамалыга., И.А.Панова // Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.- 2008.- Приложение 1.- С. 75-79.
- Параметры активации естественных киллеров при гестозе [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю.Сотникова, И.А.Панова., А.В.Кудряшова // Материалы международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека».- Новосибирск, 2008.- С.27-28.
- Особенности состояния периферических ЕК при гестозе [Текст] / Н.Ю. Сотникова., А.В. Кудряшова, И.А. Панова, И.Н. Мамалыга, Л.Ю. Мальгина // Российский иммунологический журнал.- 2008.- Т.2(11).-№2-3.- С.291.
- Влияние препарата «Суперлимф» на параметры активации цитотоксических клеток беременных женщин [Текст] / Н.Ю.Сотникова, И.Н. Мамалыга, А.В.Кудряшова, И.А. Панова // Материалы IV съезда акушеров-гинекологов России. - Москва, 2008.- С.241.
- Нарушение продукции и рецепции IFN при гестозе [Текст] / И.Н. Мамалыга, Н.Ю. Сотникова, А.В. Кудряшова, И.А. Панова // Бюллетень Военно-Медицинской академии.-2009.-Приложение 1(25).-с. 499-500
- Нарушение регуляции апоптоза лимфоцитов при гестозе [Текст] / А.В. Кудряшова., Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Мальгина Л.Ю., Мамалыга И.Н. // Медицинская иммунология.- 2009.- т.11.-№ 4-5.-с.411
- Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В., Лазарева Ю.Ю., Мамалыга И.Н., Панова И.А. Характеристика дифференцировки и функциональной активности цитотоксических Т-лимфоцитов при гестозе // Медицинская иммунология.-2009.-т.11.-№4-5.-с.421
